專利名稱：與人類細(xì)胞逐漸死亡相關(guān)的新的肽類及其編碼它的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與細(xì)胞死亡有關(guān)的新的肽類及編碼它的脫氧核糖核酸。
在不同種類動(dòng)物的幾乎所有組織中都可觀察到受發(fā)育和生理狀況控制的細(xì)胞的死亡。這種細(xì)胞死亡通常被看作“逐漸”死亡以區(qū)別于由病理過程引起的“意外”死亡。遭受逐漸死亡的大多數(shù)細(xì)胞已被闡明需要從頭合成RNA和蛋白質(zhì)。
這些事實(shí)表明即使不是特定的一種，也至少是幾種基因必須被表達(dá)以導(dǎo)致細(xì)胞逐漸死亡。
另一方面“自然死亡”一詞被用來描述一類細(xì)胞死亡的形態(tài)學(xué)特征。由自然死亡導(dǎo)致的死細(xì)胞中，染色質(zhì)在細(xì)胞核周邊的周圍濃縮，而線粒體和其它細(xì)胞器不受影響。自然死亡細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特的生化特征包括DNA斷裂成寡核苷酸片段。在哺乳動(dòng)物中，自然死亡在形態(tài)學(xué)和生化特征上與細(xì)胞的逐漸死亡是相關(guān)的，但是有些遭受逐漸死亡的細(xì)胞顯然沒有表現(xiàn)出自然死亡特有的性質(zhì)，而且缺乏任何一種蛋白質(zhì)的合成都可誘發(fā)細(xì)胞的自然死亡。
因此指出自然死亡與細(xì)胞逐漸死亡的含義不相同是至關(guān)重要的。
最近研究表明bcl-2是一種致癌基因，它存在于死亡化的B細(xì)胞中以保護(hù)細(xì)胞死亡，可見控制細(xì)胞死亡是很重要的。
至今已報(bào)道了某些與細(xì)胞逐漸死亡相關(guān)的肽類，這類肽中的一個(gè)代表是Fas抗原。(Ltoh，N.et al.，Cell.66，233(1991))人類的Fas抗原是一種含有335個(gè)氨基酸的多肽，并且它的信號(hào)肽是含有16個(gè)疏水的氨基酸的N未端，它的成熟的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被分為細(xì)胞外區(qū)(157個(gè)氨基酸)，轉(zhuǎn)膜區(qū)(17個(gè)氨基酸)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)(145個(gè)氨基酸)。Fas抗原被認(rèn)為具有受體的功能，可接受誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的因子(配體)。
本發(fā)明的目的是尋找新的多肽以替換Fas抗原所代表的多肽。
本發(fā)明中已分離出與細(xì)胞逐漸死亡密切相關(guān)的基因，并確定了它的核苷酸序列，推導(dǎo)出它的氨基酸序列。本發(fā)明人成功地找出了一種全新的多肽以及編碼它的DNA，從而完成了本發(fā)明。
為了分離出與細(xì)胞逐漸死亡密切相關(guān)的基因，鼠的PD-1被用作探針，它是從鼠的T細(xì)胞雜種瘤2B4.11(日本專利公開號(hào)5-336973)中得到的。
通過計(jì)算機(jī)程序，將本發(fā)明中測定的多肽的氨基酸序列與國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)的數(shù)據(jù)庫中所有已知的序列相比較發(fā)現(xiàn)除了鼠的PD-1外，沒有一種多肽含有與本發(fā)明的多肽完全相同或具高度同源性的氨基酸序列。毫無疑問，這確證了此多肽與Fas抗原沒有同源性。
本發(fā)明涉及與細(xì)胞逐漸死亡密切相關(guān)的多肽(以下簡稱為人的PD-1)。
本發(fā)明涉及含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸的基本上為純化形式的一種多肽;還涉及此多肽的同源物或此序列的片段或片段的同源物;還涉及編碼這種多肽的DNA。更具體地講，本發(fā)明還涉及到含有SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列的DNA，以及含有一個(gè)可選擇性地與SEQ.ID.NO.2或3中表示的核苷酸序列雜交的片段的DNA。
本發(fā)明涉及(1)一種多肽，含有SEQ.ID.NO.1中表示的氨基酸序列，(2)一種DNA，編碼上述(1)所描述的多肽，(3)一種DNA，含有SEQ.ID.NO.2中表示的核苷酸序列，和(4)一種DNA，含有SEQ.ID.NO.3中表示的核苷酸序列。
基本上為純化形式的SEQ.ID.NO.1的多肽通常含有制劑形式的多肽，其中制劑中超過90%，例如95%，98%或99%的多肽是來自SEQ.ID.NO.1。
SEQ.ID.NO.1的多肽同系物一般與SEQ.ID.NO.1的多肽至少有70%，優(yōu)選至少有80%或90%，更優(yōu)選至少95%的同源性，同源區(qū)域至少為20個(gè)鄰近的氨基酸優(yōu)選至少30，例如40，60或100或更多。這種多肽類似物在下文中提及時(shí)是稱作為本發(fā)明的多肽。
通常，SEQ.ID.NO.1的片段或它的同系物的氨基酸長度至少為10個(gè)，優(yōu)選至少為15個(gè)，例如20，25，30，40，50或60個(gè)，它包含在本文所用的“根據(jù)本發(fā)明的多肽”一詞中。
能選擇性地與SEQ.ID.NO.2或3的DNA雜交的DNA通常與SEQ.ID.NO.2或3的DNA至少具有70%的同源性，優(yōu)選至少80%或90%，更優(yōu)選至少95%的同源性，同源區(qū)為至少20個(gè)相鄰核苷酸，優(yōu)選至少30，例如40，60或100或更多。這種DNA包含在“根據(jù)本發(fā)明的DNA”一詞中。
SEQ.ID.NO.2或3的DNA片段長度至少為15個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少20，例如25，30或40個(gè)，它也包含在本文所用的“根據(jù)本發(fā)明的DNA”一詞中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例是提供了含有根據(jù)本發(fā)明的DNA的復(fù)制和表達(dá)載體，這種載體可以是例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，其中配備了復(fù)制起點(diǎn)，還可以含有或不含有用來表達(dá)所說DNA的啟動(dòng)子，以及含有或不含有此啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)基因。此載體可含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，如氨芐西林抗性基因，此載體可用于體外實(shí)驗(yàn)，如制備DNA相應(yīng)的RNA，或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
本發(fā)明又一實(shí)施例提供了用載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞以復(fù)制和表達(dá)本發(fā)明的DNA，包括SEQ.ID.NO.2或3的DNA或者它們的開放閱讀框架。可選擇與載體相容的細(xì)胞，可以是例如細(xì)菌，酵母，昆蟲或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
本發(fā)明的再一實(shí)施例提供了生產(chǎn)多肽的方法，該方法包括在表達(dá)本發(fā)明多肽的有效的條件下培養(yǎng)本發(fā)明宿主細(xì)胞。另外，此方法進(jìn)行的優(yōu)選條件是使本發(fā)明的多肽被表達(dá)再從宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。
本發(fā)明的DNA也可以反意義方向插入上述載體中以證實(shí)反義RNA的產(chǎn)生。反義RNA也可通過合成途經(jīng)產(chǎn)生，這種反義RNA也可用于控制細(xì)胞中本發(fā)明多肽的水平的方法中。
本發(fā)明還提供了抗本發(fā)明的多肽的單克隆或多克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生本發(fā)明多肽的單克隆或多克隆抗體的方法。單克隆抗體的制備可利用通常的雜交瘤技術(shù)，并使用本發(fā)明的多肽或其片段作為免疫原。多克隆抗體的制備也可用通常的方法，包括用本發(fā)明多肽接種宿主動(dòng)物，如大白鼠或兔子，再回收免疫血清。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明多肽或其抗體的藥用組合物，它與藥用可接受的稀釋劑和/或載體相結(jié)合。
本發(fā)明的多肽包括那些部分氨基酸序列缺失的多肽(例如一多肽僅含SEQ.ID.NO.1氨基酸序列中揭示生命活性所必需的序列)，和那些部分氨基酸序列被其它氨基酸取代的多肽(例如那些被具有相似性質(zhì)氨基酸所取代的多肽)以及由其它氨基酸加入或插入它們部分氨基酸序列中的多肽，還包括那些具有SEQ.ID.NO.1氨基酸序列的多肽。
眾所周知，有1至6種密碼子可作為編碼一種氨基酸的密碼子(例如，已知編碼甲硫氨酸(Met)的有一種密碼子編碼，而編碼亮氨酸(Leu)的有6種密碼子編碼)。相應(yīng)地，可改變DNA的核苷酸序列以編碼具有相同氨基酸序列的多肽。
在(2)中特指的本發(fā)明的DNA包括一組DNA，該DNA組中每種核苷酸序列都編碼SEQ.ID.NO.1中的多肽(1)，有可能通過改變核苷酸序列來提高多肽的產(chǎn)量。
(3)中特指的DNA是(2)中所述DNA的具體化，是自然狀態(tài)的序列。
(4)中所示的DNA是具有未轉(zhuǎn)譯區(qū)的(3)中特指的DNA序列。
本發(fā)明的DNA可通過基因重組、化學(xué)合成或本領(lǐng)域熟練人員已知的方法得到。
人的PD-1包括一系列在結(jié)構(gòu)特征上與Fas抗原不相同、在哺乳動(dòng)物中普遍存在的多肽。這就是說，本發(fā)明的PD-1包括本發(fā)明中公開的人的PD-1以及具很高同源性的其它哺乳動(dòng)物的PD-1(這意味著免疫作用相同，可與人PD-1抗原發(fā)生交叉反應(yīng))。
以下是人的PD-1的結(jié)構(gòu)特征人的PD-1被預(yù)言為膜結(jié)合型蛋白質(zhì)，它含有288個(gè)氨基酸，含有兩個(gè)疏水區(qū)，一個(gè)在N末端另一個(gè)在中間，可能分別擔(dān)當(dāng)信號(hào)肽和轉(zhuǎn)膜部分的作用。
將PD-1蛋白質(zhì)的N-末端序列與典型的信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)相比較表明信號(hào)肽位于Met1至Arg20區(qū)。因此預(yù)想的PD-1蛋白質(zhì)的成熟形式含有268個(gè)氨基酸，以及含有一個(gè)細(xì)胞外區(qū)(147個(gè)氨基酸)，一個(gè)轉(zhuǎn)膜區(qū)(27個(gè)氨基酸)和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)區(qū)(94個(gè)氨基酸)，在被公認(rèn)的細(xì)胞外區(qū)發(fā)現(xiàn)了四個(gè)潛在的N-糖基化作用的位點(diǎn)。
將PD-1蛋白質(zhì)的氨基酸序列與國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)數(shù)據(jù)庫中所收錄的所有序列相比較表明PD-1蛋白質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)與免疫球蛋白總庫的某些成員具有同源性。根據(jù)保守的氨基酸模式和反向平行的β鏈的數(shù)目可將免疫球蛋白區(qū)域分為V、C1和C2三部分。在PD-1的兩個(gè)半胱氨酸殘基(Cys54和Cys123)之間的68個(gè)氨基酸殘基與V部分序列的二硫鍵連接的免疫球蛋白部分很相似。而且，許多V部分序列特征性的所有四個(gè)氨基酸殘基在PD-1中也是保守的。(Arg94，Phe95，Asp117和Gly119)。
預(yù)想的PD-1蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有共有序列的不同形式(Asp/Glu-X8-Asp/Glu-X2-Tyr-X2-Leu/Ile-X7-Tyr-X2-Leu/Ile)，這些共有序列見于與抗原受體和Fc受體相關(guān)的大多數(shù)多肽的細(xì)胞質(zhì)區(qū)的后部。最近的研究表明此共有序列的一個(gè)信號(hào)單位就足夠用來轉(zhuǎn)換信號(hào)。
據(jù)認(rèn)為其它哺乳動(dòng)物的PD-1在結(jié)構(gòu)特征上與人的PD-1相類似，無論如何，在它們的序列中，氨基酸的數(shù)目或種類是不相同的。
本發(fā)明中編碼人的PD-1的DNA可以以下述方法制備。
一旦確定了SEQ.ID.NO.2和3所表示的核苷酸序列，本發(fā)明的DNA就可通過化學(xué)合成和PCR的方法得到，或通過利用本發(fā)明的DNA片段作為探針的雜交法得到。另外，通過將插入了本發(fā)明的DNA的載體DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主細(xì)胞，接著培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子的方法就可得到所需量的本發(fā)明的DNA。
本發(fā)明的PD-1多肽(見SEQ.ID.NO.1)可按下述方法制備(1)分離和純化生物體或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞，(2)化學(xué)合成，或(3)利用生物技術(shù)的方法，優(yōu)選的是(3)中所描述的方法。
利用生物技術(shù)制備多肽時(shí)所用的表達(dá)系統(tǒng)的例子如細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。
例如，通過在編碼成熟肽類的DNA 5′端加上起始密碼子(ATG)，將由此得到的DNA與適當(dāng)啟動(dòng)子的下游相連接(如trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，λPL啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子等)，再將它插入在E.Coli菌株中行使功能的載體中(如pBR322，pUC18，pUC19等)以制備一表達(dá)載體，從而實(shí)現(xiàn)在E.Coli中的表達(dá)。
然后將由此得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種E.Coli菌株(如E.Coli DH1菌株，E.Coli JM109菌株，E.Coli HB101菌株等)，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此菌株以獲得所需的多肽，當(dāng)利用了細(xì)菌的信號(hào)肽時(shí)(如pel B的信號(hào)肽)，所需的多肽也可釋放到周質(zhì)中，而且與其它多肽的融合蛋白質(zhì)也很容易產(chǎn)生。
另外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也可進(jìn)行表達(dá)，例如，將編碼PD-1的總DNA插入適當(dāng)載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，乳頭狀瘤病毒載體，痘苗病毒載體，SV40載體等)的適當(dāng)啟動(dòng)子的下游(如SV40啟動(dòng)子，LTR啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng)子等)以得到一表達(dá)載體，再將由此得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞(如猴的COS-7細(xì)胞，中國倉鼠CHO細(xì)胞，鼠L細(xì)胞等)，然后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子以在培養(yǎng)基中得到所需的多肽，由此得到的多肽可通過常規(guī)的生物化學(xué)方法分離和純化。
編碼本發(fā)明所得PD-1基因的DNA可用作分離其它動(dòng)物PD-1基因的探針。
可通過下述方法制備含有SEQ.ID.NO.3中所述核苷酸序列的cDNA，即(ⅰ)從產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞系中分離出mRNA(如人的食道癌細(xì)胞系)，(ⅱ)從由此得到的mRNA制備第一條鏈(單鏈DNA)，再制備第二條鏈(雙鏈DNA)(合成cDNA)(ⅲ)將由此得到的cDNA插入一合適的噬菌體載體中，(ⅳ)將由此得到的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(制備cDNA文庫)(ⅴ)利用鼠PD-1的cDNA作為探針，與由上得到的cDNA文庫進(jìn)行噬菌斑雜交而進(jìn)行篩選，(ⅵ)從所得陽性克隆中制備噬菌體DNA，亞克隆釋放入質(zhì)粒載體的cDNA，繪制限制性酶切圖譜，和(ⅶ)測定每一個(gè)限制性酶切片段的序列，將它們連接起來就可得到完整長度的全部序列。
詳細(xì)地說，步驟(ⅰ)可根據(jù)Okayama.H.et.al.的方法(見于Methods in Enzymology，Vol.154，P3，1987)來進(jìn)行，即從人的細(xì)胞系中分離mRNA要先經(jīng)過合適的刺激劑(如IL-1等)的刺激作用，或者不經(jīng)過刺激作用。產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞的例子優(yōu)選人的細(xì)胞系YTC3。
步驟(ⅱ)，(ⅲ)和(ⅳ)是制備cDNA文庫的一系列步驟，可根據(jù)Gubler & Hoffman(Gene，Vol.25.pp.263，1983)的方法進(jìn)行，只需稍加改變，在步驟(ⅲ)中使用的質(zhì)粒載體的例子有許多已知的質(zhì)粒載體(如pBR322，pBluesciptⅡ)和噬菌體載體(如λgt10，λDASHⅡ)，優(yōu)選使用噬菌體載體λgt10(43.3 kbpStratagene)。
步驟(ⅳ)中所使用的宿主細(xì)胞優(yōu)選E.Coli NM514(Stratagene)。
步驟(ⅴ)和(ⅵ)可根據(jù)Molecular Cloning(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，和Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))中所述方法進(jìn)行。
步驟(ⅶ)可根據(jù)Molecular Cloning(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，編寫，Cold Spring harbor Laboratory Press，1989年出版)中所述方法進(jìn)行。
步驟(ⅶ)的測序可根據(jù)Maxam-Gilbert的方法或雙脫氧終止法進(jìn)行。
有必要檢驗(yàn)由此得到的cDNA是否編碼完整或幾乎完整的長度，該驗(yàn)證可使用所述cDNA作為探針，通過Northern分析來進(jìn)行。(見上述Molecular Cloning)，據(jù)認(rèn)為如果CDNA的長度與在雜交帶中所得mRNA的長度幾乎相同，cDNA就幾乎是完整的長度。
編碼PD-1基因的DNA或者DNA片段可用作探針或引物以識(shí)別PD-1基因，因此可用于研究所述多肽和活的有機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，免疫功能或象腫瘤這類的疾病之間的關(guān)系，或者用于診斷疾病及其類似的目的。
本發(fā)明的DNA可用作重要和必需的模板以通過常規(guī)的基因重組來制備PD-1的多肽，以及被期望有不同的用途的該多肽的片段或其衍生物。
我們期望多肽，其多肽片段及其衍生的多肽可用于治療感染，免疫功能或腫瘤的遏制或加強(qiáng)。
另外，本發(fā)明多肽或多肽片段的多克隆和單克隆抗體可通過常規(guī)方法制備，它們可用于對(duì)有機(jī)體中所含的上述多肽進(jìn)行定量，因此可用來研究上述多肽和疾病之間的關(guān)系，或用于診斷疾病及其類似目的。上述單克隆抗體本身，針對(duì)人的抗體的嵌合體抗體可用作治療劑，它的多克隆和單克隆抗體的制備利用上述的多肽或其片段作為抗原可通過常規(guī)的方法來實(shí)現(xiàn)。
為了本發(fā)明的目的，本發(fā)明的多肽可系統(tǒng)地或部分地正常給藥，通常是口腔或非腸給藥，優(yōu)選口腔、靜脈內(nèi)或心室內(nèi)給藥。
給藥的劑量需由年齡、體重、癥狀、所需達(dá)到的治療效果、給藥途經(jīng)、治療的持續(xù)時(shí)間等來決定，對(duì)于成年人，口服給藥時(shí)每人每天的劑量通常在100μg和100mg之間，每天幾次服藥，通過非腸道給藥時(shí)，劑量為10μg和100mg之間，每天幾次給藥。
如上所述，所用劑量隨條件不同而變化，因此，在某些病例中，使用的劑量會(huì)比上面所規(guī)定范圍低或者高。
本發(fā)明的化合物給藥時(shí)，對(duì)于口服而言可以是固體組合物，液體組合物或其它組合物，對(duì)于非腸道給藥，可以是針劑，涂抹劑或栓劑等。
口服的固體組合物包括濃縮的藥片、藥丸、膠囊，分散的粉末，顆粒。膠囊包括軟膠囊和硬膠囊。
在這種組合物中，一種或多種有活性的化合物與至少一種惰性稀釋劑相混合(如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微結(jié)晶的纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、鎂的硅鋁酸鹽等)。這種組合物在常規(guī)臨床使用中也可含有除惰性稀釋劑外的附加物質(zhì)如潤滑劑(如鎂的硬脂酸鹽等)，崩解劑(如纖維素鈣甘醇酸酯等)、穩(wěn)定劑(如人的血清蛋白、乳糖等)以及用于溶解的輔劑(如精氨酸、天冬氨酸等)。
如果需要，片劑或丸劑要包裹一層胃或腸包衣材料所制的膜(如糖、明膠、羥丙基纖維素或羥丙甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等)，或者包裹兩層以上的膜，而且外膜可包括膠囊內(nèi)容物中可吸收的物質(zhì)，例如明膠。
口服的液體組合物包括藥用可接受的乳劑、溶液、糖漿和酏劑。在這種組合物中，本領(lǐng)域通常使用的惰性稀釋劑中含有一種或多種活性的化合物(純化水、乙醇等)，除了惰性稀釋劑，此類組合物也可含有輔藥(如濕潤劑、懸浮劑等)、增甜劑、調(diào)味劑、香味劑或保存劑。
口服的另一些組合物包括噴霧組合物，它可由已知方法制備，含有一種或多種活性化合物。噴霧組合物可含有附加的物質(zhì)而不是惰性稀釋劑如穩(wěn)定劑(亞硫酸鈉等)，等滲緩沖液(氯化鈉，檸檬酸鈉，檸檬酸等)。為了制備這種噴霧組合物，可使用例如美國專利NO.2，868，691或3，095，355中描述的方法(引入本文以供參考)。
非腸道給藥的注射劑包括無菌水或非水溶液，懸浮液和乳劑。在這種組合物中，一種或多種有活性的化合物與至少與一種惰性水稀釋液(注射用蒸餾水、生理鹽水等)或惰性非水稀釋液相混合(丙二醇，聚乙二醇、橄欖油、乙醇、POLYSOLBATE 80 TM等)。
注射液可含有附加化合物而不是惰性稀釋劑、如保護(hù)劑，濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(如人的血清蛋白、乳糖等)、和輔劑，如幫助溶解的輔劑(精氨酸，天冬氨酸等)。
它們必需經(jīng)過滅菌，例如通過細(xì)菌截留濾器的過濾作用，通過將滅菌劑與組合物相混合或者通過紫外照射來滅菌。它們也可以無菌固體組合物形式來制得，如凍干的形狀，在使用前可在無菌水或一些其它無菌稀釋液中很快溶解以用來注射。
非腸道給藥的其它組合物包括外部用藥的液體，和皮下涂抹劑(軟膏等)、直腸給藥的栓劑和陰道藥栓，它含有一種或多種活性化合物，可由已知方法制得。
以下實(shí)施例闡明但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)將人的細(xì)胞系(CESS，HPB-ALL，Jarkat，TC3，CCRF-CEM，JM和MOLT-4F)培養(yǎng)于RPMI1640(Gibco)中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10%熱滅活的小牛血清，2mM谷酰胺，50μM2-巰基乙醇，100U/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素。
實(shí)施例2Northern blot分析使用異硫氰酸胍鹽抽提法(見上述(Molecular Cloning)從所指的細(xì)胞系中制備總RNA，用oligotex-dt 30<super>(DaiichiChemical Co.)從總RNA中分離出poly(A)+RNA。在1.2%甲醛瓊酯糖凝膠上分離3μg Poly(A)+RNA，再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Biodyne A，Japan Genetic)，將膜在80℃下烘烤2小時(shí)，給含有鼠PD-1編碼區(qū)的EcoRI片段(1kb)接上隨機(jī)引物，用32P標(biāo)記制備成探針。此探針的比活大約是9×108d.p.m。/μg。雜交在10×Denhardt′s，1MNacl，50m MTris(PH7.5).10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml經(jīng)聲波處理的鮭精DNA中進(jìn)行，65℃下反應(yīng)15小時(shí)，將膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗滌10分鐘，通過放射自顯影照片可從淋巴細(xì)胞系YTC3中觀察到雜交信號(hào)(2.3kb)。
實(shí)施例3cDNA文庫的構(gòu)建和人PD-1cDNA的克隆，利用5μg從使用Time saver合成試劑盒(pharmacia)YTC3細(xì)胞系中抽提到的5μg，poly(A)+RNA構(gòu)建cDNA文庫，用寡dT引物合成CDNA的第一條鏈，將雙鏈cDNA與EcoRI-NotI接受者相連接，克隆進(jìn)λgt10載體，包裝進(jìn)噬菌體中(Gigapack Ⅱ Gold，Stratagene)，噬菌體被鋪在E.ColiNM 514菌坪的上面。從每個(gè)平板上將噬菌體DNA轉(zhuǎn)染到二個(gè)重復(fù)的文庫濾膜上，將濾膜在80℃下烘烤2小時(shí)，在60℃下雜交15小時(shí)，從Bluescript SK質(zhì)粒載體(Stratagene)中用EcoRI切割出鼠PD-1的編碼區(qū)(1kb)用作探針，將濾膜在1×SSC和0.1%SDS中，60℃下洗滌10分鐘，通過放射自顯影照片可在1.2×106個(gè)噬菌體中找到51個(gè)陽性信號(hào)。將這些克隆純化至單一形式，進(jìn)一步分析所檢得的大約23個(gè)克隆，所觀察到插入的最長的cDNA是2.1kb，這個(gè)結(jié)果與Southern Bolt分析得到的結(jié)果是一致的。
實(shí)施例4DNA序列測定將從人的cDNA文庫分離得到的cDNA插入物亞克隆進(jìn)Bluescript SK質(zhì)粒載體(Stratagene)，使用經(jīng)修飾的T7 DNA多聚酶(United States Biochemical)和[α-32P]d CTP(3000Ci/mmol，Amersham)，通過雙脫氧核苷酸鏈終止法測定其序列。將Bluescript質(zhì)粒特有的引物用作測序引物。核苷酸測序針對(duì)cDNA的兩條鏈完整地進(jìn)行，從結(jié)果看，得到了seQ.NO.2中表示的核苷酸序列，從核苷酸序列中可確定推導(dǎo)出的肽的序列(見SEQ.ID.NO.1)，推導(dǎo)出的氨基酸的總數(shù)目是288，其數(shù)目與鼠PD-1的氨基酸數(shù)目相同，互相之間具有60%的同源性。
實(shí)施例5Southern Blotting用常規(guī)方法(見上述分子克隆)從多種動(dòng)物細(xì)胞中分離出基因組DNA，應(yīng)用EcoR I，BamHI或HindⅢ消化DNA，接著根據(jù)制造商的說明電泳分離DNA片段(100V，0.8%瓊脂糖凝膠，TEA緩沖液)，用0.25N HCl洗滌DNA片段10分鐘，用0.2N NaOH/0.6M NaCl建立變性30分鐘，用0.6M NaCl/0.2MTris(PH7.5)處理1小時(shí)以中和反應(yīng)，將DNA片段轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)Southern程序所用的尼龍膜(Bidyne A)上，將此膜烘烤2小時(shí)。
給含有人PD-1編碼區(qū)的EcoRI-Stul片段(900bp)接上隨機(jī)引物用32P標(biāo)記制成探針，探針的比活大約是9×108d.P.m/μg，雜交在10×Denhardt′s，1M Nacl，50mMTris(PH7.5)，10mMEDTA，1%SDS和1mg/ml經(jīng)聲波處理的鮭精DNA中進(jìn)行，65℃下反應(yīng)10分鐘，將膜置于1×SSC，0.1%SDS中，65℃下洗滌10分鐘，當(dāng)克隆經(jīng)過任何一種酶切割后，放射自顯影照片中只能見到僅有的一條帶，因此發(fā)現(xiàn)人的PD-1基因是作為單一拷貝存在的。
各種動(dòng)物基因組DNA的Southern雜交可按與實(shí)施例2中描述的同樣的條件(雜交和洗滌)，利用含鼠PD-1編碼區(qū)的EcoRI片段(1kb)作為探針來完成，只能在鼠和人的基因組DNA中看到雜交信號(hào)，在果蠅、非洲爪蟾和兔的基因組DNA中看不到雜交信號(hào)。
實(shí)施例6人的PD-1基因組克隆的分離通過用Sau3A1部分消化和與BamHI位點(diǎn)連接，可在λDASHII載體上構(gòu)建來源于食道癌細(xì)胞系的基因組DNA文庫(從Dr.Nishiyama，lst Dept.of Pathology，School of Medicine，KyotoUniversity)得到，用EcoRI消化Bluescript SK載體切割得到人PD-1的總CDNA，通過與之雜交可從此文庫中分離得到人的PD-1基因，通過接上隨機(jī)引物，探針被32P標(biāo)記，從1×106個(gè)噬菌斑中分離純化出兩個(gè)陽性克隆，用幾種限制性內(nèi)切酶消化，用同一種探針進(jìn)行Southern雜交分析，從CISS(染色體原位抑制)中發(fā)現(xiàn)人的PD-1基因圖譜位于2q37.3。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名ONO PHARMACEUTICAL CO.，LTD.
(B)街道1-5，Doshomachi 2-chome(C)城市Chuo-ku，Osaka-shi(D)州Osaka(E)國家Japan(F)郵編(ZIP)541(A)姓名HONJO，TASUKU(B)街道Kan′Yuchi，Kitashirakawa Oiwakecno，Sakyo-ku(C)城市Kyoto-shi(D)州Kyoto(E)國家Japan(F)郵編(ZIP)606(ⅱ)發(fā)明名稱與人類細(xì)胞逐漸死亡相關(guān)的一種新的肽類及其編碼它的DNA(ⅲ)序列數(shù)目4
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度288個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1

(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度864個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度921堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度921個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)股數(shù)單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型mRNA的cDNA(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體Homo Sapiens(H)細(xì)胞系YTC3
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)25..888(C)鑒別方法P(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Sig-peptide(B)位點(diǎn)25..84(C)鑒別方法S(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞mat-peptide(B)位點(diǎn)85..888(C)鑒別方法S(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO.4

權(quán)利要求
1.一種基本上純化形式的多肽，含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，該多肽的同系物或者該序列的片段或者片段的同系物，
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，它含有SEQ.ID.NO.1中所述的氨基酸序列，
3.一種DNA，編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，
4.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.2中所述的核苷酸序列或它的，能選擇性與SEQ.ID.NO.2雜交的片段，
5.根據(jù)權(quán)利要求3的DNA，含有SEQ.ID.NO.3中所述的核苷酸序列或它的，能選擇性地與SEQ.ID.NO.3.雜交的片段，
6.一種復(fù)制和表達(dá)載體，含有根據(jù)權(quán)利要求3至5中任何一個(gè)的DNA，
7.用根據(jù)權(quán)利要求6的復(fù)制和表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
8.一種產(chǎn)生多肽的方法，包括在有效表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽的單克隆抗體或多克隆抗體，
10.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1或2的多肽或者一種根據(jù)權(quán)利要求9的抗體的藥用組合物，其中抗體或多肽與一種藥用可接受的稀釋劑和/或載體相結(jié)合。
全文摘要
一種新的與人的細(xì)胞逐漸死亡(PD-1)相關(guān)的膜蛋白和編碼這種蛋白質(zhì)的DNA，PD-1蛋白質(zhì)可用于治療不同的感染，免疫抑制或加強(qiáng)，或腫瘤等。
文檔編號(hào)C07K14/705GK1113518SQ9510327
公開日1995年12月20日 申請(qǐng)日期1995年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月1日
發(fā)明者本庶佑, 石田靖雄, 篠原隆司 申請(qǐng)人:小野藥品工業(yè)株式會(huì)社, 本庶佑