Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞 的應(yīng)用及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] BDMatrigel是從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取出的基底膜基質(zhì)，其 主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬 蛋白酶等。在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞 基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)和分化，可用于對(duì)細(xì)胞形態(tài)、 生化功能、迀移、侵染和基因表達(dá)等的研宄。
[0003] 本課題組的前期實(shí)驗(yàn)研宄表明Nanog可以作為肝癌干細(xì)胞的新標(biāo)記物分子 (Hepatology. 2012, 56 (3) : 1004-14)，也就是說(shuō)，Nanog陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镹anog陽(yáng)性細(xì)胞即 意味著肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟└杉?xì)胞。并且本研宄小組利用Matrigel進(jìn)行Nanog陰性細(xì)胞 體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中，在體視顯微鏡下意外地觀察到Nanog陰性細(xì)胞所形成的移植瘤中出現(xiàn) Nanog陽(yáng)性細(xì)胞。據(jù)此，我們推測(cè)Matrigel很可能具有誘導(dǎo)Nanog陰性細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镹anog 陽(yáng)性細(xì)胞的作用，然而這一點(diǎn)現(xiàn)有技術(shù)并無(wú)相關(guān)報(bào)道，因此，本發(fā)明在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研宄 Matrigel能否作為逆轉(zhuǎn)劑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟└杉?xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的應(yīng)用， 通過(guò)Matrigel的誘導(dǎo)，能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤干細(xì)胞；得到的腫瘤干細(xì)胞可以用于腫 瘤治療藥物的篩選以及用于腫瘤細(xì)胞發(fā)生機(jī)制的研宄。
[0005] 本發(fā)明還提供了Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下：
[0007] 1、Matrigel在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。
[0008] 優(yōu)選的，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
[0009] 優(yōu)選的，所述肝癌細(xì)胞為PLC/PRF/5細(xì)胞或Huh7細(xì)胞。
[0010] 3、Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0011] (1)將腫瘤細(xì)胞溶液與Matrigel混合，得到混合液；
[0012] (2)將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即得腫瘤干細(xì)胞。
[0013] 優(yōu)選的，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中所述肝癌細(xì)胞溶液的細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL，肝癌細(xì)胞溶 液與Matrigel按1:1的體積比混合。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟（2)中所述細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為1周。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（1)中所述肝癌細(xì)胞溶液為Nanog陰性細(xì)胞溶液；所述Nanog陰 性細(xì)胞為肝癌細(xì)胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表現(xiàn)為綠色螢光蛋白不表達(dá)的細(xì)胞。
[0017] 4、上述方法逆轉(zhuǎn)得到的腫瘤干細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：在體外環(huán)境中肝癌細(xì)胞很難轉(zhuǎn)化為肝癌干細(xì)胞，但是采 用Matrigel進(jìn)行誘導(dǎo)則能夠促進(jìn)這種轉(zhuǎn)變的發(fā)生，從而得到肝癌干細(xì)胞。得到的肝癌干細(xì) 胞可以用于腫瘤治療藥物的篩選以及用于肝癌細(xì)胞發(fā)生機(jī)制的研宄。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0020] 圖INanog陰性細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生逆轉(zhuǎn)；具體為Huh7細(xì)胞Nanog陰性細(xì)胞體內(nèi)成瘤 后體視顯微鏡（放大倍數(shù)10倍）觀察結(jié)果，通過(guò)顯微鏡可以觀察到綠色熒光出現(xiàn)；圖中的 百分比為流式檢測(cè)細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞的比例。
[0021] 圖2為將Nanog陰性細(xì)胞形成的移植瘤中Nanog陽(yáng)性和陰性細(xì)胞再次分離后，兩 種細(xì)胞的克隆和成球能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；其中GFP陽(yáng)性細(xì)胞的克隆形成效率和細(xì)胞球形成效率 均高于GFP陰性細(xì)胞。
[0022] 圖3Matrigel誘導(dǎo)Nanog陰性細(xì)胞體外逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；所用細(xì)胞為Huh7細(xì)胞，誘 導(dǎo)組加入Matrigel;對(duì)照組用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基替代Matrigel，將Nanog陰性細(xì)胞 分別經(jīng)過(guò)含Matrigel和不含Matrigel的對(duì)照條件培養(yǎng)6天后流式檢測(cè)，圖中A為對(duì)照組 顯微鏡觀察及流式結(jié)果，B為Matrigel誘導(dǎo)組顯微鏡觀察及流式結(jié)果，在Matrigel誘導(dǎo)組 觀察到了明顯的綠色熒光出現(xiàn)，流式檢測(cè)陽(yáng)性率為5. 3%。
[0023] 圖4為Matrigel體外誘導(dǎo)后得到的Nanog陽(yáng)性細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果；圖中A為誘導(dǎo) 逆轉(zhuǎn)形成的Nanog陽(yáng)性細(xì)胞成球結(jié)果，圖中B為未經(jīng)誘導(dǎo)的普通Nanog陽(yáng)性細(xì)胞成球結(jié)果； 與普通經(jīng)流式分選得到的Nanog陽(yáng)性細(xì)胞相比，逆轉(zhuǎn)形成的GFP陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)出基本一致 的成球能力。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0025] 本發(fā)明所述Nanog陰性細(xì)胞是指細(xì)胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表現(xiàn)為 GFP(綠色螢光蛋白）不表達(dá)的細(xì)胞，Nanog陽(yáng)性細(xì)胞是指細(xì)胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒 后表現(xiàn)為GFP表達(dá)的細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明所用肝癌細(xì)胞系為PLC/PRF/5細(xì)胞和Huh7細(xì)胞，PLC/PRF/5細(xì)胞購(gòu)于 ATCC ;Huh7細(xì)胞來(lái)源于本課題組庫(kù)存。
[0027] 本發(fā)明所用儀器如表1所示。
[0028] 表1實(shí)驗(yàn)儀器
[0029]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. Matrigel在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的試劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述肝癌細(xì)胞為PLC/PRF/5細(xì)胞或Huh7 細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求1所述Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于，包 括如下步驟： (1) 將腫瘤細(xì)胞溶液與Matrigel混合，得到混合液； (2) 將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即得腫瘤干細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟（1)中所述肝癌細(xì)胞溶液的細(xì)胞濃 度為1〇4個(gè)/mL，肝癌細(xì)胞溶液與Matrigel按1:1的體積比混合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟⑵中所述細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為1周。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述步驟（1)中所述肝癌細(xì)胞溶液為Nanog 陰性細(xì)胞溶液；所述Nanog陰性細(xì)胞為肝癌細(xì)胞感染Lv-pNanog-GFP慢病毒后表現(xiàn)為綠色 螢光蛋白不表達(dá)的細(xì)胞。
9. 由權(quán)利要求4?8任一項(xiàng)所述方法逆轉(zhuǎn)得到的腫瘤干細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Matrigel誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為腫瘤干細(xì)胞的應(yīng)用及方法，將腫瘤細(xì)胞溶液與Matrigel混合，得到混合液；將混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即得到逆轉(zhuǎn)的腫瘤干細(xì)胞。得到的腫瘤干細(xì)胞可以用于腫瘤細(xì)胞發(fā)生機(jī)制的研究，也可以用于藥物篩選。
【IPC分類】C12N5-095
【公開(kāi)號(hào)】CN104593328
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410849661
【發(fā)明人】錢(qián)程, 沈俊杰, 單娟娟
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2014年12月30日