肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物cd63及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物CD63及其應(yīng)用，并通過該表面標(biāo)志物從肝臟中快速分離和培養(yǎng)擴(kuò)增肝干細(xì)胞的方法。具體涉及應(yīng)用肝干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)志物，通過流式分選的方法從肝臟細(xì)胞懸液中快速分離出肝干細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)肝干細(xì)胞在體外的擴(kuò)增和雙向分化，以及在肝臟疾病動(dòng)物模型肝臟內(nèi)的再植。
【背景技術(shù)】
[0002]組織干細(xì)胞是指存在于個(gè)體已經(jīng)分化的組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞具有自我更新和特化形成該組織的細(xì)胞的能力。組織干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中，是組織器官穩(wěn)態(tài)維持的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。成年個(gè)體組織中的組織干細(xì)胞在正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，只有在病理狀態(tài)或在外界因素的作用下才能被激活增殖并向該組織的細(xì)胞類型分化。肝臟中的肝干細(xì)胞被認(rèn)為存在于Hering’ s管和膽管腺中，具有產(chǎn)生肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的雙向分化潛能。在正常肝組織中，肝干細(xì)胞的數(shù)量極少，只有當(dāng)肝臟受損并且肝細(xì)胞的增殖受到抑制或是肝臟受到持續(xù)的大規(guī)模慢性損傷時(shí)，肝臟中的肝干細(xì)胞才能被激活，即所謂的“膽管反應(yīng)”。在動(dòng)物模型中常聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制肝細(xì)胞增殖的藥物(如倒千里光堿、對(duì)乙酰氨基酚等)和三分之二肝切來誘導(dǎo)膽管反應(yīng)，而在人類的慢性肝病中(如慢性病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等)常到觀察到膽管反應(yīng)的存在。
[0003]肝干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其深入研宄對(duì)于肝臟發(fā)育，肝臟損傷后再生、肝臟腫瘤的發(fā)生的機(jī)理以及各種原因?qū)е碌慕K末期肝臟疾病的細(xì)胞治療都具有十分重要的研宄意義和應(yīng)用價(jià)值。由于肝干細(xì)胞在肝臟中存在的數(shù)量極少，目前報(bào)道肝干細(xì)胞的分離的方法尚不完善。Li等通過千里光堿聯(lián)合2/3肝切誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后，將肝臟制備成細(xì)胞懸液，經(jīng)過分級(jí)離心去除肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后，再通過差速貼壁的方法將肝干細(xì)胞純化(Li WL, SuJ, Yao YC, Tao XR, Yan YB, Yu HY, Wang XM, Li JX, Yang YJ, Lau JT, Hu YP, Isolat1n andcharacterizat1n of bipotent liver progenitor cells from adult mouse,StemCells, 24(2)，322-332)，該種分離純化肝干細(xì)胞的方法比較繁瑣，且不易從正常肝組織中分離出肝干細(xì)胞。近年來，通過Foxll，⑶133和Lgr5等肝干細(xì)胞的表面標(biāo)志物結(jié)合流式或磁珠分選的方法從正常肝臟或誘導(dǎo)膽管反應(yīng)的肝臟中分離出肝干細(xì)胞(ShinSj Walton G，Aoki R，Brondell K，Schug Jj Fox A, Smirnova 0，Dorrell C，Erker L，ChuAS, Wells RGj Grompe M，Greenbaum LE，Kaestner KH，F(xiàn)oxll-Cre—marked adult hepaticprogenitors have clonogenic and bilineage differentiat1n potential,GenesDev.25 (11):1185-1192 ；Dorre11 Cj Erker L，Schug Jj Kopp 幾，Canaday PSj FoxAJj Smirnova 0，Duncan AWj Finegold MJ，Sander M，Kaestner KHj Grompe Mj Prospectiveisolat1n of a bipotential clonogenic liver progenitor cell in adult mice.GenesDev.25 (11): 1193-1203 ；Huch Mj Dorrell Cj Boj SFj van Es JHj Li VSj van de WeteringM，Sato T，Hamer K，Sasaki N，F(xiàn)inegold MJj Haft A, Vries RGj Grompe Mj Clevers H，Invitro expans1n of single Lgr5+liver stem cells induced by Wnt-driven regenerat1n, Nature.494(7436):247-250.)，但這些標(biāo)志物并不能有效區(qū)分肝干細(xì)胞和膽管細(xì)胞。因此，現(xiàn)有的分離肝干細(xì)胞的方法操作繁復(fù)或是分離的肝干細(xì)胞純度較低，目前尚沒有能夠快速?gòu)母闻K組織中特異分離純化肝干細(xì)胞的方法。
[0004]⑶63是包含有四個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域(hydrophobic domains)的膜蛋白，是四次跨膜蛋白家族(tetraspanin family)的主要成員之一。⑶63主要與整合素(integrins)家族蛋白形成復(fù)合體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、生長(zhǎng)、激活和迀移等功能。目前，CD63被發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和激活的血小板。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CD63亦是肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物，并提供了從肝臟細(xì)胞懸液中快速、特異分離和純化⑶63+肝干細(xì)胞的方法，同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了肝干細(xì)胞在體外的擴(kuò)增和雙向分化，以及在肝臟疾病動(dòng)物模型肝臟內(nèi)的再植。CD63+肝干細(xì)胞的獲得為肝臟疾病的細(xì)胞治療和肝臟疾病治療藥物篩選提供平臺(tái)，也為開發(fā)以CD63為靶標(biāo)的肝臟疾病診斷試劑盒和治療方法等研宄奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物CD63。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物CD63在肝干細(xì)胞快速分離擴(kuò)增和/或誘導(dǎo)分化的方法中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的又一目的在于提供肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物CD63在制備肝臟疾病診斷試劑盒和/或治療肝臟疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第一方面，提供了一種肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物，所述的肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物是CD63。
[0009]本發(fā)明的肝干細(xì)胞的特異性表面分子標(biāo)志物，也稱為肝干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物、肝干細(xì)胞的表面分子標(biāo)記、肝干細(xì)胞的表面分子標(biāo)志等。
[0010]本發(fā)明的第二方面，提供了 CD63作為肝干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物的應(yīng)用，該應(yīng)用具體是CD63在肝干細(xì)胞快速分離擴(kuò)增和/或誘導(dǎo)分化的方法中的應(yīng)用。
[0011]⑶63作為肝干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，可以準(zhǔn)確地、特異性地從正常肝臟中分離出肝干細(xì)胞，也可從DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后的肝臟中分離出肝干細(xì)胞。
[0012]特異性表面分子標(biāo)志物CD63在肝干細(xì)胞快速分離擴(kuò)增和/或誘導(dǎo)分化的方法中的應(yīng)用。本發(fā)明通過肝干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD63，結(jié)合流式分選的方法快速特異的從小鼠肝臟中分離出CD63陽性肝干細(xì)胞。CD63陽性的肝干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力和分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的雙向分化能力。其中所述肝臟是指正常肝臟或DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后的肝臟。
[0013]所述的DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后的肝臟，誘導(dǎo)方法可參見文獻(xiàn)Preisegger KH, FactorVMj Fuchsbichler A，Stumptner C，Denk H，Thorgeirsson SSj Atypical ductularproliferat1n and its inhibit1n by transforming growth factor betalin the3，5-diethoxycarbonyl-l, 4-dihydrocollidine mouse model for chronic alcoholicliver disease, Lab Invest.79 (2):103-109。
[0014]特異性表面分子標(biāo)志物CD63在肝干細(xì)胞快速分離擴(kuò)增的方法中的應(yīng)用，具體方法如下:
[0015]A、原位免疫熒光和免疫組化染色鑒定⑶63陽性的肝干細(xì)胞在正常肝臟或DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后肝臟中的定位。免疫熒光和免疫組化染色結(jié)果顯示CD63陽性的肝干細(xì)胞在肝臟內(nèi)分布于Hering’ s管和膽管腺內(nèi)。
[0016]B、通過流式細(xì)胞儀分選的方法，從正常肝臟或DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)后肝臟中分離出CD63陽性(CD63+)的肝干細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)了 CD63陽性的肝干細(xì)胞在體外的擴(kuò)增。首先將正常肝臟或DDC誘導(dǎo)膽管反應(yīng)3周后的肝臟用兩步法原位膠原酶灌注消化肝臟(Wang MJl, ChenF，Li JX, Liu CC, Zhang HB, Xia Y, Yu B, You P, Xiang D, Lu L, Yao H, Borjigin U, YangGS,Wangensteen KJ, He ZY, Wang X,Hu YP, Reversal of hepatocyte senescence aftercontinuous in vivo cell proliferat1n, Hepatology.6O (I): !M9-36L )，消化混合物繼續(xù)用0.25%膠原酶在37°C孵育30分鐘，然后通過梯度離心法富集肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。再通過流式細(xì)胞儀分選出⑶11b、⑶31和⑶45陰性，而⑶63陽性的肝干細(xì)胞。最后將⑶63陽性的肝干細(xì)胞在SCM-A培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增，SCM-A培養(yǎng)基:DMEM/F12、10%胎牛血清(Fetalbovine serum, FBS)、I X 青鏈霉素、0.lmM2_ 疏基乙醇(2-Mercaptoethanol，2_Mer)、I X 膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白 _砸溶液(Insulin-Transferrin-Selenium Solut1n, ITS)、10ng/ml 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)、10ng