以在癌干細胞中表達的分子為靶標的癌癥診斷和治療方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及以在癌干細胞中表達的分子為靶標的癌癥診斷和治療方法，特別地， 涉及用于確定癌惡性程度的方法，癌預后評估方法，癌抗原肽，用于制造用于過繼性免疫的 細胞組合物的方法，以及癌預防、癌治療、癌轉移遏制或癌復發(fā)遏制劑。
【背景技術】
[0002] 日益增加的證據(jù)表明，大多數(shù)實體瘤由異質性的腫瘤細胞構成，相對小的細胞亞 群顯示出獨特的特征，包括：高的致腫瘤性（tumorgenicity)、作為非粘附性球體生長、無 限自更新、和非對稱性分化。該獨特的亞群的成員具有正常干細胞所具有的生物學、生物 化學和分子學特征，因此被稱為癌干細胞（cancer stem cells，CSC)。在經(jīng)典的CSC模型 中，CSC亞群與相對分化的、主體癌細胞群（bulk cancer population)之間的遞進關系 (hierarchy)是嚴格且單向的。但近來的數(shù)據(jù)顯示，CSC和分化的癌細胞可在受調控的平衡 下雙向轉化（非專利文獻1)。
[0003] 有報道稱，在具有細胞毒性的化療和分子靶向治療后存活的極少量細胞展現(xiàn)出對 ⑶133 (可能的CSC標志物之一）的一致性表達（非專利文獻2和3)。因為CSC具有抵抗細 胞死亡的多種機制：例如改變的染色質狀態(tài)、過量的多藥排出轉運蛋白（multidrug efflux transporters)、抗凋亡因子、DNA修復基因產(chǎn)物和干細胞特異性生長信號機制，因此CSC可 在致死性脅迫（例如具有細胞毒性的抗癌藥物、分子靶向治療劑和放療）下存活。在此類 致死性脅迫下存活的這些獨特的癌細胞亞群可產(chǎn)生永久的、耐藥的細胞群，所述細胞群具 有遺傳突變，并且可用作為母細胞（非專利文獻2)。因此，CSC系統(tǒng)是大多數(shù)的治療失敗和 癌復發(fā)的最可能的原因。除非開發(fā)出能夠摧毀CSC亞群的有效治療，否則極難實現(xiàn)持久性 的治愈。因此，人們需要用于摧毀CSC亞群的有效治療。
[0004] 參考文獻 [0005] 非專利文獻
[0006] 非專利文獻 I :Li Y, Laterra J. Cancer stem cells: distinct entities or dynamically regulated phenotypes ? Cancer research. 2012 ；72:576-80
[0007] 非專利文獻 2 :Sharma SV，Lee DY, Li B，Quinlan MP，Takahashi F，Maheswaran S，et al. A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations· Cell. 2010 ;141:69-80
[0008] 非專利文獻 3 :Rappa G，F(xiàn)odstad 0,Lorico A. The stem cell-associated antigen CD133(Prominin-1)is a molecular therapeutic target for metastatic melanoma. Stem Cells. 2008 ;26:3008-17

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明解決的技術問題
[0010] 本發(fā)明的目的之一是提供用于確定癌惡性程度的新方法，新的癌預后評估方法， 新的癌抗原肽，用于制造用于過繼性免疫的細胞組合物的新方法，和新的癌預防、癌治療、 癌轉移遏制或癌復發(fā)遏制劑。
[0011] 解決技術問題的方案
[0012] 本申請的發(fā)明人以前曾報道，在腫瘤引流淋巴結中經(jīng)腫瘤抗原初免疫 (primed)的效應T細胞在腦、肺和皮膚轉移模型中具有抗腫瘤治療效果（Kagamu H, Shu S. Purification of L-selectin(low)cells promotes the generation of highly potent CD4 antitumor effector T lymphocytes. J Immunol. 1998 ; 160:3444-52.、Fujita N1Kagamu H1Yoshizawa H1Itoh K1Kuriyama H1Matsumoto N, et al. CD401igand promotes priming of fully potent antitumor CD4(+)T cells in draining lymph nodes in the presence of apoptotic tumor cells. J Immunol. 2001;167:5678-88)。再后來，本申請 的發(fā)明人注目于CSC標志物之一⑶133,并且成功地純化出了⑶133陽性黑色素瘤細胞，其 在總的黑色素瘤細胞中占少于1%。該⑶133陽性黑色素瘤細胞具有CSC性質。本發(fā)明的 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用黑色素瘤CSC進行接種誘導出了特異性CD8陽性T細胞，其包括輔助T細胞 17 (Thl7細胞）和Thl細胞。特別地，黑色素瘤CSC特異性⑶4陽性T細胞驅動效應器T細 胞和具有高表達的MHC II類分子的活性樹突狀細胞在腫瘤細胞中的長期積累，展示出強的 抗腫瘤效果。調控T細胞（Treg)(典型地被發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織中）在注射了黑色素瘤CSC特 異性CD4陽性T細胞的小鼠中沒有被誘導。此外，該治療摧毀了 CD133陽性腫瘤細胞，由此 使得親本黑色素瘤（parental melanomas)治愈。這些結果顯示，⑶133陽性黑色素瘤細胞 具有特異性的免疫原性抗原，以及，抗原特異性T細胞具有迄今未見的水平的、能摧毀CSC 的抗腫瘤活性。
[0013] 為了對優(yōu)先表達于CD133陽性腫瘤細胞中的免疫原性蛋白質加以闡明，本申 請的發(fā)明人使用二維電泳分析對蛋白質表達進行了比較，由此鑒定出了四種蛋白質。 基于質譜（MS/MS)分析數(shù)據(jù)的Mascot檢索將這些蛋白質之一鑒定為連接X的DEAD/ H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒多肽 3(DDX3X)。
[0014] 該蛋白質是ATP依賴性RNA解旋酶（heI icase) DEAD盒家族（DEAD盒解旋酶） 的成員，位于X染色體上。DEAD盒解旋酶具有多種功能，包括RNA剪切、從細胞核向胞質 運出mRNA、轉錄和翻譯調控、RNA分解和核糖體生物發(fā)生（Rocak S，Linder P.DEAD-box proteins:the driving forces behind RNA metabolism. Nature reviews Molecular cell biology. 2004 ;5:232-41)。DDX3X在進化上從酵母到人高度保守，這暗示其是細胞存活所 必需的。其具有位于Y染色體上的同源體DDX3Y，這兩個基因均在胚胎發(fā)生中發(fā)揮作用。 在人類中，DDX3X缺失或功能障礙導致生殖細胞形成受損（Matzuk麗,Lamb DJ. Genetic dissection of mammalian fertility pathways. Nat Cell Biol. 2002 ;4Suppl:s41-9)〇
[0015] 在本發(fā)明中，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DDX3X是⑶133陽性黑色素瘤細胞的主要免疫 原性靶標蛋白質。用合成的DDX3X進行接種在皮膚黑色素瘤治療模型中展示出腫瘤消退 (regression)效果。DDX3X在表達CSC標志物的人癌細胞系中強表達，但在正常的人上皮 細胞和正常的人內皮細胞中僅略微表達。
[0016] 本申請的發(fā)明人從上述結果設想：
[0017] 癌組織中的DDX3X表達水平可用作為癌惡性程度的指標；
[0018] DDX3X特異性T細胞在癌患者血液中的存在與否可用作為癌預后評估的指標；
[0019] DDX3X的部分肽（片段）可用作為癌疫苗；以及
[0020] 抗DDX3X免疫療法可能是有望摧毀CSC、由此治愈癌癥的有前途的策略。
[0021] 本申請的發(fā)明人進行了進一步研宄，并完成了本發(fā)明。
[0022] 本發(fā)明包括下述方面。
[0023] 項1、癌惡性程度評估方法，所述方法包括下述步驟：
[0024] 測量癌組織中的DDX3X表達水平的步驟；和
[0025] 通過使用所述DDX3X表達水平來評估癌組織的惡性程度的步驟。
[0026] 項2、癌惡性程度評估試劑盒，所述試劑盒包含：
[0027] 針對DDX3X的抗體、或者
[0028] 與DDX3X mRNA或相應的cDNA特異性結合的多核苷酸，
[0029] 其中，所述抗體或多核苷酸用于測量癌組織中DDX3X的表達水平。
[0030] 項3、癌預后評估方法，所述方法包括下述步驟：
[0031] 檢測癌患者的血液中DDX3X特異性T細胞的步驟；和
[0032] 通過使用檢測結果評估癌預后的步驟。
[0033] 項4、癌預后評估試劑盒，所述試劑盒包含：
[0034] DDX3X或其部分肽，
[0035] 其中，所述DDX3X或其部分肽用于檢測癌患者血液中的DDX3X特異性T細胞。
[0036] 項5、一種肽，其由：
[0037] 包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中SEQ ID NO :2至87中任一所示的氨基酸序列 的9~20個連續(xù)氨基酸的序列，或
[0038] 與上述氨基酸實質上相同的氨基酸序列
[0039] 構成。
[0040] 項6、根據(jù)項5所述的肽，其中，所述肽為癌抗原肽。
[0041] 項7、癌疫苗，其包含項5所述的肽。
[0042] 項7-2、根據(jù)項5所述的肽，其用于針對癌的疫苗。
[0043] 項8、根據(jù)項7所述的癌疫苗，其中，所述疫苗用于預防或治療癌，或用于遏制癌轉 移或癌復發(fā)。
[0044] 項9、制造過繼性免疫細胞的方法，所述方法包括下述步驟：
[0045] 用DDX3X或其部分肽對具有抗原呈遞能力的細胞進行脈沖的步驟。
[0046] 項10、經(jīng)DDX3X或其部分肽脈沖的抗原呈遞細胞。
[0047] 項11、DDX3X特異性細胞誘導劑，其包含項10所述的抗原呈遞細胞作為活性組分。
[0048] 項11-2、根據(jù)權利要求10所述的抗原呈遞細胞，其中所述抗原呈遞細胞用于誘導 DDX3X特異性T細胞。
[0049] 項12、制造過繼性免疫細胞組合物的方法，所述方法包括下述步驟：
[0050] 將具有抗原呈遞能力的細胞暴露給DDX3X或其部分肽、以獲得呈遞源于DDX3X或 其部分肽的抗原的細胞的步驟；和
[0051] 用所述抗原呈遞細胞誘導DDX3X特異性T細胞的步驟。
[0052] 項13、根據(jù)項12所述的方法，其中所述DDX3X特異性T細胞是DDX3X特異性CD4 陽性T細胞。
[0053] 項14、癌預防、癌治療、癌轉移遏制或癌復發(fā)遏制劑，包含抑制DDX3X表達或活性 的化合物。
[0054] 項14-2、抑制DDX3X表達或活性的化合物，所述化合物用于預防或治療癌、或用于 遏制癌的轉移或癌的復發(fā)。
[0055] 本發(fā)明的有益效果
[0056] 本發(fā)明的肽是癌抗原，其可用于提供用于確定癌惡性程度的方法，癌預后評估方 法，癌抗原肽，用于制造用于過繼性免疫的細胞組合物的方法，以及癌預防、癌治療、癌轉移 遏制或癌復發(fā)遏制劑，等等。
[0057] 附圖簡沐
[0058] 圖1是人DDX3X的氨基酸序列。
[0059] 圖2是展示由⑶8陽性T細胞進行的IFN- γ制造的圖（實施例1)。
[0060] 圖3是展示由⑶4陽性T細胞進行的IFN- γ和IL-17制造的圖（實施例1)。
[0061] 圖4是展示由⑶8陽性T細胞進行的IFN-γ制造的圖（實施例1)。
[0062] 圖5是展示由⑶4陽性T細胞進行的IFN- γ和IL-17制造的圖（實施例1)。
[0063] 圖6顯示了經(jīng)接種的小鼠的腫瘤生長曲線（實施例2)。
[0064] 圖7顯示了具有已建立的皮膚腫瘤的經(jīng)接種小鼠的腫瘤生長曲線（實施例3)。
[0065] 圖8顯示了經(jīng)接種的小鼠的腫瘤生長曲線（實施例4)。
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