鴨坦布蘇病毒單克隆抗體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)動(dòng)物病毒學(xué)與免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鴨坦布蘇病毒單克隆 抗體及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨坦布蘇病毒病是黃病毒科黃病毒屬坦布蘇病毒值ucktembusvirus,DTMUV)引 起的W鴨死亡和蛋鴨產(chǎn)蛋下降為特征的新發(fā)傳染病。黃病毒屬的其他類病毒有己腦病毒、 西巧羅病毒、登革熱病毒等。
[0003]自2010年W來(lái)我國(guó)大部分種鴨和蛋鴨養(yǎng)殖地區(qū)相繼發(fā)生了 W減料、產(chǎn)蛋下降和 伴有一定死淘率為特征的傳染病。該病大范圍爆發(fā)首先發(fā)生在2010年4-6月份，發(fā)病地點(diǎn) 主要集中在種鴨和蛋鴨養(yǎng)殖比較密集的福建、浙江、安徽等地，隨后又迅速波及河南、山東 等地。感染鴨中W麻鴨最多，其次是樓桃谷種鴨，番鴨最少，肉鴨和鶴也有感染報(bào)道，部分人 在蛋雞中也分離到了雞坦布蘇病毒。該病主要為水平傳播，特別是經(jīng)呼吸道傳播途徑，動(dòng)物 的采食及飲水都成為了該病傳播的可能。
[0004] 鴨坦布蘇病毒病主要引起蛋鴨及種鴨的產(chǎn)蛋急劇下降，同時(shí)伴有體溫輕微上升， 出現(xiàn)流淚、拉黃綠色稀便等臨床癥狀，在感染該病3~5天后會(huì)出現(xiàn)采食量下降的癥狀，在 發(fā)病后期會(huì)出現(xiàn)販行、站立不穩(wěn)甚至擁痕等神經(jīng)癥狀。鴨坦布蘇病毒感染維鴨后會(huì)引起維 鴨的死亡。
[0005] 由于鴨坦布蘇病是2010年新出現(xiàn)的疾病，目前還沒(méi)有快速診斷技術(shù)，實(shí)驗(yàn)室診斷 包括病毒分離鑒定、病原學(xué)和血清學(xué)試驗(yàn)，目前的診斷DTMUV方法有：RT-PCR法（快速、簡(jiǎn) 單）、套式PCR(靈敏度高）、Real-time PCR(可定量，靈敏度聞）等。雖然該些檢測(cè)技術(shù) 給鴨坦布蘇病在臨床診斷上提供了準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)，為鴨坦布蘇病的防治做出了巨大的貢 獻(xiàn)，但是該些檢測(cè)技術(shù)仍然耗時(shí)費(fèi)力，切需要專口設(shè)備和具有專業(yè)技術(shù)的人才可操作，不適 合大量的臨床檢測(cè)。因此，在此技術(shù)上北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中屯、發(fā)明了鴨坦布蘇病毒 單克隆抗體、抗原檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用方法（201410314144. 4)，解決了臨床診斷需要批量操 作的瓶頸，大大的提高了檢測(cè)效率。但是化ISA檢測(cè)技術(shù)仍然具有其局限性，因?yàn)榛疘SA檢 測(cè)技術(shù)仍然偏向于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，需要專業(yè)的人員和設(shè)備，仍然做不到快速檢測(cè)。
[0006] 因此本發(fā)明也是在基于此用鴨坦布蘇病毒單克隆抗體制備免疫膠體金試劑盒。 與申請(qǐng)?zhí)枮?01410314144.4的發(fā)明專利申請(qǐng)的技術(shù)方案不同的是，本發(fā)明在單克隆抗 體的特異性和靈敏性上特別高。北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中屯、的申請(qǐng)中，將已測(cè)定毒價(jià) 8. 7X 105p化/0. 1ml的鴨坦布蘇病毒進(jìn)行倍比稀釋，最低檢測(cè)濃度為1. 09X 104p化/0. 1ml ( 0. 763X 104TCIDw/0. 1ml)，即稀釋至80倍。而本發(fā)明的膠體金試紙條在將鴨坦布蘇病毒倍 比稀釋至8. 14X103TCIDs〇/0. 1ml仍然檢測(cè)的出來(lái)。（病毒粒子P化和TCID50換算公式； P即S = 0. 7XTCID50化LISA和膠體金檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)
[0007] ELISA檢測(cè)技術(shù)的基本原理
[0008] Elisa的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表 面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體即保留其免疫學(xué)活性，又保留 酶的活性。在測(cè)定時(shí)，首檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體 其反應(yīng)。用洗漆的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再 加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相載體上的酶量與標(biāo) 本中受量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間 接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
[000引 Elisa的優(yōu)點(diǎn)
[0010] (1)敏感性高，一般是膠體金產(chǎn)品的10倍的靈敏度。
[0011] 似特異性取決于抗原抗體制備，特異性很高，假陽(yáng)性和假陰性均比膠體金法低很 多。
[001引 做重復(fù)性高，一般批內(nèi)小于5%，批間小于10%。
[0013] (4)結(jié)果判斷客觀，并且是定量的分析樣品的濃度。
[0014] (5)分析自動(dòng)化可W，用大型的自動(dòng)酶標(biāo)儀，包括加樣、洗漆、顯色、讀數(shù)等一系列 過(guò)程可自動(dòng)完成。
[0015] (6)主要設(shè)備酶標(biāo)儀
[001引 （7)實(shí)驗(yàn)成本低，特別是檢測(cè)大量樣本時(shí)，明顯降低單個(gè)的檢測(cè)時(shí)間及成本。
[0017] (8)試劑穩(wěn)定性低溫保存一般可W保存一年
[0018] (9)應(yīng)用范圍主要應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷，需要專業(yè)人才才能做到
[0019] 膠體金方法
[0020] 免疫膠體金技術(shù)是W膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫 標(biāo)記技術(shù)。原理略
[0021] 膠體金的主要特點(diǎn)
[0022] (1)操作簡(jiǎn)單無(wú)需專業(yè)知識(shí)或操作經(jīng)驗(yàn)即可完成，也無(wú)需任何儀器。
[002引 （2)檢測(cè)時(shí)間短通常加樣后5-10分鐘可得到結(jié)果
[0024] (3)便攜方便攜帶，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0025] (4)保存方便通常在室溫下可W穩(wěn)定保存1年W上
[0026] 免疫膠體金技術(shù)自問(wèn)世W來(lái)得到了迅速的發(fā)展，在動(dòng)物疫病檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛， 特別是膠體金免疫技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速靈敏、結(jié)果清晰易于判斷、無(wú)需儀器設(shè)備等 優(yōu)點(diǎn)，適合臨床的快速診斷和基層流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模應(yīng)用。將免疫膠體金技術(shù)應(yīng)用于體 外快速檢測(cè)和診斷鴨坦布蘇病毒在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，本檢測(cè)卡敏感性高，特異性好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種鴨坦布蘇病毒單克隆抗體，它們是分別由保藏號(hào) 為C2014219或C2014220的細(xì)胞株的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。保藏在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中屯、。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的免疫膠體金試紙 條，該試紙操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏、結(jié)果清晰易于判斷。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種檢測(cè)鴨坦布蘇病毒免疫膠體金試紙條的 制備方法，試紙條制備過(guò)程簡(jiǎn)單，原輔料廉價(jià)易得，膠體金試紙條操作簡(jiǎn)單，臨床使用中不 需要任何設(shè)備，便于攜帶和使用。
[0029] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供了鴨坦布蘇病毒單克隆抗體在制備鴨坦布蘇病 毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，利用該單克隆抗體可W制備本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)試劑盒，包括ELISA 試劑盒，免疫膠體金試紙等。
[0030] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0031] 本發(fā)明提供了鴨坦布蘇病毒單克隆抗體，該單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株 1-E11 (保藏編號(hào)CCTCC N0:C2014219)或雜交瘤細(xì)胞株4-C3(保藏編號(hào)CCTCC NO; C2014220)分泌得到。
[0032] 所述的雜交瘤細(xì)胞株由W下方法獲得：
[0033] (1)制備純化的鴨坦布蘇病毒；將鴨坦布蘇病毒XN株（鴨坦布蘇病毒XN株的分 離鑒定，冕行周等）在雞胚上增值，72小時(shí)后收取尿囊液，提取病毒RNA鑒定，鑒定正確，超 速離屯、，重懸后庶糖梯度離屯、，用滅菌PBS重懸沉淀，再次取少量進(jìn)行鑒定，鑒定正確后W 此作為免疫原。
[0034] (2)篩選抗鴨坦布蘇病毒陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株：
[0035] (a)制備脾細(xì)胞；用步驟（1)所得的鴨坦布蘇病毒100yg/200 uL與等體積的 弗氏完全佐劑乳化后皮下注射免疫6~8周齡的雌性Ba化/c小鼠；2周后，用純化的鴨 坦布蘇病毒100 y g/200 y L與等體積的弗氏不完全佐劑乳化皮下注射免疫一次；再間隔 2周，用純化的鴨坦布蘇病毒100 y g/200 y L與等體積的弗氏不完全佐劑乳化皮下注射免 疫；10天后測(cè)定免疫效果；對(duì)免疫效價(jià)高的小鼠在融合前3天腹腔注射鴨坦布蘇病毒抗原 100 y g/200 y L ;取小鼠脾臟，充分研磨，1640培養(yǎng)液洗漆，離屯、重懸后得到了脾細(xì)胞。
[0036] (b)細(xì)胞融合；分別取1. 0X 1〇8個(gè)脾細(xì)胞和1. 0X 10 7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞懸液，合并加 入到圓底離屯、管中1000巧m離屯、5min，棄上清液；沉淀細(xì)胞中緩緩加人50% (v/v)PEG4000 混勻，融合后靜置1分鐘，加入不完全培養(yǎng)液1640終止融合；將反應(yīng)終止后的細(xì)胞懸液 100化pm離屯、5min，棄上清液，加入HAT選擇培養(yǎng)液輕輕重懸；W每孔100 y L的量加入到已 準(zhǔn)備好的含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置5% (v/v) 0)2、37°C、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，培養(yǎng)4天后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0037] (C)篩選單克隆抗體及克隆化；待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底1/10~1/5時(shí)，換液后取 細(xì)胞培養(yǎng)上清液用間接化ISA進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)到有8個(gè)強(qiáng)陽(yáng)性的孔，用有限稀釋法進(jìn)行亞 克隆和克隆，經(jīng)過(guò)3次克隆化操作后，所有的克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100 %，即可確定 已獲得了分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并且凍存。
[0038] 通過(guò)大量篩選工作，最終獲得了兩株雜交瘤細(xì)胞株，該兩株雜交瘤細(xì)胞株已于 2014年11月25號(hào)送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、進(jìn)行保藏，分類命名：雜交瘤細(xì)胞株 1-E11，保藏編號(hào)CCTCC N0:C2014219;分類命名；雜交瘤細(xì)胞株4-C3,保藏編號(hào)CCTCC NO; C2014220 ;地址；中國(guó)武漢武漢大學(xué)。其中雜交瘤細(xì)胞株1-Ell分泌的單抗1-Ell為標(biāo)記單 抗，雜交瘤細(xì)胞株4-C3分泌的單抗為包被單抗。
[0039] 所述的雜交瘤細(xì)胞株1-611和雜交瘤細(xì)胞株4-〔3可^在含有20%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基中W半貼壁方式生長(zhǎng)，生長(zhǎng)環(huán)境為37°C，5% Ch的培養(yǎng)箱。該雜交瘤細(xì) 胞株為渾圓透亮，成簇生長(zhǎng)，并能穩(wěn)定的分泌抗鴨坦布蘇病毒的單克隆抗體。該細(xì)胞由骨髓 瘤細(xì)胞SP2/0和免疫脾細(xì)胞融合而得，染色體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示該雜交瘤細(xì)胞株染色體為90條 (介于骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的染色體數(shù)目70條和BALB/c小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目40條之 間）。
[0040] 鴨坦布蘇病毒單克隆抗體在制備鴨坦布蘇病毒檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，包括利用單 克隆抗體1-E11和4-C3制備常規(guī)的鴨坦布蘇病毒檢測(cè)試劑盒，包括化ISA試劑盒，免疫膠 體金試紙等，其中優(yōu)選的，1-E11為標(biāo)記單抗，4-C3為包被單抗。
[0041] 一種能檢測(cè)鴨坦布蘇病毒免疫膠體金試紙條，所述的試紙條包括有硬質(zhì)聚氯己締 背襯板、硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊。其特征在于；硝酸纖維素膜粘貼在 硬質(zhì)聚氯己締背襯板上面，在硝酸纖維膜的一端粘貼有膠體金結(jié)合墊，在膠體金結(jié)合墊上 粘貼有樣品墊，吸水墊置于硝酸纖維素膜的另一端上面。
[0042] 所述的樣品墊具體為緩沖液A處理過(guò)的吸水紙。緩沖液A配方為；0.4mol/L的 Tris-Cl，pH 9. 0。
[0043] 所述的吸水墊具體為裁切過(guò)的吸水紙。
[0044] 所述的膠體金結(jié)合墊噴涂有抗鴨坦布蘇病毒的單克隆抗體1-E11-膠體金標(biāo)記 物。
[0045] 所述的硝酸纖維素膜上分別噴涂有抗鴨坦布蘇病毒的單克隆抗體4-C3檢測(cè)線和 兔抗鼠抗體的質(zhì)控線。
[0046] -種能檢測(cè)鴨坦布蘇病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，它包括W下步驟：
[0047] (1)用巧樣酸S鋼與氯金酸反應(yīng)制備膠體金：已娃化的瓶子中入125血注射用水， 再加入1. 2mL 1% (w/v)氯金酸，放入微波爐中火加熱4min ;迅速一次加入1. 8