一類新的stat3通路抑制劑和癌干細(xì)胞通路抑制劑的制作方法
【專利摘要】一類新的STAT3通路抑制劑和癌干細(xì)胞通路抑制劑。本發(fā)明涉及一類新的癌干細(xì)胞通路(CSCP)抑制劑的用途；利用此類化合物治療頑固性、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的方法；通過利用此類化合物以特定施用策略選擇性殺死癌細(xì)胞的方法；通過抑制Stat3通路靶向癌干細(xì)胞的方法；利用新化合物治療哺乳動(dòng)物異常Stat3通路活性相關(guān)病情或紊亂的方法；以及制備此類化合物及其中間體的方法；相關(guān)化合物的藥物組合物；和施用這些化合物的具體方法。
【專利說(shuō)明】
一類新的STAT3通路抑制劑和癌干細(xì)胞通路抑制劑
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年9月10日，PCT申請(qǐng)進(jìn)入國(guó)家階段日2010年5月7日，申請(qǐng) 號(hào)為:200880115250.2，發(fā)明名稱為"一類新的STATS通路抑制劑和癌肝細(xì)胞通路抑制劑"的 專利申請(qǐng)之分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般地涉及Stat3通路抑制劑用于治療病情（conditions)的用途。更具體 地，本發(fā)明涉及Stat3通路抑制劑用于靶向癌干細(xì)胞、以及治療其他紊亂的用途。甚至更具 體地，本發(fā)明涉及萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮及相關(guān)化合物用于抑制Stat3、靶向癌干細(xì) 胞、以及治療惡性疾病的用途。本發(fā)明還涉及頑固性、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性癌癥的治療，制備相 關(guān)化合物及其中間體的方法，以及相關(guān)化合物的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 癌干細(xì)胞(CSC)
[0004] 近年來(lái)，一種新的腫瘤發(fā)生模型得到了廣泛認(rèn)可，其中提出假說(shuō)，在全部腫瘤物質(zhì) 中僅一小部分負(fù)責(zé)腫瘤內(nèi)的致瘤活性，而老的模型或者說(shuō)克隆遺傳模型卻假定所有突變的 腫瘤細(xì)胞均等同地貢獻(xiàn)于此致瘤活性。根據(jù)新模型，這小部分腫瘤發(fā)生細(xì)胞是具有干細(xì)胞 樣性能的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并稱為"癌干細(xì)胞"（CSC)。在20世紀(jì)90年代，Bonnet和Dick首先在體內(nèi) 證明了急性髓性白血病(AML)中CSC的存在。他們的數(shù)據(jù)表明，僅小亞群的人AML細(xì)胞在移植 到免疫缺陷小鼠中時(shí)具有轉(zhuǎn)移AML的能力，而其他AML細(xì)胞不能夠誘發(fā)白血病。后來(lái)，證明這 些CSC具有與原始造血干細(xì)胞相同的細(xì)胞標(biāo)志⑶34+/⑶38?1]。從那以后，研究人員已經(jīng)確 鑿地在多種類型的腫瘤(包括腦、乳腺、皮膚、前列腺等的腫瘤）中發(fā)現(xiàn)CSC。
[0005] 腫瘤發(fā)生的CSC模型能夠解釋為什么為了確立腫瘤移植物，需要將幾萬(wàn)或幾十萬(wàn) 的腫瘤細(xì)胞注射到試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)。在人AML中，這些CSC細(xì)胞的頻率低于萬(wàn)分之一[2]。盡管 CSC在一個(gè)給定的腫瘤細(xì)胞群體中是稀少的，但有增加的證據(jù)表明此類細(xì)胞存在于幾乎所 有腫瘤類型中。然而，由于癌細(xì)胞系是從特異地適應(yīng)于組織培養(yǎng)生長(zhǎng)的癌細(xì)胞亞群中選擇 的，所以癌細(xì)胞系的生物學(xué)及功能特性可能經(jīng)歷顯著的變化。因此，并非所有的癌細(xì)胞系都 含有CSC。
[0006] 癌干細(xì)胞與正常干細(xì)胞享有許多相似的性狀。例如，CSC具有自我更新能力，即產(chǎn) 生其他的致瘤性癌干細(xì)胞的能力，一般速率比其他分裂腫瘤細(xì)胞低，但非有限次數(shù)的分裂。 CSC還具有分化成多種細(xì)胞類型的能力，這就解釋了如下組織學(xué)現(xiàn)象一一許多腫瘤不僅含 有多種對(duì)宿主器官而言天然的細(xì)胞類型，而且腫瘤轉(zhuǎn)移中常常保持異質(zhì)性。已經(jīng)證明CSC根 本性地負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生、癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)。CSC也稱為腫瘤起始細(xì)胞、癌干細(xì)胞樣細(xì)胞、干 細(xì)胞樣癌細(xì)胞、高致瘤性細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、實(shí)體瘤干細(xì)胞或超級(jí)惡性細(xì)胞。
[0007] 癌干細(xì)胞的存在對(duì)于未來(lái)的癌癥治療和療法具有根本性的意義。這些意義表現(xiàn)在 疾病鑒定、選擇性藥物靶向、預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、以及開發(fā)新的策略對(duì)抗癌癥方面。
[0008] 目前癌癥治療的功效在檢驗(yàn)的初始階段往往以腫瘤大小的縮減來(lái)衡量，即去掉的 腫瘤物質(zhì)的量。由于CSC構(gòu)成腫瘤的一個(gè)極小部分，且具有與其更為分化的子代顯著不同的 生物學(xué)特征，所以對(duì)腫瘤質(zhì)量的測(cè)量可能不一定能夠選擇出特異地作用于此干細(xì)胞的藥 物。事實(shí)上，癌干細(xì)胞呈現(xiàn)出放療(XRT)耐藥性，并且還呈化療劑和靶向藥物頑固性[3-5]。 正常的體干細(xì)胞天然地對(duì)化療劑具有耐藥性一一他們具有將藥物栗出的多種栗(例如MDR) 以及DNA修復(fù)蛋白質(zhì)。而且，他們還具有緩慢的細(xì)胞更新速率，而化療劑靶向快速?gòu)?fù)制的細(xì) 胞。癌干細(xì)胞為正常干細(xì)胞的突變對(duì)應(yīng)物，可能也具有類似的機(jī)制使之幸免于藥物治療和 放射治療。換言之，傳統(tǒng)的化療法和放療法殺死分化了的或分化中的細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成腫 瘤的大部分，不能產(chǎn)生新的高致瘤性癌干細(xì)胞。另一方面，產(chǎn)生所述分化了的或分化中的細(xì) 胞的癌干細(xì)胞群可能保持原樣并引起疾病復(fù)發(fā)。傳統(tǒng)抗癌療法的另一危險(xiǎn)在于化療可能 導(dǎo)致僅僅留下耐受化療的癌干細(xì)胞，由此使得繼發(fā)的復(fù)發(fā)性腫瘤很可能也是化療耐受的。
[0009] 由于存活的癌干細(xì)胞能夠使腫瘤重新建殖故而造成復(fù)發(fā)，所以在抗癌療法中納入 抗CSC策略是絕對(duì)必要的（見圖1)。這就類似于斬草需除根[6]。通過選擇性地靶向癌干細(xì) 胞，可以治療患有侵襲性不可切除腫瘤和頑固性或復(fù)發(fā)性癌癥的患者，以及防止腫瘤轉(zhuǎn)移 和復(fù)發(fā)。開發(fā)靶向癌干細(xì)胞的特異性療法可以改善癌癥患者、尤其是轉(zhuǎn)移性癌癥受害者的 存活和生活質(zhì)量。開啟這股未被利用的潛力的關(guān)鍵在于鑒定和驗(yàn)證對(duì)于癌干細(xì)胞自我更新 和存活具有選擇的重要性的通路。不幸的是，雖然在過去已闡述過位于癌癥的腫瘤發(fā)生或 者胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的自我更新背后的多個(gè)通路，但是尚未鑒定和驗(yàn)證用于癌干細(xì) 胞自我更新和存活的通路。
[0010] 也有許多鑒定和分離癌干細(xì)胞的研究。所用的方法主要是利用CSC外排藥物的能 力，或是基于癌干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志的表達(dá)。
[0011] 例如，由于CSC對(duì)許多化療劑具有耐藥性，那么CSC幾乎普遍地過表達(dá)藥物外排栗 如ABCG2 (BCRP-I)[ 7-11 ]及其他ATP結(jié)合盒(ABC)超家族成員[12，13 ]，就不足為奇。從而，也 采用最初用來(lái)富集造血和白血病干細(xì)胞的側(cè)群（side population,SP)技術(shù)來(lái)鑒定和分離 CSC[14]。這種技術(shù)首先由Goodell等人描述，利用熒光染料如Hoechst 33342的差異性ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴性外排來(lái)確定和分離富含CSC的細(xì)胞群[10,15]。具體而言，通過用戊脈安 (verapamil)阻斷藥物外排來(lái)揭示該SP，此時(shí)染料不再能夠栗出該SP。
[0012] 研究人員還集中于尋找使癌干細(xì)胞區(qū)別于大部分腫瘤的特異性標(biāo)志。癌干細(xì)胞最 常表達(dá)的表面標(biāo)志包括⑶44、CD133和⑶166[16-22]。通過主要基于這些表面標(biāo)志的差異表 達(dá)來(lái)分選腫瘤細(xì)胞，已經(jīng)導(dǎo)致了迄今描述的高致瘤性CSC的大多數(shù)。因此，對(duì)于從癌細(xì)胞系 和大塊腫瘤組織中鑒定和分離癌干細(xì)胞而言，這些表面標(biāo)志是被充分驗(yàn)證了的。
[0013] Stat3 通路
[0014]哺乳動(dòng)物或人癌細(xì)胞中有許多不同的遺傳缺陷，且有許多已被研究以尋求治愈癌 癥。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P53腫瘤阻遏蛋白在半數(shù)以上的人類癌癥中是缺陷型的或者全然無(wú)存。 STAT(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子)蛋白家族是潛伏的轉(zhuǎn)錄因子，響應(yīng)細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子而 被激活以促進(jìn)增殖、存活及其他生物過程。其中，Stat3通過由生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶、 Janus激酶或Src家族激酶等介導(dǎo)的關(guān)鍵酪氨酸殘基磷酸化而激活。這些激酶包括但不限于 EGFR、JAK、Abl、KDR、c-Met、Src和Her2[23]。一旦酪氨酸磷酸化，Stat3形成同源二聚體，轉(zhuǎn) 位至細(xì)胞核，結(jié)合祀基因啟動(dòng)子區(qū)中的特異性DNA效應(yīng)元件，誘導(dǎo)基因表達(dá)[24]。
[0015]在正常細(xì)胞中，Stat3激活是瞬時(shí)的，受到嚴(yán)密的調(diào)控，持續(xù)30分鐘至數(shù)小時(shí)。然 而，發(fā)現(xiàn)Stat3在廣泛種類的人類癌癥(包括所有主要的癌癥以及一些血液腫瘤）中異常激 活。Stat3在癌癥進(jìn)展中起多種作用。作為一種有力的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它靶向參與許多重要 細(xì)胞功能的基因，例如Bcl-xl、 C-MyC、細(xì)胞周期蛋白Dl、Vegf、MMP-2和生存素[25-30]。它也 是腫瘤免疫監(jiān)視和免疫細(xì)胞募集的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[31-33]。
[0016] 通過反義、SiRNA、顯性失活形式的Stat3和/或阻斷酪氨酸激酶，消除Stat3信號(hào)傳 遞，在體外和/或體內(nèi)可以抑制某些癌細(xì)胞系或腫瘤[24，26,34，35]。但是尚未經(jīng)驗(yàn)性地提 出Stat3和癌干細(xì)胞功能之間的清楚關(guān)聯(lián)。研究人員也尚未發(fā)現(xiàn)有效的Stat3通路抑制劑以 開發(fā)針對(duì)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有癌干細(xì)胞的癌癥的潛在治療應(yīng)用。如早先所說(shuō)明的那樣，最近已經(jīng) 證明癌干細(xì)胞(CSC)根本性地負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，故而在設(shè)計(jì)靶向已知具有這些細(xì) 胞的腫瘤的任何治愈性療法時(shí)，不論CSC可能占該腫瘤物質(zhì)的多小比例，都應(yīng)將其考慮在 內(nèi)。
[0017] 在除癌癥以外的疾病中，已經(jīng)在許多自身免疫疾病和炎性疾病中證明了白介素6 (IL6)對(duì)Stat3的過度激活[36]。最近已經(jīng)揭示，Stat3通路還通過其在產(chǎn)生TH17 T細(xì)胞應(yīng)答 中的基本作用而促進(jìn)病理性免疫反應(yīng)[37]。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL6-Stat3通路介導(dǎo)的炎癥是動(dòng) 脈粥樣硬化、外周血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、高血壓、骨質(zhì)疏松癥、2型糖尿病和癡呆的共同 病因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明部分地基于本文提供的如下經(jīng)驗(yàn)性證據(jù)，即Stat3在廣譜癌癥中對(duì)癌干細(xì) 胞(CSC)的存活和自我更新能力均起著關(guān)鍵作用。從而，本發(fā)明的第一方面涉及抑制癌干細(xì) 胞的方法，其中該方法包括通過Stat3通路抑制劑抑制癌干細(xì)胞中的至少一些、大多數(shù)、或 基本上所有（例如30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 % )的Stat3通路活性。該方 法抑制CSC自我更新、或殺死CSC。該方法可在體外實(shí)施、或體內(nèi)實(shí)施以治療癌癥，尤其是具 有CSC和具有異常（例如過度激活）的Stat3通路活性的癌癥。這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可通過學(xué)院知識(shí) (即患者的癌癥屬于已知具有CSC和異常Stat3通路活性的類型）來(lái)滿足，或者可例如通過對(duì) 活檢組織進(jìn)行檢驗(yàn)而由個(gè)體患者確認(rèn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，CSC已知或被確認(rèn)具有異常 Stat3通路活性。
[0019] 目前已知既具有CSC又具有異常Stat3通路活性的癌癥包括但不限于：乳腺癌、頭 頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、肉瘤、肝癌、腦瘤、多發(fā)性骨髓 瘤和白血病。還發(fā)現(xiàn)這些癌癥的轉(zhuǎn)移形式中有許多既具有CSC又具有異常Stat3通路活性， 例如轉(zhuǎn)移性乳腺癌。在一個(gè)特征中，可實(shí)施本發(fā)明的方法以治療選自該組的癌癥。在一個(gè)實(shí) 施方案中，可實(shí)施本發(fā)明的方法以治療選自如下的癌癥:肺癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、 肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌。
[0020] 此外，由于已經(jīng)證明CSC根本性地負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生、癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)，所以可實(shí) 施本發(fā)明的方法以治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、固有地抵抗化療的、或在初始治療 后在受試者體內(nèi)復(fù)發(fā)的癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，Stat3通路抑制劑是分離的、純化的或合 成的，并且可選自下組：小分子Stat3抑制劑、針對(duì)Stat3的RNAi藥劑、針對(duì)Stat3的反義藥 劑、肽模擬物Stat3抑制劑和G四聯(lián)體寡聚脫氧核苷酸Stat3抑制劑。抑制機(jī)制可選自：基本 上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核轉(zhuǎn) 位(nuclear translocation)、基本上抑制Stat3蛋白的DNA結(jié)合活性、和基本上抑制Stat3 蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。
[0021 ]在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是選自下組的化合物:2-(1-羥乙基)_萘并[2，3-b]呋 喃-4,9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b] 呋喃-4，9-二酮、2-乙?；敛2，3-b ]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b ]呋喃-4，9-二 酮、磷酸單-[1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸 1-(4,9-二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其對(duì)映異構(gòu) 體、非對(duì)映異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、鹽或溶劑化物(下文稱作"本發(fā)明化合物"）。
[0022]第二方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞中的細(xì)胞Stat3通路活性的方法。該方法包括向 細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明化合物，從而降低細(xì)胞中至少不期望的Stat3通路活性，例如降低 至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是CSC， 或者是癌細(xì)胞。該方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或抑制細(xì)胞的自我更新。該方法可在體外或體內(nèi) 實(shí)施。
[0023]第三方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者的異常Stat3通路活性相關(guān)紊亂的方 法，該方法包括向受試者施用治療有效量的、包含本發(fā)明化合物的藥物組合物，從而降低至 少異常Stat3通路活性。在一個(gè)特征中，異常Stat3通路活性可通過磷酸化Stat3的表達(dá)或 Stat3磷酸化的替代性(surrogate)上游或下游調(diào)控因子的表達(dá)來(lái)鑒定。紊亂可為癌癥。在 一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥已知具有異常Stat3通路活性，并且包括但不限于：乳腺癌、頭頸部 癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、肉瘤、 腦瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。紊亂還可以是已知與異常Stat3通路活性相關(guān) 的非癌癥病情，并且在一個(gè)實(shí)施方案中選自：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎癥性腸道疾病、 關(guān)節(jié)炎、自身免疫性脫髓鞘病、阿爾茨海默病、中風(fēng)、缺血再灌注損傷和多發(fā)性硬化癥。 [0024]第四方面，本發(fā)明提供了治療患者的方法，并且包括步驟:通過異常Stat3通路活 性鑒定患者以及向患者施用治療有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過異常 Stat3通路活性來(lái)鑒定患者的步驟包括檢驗(yàn)磷酸化Stat3的表達(dá)或Stat3磷酸化的替代性上 游或下游調(diào)控因子的表達(dá)。通過異常Stat3通路活性鑒定患者的步驟可以包括檢驗(yàn)取自患 者的患病組織或液體，其可以是腫瘤的一部分。
[0025]第五方面，本發(fā)明提供了治療患者的方法，包括鑒定診斷患有異常Stat3通路活性 相關(guān)紊亂的患者以及向患者施用治療有效量的本發(fā)明化合物的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中， 鑒定患者的步驟包括檢查至少一種在患者中指示該紊亂的生物標(biāo)志。
[0026]第六方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括至少一種用于診斷異常Stat3通路活性相 關(guān)紊亂的試劑(其可檢查指示紊亂存在的生物標(biāo)志），和治療有效量的本發(fā)明化合物。
[0027]第七方面，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括至少一種用于診斷異常Stat3通路活性的 試劑，和治療有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑檢查磷酸化Stat3的表 達(dá)或Stat3磷酸化的替代性上游或下游調(diào)控因子的表達(dá)。
[0028]第八方面，本發(fā)明提供了抑制一種或多種癌干細(xì)胞的方法。該方法包括向癌干細(xì) 胞施用有效量的本發(fā)明化合物。該方法可在體外實(shí)施或在體內(nèi)實(shí)施以治療受試者癌癥。在 一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥已知具有CSC，并且包括但不限于:乳腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、 胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腦瘤、肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和 白血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥是轉(zhuǎn)移性的。在另一實(shí)施方案中，癌癥是化療或放療頑固 性的。例如，癌癥可固有地抵抗化療。而在另一實(shí)施方案中，癌癥經(jīng)初始治療后在受試者復(fù) 發(fā)。
[0029] 第九方面，本發(fā)明提供了鑒定能夠抑制癌干細(xì)胞的候選藥物的方法，該方法包括 篩選抑制Stat3通路活性的候選藥物。候選藥物在一個(gè)實(shí)施方案中能夠在癌干細(xì)胞中誘導(dǎo) 細(xì)胞死亡，而在另一個(gè)實(shí)施方案中能夠抑制CSC的自我更新。在多個(gè)實(shí)施方案中，候選藥物 是小分子Stat3抑制劑、針對(duì)Stat3的RNAi藥劑、針對(duì)Stat3的反義藥劑、肽模擬物Stat3抑制 劑、或G四聯(lián)體寡聚脫氧核苷酸Stat3抑制劑。候選藥物可以具有選自如下的能力:基本上抑 制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核轉(zhuǎn)位、 基本上抑制Stat3蛋白的DNA結(jié)合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。
[0030] 第十方面，本發(fā)明提供了治療受試者中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療具頑固性的癌癥的方法，該方 法包括向受試者施用治療有效量的、包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。標(biāo)準(zhǔn)治療可為例如 化療、放療和/或手術(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥固有地抵抗化療。
[0031] 第十一方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者癌癥復(fù)發(fā)的方法，該方法包括向受 試者施用治療有效量的、包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物 作為手術(shù)后的輔助治療施用。
[0032] 第十二方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者癌癥轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括向受 試者施用治療有效量的、包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物 作為手術(shù)后的輔助治療施用。
[0033] 第十三方面，本發(fā)明提供了選擇性地靶向受試者癌細(xì)胞以例如治療惡性疾病的方 法，該方法包括向受試者施用包含本發(fā)明化合物的藥物組合物，使每劑量后受試者血漿中 的化合物濃度維持在臨界濃度之上不超過24小時(shí)，由此選擇性地殺死癌細(xì)胞而基本上不傷 害正常細(xì)胞?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的方法，在每劑量后化合物血漿濃度在特定時(shí)間點(diǎn)（例如 12、16、20或24小時(shí))不超過臨界濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用藥物組合物，使每劑量后受 試者血漿中的化合物濃度維持在臨界濃度之上(例如，持續(xù)地維持)不超過選自下組的持續(xù) 時(shí)間：12、16和20小時(shí)。在多個(gè)實(shí)施方案中，臨界濃度為約100μΜ、約50μΜ、約30μΜ、或約20μΜ。 在一個(gè)實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是選自下組或其任何亞組的癌癥的一部分:肝癌、頭頸部癌、胰 腺癌、胃癌、腎癌、肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、白血病、淋巴瘤、食道癌、腦瘤、神經(jīng) 膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、膽管癌、骨癌、眼癌(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤）、膽囊癌、垂 體癌、直腸癌、涎腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、宮 頸癌、白血病、黑素瘤、口腔上皮癌(oral epithermoid)、角質(zhì)形成細(xì)胞癌和皮膚癌。在另一 實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是選自下組的癌癥的一部分:肺癌、乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移類型）、宮頸癌、結(jié) 直腸癌、肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌。
[0034] 第十四方面，本發(fā)明提供了治療受試者癌癥的方法，該方法包括向受試者施用治 療有效量的、包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。可應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明該方面的方法來(lái)治療與 就本發(fā)明之前各方面描述的癌癥類似的癌癥。在一個(gè)特征中，治療的受試者是哺乳動(dòng)物， 例如人類。
[0035] 第十五方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明化合物和可藥用的賦形劑、 載體或稀釋劑，其中本發(fā)明化合物為選自下組的化合物:2-(1-羥乙基)_萘并[2,3_b]呋喃- 4，9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b]呋 喃-4，9-二酮、2-乙?；敛2，3-b ]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b ]呋喃-4，9-二酮、 磷酸單-[1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其可藥用鹽或 溶劑化物。在一個(gè)特征中，組合物適合于口服、經(jīng)鼻、局部、直腸、陰道或胃腸外施用，或靜脈 內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射。
[0036]第十六方面，本發(fā)明還提供了制備一些本發(fā)明化合物的方法。該方法通過使通式 4-4的化合物
[0037
[0038] 在堿和氧化劑的存在下在溶劑中與酮反應(yīng)來(lái)制備通式4-6的化合物：
[0039]
[0040] 其中Ri是H、C1或F。氧化劑可為例如02、Br2或CBrCl3。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在開 放式(open air)容器中進(jìn)行。在一個(gè)特征中，該方法的所有步驟在一個(gè)罐中、即在同一容器 中進(jìn)行。在多個(gè)例示性的實(shí)施方案中，溶劑可以是四氫呋喃(THF)、二噁烷、或甲苯，而堿可 以是1，8_二氮雜雙環(huán)[5.4.0]^碳-7-烯(DBU)、三乙胺或二異丙基乙胺。
[0041 ] 在h沭方法的一個(gè)實(shí)施方案中，酮是通式4-3的化合物：
[0042:
[0043] 上述方法可進(jìn)一步包括如下步驟：
[0044] 使通式4-1的化合物
[0045]
[0046] 在有或無(wú)溶劑的情況下與溴化物反應(yīng)以產(chǎn)生通式4-2的化合物：
[0047]

[0048] 隨后，使通式4-2的化合物在溶劑中在堿的存在下進(jìn)行反應(yīng)以產(chǎn)生通式4-3的化合 物：
[0049]
[0050] 第十七方面，本發(fā)明提供了具有式磷酸單-[1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a_四氫-萘 并[2,3-b]呋喃-2-基)_乙烯基]酯的化合物。
[0051] 第十八方面，本發(fā)明提供了具有式磷酸1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a_四氫-萘并[2， 3_b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯的化合物。
[0052]第十九方面，本發(fā)明提供了制備化合物磷酸單_[ 1-(4，9-二氧代_3a，4，9，9a_四 氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯的方法，該方法包括使化合物2-乙?；敛2,3-b]呋喃-4,9-二酮與選自下組的溶液反應(yīng):雙(三甲基甲硅烷基)氨基鋰、雙(三甲基甲硅烷 基)氨基鈉和雙(三甲基甲硅烷基)氨基鉀，接著添加氯磷酸二甲酯溶液。該方法可以進(jìn)一步 包括純化由反應(yīng)獲得的粗產(chǎn)物:將產(chǎn)物溶解在CH 2Cl2中，用飽和NH4CL和水洗滌，用MgSO2干 燥，隨后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行柱層析。
[0053]第二十方面，本發(fā)明提供了制備化合物磷酸1- (4，9-二氧代_3a，4，9，9a_四氫-萘 并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯的方法，該方法包括使化合物磷酸單-[1-(4,9_二 氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯與三甲基甲硅烷基溴化物反 應(yīng)。該方法可進(jìn)一步包括通過半制備性HPLC來(lái)純化由反應(yīng)獲得的粗產(chǎn)物。
[0054]本發(fā)明的其他方面和實(shí)施方案在如下發(fā)明詳述中闡釋，或?qū)?huì)因其變得顯而易 見。
【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1圖示了癌干細(xì)胞特異性癌癥療法和傳統(tǒng)癌癥療法之間的差異。
[0056] 圖2顯示了癌中的Stat3通路。
[0057] 圖3A顯示了 Stat3在Hoechst側(cè)群細(xì)胞中組成型地激活。
[0058] 圖38顯示了3七&七3在0)133+細(xì)胞中組成型地激活。
[0059] 圖4A和4B顯示了癌干細(xì)胞中的Stat3敲低(knockdown)誘導(dǎo)凋亡。
[0060]圖5顯示了癌干細(xì)胞中的Stat3敲低抑制癌干細(xì)胞球體形成。
[00611圖6顯示了化合物401抑制Stat3的轉(zhuǎn)錄激活活性。
[0062]圖7A顯示了化合物401抑制核提取物中Stat 3的DNA結(jié)合活性。
[0063] 圖7B顯示了化合物401、416和418抑制核提取物中3七&七3的0嫩結(jié)合活性。
[0064] 圖8A顯示了化合物401抑制異種移植腫瘤組織中Stat3的DNA結(jié)合活性。
[0065] 圖8B顯示了化合物401抑制異種移植腫瘤組織中Stat3的下游效應(yīng)子的表達(dá)水平。
[0066] 圖9A顯示了Hoechst側(cè)群的分選和分析。
[0067] 圖9B顯示了Hoechst側(cè)群對(duì)化合物401與非側(cè)群一樣敏感。
[0068] 圖IOA顯示了化合物401使Hoechst側(cè)群細(xì)胞凋亡。
[0069] 圖IOB顯示了化合物401使CD133+細(xì)胞凋亡。
[0070] 圖11顯示了化合物401阻斷⑶44high球體形成。
[0071]圖12顯示了體內(nèi)化合物401處理降低異種移植腫瘤細(xì)胞的球體形成。
[0072] 圖13顯示了化合物401在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
[0073]圖14顯示了化合物401在人胰腺癌異種移植物模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性，且與標(biāo) 準(zhǔn)化療行為不同一一其消除腫瘤反彈。
[0074]圖15顯示了化合物401在人頭頸部癌異種移植模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0075]圖16顯示了化合物401在人乳腺癌異種移植模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0076]圖17顯示了化合物401在人前列腺癌異種移植模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0077]圖18顯示了化合物401在人胃癌異種移植模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0078]圖19顯示了化合物401在人肝癌異種移植模型中呈現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0079] 圖20顯示了化合物401在ISMS模型中抑制轉(zhuǎn)移。
[0080]圖21顯示了化合物401在大鼠中的藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
【具體實(shí)施方式】
[0081] 如本文所用，單數(shù)形式的"一"、"一個(gè)"和"該"包括復(fù)數(shù)引述，除非上下文另有清楚 說(shuō)明。例如，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。
[0082] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"分離的"或"純化的"是指物質(zhì)實(shí)質(zhì)上或基本上不含在其天然 狀態(tài)下與其正常相伴的成分。純度和均質(zhì)性一般可以利用分析化學(xué)技術(shù)來(lái)確定，例如聚丙 烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。
[0083]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"癌干細(xì)胞"和"CSC"可互換。CSC是哺乳動(dòng)物的，并且在優(yōu)選的實(shí) 施方案中，這些CSC是人類來(lái)源的，但它們并非旨在限于此。癌干細(xì)胞定義為、并在功能上表 征為:源于實(shí)體瘤的細(xì)胞群，其：（1)具有廣泛的增殖能力；2)能夠進(jìn)行不對(duì)稱細(xì)胞分裂，生 成一種或多種類型具有減小的增殖或發(fā)育潛力的分化子代;和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱細(xì)胞分裂 以自我更新或自我維持。其他表征CSC的常見方法包括形態(tài)學(xué)和檢查細(xì)胞表面標(biāo)志、轉(zhuǎn)錄 譜、和藥物反應(yīng)。CSC在研究文獻(xiàn)中也稱作腫瘤/癌癥起始細(xì)胞、癌干細(xì)胞樣細(xì)胞、干細(xì)胞樣 癌細(xì)胞、高致瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、實(shí)體瘤干細(xì)胞、藥物存活細(xì)胞(DSC )、耐藥性細(xì)胞(DRC)或 超級(jí)惡性細(xì)胞。
[0084] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"自我更新"是指癌干細(xì)胞產(chǎn)生新的致瘤性癌干細(xì)胞以補(bǔ)充或 增加其數(shù)量的能力。
[0085] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌變的"是指或者描述的是，哺乳動(dòng)物中一群細(xì)胞以 失控的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的生理狀況。如本文所用的"癌細(xì)胞"和"腫瘤細(xì)胞"是指源于腫瘤的 總細(xì)胞群，既包括構(gòu)成腫瘤細(xì)胞群體的大部分的非腫瘤發(fā)生性細(xì)胞，又包括腫瘤發(fā)生性干 細(xì)胞(癌干細(xì)胞）。癌癥的實(shí)例包括但不限于:癌（carcinoma)、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白 血病。此類癌癥更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗 癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、 乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、涎腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲 狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸部癌。
[0086] 如本文所用的"腫瘤"是指由于過度細(xì)胞生長(zhǎng)或增值而產(chǎn)生的任何組織塊，或良性 (非癌變)或惡性的(癌變），包括癌前病變。
[0087] 如本文所用的"轉(zhuǎn)移"（metastasis)是指癌癥由起源位點(diǎn)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移到身體其他 區(qū)域、在新位置上形成類似的癌性病變的過程。"轉(zhuǎn)移性"或"轉(zhuǎn)移"細(xì)胞是喪失與鄰近細(xì)胞 的粘附性接觸、并借助血流或淋巴由疾病的原發(fā)部位迀移而浸潤(rùn)?quán)徑眢w結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。
[0088] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"受試者"是指任何將作為特定治療的接受者的動(dòng)物(例如，哺乳 動(dòng)物），包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、嗤齒類動(dòng)物等。一般，術(shù)語(yǔ)"受試者"和"患者"就 人類受試者而言在本文可互換使用。
[0089] 如本文所用的諸如"治療"或"緩解"等術(shù)語(yǔ)既指1)治愈、減緩、減輕所診斷病情 (condition)或紊亂的癥狀，和/或中斷其進(jìn)展的治療性措施，又指2)防止或減緩所靶向病 情或紊亂的發(fā)展的防范性或預(yù)防性措施。因而，需要治療的包括已經(jīng)患有紊亂的那些；易于 患有紊亂的那些；以及欲預(yù)防紊亂的那些。如果患者顯示出如下一種或多種狀況，則該受試 者被本發(fā)明的方法成功地"治療"：癌細(xì)胞數(shù)量的減小或完全不存在癌細(xì)胞;腫瘤大小的減 小;癌細(xì)胞向周圍器官的浸潤(rùn)、包括癌向軟組織和骨的擴(kuò)散，的抑制或不存在;腫瘤轉(zhuǎn)移的 抑制或不存在;腫瘤生長(zhǎng)的抑制或不存在;與具體癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀的減輕;減 小的發(fā)病率和死亡率;和生活質(zhì)量的提高。
[0090] 如本文所用，當(dāng)用在生物活性的語(yǔ)境中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"抑制"及其語(yǔ)法等同體是指生物 活性的下調(diào)，這可以減小或消除所靶向的功能，例如蛋白質(zhì)的生產(chǎn)或分子的磷酸化。在特別 的實(shí)施方案中，抑制可以指所靶向活性的約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或95%的減小。當(dāng)用于紊亂或疾病的語(yǔ)境中時(shí)，該術(shù)語(yǔ)是指成功地防止癥狀發(fā)作、緩解癥狀 或消除疾病、病情或紊亂。
[0091] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑"表示可藥用的材料、組合物 或媒介物，例如參與將主題藥物活性劑由一種器官或身體部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸至另一器官或身 體部分的液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。就與制劑中的其他成分相 容且對(duì)患者無(wú)害這一意義上，各載體必須是〃可接受的〃。能夠作為可藥用載體的材料的一 些實(shí)例包括:糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉;纖維素及其 衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素;黃芪膠粉;麥芽；明膠;滑石;賦形 劑，例如可可脂和栓劑蠟;油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆 油;甘醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯 和月桂酸乙酯;瓊脂;緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁;褐藻酸;無(wú)熱原水;等滲鹽水;林格 液;乙醇;磷酸鹽緩沖液；以及其他在藥學(xué)制劑中采用的無(wú)毒相容物質(zhì)。潤(rùn)濕劑、乳化劑和潤(rùn) 滑劑(例如十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂和聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物）、以及著色劑、釋 放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑和香料劑、防腐劑和抗氧化劑也可存在于組合物中。
[0092] 本發(fā)明的化合物可以形成鹽，這也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文述及本發(fā)明的化合 物應(yīng)理解為包括述及其鹽，除非另有說(shuō)明。如本文所采用的術(shù)語(yǔ)"鹽"，表示與無(wú)機(jī)和/或有 機(jī)酸和堿形成的酸加成鹽和/或堿加成鹽。另外，當(dāng)本發(fā)明的化合物既含有堿性部分(例如 但不限于吡啶或咪唑）、又含有酸性部分（例如但不限于羧酸）時(shí)，可以形成兩性離子（"內(nèi) 鹽"），并包括在如本文所用的術(shù)語(yǔ)"鹽"中。優(yōu)選可藥用的（即，無(wú)毒、生理上可接受的）鹽， 不過其他鹽也是有用的，例如用于制備期間可能采用的分離或純化步驟中。本發(fā)明化合物 的鹽可以，例如，通過使化合物I、II或III與一定量(例如等量）的酸或堿在介質(zhì)（例如鹽在 其中沉淀的介質(zhì)或在水性介質(zhì)）中反應(yīng)并之后凍干而形成。
[0093]本文也考慮本發(fā)明化合物的溶劑化物。本發(fā)明化合物的溶劑化物包括例如水合 物。
[0094]最近的研究已經(jīng)揭示了癌干細(xì)胞(CSC)的存在，其具有再生腫瘤的獨(dú)有能力。CSC 存在于幾乎所有腫瘤類型中，且功能性地與持續(xù)的惡性生長(zhǎng)、癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和癌癥藥物耐 性關(guān)聯(lián)。CSC與其更為分化的子代看起來(lái)具有顯著不同的生物學(xué)特征。傳統(tǒng)癌癥藥物篩選依 賴于腫瘤物質(zhì)的量的測(cè)量，因此它們可能不一定選擇出特異性地作用于CSC的藥物。事實(shí) 上，已經(jīng)證明CSC對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化療和放療具有抵抗性，且在標(biāo)準(zhǔn)抗癌治療后變得富集，這導(dǎo)致癌 癥的頑固性和復(fù)發(fā)。分離這些細(xì)胞的方法包括但不限于，通過其外排Hoechst 33342的能力 來(lái)鑒定，通過這些細(xì)胞表達(dá)的表面標(biāo)志如⑶133、⑶44、CD166等來(lái)鑒定，以及通過其腫瘤發(fā) 生特性來(lái)富集。將癌干細(xì)胞與腫瘤發(fā)生關(guān)聯(lián)起來(lái)的支持性證據(jù)開啟了靶向癌干細(xì)胞的巨大 治療良機(jī)。
[0095]開啟這股未被利用的潛力的關(guān)鍵在于鑒定和驗(yàn)證對(duì)于CSC自我更新和存活具有選 擇性重要性的通路。雖然在過去已闡述過位于癌癥的腫瘤發(fā)生或者胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì) 胞的自我更新背后的多個(gè)通路，但是尚未鑒定和驗(yàn)證用于癌干細(xì)胞自我更新和存活的通 路。
[0096]本發(fā)明提供了 Stat3通路活性對(duì)于CSC的存活和自我更新均至關(guān)重要的證據(jù)(實(shí)施 例1)。本發(fā)明還提供了為Stat3通路活性的有效抑制劑的化合物(實(shí)施例2)。本發(fā)明還提供 了這些Stat3抑制劑確實(shí)抑制CSC的自我更新并對(duì)CSC具有凋亡作用的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)(實(shí) 施例3)。本發(fā)明還表明這些化合物能夠在體外選擇性地殺死廣譜的癌細(xì)胞(實(shí)施例4)，且在 體內(nèi)抑制類似廣泛范圍的癌癥(實(shí)施例5)。此外，本發(fā)明經(jīng)驗(yàn)性地確證了Stat3抑制劑對(duì)轉(zhuǎn) 移性癌癥的功效(實(shí)施例6)。而且，本發(fā)明經(jīng)驗(yàn)性地確認(rèn)了這些化合物能夠達(dá)到期望的PK 暴露以在體內(nèi)選擇性地殺死癌細(xì)胞(實(shí)施例7)。
[0097]本文提供的數(shù)據(jù)，結(jié)合CSC研究方面最近的突破，使得本發(fā)明可以提供一系列旨在 抑制CSC、或者治療具有CSC的特定癌癥或治療一般癌癥的方法。本文還提供了抑制細(xì)胞中 的Stat3通路活性、或治療異常Stat3通路活性相關(guān)紊亂(癌的及非癌的）的方法。本發(fā)明還 提供了相關(guān)的方法(例如，生產(chǎn)和候選藥物篩選）、材料、組合物和試劑盒。
[0098]隨著發(fā)現(xiàn)下調(diào)或阻斷Stat3通路既抑制CSC的自我更新又抑制其存活(實(shí)施例1)， 本發(fā)明提供了抑制癌干細(xì)胞的方法，其中通過Stat3通路抑制劑抑制CSC中的至少一些 Stat3通路活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制大多數(shù)，即50%以上，的Stat3通路活性。在另一實(shí) 施方案中，抑制基本上所有的Stat3通路活性。該方法能夠阻止CSC自我更新，使其不再能夠 通過分裂成致瘤性CSC細(xì)胞而補(bǔ)充其數(shù)量?；蛘咴摲椒軌蛟贑SC中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0099]該方法能夠用來(lái)治療受試者癌癥。已知具有CSC和異常(例如過度激活或組成型激 活的）Stat3通路活性的癌癥是此類治療的良好候選者，并且包括但不限于:乳腺癌、頭頸部 癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、肉瘤、 腦瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。在一實(shí)施方案中，該方法用來(lái)治療肝癌、頭頸 部癌、胰腺癌和/或胃癌。在另一實(shí)施方案中，該方法用來(lái)治療多發(fā)性骨髓瘤、腦瘤和肉瘤。 [0100]此外，由于已經(jīng)證明esc根本性地負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生、癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)，所以可實(shí) 施涉及抑制CSC的任何本發(fā)明方法以治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、或經(jīng)初始治療后 在受試者體內(nèi)復(fù)發(fā)的癌癥。
[0101] 在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是分離的、純化的或合成的，并且可選自：小分子Stat3 抑制劑、針對(duì)Stat3的RNAi藥劑、針對(duì)Stat3的反義藥劑、肽模擬物Stat3抑制劑、和G四聯(lián)體 寡聚脫氧核苷酸Stat3抑制劑。抑制劑也可以從天然產(chǎn)物分離或純化。
[0102] 可選擇抑制機(jī)制以靶向Stat3通路中的任何步驟。例如，抑制劑可基本上抑制 Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核轉(zhuǎn)位、基 本上抑制Stat3蛋白的DNA結(jié)合活性、和/或基本上抑制Stat3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性?？蛇x地， Stat3通路抑制劑可以抑制Stat3通路中的一個(gè)或多個(gè)上游或下游組分。
[0103] Stat3通路可響應(yīng)細(xì)胞因子（如IL-6)或被一系列酪氨酸激酶（如EGFR、JAK、Abl、 KDR、c-Me t、Sr c和Her 2)激活。Stat 3的下游效應(yīng)子包括但不限于Be 1 -χ I、c-My c、細(xì)胞周期蛋 白DUVegf、MMP-2和生存素（圖2)。發(fā)現(xiàn)Stat3通路在廣泛種類的人類疾病中異常激活，如表 1所示。所研究的既有臨床樣品顯示，持久激活的Stat3通路存在于一半以上的乳腺癌和肺 癌、肝細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤中，以及95%以上的頭頸部癌中。也已經(jīng)在許多自身免疫病和 炎性疾病中證實(shí)激活的Stat3。而且，由于細(xì)胞因子如白介素6(IL6)介導(dǎo)的炎癥是動(dòng)脈粥樣 硬化[38]、外周血管疾病[39,40]、冠狀動(dòng)脈疾病[39,40]、高血壓[41]、骨質(zhì)疏松癥[42]、2 型糖尿病[39]和癡呆[43]的共同病因，而gpl30-Jaks-Stats是IL-6激活的主要通路，所以 抑制Stat3通路也可以預(yù)防這些疾病。
[0104] 表1.人類疾病中STAT3通路的激活
[0106]在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的Stat3抑制劑是:2-(1-羥乙基)-萘并[2,3-b]呋 喃-4,9-二酮、2-乙?；?7-氯-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙?；?7-氟-萘并[2,3-b] 呋喃-4,9-二酮、2-乙?；敛2,3-b]呋喃-4,9-二酮、2-乙基-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二 酮、磷酸單-[1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸 1-(4,9-二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其對(duì)映異構(gòu) 體、非對(duì)映異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、鹽或溶劑化物（"本發(fā)明化合物"）（實(shí)施例2)。本發(fā)明還提供 了本發(fā)明化合物抑制CSC的自我更新和在CSC中誘導(dǎo)凋亡的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)(實(shí)施例3)。
[0107] 由于已經(jīng)提供了下調(diào)Stat3通路抑制CSC的證據(jù)，本發(fā)明提供了鑒定能夠抑制癌干 細(xì)胞的候選藥物的方法。該方法包括篩選抑制Stat3通路活性的候選藥物。在多個(gè)實(shí)施方案 中，候選藥物是小分子Stat3抑制劑、針對(duì)Stat3的RNAi藥劑、針對(duì)Stat3的反義藥劑、肽模擬 物Stat3抑制劑、或G四聯(lián)體寡聚脫氧核苷酸Stat3抑制劑。
[0108] 在一個(gè)實(shí)施方案中，候選藥物能夠在CSC中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或至少抑制其自我更新。 可靶向通路中的各階段，以篩選候選藥物。例如，該方法的多個(gè)實(shí)施方案可篩選基本上抑制 Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核轉(zhuǎn)位、基 本上抑制Stat3蛋白的DNA結(jié)合活性、或基本上抑制Stat3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性的候選藥物。
[0109] 如下文實(shí)施例2所示，本發(fā)明的化合物可以在體外抑制Stat3轉(zhuǎn)錄活性和Stat3 DNA結(jié)合活性。實(shí)施例2還顯示，本發(fā)明的化合物可以在體內(nèi)既抑制Stat3下游效應(yīng)子(例如 細(xì)胞周期蛋白Dl和生存素）的表達(dá)，又抑制Stat3 DNA結(jié)合活性。
[0110]從而，另一方面，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞Stat3通路活性的方法，其中施用有效量 的本發(fā)明化合物。另一方面，本發(fā)明的化合物可用來(lái)配制藥物組合物以治療或預(yù)防異常 Stat3通路活性相關(guān)紊亂或病情。在本文中一種紊亂被視為與異常Stat3通路活性"相關(guān)"， 條件是患有該紊亂(其可為該類紊亂的一個(gè)亞型）的患者典型地在其至少一些細(xì)胞中具有 異常Stat3通路活性(這可以但并不必貢獻(xiàn)于該紊亂的病理）。一些已知與異常Stat3通路活 性相關(guān)的紊亂包括但不限于：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎癥性腸道疾病、關(guān)節(jié)炎、自身 免疫性脫髓鞘病、阿爾茨海默病、中風(fēng)、缺血再灌注損傷和多發(fā)性硬化癥。一些已知與異常 Stat3通路活性相關(guān)的紊亂是癌癥，并且包括但不限于：多種類型的乳腺癌、頭頸部癌、肺 癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、宮頸癌、肉瘤、腦瘤、 胃癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。
[0111] 與本發(fā)明該方面相關(guān)，提供了試劑盒，其包括一種或多種用于診斷異常stat3通路 活性相關(guān)紊亂的試劑，和治療有效量的本發(fā)明化合物或其他有效的Stat3通路抑制劑。診斷 劑取決于該疑似紊亂可為任何適宜的試劑，并且可以包括抽取血液、獲取活檢樣品、篩選生 物分子(例如抗原或抗體)或從樣品提取遺傳信息所需的試劑。試劑可以包括溶劑、去污劑、 抗凝血?jiǎng)⒖乖?、抗體、酶、PCR引物等等。
[0112] 無(wú)論患者是否診斷為患有已知牽涉異常Stat3活性的紊亂，醫(yī)師總是能夠開囑化 驗(yàn)單以查看取自患者的活檢樣品中是否存在異常Stat3活性。因此，提供了試劑盒，其包括： 一種或多種診斷異常Stat3通路活性的試劑，和治療有效量的本發(fā)明化合物或其他有效的 Stat3通路抑制劑。在一個(gè)特征中，異常Stat3通路活性可通過任何適宜的分析手段檢查任 何此類活性的指標(biāo)來(lái)鑒定，例如檢查磷酸化Stat3的表達(dá)（水平、持續(xù)時(shí)間等）或替代性 Stat3磷酸化上游或下游調(diào)控因子的表達(dá)(水平、持續(xù)時(shí)間等）。與前面描述的試劑盒類似， 取決于化驗(yàn)所著眼的異常Stat3通路活性的指標(biāo)，診斷試劑可為任何適宜的試劑。
[0113] 如下文實(shí)施例3所示，本發(fā)明的化合物，至少是Stat3通路抑制劑，殺死癌干細(xì)胞。 實(shí)施例3還證明，本發(fā)明的化合物還在體外和體內(nèi)抑制CSC球體形成，成功抑制CSC自我更新 的一個(gè)指標(biāo)。
[0114] 從而一方面本發(fā)明提供了抑制癌干細(xì)胞的方法，其中向細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明 化合物。已知具有CSC的癌癥是此類治療的良好候選者，并且包括但不限于：多種類型的乳 腺癌、頭頸部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、 腦瘤、肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和白血病。
[0115] 此外，由于已經(jīng)證明CSC根本性地負(fù)責(zé)腫瘤發(fā)生、癌癥轉(zhuǎn)移和癌癥復(fù)發(fā)，所以可實(shí) 施涉及抑制CSC的任何本發(fā)明方法以治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、或經(jīng)初始治療后 在受試者體內(nèi)復(fù)發(fā)的癌癥。下文實(shí)施例6專門檢驗(yàn)了本發(fā)明化合物的體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移功效，且數(shù) 據(jù)顯示，原發(fā)性腫瘤病灶和自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移的數(shù)目顯著減少。
[0116] 在下文實(shí)施例4中，顯示本發(fā)明的化合物不僅在廣譜癌細(xì)胞中造成凋亡，而且在其 細(xì)胞毒性方面呈現(xiàn)出選擇性，這對(duì)于開發(fā)低毒性治療劑至關(guān)重要。本文中，選擇性細(xì)胞毒性 是指化合物有些時(shí)候在某些條件下殺死癌細(xì)胞而基本上不傷害正常細(xì)胞的能力。正常細(xì)胞 通常是指健康的非腫瘤發(fā)生細(xì)胞。在候選藥物中導(dǎo)致選擇性細(xì)胞毒性的條件是難以預(yù)測(cè) 的，因?yàn)檫@需要有關(guān)細(xì)胞毒性潛在機(jī)制的知識(shí)。例如，降低靶向有絲分裂期間微管形成的抗 癌藥物的毒性，與阻斷細(xì)胞代謝過程的藥物相比，要研究完全不同的因素。造成選擇性毒性 的適宜條件需要平衡需要藥物有足夠毒性以有效殺死癌細(xì)胞而同時(shí)正常細(xì)胞又足夠耐受 的需求。例如，如果應(yīng)用較低的濃度，則往往意味著需要延長(zhǎng)輸注以殺死癌細(xì)胞。
[0117] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所生成的數(shù)據(jù)，包括實(shí)施例4所示的那些，看來(lái)如果患病細(xì)胞不 持續(xù)接觸臨界濃度的化合物超過一定的持續(xù)時(shí)間，則本發(fā)明的化合物能夠?qū)崿F(xiàn)選擇性細(xì)胞 毒性。在旨在選擇性殺死受試者體內(nèi)癌細(xì)胞的方法中，向受試者施用具有本發(fā)明化合物的 藥物組合物，使每劑量后受試者血漿中的化合物濃度維持在臨界濃度之上不超過24小時(shí)。 該方法可用來(lái)治療所有癌癥，包括任何本文所述的癌癥組別，以及用來(lái)治療Stat3相關(guān)紊亂 (其例示性清單已在上文提供，故而此處不再重復(fù)）?？蛇x地，持續(xù)時(shí)間可進(jìn)一步限于每劑量 后12、16和20小時(shí)。各化合物的臨界濃度可以變化不等。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，臨界 濃度約1 〇〇μΜ、約50μΜ、約30μΜ、或約20μΜ。
[0118] 在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所治療的癌癥選自下組:肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃 癌、腎癌、肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、白血病、淋巴瘤、食道癌、 腦瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌、膽管癌、骨癌、眼癌(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤）、 膽囊癌、垂體癌、直腸癌、涎腺癌和鼻咽癌。
[0119] -方面本發(fā)明提供了治療受試者癌癥的方法，其中向受試者施用治療有效量的、 包含本發(fā)明化合物的藥物組合物。癌癥可以是轉(zhuǎn)移性的。受試者可以是哺乳動(dòng)物，例如人 類。
[0120] 對(duì)于任何本文所述的治療受試者的方法，本發(fā)明提供有效劑量范圍、劑量頻率、和 化合物的血漿濃度。在多個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物以如下劑量施用：（a)約lmg/m 2至約5， 000mg/m2( I · V.)或約lmg/m2至約50，000mg/m2(P0); (b)約2mg/m2至約3，000mg/m2(I · V.)或約 1011^/1112至約50,00011^/1112(?0)。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可每隔一天(( >)20)、每天 (QD)或每天兩次(BID)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物口服施用，且不超過每天四次 (QID) 0
[0121] 在一個(gè)特征中，向受試者施用藥物組合物，從而受試者血漿中的化合物濃度在每 劑量后維持在臨界濃度之上不超過24小時(shí)（或12、16和20小時(shí)）。根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方 案，化合物血漿濃度在每劑量后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)（例如12、16、20或24小時(shí)）不超過臨界濃度， 作為避免非選擇性毒性的策略。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，臨界濃度為約1〇〇μΜ、約50μΜ、 約30μΜ、或約20μΜ。組合物在某些情況下是分離的、純化的或合成的。
[0122] 另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的化合物和可藥用的賦形劑、 載體或稀釋劑。在一個(gè)特征中，組合物適合于口服、經(jīng)鼻、局部、直腸、陰道或胃腸外施用，或 靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射。
[0123] 本發(fā)明的制劑包括適于口服、經(jīng)鼻、局部(包括口腔和舌下）、直腸、陰道和/或腸胃 外施用的那些。制劑可以便利地以單位劑型的形式提供，并且可以通過任何藥學(xué)領(lǐng)域公知 的方法制備?？膳c載體材料混合以生產(chǎn)單個(gè)劑型的活性成分的量將根據(jù)待治療的哺乳動(dòng)物 和具體的施用方式而變?？膳c載體材料混合以生產(chǎn)單個(gè)劑型的活性成分的量一般是產(chǎn)生治 療效果的化合物量。一般而言，在100%里面，該量的范圍是例如約1%至約99%活性成分、 約5%至約70%、約10%至約30%。
[0124] 適于口服施用的本發(fā)明的治療性組合物或制劑可以是膠囊劑、扁膠劑、丸劑、片 劑、錠劑(應(yīng)用香基，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠）、粉劑、顆粒劑的形式，或作為處于 水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑，或作為水包油型或油包水型液體乳劑，或作為酏 劑或糖衆(zhòng)劑，或作為錠劑(P a s t i 11 e s)(應(yīng)用惰性基，例如明膠和甘油，或鹿糖和阿拉伯樹 膠），和/或作為漱口劑等，分別含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物作為活性成分。本發(fā)明的化合物 還可以作為大丸劑、甜劑(electuary)或糊劑施用。
[0125] 在口服施用的本發(fā)明固體劑型（膠囊劑、片劑、丸劑、糖錠劑、粉劑、顆粒劑等）中， 本發(fā)明的化合物與一種或多種可藥用的載體(例如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣)和/或如下任一混 合:填充劑或充填劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸;粘合劑，例如羧甲基纖 維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠;保濕劑，例如甘油；崩解劑，例 如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽、碳酸鈉、和羧基乙酸淀粉 鈉;溶液遲延劑，例如石蠟;吸收加速劑，例如季銨化合物;潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘 油酯、和聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物;吸收劑，例如高嶺土和膨潤(rùn)土;潤(rùn)滑劑，例如滑石、 硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、及其混合物；以及著色劑。在膠囊劑、 片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。還可以采用相似類型的固體組合物 作為填料，使用賦形劑諸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，用于軟及硬明膠膠囊。
[0126] 口服施用本發(fā)明化合物的液體劑型包括可藥用的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、 糖漿劑和酏劑。除了活性成分，液體劑型還可以含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其 他溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二 醇、1，3_ 丁二醇、油(特別是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油）、 甘油、四氫化呋喃醇、聚乙二醇和失水山梨糖的脂肪酸酯、及其混合物。另外，環(huán)糊精，例如 羥基丙基-β-環(huán)糊精，可以用來(lái)增溶化合物。
[0127] 除了惰性稀釋劑，口服組合物還可包括輔劑例如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味 劑、矯味劑、著色劑、香料和防腐劑。除了一種或多種本發(fā)明化合物之外，混懸劑可以含有懸 浮劑，例如乙氧基化的異硬脂酸醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫 氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂-瓊脂和黃芪膠、及其混合物。
[0128] 用于直腸或陰道施用的本發(fā)明藥物組合物的制劑可以作為栓劑提供，其可以通過 將一種或多種本發(fā)明的化合物與一種或多種適宜的無(wú)刺激性賦形劑或載體(包括例如可可 月旨、聚乙二醇、栓劑蠟或水楊酸鹽)混合來(lái)制備，且室溫時(shí)其為固體但體溫時(shí)為液體，因此會(huì) 在直腸或陰道中融化并釋放本發(fā)明的藥物活性劑。適于陰道施用的本發(fā)明制劑還包括含有 本領(lǐng)域已知合適的載體的陰道栓劑、棉塞、霜?jiǎng)?、凝膠劑、糊劑、泡沫劑、或噴霧制劑。
[0129 ]局部或經(jīng)皮施用本發(fā)明組合物的劑型包括粉劑、噴霧劑、膏劑、糊劑、霜?jiǎng)?、洗劑?凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跓o(wú)菌條件下與可藥用的載體、以及與任 何可能需要的防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。
[0130] 除本發(fā)明的化合物之外，膏劑、糊劑、霜?jiǎng)┖湍z劑還可以含有賦形劑，例如動(dòng)物 及植物脂肪、油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅油、膨潤(rùn)土、硅酸、滑石 和氧化鋅、或其混合物。
[0131] 除本發(fā)明的化合物之外，粉劑和噴霧劑可含有賦形劑，例如乳糖、滑石、硅酸、氫氧 化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉，或這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可額外含有傳統(tǒng)的推進(jìn)劑，例如氯 氟烴和揮發(fā)性未取代的烴，例如丁烷和丙烷。
[0132] 眼科制劑，眼膏、粉、溶液等，也考慮落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0133] 適于胃腸外施用的本發(fā)明藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的化合物以及一種 或多種可藥用的無(wú)菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液、或可以在臨用前重構(gòu) 為無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與 目的受體的血液等滲的溶質(zhì)，或懸浮劑或增稠劑。
[0134] 在一些情況下，為了延長(zhǎng)根據(jù)本發(fā)明的組合物的效應(yīng)，期望放緩機(jī)體自皮下或肌 內(nèi)注射對(duì)組合物的吸收。這可以通過應(yīng)用水溶性差的結(jié)晶或無(wú)定形材料的液體懸浮液來(lái)實(shí) 現(xiàn)。這樣，藥物的吸收速率取決于其溶解速率，這又可以取決于晶體大小或結(jié)晶形式?？蛇x 地，胃腸外施用的組合物的延遲吸收可以通過將化合物溶解或懸浮在油載體中實(shí)現(xiàn)。用于 貯存注射劑的一個(gè)策略包括應(yīng)用聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷共聚物，其中該載體在室溫時(shí)為 流體，而在體溫時(shí)固化。
[0135] 本發(fā)明的藥物化合物可以單獨(dú)施用，或組合其他藥劑，或組合如本文所述的其他 抗癌療法，以及組合可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑。
[0136] 在一實(shí)施方案中，可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑包括用于靜脈內(nèi)遞送的脂質(zhì)。月旨 質(zhì)可為:磷脂、合成卵磷脂、天然卵磷脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷 脂酸、膽固醇、硫酸膽固醇、以及半抗原和PEG綴合的脂質(zhì)。脂質(zhì)可以是納米乳液、膠束、乳 液、懸浮液、納米懸浮液、類脂囊泡(noisome)、或脂質(zhì)體的形式。在一實(shí)施方案中，可藥用的 賦形劑、載體或稀釋劑為膠束乳液、懸浮液或納米顆粒懸浮液的形式，并且其進(jìn)一步包含靜 脈內(nèi)可接受的、用于靜脈內(nèi)遞送的蛋白質(zhì)，例如人白蛋白或其衍生物。
[0137] 在一實(shí)施方案中，可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑包含用于口服遞送的蠟質(zhì)材料。 蠟質(zhì)材料可以是單_、雙_、或三-酸甘油酯，PEG的單_、雙-脂肪酸酯，PEG綴合的維生素E(維 生素E TPG)，和/或GelucireXelucire可選自Gelucire 44/14、Gelucire 43/01、Gelucire 50/02、Gelucire 50/13、Gelucire 37/02、Gelucire 33/01、Gelucire 46/07、和Gelucire 35/10。在一實(shí)施方案中，可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑選自capryoKtranscutoI hp、 labrafil M、Iabrasol、三醋精、pharmasolv、乙醇、聚乙稀吡略燒酮、羧甲基纖維素、吐溫20 和吐溫80。在一實(shí)施方案中，可藥用的賦形劑(例如Gelucire 44/14)與表面活性劑(其可為 吐溫80或吐溫20)混合。這些實(shí)施方案的藥物組合物可進(jìn)一步配制用于口服施用。
[0138] 本發(fā)明的化合物可利用可商購(gòu)的起始材料和有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法 來(lái)合成。在實(shí)施例8-10中，本發(fā)明提供了一些本發(fā)明化合物的生產(chǎn)方法。
[0139]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，小分子Stat3抑制劑是指任何對(duì)Stat3顯示出 抑制活性的小分子量藥物。與較大分子量的藥物(如蛋白質(zhì)、肽和糖)相比，小分子能夠更容 易地穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。這些分子傾向于使工藝開發(fā)和生產(chǎn)成本更低。
[0140]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，RNAi療法是在疾病治療中直接應(yīng)用RNA干涉 (RNAi)，使產(chǎn)生不良蛋白質(zhì)的基因沉默，從而抑制疾病。RNAi是活細(xì)胞中天然存在的抑制某 些基因活性的過程。其是普遍保守的真核功能，由雙鏈RNA借助于短RNA雙鏈體中間體如小 干擾RNA(SiRNA)在細(xì)胞中觸發(fā)。通過一系列的加工步驟，siRNA兩條鏈中的一條與蛋白質(zhì)復(fù) 合形成RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物）AISC通過Watson-Crick堿基配對(duì)識(shí)別互補(bǔ)的RNA序 列，然后切割之。RNAi還包括shRNA、miRNA等。
[0141] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，反義療法是用于遺傳紊亂或感染的一種治療 形式。當(dāng)已知特定基因的遺傳序列為特定疾病的病因時(shí)，可以合成與該基因產(chǎn)生的信使RNA (mRNA)結(jié)合并使之失活的核酸鏈(DNA、RNA或化學(xué)類似物），從而"關(guān)閉"該基因。這是因?yàn)?mRNA為進(jìn)行翻譯必需是單鏈。這種合成的核酸稱為"反義"寡核苷酸，因?yàn)槠鋲A基序列互補(bǔ) 于基因的信使RNA(mRNA)，后者稱為"有義"序列（這樣，有義mRNA區(qū)段"5 ' -AAG⑶C-3 '"可以 被反義mRNA區(qū)段"3 ' -UUCCAG-5 '"封閉）。
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，肽模擬物是設(shè)計(jì)用來(lái)模擬肽的小蛋白質(zhì)樣 鏈。它們一般源于為改變分子特性而對(duì)既有肽進(jìn)行的修飾。例如，它們可以源于為改變分子 的穩(wěn)定性或生物活性而進(jìn)行的修飾。這可用于自既有肽開發(fā)藥物樣化合物。這些修飾包括 對(duì)肽進(jìn)行非天然的改變(例如改變骨架，和摻入非天然氨基酸）。
[0143] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，G四聯(lián)體寡聚脫氧核苷酸抑制劑是催化性DNA 分子(DNAzymes)，設(shè)計(jì)用來(lái)抑制蛋白質(zhì)，而不依賴于其在細(xì)胞中的RNA切割活性。
[0144] 材料和方法
[0145] 生物學(xué)測(cè)定
[0146] 本發(fā)明的化合物可根據(jù)上文所述的方案進(jìn)行檢查。表2顯示了在該方案中描述的 化合物列表。
[0147] 表2
[0149]細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa、DU145、H1299、DLDl、SW480、A549、MCF7、LN18、HCT116、HepG2、 ?&。&2、？311。1、0^^、？3〇11、耵29和？03細(xì)胞（41'0：，]\^11^8838，￥4)在補(bǔ)充有10%胎牛血清 (FBS) (Gemini Bio-Products ,West Sacramento，CA)和5%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B (Invitrogen)的Dulbecco 改良 Eagl e 培養(yǎng)基（DMEM) (Invitrogen ,Car lsbad ,CA)中維持。
[0150] Hoechst側(cè)群:為鑒定和分離側(cè)群(SP)和非SP級(jí)分，用胰蛋白酶和EDTA自培養(yǎng)皿中 取出SW480細(xì)胞，離心沉淀，以磷酸緩沖鹽水（PBS)洗滌，并重懸于37 °C含2 % FBS和ImM HEPES的Dulbecco改良EagIe培養(yǎng)基（DMEM)中。然后用Hoechst 33342( Invitrogen)以5yg/ mL的濃度標(biāo)記細(xì)胞。標(biāo)記的細(xì)胞單獨(dú)或與50μΜ戊脈安（verapami I，Sigma-Aldrich， St. Louis) -起于37°C孵育120分鐘。染色后，使細(xì)胞懸浮于含2%FBS和ImM HEPES的Hanks 平衡鹽溶液(HBSS; Invi trogen)中，流經(jīng)40μηι濾網(wǎng)，并維持在4°C直至進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。 Hoechst染料在350nm激發(fā)，并利用450DF10(450/20nm帶通濾光片）和675LP(675nm長(zhǎng)波通 截止濾光片)光學(xué)濾光片在兩個(gè)波長(zhǎng)測(cè)量其熒光。正向和側(cè)向散射光設(shè)門并不嚴(yán)格，僅排除 碎片[15]。
[0151] 以表面標(biāo)志進(jìn)行CSC分離:通過主要基于表面標(biāo)志（例如⑶44或⑶133)的差異表達(dá) 來(lái)分選腫瘤細(xì)胞，已經(jīng)產(chǎn)生了大多數(shù)迄今描述的高致瘤性CSCXD133基于稍加修改的 Ricci-Vitiani等人的方法[20]分離。CD133+細(xì)胞通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或基于磁 納米顆粒的分離法進(jìn)行分離。簡(jiǎn)言之，對(duì)于基于FACS的細(xì)胞分選，以CD133/1(AC133)-PE標(biāo) 記IO 7細(xì)胞/mL;或?qū)τ诨诖艌?chǎng)的分離，利用EasySep?生物素選擇試劑盒（Mi I teny i Biotec)按照生產(chǎn)商的建議以⑶ 133/1(ACl33)-生物素(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)標(biāo)記 IO7細(xì)胞/mL。非特異性標(biāo)記用提供的FcR阻斷試劑來(lái)阻斷，而抗體孵育（1:11)在冰上于具有 2%FBS和ImM EDTA的I3BS中進(jìn)行15分鐘。對(duì)于EasySep⑩分離進(jìn)行5次洗滌，而在FACS分選 前細(xì)胞在400 X g沉淀5分鐘，并重懸至2 X 107/mL。
[0152] CD44high細(xì)胞根據(jù)稍加修改的Ponti等人所述的方法[85]通過FACS分離。簡(jiǎn)言之， 經(jīng)胰蛋白酶消化和37°C生長(zhǎng)培養(yǎng)基中30分鐘的細(xì)胞恢復(fù)之后，細(xì)胞在400Xg沉淀，并于具 有2%FBS和ImM EDTA的PBS中重懸至I X IO6細(xì)胞/mL。細(xì)胞隨之在冰上與1:100稀釋的邙44_ FITC(BD Biosicences，San Diego,CA)孵育 15分鐘?；蛘?，利用CD24-PE(BD Bioscences, San Diego ,CA) (1:100)進(jìn)行負(fù)選擇。洗滌3次之后，細(xì)胞重懸至2 X 106/mL，并流經(jīng)40μπΓ2Ε| 網(wǎng)，之后進(jìn)行分選。
[0153] 球體測(cè)定試驗(yàn):一種測(cè)量細(xì)胞群自我更新能力的可靠方法是在不存在血清或貼壁 的情況下被培養(yǎng)為球體的能力。CD44hlgh FaDu或Hoechst側(cè)群癌干細(xì)胞在超低附著板中于 癌干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F12，B27Neurobasal增補(bǔ)物，20ng/ml EGF, 10ng/ml FGF，4μg/ml膜 島素和0.4%BSA)中培養(yǎng)以允許球體形成。一般，10-14天培養(yǎng)后通過顯微鏡檢評(píng)估球體形 成，并記錄具有>50個(gè)細(xì)胞的球體。
[0154] 螢光素酶報(bào)告試驗(yàn)：HeLa細(xì)胞用Stat3_螢光素酶（Stat3_Luc)報(bào)告載體 (Panomics ,Fremont，CA)和海腎螢光素酶（Promega ,Madison ,WI)通過 Lipofectamine 2000如生產(chǎn)商（Invitrogen)所述進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞在含0.5%FBS的培養(yǎng)基中維 持24小時(shí)。細(xì)胞隨之用所示的化合物處理30分鐘，之后向培養(yǎng)基中添加25ng/ml制瘤素M (OSM) (R&D Systems ,Minneapolis ,MN)。繼OSM添加后6小時(shí)，收獲細(xì)胞，并利用Dual-Glo螢 光素酶測(cè)定系統(tǒng)如生產(chǎn)商(Promega)所述測(cè)量螢火蟲和海腎螢光素酶的水平。
[0155] 凋亡分析：用或未用化合物處理的細(xì)胞在處理后5小時(shí)收獲，進(jìn)行膜聯(lián)蛋白-V染 色。收集的細(xì)胞以I3BS洗滌，重懸于含膜聯(lián)蛋白-V-FITC的緩沖液中，并按照生產(chǎn)商(Roche) 的說(shuō)明染色。膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)確定。
[0156] STAT3 DNA結(jié)合測(cè)定試驗(yàn)：如生產(chǎn)商（Li-Cor Biosciences,Lincoln,NE)所述進(jìn)行 電泳迀移率變動(dòng)分析（EMSA)。簡(jiǎn)言之，利用NucBuster蛋白質(zhì)提取試劑盒如生產(chǎn)商（EMD Biosciences，San Diego ,CA)所述由HeLa細(xì)胞制備核提取物。5yg核提取物與所示劑量的所 示化合物一起預(yù)孵育30分鐘，之后再與IR700標(biāo)記的共有Stat3寡核苷酸一起孵育15分鐘。 樣品隨之在聚丙稀酰胺凝膠上電泳，并應(yīng)用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(Li-Cor Biosciences) 直接掃描。對(duì)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，5yg核提取物與所示濃度的所示化合物預(yù)孵育 30分鐘，之后添加生物素化的寡聚體（5 ' -生物素-GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC-3 ' SEQ ID NO. IhStatS-DNA復(fù)合物隨之被捕獲到鏈親和素包被的96孔板(Pierce ,Rockford，IL)上。 結(jié)合的復(fù)合物隨之與Stat3多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz,CA)、接 著是抗兔HRP綴合的二抗(GE Healthcare ,Pittsburgh,PA)進(jìn)行孵育。結(jié)合的抗體隨之通過 添加TMB底物(Pierce)并在450nm測(cè)量吸光值而觀察。
[0157] 細(xì)胞生存力確定：對(duì)于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鎬^(MTT) (31 8111&41(^吐，3七丄〇1^，0)分析，細(xì)胞以10,000細(xì)胞/孔接種在96孔板中。種板后24小 時(shí)，以所示劑量向細(xì)胞中添加化合物?；衔锾砑雍?2小時(shí)，向各孔添加MTT(0.5mg/ml終濃 度），并使板在37°C再孵育2小時(shí)。然后吸出培養(yǎng)基，并使甲臜產(chǎn)物溶解在100μΙ異丙醇中。各 孔的吸光值利用微板讀數(shù)器在570nm測(cè)量。
[0158] 免疫熒光：用所示化合物處理所示時(shí)間的細(xì)胞在4%甲醛或冷甲醇中固定，分別用 于檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V、裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)或stat3。蓋片風(fēng)干，在PBS中 室溫重新水合10分鐘。樣品之后在封閉緩沖液(PBS，5%FBS)中在潮濕箱中室溫孵育10分 鐘。細(xì)胞與一抗在4 °C孵育過夜。洗滌后，細(xì)胞與1:500稀釋的FI TC綴合的抗兔抗體室溫孵育 1小時(shí)。用配備有落射熒光和SPOT鑲嵌CXD相機(jī)的Nikon TE200顯微鏡捕獲圖像。多克隆抗裂 解的胱天蛋白酶3抗體（1:100)獲自Cell Signaling Technology ,Danvers ,MA·公司。膜聯(lián) 蛋白-V-FITC獲自德國(guó)Penzberg的羅氏（Roche)公司。多克隆抗Stat3抗體獲自Santa Cruz 公司。
[0159] 通過TPIV?技術(shù)敲低基因 ：TPIV? (治療通路鑒定和驗(yàn)證）技術(shù)（Boston Biomedical Inc. ,Norwood,MA,USA)提供了能夠用來(lái)首先轉(zhuǎn)染細(xì)菌、進(jìn)而細(xì)菌可以被哺乳 動(dòng)物受試者攝取的質(zhì)粒。在細(xì)菌裂解后，由丁PIV k質(zhì)粒編碼并由細(xì)菌加工的dsRNA被釋放到 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)所靶向基因的敲低。ΤΡΓΥΚ)技術(shù)在共同擁有的于2008年6 月30日遞交的PCT專利申請(qǐng)PCT/US08/68866中描述，其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考。具體而 言，編碼針對(duì)Stat3的有效siRNA序列的TPIV k質(zhì)粒利用如下引物通過PCR克隆購(gòu)自 Origene Technologies(Rockvilie ,MD ,USA)的Stat3質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建：
[0160] TPIV_Stat3(300bp 插入物）
[0161] 引物：
[0162] Stat3 TPIV For 5'-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC(SEQ ID N0.2)
[0163] Stat3 TPIV Rev 5'-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG(SEQ ID N0.3)
[0164] 對(duì)照質(zhì)粒應(yīng)用購(gòu)自？1'〇111683(1&1(1丨8〇11，￥1，1]34)的。61^2質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建。
[0165] TPIV_GL2(300bp 插入物）
[0166]引物：
[0167] GL2 TPIV For 5'-CCCTCTAGATGGTTCCTGGAAC(SEQ ID N0.4)
[0168] GL2 TPIV Rev 5'-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG(SEQ ID N0.5)
[0169] 化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(E·coli)BL21(DE3)pLYSe細(xì)菌(50~100μl)用對(duì)照或100ng 革巴向Stat3的TPIV k質(zhì)粒按照生產(chǎn)商（Stratagene)的說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然后將單菌落接種 到含lOOwg/ml氨芐青霉素的BHI培養(yǎng)基中，并于37°C生長(zhǎng)過夜。第二天，將5ml各過夜培養(yǎng)物 1:40稀釋至含100μg/ml氨芐青霉素的新鮮BHI培養(yǎng)基中，并再生長(zhǎng)2-4小時(shí)（直至OD 6Q0 = 0.5)。各培養(yǎng)物隨之用IPTG(lmM終濃度)處理2-4小時(shí)，以誘導(dǎo)長(zhǎng)雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄，其會(huì)被細(xì)菌 加工為混合siRNA。在IPTG誘導(dǎo)之后，通過測(cè)量OD 6qq值來(lái)計(jì)算各培養(yǎng)物中的細(xì)菌總數(shù)(8 X IO8細(xì)菌/ml培養(yǎng)物具有OD6qq= 1)。然后根據(jù)細(xì)胞匯合度和在適當(dāng)反應(yīng)體積中所需的感染復(fù) 數(shù)(Μ0Ι;嘗試20:1至2000:1的細(xì)菌比細(xì)胞范圍），計(jì)算用于細(xì)胞處理的細(xì)菌數(shù)目。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 應(yīng)選擇反應(yīng)體積以導(dǎo)致對(duì)于1000: IMOI為3 X 108/ml。所需體積的細(xì)菌培養(yǎng)物隨之在2500g 4°C離心10分鐘，沉淀用無(wú)血清培養(yǎng)基（用于細(xì)菌感染細(xì)胞時(shí)，加上lOOμg/ml氨芐青霉素和 ImM IPTG)洗滌一次，并以細(xì)菌感染(bactofection)所需的密度重懸于相同的培養(yǎng)基中。 [0170]同時(shí)分離癌細(xì)胞或癌干細(xì)胞，在細(xì)菌感染前30分鐘，將細(xì)胞培養(yǎng)基替換為2ml含 lOOμg/ml氨芐青霉素和ImM IPTG的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。上文制備的細(xì)菌隨之以期望的MOI 添加到細(xì)胞中，37°C感染2小時(shí)。
[0171] 感染期過后，細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次。細(xì)胞隨之與2ml含有l(wèi)OOμg/ml氨 芐青霉素和KOμg/ml慶大霉素的新鮮完全細(xì)胞培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，以殺死任何殘留的胞外 細(xì)菌。在氨芐青霉素和慶大霉素處理后，細(xì)胞與3ml含lOμg/ml氧氟沙星的新鮮完全RPMI 1640培養(yǎng)基孵育，以殺死任何胞內(nèi)細(xì)菌。隨之收獲細(xì)胞或在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析，以評(píng)估靶基 因沉默的程度和產(chǎn)生的表型。
[0172] 活體評(píng)價(jià)(in life evaluations):還對(duì)每只動(dòng)物的健康狀態(tài)進(jìn)行了每日檢查。每 三天檢查體重。按照機(jī)構(gòu)的動(dòng)物管理方法每日供應(yīng)食物和水。引起>20 %致死率和/或>20 % 凈體重?fù)p失的處理視為有毒性。結(jié)果表達(dá)為平均腫瘤體積(mm3) 土SE13P值〈0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué) 相關(guān)。
[0173] 動(dòng)物管理：4-5周齡的雄性或雌性無(wú)胸腺裸鼠（Charles River Laboratories, Wilmington，MA.)在研究開始前適應(yīng)動(dòng)物畜舍設(shè)施至少一周。所利用的所有實(shí)驗(yàn)方法與美 國(guó)生理學(xué)會(huì)(American Physiology Society)所給出的指南以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指 南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)相符，并且也得到了波士頓生 物醫(yī)學(xué)公司（Boston Biomedical Inc.)研究所動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)（Institutional Animal Care and Use Committee)的批準(zhǔn)。動(dòng)物4只一組關(guān)進(jìn)木肩鋪底的籠中，置于具有控 制的溫度(68° F-72° F)、光照（12小時(shí)光-暗周期)和濕度(45-55% )的房間。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自 由飲水?dāng)z食。
[0174] 脾內(nèi)裸鼠模型系統(tǒng)（ISMS模型）：雌性裸鼠麻醉并置于無(wú)菌條件，在左側(cè)腹切割以 露出脾臟。利用27號(hào)針在脾被膜下注射0.1ml PBS中的100萬(wàn)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞。將脾重置 于腹膜腔內(nèi)，并閉合切口。移植后第二天開始處理直至檢查當(dāng)天。處理策略為每周5天一天 一次(5qd/wk)的腹膜內(nèi)注射。小鼠在垂死時(shí)或注射后30天處死。取出脾和肝進(jìn)行檢查，并記 錄腫瘤病變數(shù)。
[0175] 實(shí)施例1
[0176] 鑒定Stat3作為抗癌干細(xì)胞靶標(biāo)
[0177] 在CSC中Stat3的敲低可以誘導(dǎo)凋亡。為確定癌干細(xì)胞是否表達(dá)Stat3,以及Stat3 是否組成型激活，我們進(jìn)行了免疫熒光顯微鏡檢，這不僅允許分析罕見細(xì)胞群，而且還提供 了有關(guān)蛋白質(zhì)定位的額外信息，以及能夠?qū)⑷旧c表型（即凋亡）相關(guān)聯(lián)。在通過FACS自 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞分離的NSP和SP細(xì)胞中對(duì)p-Stat3和Stat3進(jìn)行了免疫熒光檢測(cè)后，我們確 定了Stat3確實(shí)存在于SP細(xì)胞中，且在細(xì)胞核中適度富集（圖3A)。另外，我們還在SP細(xì)胞中 觀察到比NSP細(xì)胞增加的p-Stat3染色，提示SP細(xì)胞的存活可能更大比重地依賴于Stat3。
[0178] 還評(píng)價(jià)了自FaDu人頭頸部癌細(xì)胞和LN18人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞分離的CD133+細(xì)胞 中的Stat3狀態(tài)。如圖3B所示，Stat3在這些細(xì)胞中也具有組成型活性。綜上所述，這些數(shù)據(jù) 提示Stat3是對(duì)于癌干細(xì)胞特別重要的靶標(biāo)。
[0179] 我們接下來(lái)利用TPIVκ檢驗(yàn)了在CSC中Stat3敲低的效應(yīng)。免疫熒光分析揭示，在 新鮮分離的CSC(SP)上感染24小時(shí)之內(nèi)（圖4A)能夠?qū)崿F(xiàn)Stat3的顯著耗竭，并發(fā)現(xiàn)用靶向 Stat3的TPPZ cki質(zhì)粒處理的大多數(shù)細(xì)胞在感染24小時(shí)之內(nèi)經(jīng)歷凋亡，而對(duì)照TPIV?質(zhì)粒 并不誘導(dǎo)高于對(duì)照未感染細(xì)胞的凋亡水平（圖4B)。這些數(shù)據(jù)證明癌干細(xì)胞依賴于Stat3用 于存活。
[0180] 在CSC中敲低Stat3抑制CSC球體形成。通過FACS分離CD44high/CD24lQW FaDu或 Hoeschst側(cè)群癌干細(xì)胞，并在超低附著板中于癌干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/F12，B27 Neurobasal 增補(bǔ)物，20ng/mL EGF，10ng/mL FGF，4yg/mL胰島素和0.4 % BSA)中培養(yǎng)以允許球體形成。收 集初級(jí)球體(primary spheres)，用胰蛋白酶解聚，并在ΤΡΠ/ρ?處理之前分配至96孔超低附 著板中。以1000的MOI施加細(xì)菌兩小時(shí)，之后添加抗生素混合物（青-鏈霉素混合物 (penstrep)、慶大霉素、氧氟沙星）。10-14天培養(yǎng)后評(píng)估球體形成。在添加臺(tái)盼藍(lán)鑒定死細(xì) 胞之前（圖5,左上圖）或之后（圖5,左下圖）獲取代表性的球體圖像。相對(duì)球體形成示于圖5 的右圖。數(shù)據(jù)清楚地表明，在癌干細(xì)胞中Stat3敲低抑制球體形成，證明Stat3是癌干細(xì)胞的 關(guān)鍵自我更新因子。
[0181] 實(shí)施例2
[0182] 鑒定抑制Stat3通路活性的化合物
[0183] Stat3轉(zhuǎn)錄活性的抑制。利用Stat3_螢光素酶(Stat3_luc)報(bào)告分子構(gòu)建體檢驗(yàn)了 化合物在細(xì)胞中抑制Stat3轉(zhuǎn)錄激活活性的能力。轉(zhuǎn)染了 Stat3_luc的細(xì)胞在減少血清的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后再添加所示的化合物孵育30分鐘。細(xì)胞隨之用25ng/ml制瘤素M(OSM)刺激 6小時(shí)，之后檢測(cè)Stat3-luc報(bào)告分子活性。細(xì)胞與化合物401孵育抑制了 OSM刺激的Stat3報(bào) 告分子活性（圖6，左圖）。納入AG490 (-種已知的Jak-Stat通路抑制劑)作為Stat3抑制的陽(yáng) 性對(duì)照。依托泊苷納入作為遺傳毒性活性對(duì)照，其顯示出很小或無(wú)Stat3抑制作用?；衔?1001為萘而非作為本發(fā)明化合物的萘醌，其即便是在高得多的濃度也不抑制OSM刺激的 Stat3報(bào)告分子活性（圖6，右圖）。
[0184] 在Stat3螢光素酶報(bào)告分子測(cè)定中檢驗(yàn)了其他化合物，且結(jié)果總結(jié)于表3。
[0185] 表3
[0188] Stat3 DNA結(jié)合活性的抑制。應(yīng)用來(lái)自HeLa細(xì)胞的核提取物（如通過酪氨酸705殘 基磷酸化所檢測(cè)的那樣，其含有組成型激活的Stat3)進(jìn)行Stat3 EMSA以監(jiān)測(cè)Stat3 DNA結(jié) 合活性。核提取物與所示化合物孵育，之后再與IR700標(biāo)記的Stat3共有寡核苷酸孵育。 Stat3與寡核苷酸的結(jié)合通過凝膠電泳監(jiān)測(cè)，并利用LiCor Odyssey紅外掃描儀檢測(cè)。鑒定 至lJStat3阻滯的條帶，并通過抗Stat3抗體的超級(jí)迀移（圖7A，左圖）和Stat3肽的劑量依賴性 抑制進(jìn)行了確認(rèn)（圖7A，中圖）。在孵育標(biāo)記的探針和化合物401之后觀察到Stat3 DNA結(jié)合 的劑量依賴性抑制（圖7A，右圖）。
[0189] 在EMSA測(cè)定中檢驗(yàn)了其他化合物。如圖7B所示，化合物401、416和418能夠抑制 Stat3的DNA結(jié)合活性。
[0190]異種移植腫瘤組織中Stat3下游效應(yīng)子的抑制。從在收獲前4小時(shí)用化合物401或 載體對(duì)照處理過的異種移植Paca2腫瘤中制備提取物。樣品通過western印跡和EMSA分析， 以評(píng)價(jià)Stat3下游效應(yīng)子表達(dá)水平和Stat3 DNA結(jié)合活性?；衔?01處理的樣品（T)與對(duì)照 (V)相比顯示出Stat3 DNA結(jié)合活性下降（圖8A)。另外，化合物401處理導(dǎo)致Stat3下游效應(yīng) 子細(xì)胞周期蛋白Dl和生存素的表達(dá)水平下降（圖8B)。
[0191] 實(shí)施例3
[0192] 鑒定靶向癌干細(xì)胞的化合物
[0193] 鑒定使癌干細(xì)胞凋亡的化合物。由于已經(jīng)證明癌干細(xì)胞活躍地外排Hoechst，故用 Hoechst染色SW480細(xì)胞，分選側(cè)群(如圖9A所示，左圖圍起來(lái)的區(qū)域）以富集癌干細(xì)胞。為確 認(rèn)此側(cè)群富集癌干細(xì)胞，對(duì)照組的SW480細(xì)胞首先用戊脈安（verapami I，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制 劑)處理，之后用Hoechst染色。如圖9A右圖所示，戊脈安處理導(dǎo)致側(cè)群?jiǎn)适А?br>[0194] 在MTT測(cè)定中評(píng)估了化合物401對(duì)Hoechst側(cè)群的IC5Q，并與對(duì)非側(cè)群的IC 5q進(jìn)行 了比較。結(jié)果顯示，側(cè)群對(duì)化合物401與非側(cè)群一樣敏感（圖9B，右圖）。然而，側(cè)群對(duì)多柔比 星比非側(cè)群耐藥性大得多（圖9B，左圖），這與之前的公開一致[7,86]。這些數(shù)據(jù)提示化合物 401殺死癌干細(xì)胞。
[0195] Hoechst側(cè)群細(xì)胞用化合物401處理，并通過膜聯(lián)蛋白V(凋亡的早期標(biāo)志）染色來(lái) 評(píng)估細(xì)胞死亡模式。結(jié)果顯示，垂死細(xì)胞為膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性（圖10A)，證明化合物401使癌干 細(xì)胞凋亡。
[0196] 可選地，我們進(jìn)行了⑶133(常見的癌干細(xì)胞表面標(biāo)志之一)抗體磁珠沉降以富集 癌干細(xì)胞。CD133+細(xì)胞隨之用化合物401處理，接著用抗裂解的胱天蛋白酶3(凋亡標(biāo)志）的 抗體染色。如圖IOB所示，許多CD133+細(xì)胞在化合物401處理后變成裂解型胱天蛋白酶3陽(yáng)性 的，證實(shí)化合物401使癌干細(xì)胞凋亡。
[0197] 另外，我們檢驗(yàn)了若干其他化合物抗癌干細(xì)胞的活性。簡(jiǎn)言之，新鮮分離的CSC (SW480 Hoechst SP細(xì)胞或CD44high FaDu細(xì)胞）與一定劑量范圍（30-0.117μΜ)的化合物接 觸48小時(shí)，之后通過MTT測(cè)定研究細(xì)胞生存力。通過對(duì)存活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行作圖來(lái)估算IC50。 如表4和表5所示，本發(fā)明的化合物能夠靶向癌干細(xì)胞。
[0198]表4
[0202] 鑒定在體外抑制CSC球體形成的化合物。癌干細(xì)胞的標(biāo)志之一是其自我更新的能 力。一種測(cè)量細(xì)胞群自我更新能力的可靠方法是其在不存在血清或附著的情況下培養(yǎng)為球 體的能力。為比較化合物401與其他靶向及化療劑的該能力，F(xiàn)ACS分離的CD44 high CSC培養(yǎng) 為球體72小時(shí)，之后用一組治療劑進(jìn)行攻擊。所檢驗(yàn)的藥劑中，只有化合物401有效防止球 體增殖（圖11)。注意，盡管施加的多柔比星和多烯紫杉醇的量大約十倍于其在類似測(cè)定中 導(dǎo)致細(xì)胞死亡的IC5Q濃度，但球體還是具有耐藥性。添加的特羅凱(Tarceva)、索坦(Sutent) 和格列衛(wèi)(Gle evec)大約三倍于其報(bào)告的治療濃度。這證明雖然癌干細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療劑和 靶向劑具有耐藥性，但化合物401高度有效地抑制其生長(zhǎng)。
[0203] 鑒定在體內(nèi)抑制C S C球體形成的化合物。六周齡雌性無(wú)胸腺n u / n u小鼠獲自 Charles River Labs(Wilmington，ΜΑ)。小鼠在腰窩處皮下注射處于0 · 2mL無(wú)血清DMEM中的 6 X IO6FaDu或Paca2癌細(xì)胞。在異種移植物大小達(dá)到~200mm3后，攜帶Paca2異種移植腫瘤的 動(dòng)物通過腹膜內(nèi)施用載體、吉西他濱（120mg/kg，一周兩次)或化合物401 (20mg/kg)-周，而 攜帶FaDu異種移植腫瘤的動(dòng)物通過腹膜內(nèi)每日施用載體、卡鉑（30mg/kg)或化合物401 (20mg/kg)兩周，之后處死。然后分別針對(duì)Paca2和FaDu細(xì)胞，收集腫瘤。在動(dòng)物處死并無(wú)菌 取出腫瘤后制備單細(xì)胞懸液。簡(jiǎn)言之，用無(wú)菌解剖刀將腫瘤切成0.1mm 3的碎塊，之后在Img/ mL膠原酶/HBSS中持續(xù)震蕩消化15-30分鐘。在流經(jīng)40μπι濾網(wǎng)后，將細(xì)胞懸液層放在ImL Histopaque上，并在1440 Xg離心30分鐘后收集界面層，而除去RBC、死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然 后計(jì)數(shù)活細(xì)胞，并用來(lái)測(cè)量其形成球體的能力。細(xì)胞以100細(xì)胞/孔的密度分配到超低附著 96孔板的癌干細(xì)胞培養(yǎng)基中（DMEM/F12，B27 Neurobasal增補(bǔ)物，20ng/mL EGF，10ng/mL FGF,4yg/mL胰島素和0.4%BSA)。每三天添加新鮮培養(yǎng)基，并在10-14天培養(yǎng)后測(cè)定球體形 成。記錄具有>50個(gè)細(xì)胞的球體。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，添加臺(tái)盼藍(lán)以鑒定死細(xì)胞。如圖12所示，如增 加的球體形成所證明的，標(biāo)準(zhǔn)化療吉西他濱(上圖）和卡鉑(下圖）富集了癌干細(xì)胞。相反地， 如減少的球體形成所證明的那樣，化合物401處理減少了癌干細(xì)胞。
[0204] 實(shí)施例4
[0205] 鑒定選擇性殺死廣譜癌細(xì)胞的化合物
[0206] 鑒定在體外使廣譜癌細(xì)胞凋亡的化合物。對(duì)鋪板在96孔板中并用所示化合物處理 的細(xì)胞在化合物處理后24小時(shí)進(jìn)行MTT分析，以確定細(xì)胞生存力。對(duì)多種細(xì)胞系計(jì)算的IC 50 值總結(jié)于下表6。數(shù)據(jù)證明，這些化合物對(duì)廣譜癌細(xì)胞具有有力的活性。
[0207] 表 6
[0209]另外，DU145細(xì)胞首先用DMSO或所示濃度的化合物401處理，然后用膜聯(lián)蛋白V染 色，接著在處理后5小時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。結(jié)果顯示401處理導(dǎo)致膜聯(lián)蛋白V染色的劑量 依賴性增加（圖13 )，證明化合物401使這些癌細(xì)胞凋亡。
[0210] 化合物選擇性的實(shí)例。在導(dǎo)致幾乎所有癌細(xì)胞死亡的測(cè)定條件下，正常細(xì)胞保持 基本上存活。外周血單核細(xì)胞(PBMC)相對(duì)地抵抗化合物401，在與化合物401孵育24小時(shí)后 具有14μΜ的MTT IC5Q。此IC5q比在多種癌細(xì)胞系中所見的IC5q高6至116倍，表明與癌細(xì)胞相 比合理的治療窗口。
[0211] 與PMBC方式類似，CD34+骨髓造血干細(xì)胞在用化合物401處理時(shí)不受傷害。如表7所 示，CD34+骨髓單核細(xì)胞與化合物401 -起孵育6小時(shí)，結(jié)果對(duì)于骨髓紅系（erythroid lineage)和粒系（myeloid lineage)兩者的IC5Q均高于30μΜ，而DU145前列腺癌細(xì)胞和HT29 結(jié)腸癌細(xì)胞在相似條件下具有的IC5q低于0.5μΜ。這些數(shù)據(jù)提示，根據(jù)該體外數(shù)據(jù)，化合物 401具有寬（大于50倍)的治療窗口。
[0212] 表7.化合物401對(duì)⑶34+骨髓干細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒性
[0214] BM =骨髓
[0215] 集落形成測(cè)定中比較化合物401對(duì)⑶34+骨髓單核細(xì)胞、DU145細(xì)胞和FaDu細(xì)胞的 IC5Oo
[0216] 實(shí)施例5
[0217] 體內(nèi)抗腫瘤功效
[0218] 胰腺癌異種移植模型。paca-2細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（4 X IO6細(xì)胞/小鼠）。 當(dāng)腫瘤達(dá)到大約450mm3時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分成2組，每組5只小鼠。小鼠每天用20mg/kg的化合 物401或載體對(duì)照進(jìn)行腹膜內(nèi)治療。化合物401以5mg/ml配制在1.5%脂質(zhì)和H 2O中。動(dòng)物接 受總計(jì)14個(gè)劑量，進(jìn)行治療后觀察。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤，且在治療后再監(jiān)測(cè)22天。 如圖14左圖所示，化合物401有力地抑制了腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤生長(zhǎng)抑制在第60天計(jì)算為64%， 并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P〈〇.001)。更重要的是，在治療后22天的時(shí)間階段中腫瘤體積保持靜 ??τ O
[0219] 在相似的實(shí)驗(yàn)中，panc-l人胰腺癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（2 X IO6細(xì)胞/小 鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約60mm3時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分成2組，每組5只小 鼠。小鼠用吉西他濱以標(biāo)準(zhǔn)方案（120mg/kg，每三天一次)或用載體對(duì)照進(jìn)行腹膜內(nèi)（ip)治 療，總計(jì)6個(gè)劑量的吉西他濱或載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤，且治療后再監(jiān)測(cè)19 天。如圖14右圖所示，用吉西他濱作為單一療法治療抑制了腫瘤生長(zhǎng)，第41天腫瘤生長(zhǎng)抑制 47.5%。治療終止后，吉西他濱治療組的腫瘤很快長(zhǎng)得超過了對(duì)照組。
[0220]在化合物401治療期間或治療后階段在異種移植的Paca-2人胰腺癌模型中未觀察 到腫瘤反彈，這與其癌干細(xì)胞靶向作用機(jī)制相符。相反，用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療吉西他濱治療的 人胰腺癌異種移植腫瘤最初產(chǎn)生反應(yīng)，但在繼續(xù)治療期間反彈，或者在給藥終止后長(zhǎng)得超 過了對(duì)照腫瘤。消除腫瘤反彈使得化合物401有別于標(biāo)準(zhǔn)化療，這從而提供了顯著和根本性 地改善癌癥治療的可能性。
[0221 ]頭頸部癌異種移植模型。FaDu人頭頸部癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（6 X IO6 細(xì)胞/小鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約I 〇Omm3時(shí)，動(dòng)物每天用2Omg/kg的 化合物401或載體對(duì)照進(jìn)行腹膜內(nèi)（ip)治療（連續(xù)5天，跟著是2天的施用休息日）?；衔?401以5mg/ml配制在2 %脂質(zhì)、0.1 %膽固醇和H2O中。動(dòng)物接受總計(jì)15個(gè)劑量的化合物401或 載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤。如圖15所示，在這種高度攻擊性的頭頸部癌異種移 植模型中，用化合物401作為單一療法腹膜內(nèi)施用的動(dòng)物有力地抑制了腫瘤生長(zhǎng)?；衔?401的腫瘤生長(zhǎng)抑制經(jīng)計(jì)算為75%，p值為0.007。腹膜內(nèi)施用載體或20mg/kg的化合物401并 沒有引起顯著的體重變化。
[0222] 乳腺癌異種移植模型。1?^-|?-231人乳腺癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（8乂 IO6細(xì)胞/小鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約200mm3時(shí)，動(dòng)物每天用200mg/kg 的化合物401或載體對(duì)照進(jìn)行口服(po)治療（連續(xù)5天，跟著是2天的施用休息日）?；衔?401以20mg/ml配制在8%gelucire和20%維生素E中。動(dòng)物接受總計(jì)15個(gè)劑量的化合物401 或載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤。如圖16所示，用化合物401作為單一療法以200 mg/kg 口服施用有力地抑制了腫瘤生長(zhǎng)?；衔?01的最佳腫瘤生長(zhǎng)腫瘤生長(zhǎng)抑制經(jīng)計(jì)算為 66%，p值為0.0068。口服施用載體或200mg/kg的化合物401并沒有引起顯著的體重變化。這 些數(shù)據(jù)提示，化合物401能夠以在這種人乳腺癌模型中有效的方案安全施用。
[0223]前列腺癌異種移植模型。PC3人前列腺癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（8 X IO6細(xì) 胞/小鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約10Omm3時(shí)，動(dòng)物每天用2Omg/kg的化 合物401或載體對(duì)照進(jìn)行腹膜內(nèi)（ip)治療。化合物401以5mg/ml配制在2%脂質(zhì)、0.1%膽固 醇和H 2O中。動(dòng)物接受總計(jì)30個(gè)劑量的化合物401或載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤。 如圖17所示，用化合物401作為單一療法以20mg/kg腹膜內(nèi)施用抑制了腫瘤生長(zhǎng)。化合物401 的最佳腫瘤生長(zhǎng)抑制經(jīng)計(jì)算為55%，p值為0.015dp施用載體或20mg/kg的化合物401并沒 有引起顯著的體重變化。這些數(shù)據(jù)提示，化合物401能夠以在這種人前列腺癌模型中有效的 方案安全施用。
[0224]胃癌異種移植模型。MKN-45人胃癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（8 X IO6細(xì)胞/小 鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約180mm3時(shí)，動(dòng)物每天口服(po)施用200mg/ kg的化合物401或載體對(duì)照。化合物401以20mg/ml配制在8%gelucire和20%維生素E中。動(dòng) 物接受總計(jì)20個(gè)劑量的化合物401或載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤。如圖18所示， 用化合物401作為單一療法以200mg/kg 口服施用抑制了腫瘤生長(zhǎng)。化合物401的最佳腫瘤生 長(zhǎng)抑制經(jīng)計(jì)算為70%，p值為0.01?？诜┯幂d體或200mg/kg的化合物401并沒有引起顯著 的體重變化。這些數(shù)據(jù)提示，化合物401能夠以在這種人胃癌模型中有效的方案安全施用。
[0225] 肝癌異種移植模型。HepG2人肝癌細(xì)胞皮下接種雌性無(wú)胸腺裸鼠（8 X IO6細(xì)胞/小 鼠），并使之形成可觸知的腫瘤。在本研究中，當(dāng)腫瘤達(dá)到大約700mm3時(shí)開始給藥。動(dòng)物每天 用10mg/kg的化合物401或載體對(duì)照進(jìn)行靜脈內(nèi)（iV)治療?；衔?01以2mg/ml配制在1.5 % 白蛋白中。動(dòng)物接受總計(jì)10個(gè)劑量的化合物401或載體對(duì)照。在整個(gè)治療過程中測(cè)量腫瘤。 如圖19所示，即使是在腫瘤生長(zhǎng)的非常晚期階段才開始治療，用化合物401作為單一療法以 10mg/kg靜脈內(nèi)治療仍有力地抑制了腫瘤生長(zhǎng)?；衔?01的最佳腫瘤生長(zhǎng)抑制經(jīng)計(jì)算為 52.3%，p值為0.05。iv施用載體或10mg/kg的化合物401并沒有引起顯著的體重變化。這些 數(shù)據(jù)提示，化合物401能夠以在這種人肝癌模型中有效的方案安全施用。
[0226] 實(shí)施例6
[0227] 抗轉(zhuǎn)移功效
[0228] 還檢驗(yàn)了化合物401在ISMS模型中抑制轉(zhuǎn)移的能力。脾內(nèi)裸鼠模型系統(tǒng)（ISMS模 型)適于研究結(jié)直腸癌的惡性行為，因?yàn)榇思夹g(shù)能夠在肝中產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移。在此模型中， 在裸鼠脾被膜下注射處于0.1ml PBS中的100萬(wàn)HT29細(xì)胞。將脾重置于腹膜腔內(nèi)，并閉合切 口。小鼠在垂死時(shí)或注射后30天處死。取出脾和肝進(jìn)行檢查，并記錄腫瘤病變數(shù)(number of tumor lesions)。小鼠分成2組，對(duì)照組給予載體(η = 4)，而另一組接受20mg/kg化合物401 (n = 4)。在i.s.注射后第2天起至第30天，5天/周腹膜內(nèi)施用藥物。顯微鏡檢估算原發(fā)性腫 瘤和轉(zhuǎn)移性肝腫瘤的數(shù)目。代表性照片示于圖20。在載體對(duì)照組中，脾臟處有重負(fù)荷的原發(fā) 性腫瘤（圖20,上左圖）。還觀察到大量的自發(fā)肝轉(zhuǎn)移（圖20,上右圖）?；衔?01處理顯著降 低了原發(fā)性腫瘤病灶數(shù)和自發(fā)肝轉(zhuǎn)移數(shù)(圖20，下圖）。
[0229] 實(shí)施例7
[0230] 藥物代謝動(dòng)力學(xué)和毒性譜
[0231]在大鼠中進(jìn)行了化合物401的藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析。用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)的 雌性Sprague Dawley大鼠（9只大鼠/組)通過口服強(qiáng)飼給藥。劑量體積為10ml/kg，各組分別 給予含對(duì)照媒介物(9 % Ge Iuc ire 44/14和18 %維生素E TPGS，于無(wú)菌水中）的制品，或者于 對(duì)照媒介物中的I 〇或30mg/kg/天化合物401。按3只動(dòng)物/性別/時(shí)間點(diǎn)在施用前以及初始施 用后大約2、4、6、8、10和24小時(shí)采集血樣。離心收獲血漿，并貯存在設(shè)置維持在-75°C±15°C 的冰箱中直至分析。本研究的生物分析部分利用經(jīng)驗(yàn)證的LC/MS/MS方法進(jìn)行。定量下限 (LLOQ)為10.Ong/mL。如圖21所示，藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，化合物401達(dá)到并維持不超 過7μΜ的臨界濃度不超過8小時(shí)。
[0232] 在這些劑量時(shí)在連續(xù)施用28天的大鼠中未觀察到毒性作用。這包括臨床觀察、實(shí) 驗(yàn)室化驗(yàn)、總體的和組織學(xué)的結(jié)果?？偠灾@些數(shù)據(jù)證明，對(duì)于選擇性抗癌活性而言，化 合物401能夠?qū)崿F(xiàn)期望的PK暴露。
[0233] 實(shí)施例8 「02341 卞宏 1
L0236」DBU: 1，8-二氮雜雙環(huán)[5 · 4 · 0 ] i-一碳 _7_烯；
[0237] THF:四氫呋喃；
[0238] RT:室溫。
[0239] 制備2-乙酰基-4H，9H-萘并[2,3-b]呋喃-4,9-二酮(通式4-6的化合物，其中Rl = 尺7 = !1且1? = -〇13)
[0240]向劇烈攪拌的處于冰浴中的18.8g(22ml，0.268mol )3_丁烯-2-酮(方案1中的通式 4-1)在200ml戊烷中的溶液中，在30分鐘內(nèi)緩慢加入39. Og (12.54ml，0.244mol)溴在50ml 戊烷中的溶液。在冰浴中另外攪拌5分鐘之后，蒸發(fā)混合物以除去大部分戊烷。將來(lái)自步驟I 的小量3,4_二溴-2-丁酮?dú)埩粑?4-2)溶解在400ml THF中，然后在冰浴上冷卻。向冰浴中劇 烈攪拌的該溶液中，在30分鐘內(nèi)緩慢加入在50ml THF中的37.2g(36.5ml，0.244mol )DBU。生 成大量鹽沉淀物。該混合物直接用于下一步的反應(yīng)。向3-溴-3-丁烯-2-酮(4-3)的反應(yīng)混合 物中加入38.5g(0.220m 〇l)2-羥基-1，4-萘醌(4-4)。所得的混合物在室溫水浴中劇烈攪拌。 然后在30分鐘內(nèi)向該混合物中緩慢加入44.6g(43.8ml，0.293mol )DBU。反應(yīng)混合物的溫度 由于反應(yīng)生成的熱而升高，通過向水浴中加冰而控制在低于35°C。在室溫開放劇烈攪拌另 外3小時(shí)后，向混合物中加入I，800ml水。將所得的混合物冷至(TC，然后過濾。過濾的固體相 繼地用500ml水、500ml 5 %碳酸氫鈉水溶液、500ml 1 %醋酸和250ml冰冷丙酮洗滌。洗滌后 的固體在200ml甲酸中重結(jié)晶，得至Ij 12g產(chǎn)物，化合物4-6或3-2(R1 =H，R3 = CH3,R7 = H)的總 產(chǎn)率為22.8%? NMR(CDC13中）S2.67(s，3H)，7.61(s，lH-3) ,7.79-7.84(m，2H) ,8.22-8.28 (m，2H)〇
[0241] 實(shí)施例9
[0242] 方案 2
[0243] 制備化合物磷酸單-[1-(4,9-二氧代-3a，4,9,9a_四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯
[0245] 向-78°C的8816002(24011^，1111111〇1)在501'冊(cè)中的溶液中加入雙（三甲基甲硅烷基） 氨基鋰溶液（I.OM在THF中，1.2mL)。在此溫度攪拌1小時(shí)之后，反應(yīng)混合物在(TC攪拌30分 鐘。然后在-78°C向該混合物中加入氯磷酸二甲酯（217mg，1.5mmol)在5mLTHF中的溶液。攪 拌所得混合物，并使之緩慢溫至室溫。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，蒸發(fā)掉溶劑，殘留物溶解在CH 2Cl2 中，用飽和NH4Cl和水洗滌，在MgSO4上干燥。溶劑蒸發(fā)產(chǎn)生粗反應(yīng)混合物，通過柱層析純化， 得到黃色固體的磷酸1-(4,9-二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯 二甲酯。 1!1匪1?(40010^，0)(：13)38.2〇-8.28(111，2!1)，7,78-7.82(111，2!〇,7.07(8，1!〇,5.78 (t，lH，J = 2.8Hz)，5.50(t，lH，J = 2.8Hz)，3.96(s，3H)，3.94(s，3H);MS m/z 347·20(Μ-Η)。
[0246] 實(shí)施例10
[0247] 方案 3
[0248] 制備化合物磷酸1 - (4，9-二氧代_3a，4，9，9a_四氫-萘并[2，3-b ]呋喃-2-基)-乙烯 基酯二甲酯
[0250] 在室溫向磷酸1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a_四氫-萘并[2,3_b]呋喃-2-基)_乙烯基 酯二甲酯(40mg，0.114mmo 1)在CH2Cl2 (2mL)中的溶液中，加入三甲基甲硅烷基溴化物(7 Img， 0.46mmol)。反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后真空濃縮。殘留物通過半制備性HPLC純化，獲 得黃色固體的產(chǎn)物磷酸單-[1-(4,9_二氧代-3a，4,9,9a-四氫-萘并[2,3-b]呋喃-2-基)-乙 烯基]酯。 1H Nmr(^omhz1CDCIS)S1H NMR(400MHz，CDC13)S7.98-8.02(m，2H)，7,57-7.62(m， 2H)，6.92(s，lH)，5.54(t，lH，J = 2.8Hz)，5.36(t，lH，J = 2.8Hz);MS m/z319.20(M-H)。
[0251] 本文引述的所有參考文獻(xiàn)在適用法律允許的程度上整體并入本文作為參考，并在 相同的程度上用于所有目的，就如同明確單獨(dú)地說(shuō)明將各單個(gè)出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)全 文并入作為參考用于所有目的一樣。在并入作為參考的出版物和專利或?qū)＠暾?qǐng)與本說(shuō) 明書所含公開內(nèi)容相悖的程度上，本說(shuō)明書旨在替換和/或優(yōu)先于任何這樣的矛盾材料。
[0252] 在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用的表達(dá)成分、反應(yīng)條件、分析結(jié)果等等數(shù)量的數(shù) 字在所有情況下應(yīng)理解為受術(shù)語(yǔ)"約"修飾。從而，除非有相反說(shuō)明，本說(shuō)明書和所附權(quán)利要 求書中闡述的數(shù)值參數(shù)為近似值，其可以根據(jù)本發(fā)明尋求獲得的期望性能而變。各數(shù)值參 數(shù)應(yīng)按照有效數(shù)字和普通舍入方法加以解釋，但絲毫、也不應(yīng)試圖限制等同原則對(duì)權(quán)利要 求范圍的適用。
[0253] 可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾和改變而不偏離其精神和范圍，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而 易見的。本文所述的具體實(shí)施方案僅僅是作為舉例提供，而不意味著以任何方式加以限制。 意思是說(shuō)明書和實(shí)施例應(yīng)視為僅僅是例示性的，而本發(fā)明的真正范圍和精神由如下權(quán)利要 求表不。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適用于治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、固有地抵抗化療的、或復(fù)發(fā)性的癌 癥，以及預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的藥物組合物，所述藥物組合物向受試者施用，使受試者血 漿中的2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮濃度在每劑量后不超過臨界濃度不超過24小 時(shí)，由此選擇性地殺死癌細(xì)胞而基本上不傷害正常細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中受試者血漿中的化合物濃度在每劑量后不超 過臨界濃度不超過選自下組的持續(xù)時(shí)間，由此選擇性地殺死癌細(xì)胞而基本上不傷害正常細(xì) 胞:8、12、16和20小時(shí)。3. 如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于，其中臨界濃度為100μΜ、50μΜ、30μ Μ、20μΜ或7μΜ。4. 如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，所述藥物組合物適于口服、經(jīng)鼻、局部、直腸、陰道 或胃腸外施用，或靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射。5. 如權(quán)利要求1的藥物組合物，其中癌癥選自下組:肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃癌、腎 癌、肉瘤、腦瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、食道癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、 膽管癌、骨癌、膽囊癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、宮 頸癌、黑素瘤、角質(zhì)形成細(xì)胞癌和皮膚癌。6. -種適用于治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、固有地抵抗化療的、或復(fù)發(fā)性的癌 癥，以及預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的藥物組合物，所述藥物組合物向受試者施用，使受試者血 漿中的2-乙酰基萘并[2,3-b]呋喃_4,9_二酮濃度在每劑量后至少達(dá)到臨界濃度以上，其中 臨界濃度為Ο.ΙΙμΜ，所述藥物組合物適于口服、經(jīng)鼻、局部、直腸、陰道或胃腸外施用，或靜 脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射。7. 如權(quán)利要求6的藥物組合物，其特征在于，其中臨界濃度為0.5μΜ、0.95μΜ或1.7μΜ。8. 如權(quán)利要求6的藥物組合物，其中癌癥選自下組:肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃癌、腎 癌、肉瘤、腦瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、食道癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、 膽管癌、骨癌、膽囊癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、宮 頸癌、黑素瘤、角質(zhì)形成細(xì)胞癌和皮膚癌。9. 一種可以向癌細(xì)胞遞送2-乙?；敛2,3-b]呋喃_4,9_二酮的，適用于治療轉(zhuǎn)移性 的、化療或放療頑固性的、固有地抵抗化療的、或復(fù)發(fā)性的癌癥，以及預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù) 發(fā)的藥物組合物，所述藥物組合物適于口服、經(jīng)鼻、局部、直腸、陰道或胃腸外施用，或靜脈 內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)注射。10. 如權(quán)利要求9的藥物組合物，其中癌癥選自下組:肝癌、頭頸部癌、胰腺癌、胃癌、腎 癌、肉瘤、腦瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、食道癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、 膽管癌、骨癌、膽囊癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、宮 頸癌、黑素瘤、角質(zhì)形成細(xì)胞癌和皮膚癌。11. 一種適用于治療轉(zhuǎn)移性的、化療或放療頑固性的、固有地抵抗化療的、或復(fù)發(fā)性的 癌癥，以及預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的藥物組合物，所述藥物組合物以lmg/m2至5,000mg/m2 (I.V)或lmg/m2至50,000mg/m2(P0)的劑量向受試者施用，使受試者血漿中的2-乙酰基萘并 [2，3-b ]呋喃-4，9-二酮濃度在每劑量后達(dá)到0.5μΜ以上。12. 如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中藥物組合物以2mg/m2至3，000mg/m2(I. V)或 1 Omg/m2至50，000mg/m2 (P0)的劑量向受試者施用。13. 如權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述藥物組合物每隔一天 (Q2D)，每天(QD)或每天兩次(BID)施用。14. 如權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述藥物組合物口服施 用，且不超過每天四次(QID)。15. 如權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其中癌癥選自下組：肝癌、頭頸部癌、胰腺 癌、胃癌、腎癌、肉瘤、腦瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、食道癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、子 宮內(nèi)膜癌、膽管癌、骨癌、膽囊癌、直腸癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、卵巢癌、成神經(jīng) 細(xì)胞瘤、宮頸癌、黑素瘤、角質(zhì)形成細(xì)胞癌和皮膚癌。16. 如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述藥物組合物包含 可藥用的賦形劑、載體或稀釋劑。17. 如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，其中可藥用的賦形劑、載體或稀釋 劑包括用于靜脈內(nèi)遞送的脂質(zhì)。18. 如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述脂質(zhì)選自下組:磷脂、合成 卵磷脂、天然卵磷脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、膽固醇、硫酸 膽固醇、以及半抗原和PEG綴合的脂質(zhì)。19. 如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述脂質(zhì)是選自下組的形式： 納米乳液、膠束、乳液、懸浮液、納米懸浮液、類脂囊泡，或脂質(zhì)體。20. 如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述可藥用的賦形劑、載體或 稀釋劑是選自下組的形式:膠束乳液、懸浮液和納米顆粒懸浮液，并且還包括用于靜脈內(nèi)遞 送的靜脈內(nèi)可接受的蛋白質(zhì)。21. 如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其特征在于，所述靜脈內(nèi)可接受的蛋白質(zhì)是人白 蛋白或其衍生物。22. 如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述可藥用的賦形劑、載體或 稀釋劑包括用于口服遞送的蠟質(zhì)材料。23. 如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述蠟質(zhì)材料選自下組:單-、 雙-、或三-酸甘油酯、PEG的單-、雙-脂肪酸酯，PEG綴合的維生素 E和Gelurire。24. 如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，其中所述可藥用的賦形劑、載體或 稀釋劑選自下組：capryol、transcutolhp、labraf il M、labrasol、三醋精、pharmasolv、乙 醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素、吐溫20和吐溫80。
【文檔編號(hào)】A61K31/343GK105963289SQ201610134121
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2008年9月10日
【發(fā)明人】C·J·李, Z·江, H·羅格夫, Y·李, J·劉, W·李
【申請(qǐng)人】北京強(qiáng)新生物科技有限公司