一種vegf單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言涉及一種VEGF的單克隆抗體，本發(fā)明還涉及 所述抗體的制備方法與其在制備檢測(cè)VEGF試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 單克隆抗體由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗 體。通常采用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備，雜交瘤（hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ) 上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無(wú)限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B 細(xì)胞雜交瘤。應(yīng)用于醫(yī)療中時(shí)，在識(shí)別抗原中的顯示微小變化有助于減小副作用。單克隆 抗體具有三種獨(dú)特的作用機(jī)制，分別為靶向效應(yīng)、阻斷效應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)。
[0003] 單克隆抗體藥物發(fā)展經(jīng)歷了四個(gè)階段，分別為：鼠源性單克隆抗體、嵌合性單克隆 抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體。在第一個(gè)階段中，鼠源單克隆抗體是用小鼠 制備的普通單克隆抗體藥物，一方面抗體不能有效的激活人體中補(bǔ)體和FC受體相關(guān)的效 應(yīng)系統(tǒng)，被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAM)，在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除掉，另 一方面它毒副作用明顯，常引起人體的不良反應(yīng)，大大制約了其在臨床實(shí)驗(yàn)及相關(guān)應(yīng)用領(lǐng) 域的發(fā)展；第二代人鼠嵌合性單抗藥物對(duì)小鼠抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造，使其 人源化程度達(dá)到70%左右，仍有很大的毒副作用；而后出現(xiàn)的第三代人源化單抗的人源化 程度達(dá)到95%左右，更加接近于人體自身的抗體，大大降低了毒副作用。全人源抗體是從人 體免疫B細(xì)胞中直接分離，作為治療性抗體基本沒(méi)有排異反應(yīng)，具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 單克隆抗體除了用于制備治療藥物，由于其與物質(zhì)結(jié)合時(shí)特異的，所以單克隆抗 體還可用于制備檢測(cè)試劑。
[0005] 人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)是正常和異常血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，在生理和 病理性血管新生中起重要作用。其主要作用機(jī)制是作為一種促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，促進(jìn)血管 內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖以及血管生成。VEGF參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展整個(gè)過(guò)程，腫瘤組織快速生 長(zhǎng)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，在缺氧狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞表達(dá)VEGF顯著增加，VEGF局部濃度的升高 可以促進(jìn)新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
[0006] VEGF家族成員共包括五個(gè)：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF， 分別由各自的基因編碼。VEGF家族成員均與細(xì)胞膜酪氨酸受體相互作用，導(dǎo)致受 體二聚化和自身磷酸化，并啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活大量下游蛋白，如磷脂酰肌醇 3_ 激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)、Ras、有絲分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)等，介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)
[0007] VEGF-A通常被稱為VEGF，因?yàn)閂EGF-A是血管發(fā)生和祖內(nèi)皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié) 劑，在人類多種腫瘤中，VEGF-A都是過(guò)表達(dá)的，這與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
[0008] 研究表明，食管癌患者血漿中VEGF與TGF-P1的表達(dá)水平明顯高于正常人的表達(dá) 水平，提示血漿中VEGF與TGF-P1可能參與了食管癌的發(fā)生。VEGF與TGF-P1的表達(dá)水平 可以作為食管癌早期檢測(cè)的指標(biāo)。還有研究表明VEGF蛋白在前列腺癌組織中有顯著的高 表達(dá)，且與臨床分期、骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
[0009] 鑒于此，本領(lǐng)域需要一種準(zhǔn)確檢測(cè)VEGF表達(dá)水平的試劑，用于各類與VEGF高表達(dá) 的疾病的早期診斷。為解決上述問(wèn)題本發(fā)明人通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選到了特異性強(qiáng)、靈敏度 高的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 由于VEGF在眾多腫瘤疾病中高表達(dá)，為此開(kāi)發(fā)一種能準(zhǔn)確檢測(cè)VEGF表達(dá)水平的 試劑，對(duì)于用于各類與VEGF高表達(dá)的疾病的診斷具有重要的臨床意義。為此本發(fā)明通過(guò)雜 交瘤技術(shù)篩選出了多株與VEGF特異性結(jié)合的單克隆抗體，其中編號(hào)為YS03的抗體株結(jié)合 效果最好。
[0011] 本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人VEGF的單克隆抗體YS03,所述單克隆抗體包括輕鏈和重 鏈，其氨基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示。
[0012] 本發(fā)明所述的單克隆抗體YS03的輕鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、 CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5所示。 所述單克隆抗體的重鏈蛋白質(zhì)分子可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分 別如序列表中SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8 所示。
[0013] 本發(fā)明還公開(kāi)了上述單克隆抗體YS03的制備方法，主要包括如下：
[0014] 1.抗人VEGF單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建
[0015] 首先，原核表達(dá)人VEGF蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。用間 接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆再反復(fù)亞克隆，直到所有雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)為100% 陽(yáng)性。
[0016] 2.雜交瘤細(xì)胞抗體輕、重鏈基因的釣取
[0017] 提取單克隆抗體YS03細(xì)胞的RNA，經(jīng)RT-PCR，用特異性引物釣取抗體的輕重鏈基 因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行 DNA測(cè)序分析。
[0018] 3.單克隆抗體YS03可變區(qū)氨基酸序列和互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列的分析
[0019] 用www.expasy.org在線軟件將單克隆抗體YS03的輕、重鏈可變區(qū)核苷酸序列翻 譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體YS03的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:1 和SEQIDNO:2 所示；
[0020] 根據(jù)Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)確定單克隆抗體YS03輕鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶RU CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所 示；重鏈可變區(qū)序列中的互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ IDNO:6、SEQIDNO:7 和SEQIDNO:8 所示；
[0021] 本發(fā)明的單克隆抗體基于上述已克隆到的人VEGF結(jié)合性單克隆抗體YS03輕、重 鏈可變區(qū)基因，可構(gòu)建和表達(dá)多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、 Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質(zhì)，可以交聯(lián)上多種生物活 性分子，制備用于VEGF表達(dá)水平檢測(cè)、診斷和治療VEGF高表達(dá)所導(dǎo)致疾病的診斷或治療藥 物。
[0022] 本發(fā)明基于YS03抗體構(gòu)建了用于檢測(cè)VEGF的ELISA試劑盒，所述的ELISA試劑 盒包括：抗VEGF抗體YS03、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶底物緩沖液、蛋 白標(biāo)準(zhǔn)品人VEGF(100ug/ml，0.Iml)、陰性對(duì)照樣品BSA。
[0023] 本發(fā)明還對(duì)單克隆抗體YS03的靈敏性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒能 夠靈敏的檢測(cè)樣品中VEGF的含量，其靈敏度能夠達(dá)到0. 6ng/ml。
[0024] 本發(fā)明的所述的YS03抗體或其片段也可連接化學(xué)物部分。這些化學(xué)物部分可以 是多聚物、熒光標(biāo)記物、細(xì)胞毒性因子、放射性核素等?；瘜W(xué)物部分優(yōu)選可提供抗體在體內(nèi) 半衰期的多聚物。適合的多聚物包括（但不限于）聚乙二醇、右旋糖酐和單甲基聚乙二醇。
[0025] 本發(fā)明抗體和抗體片段可以連接熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，如熒光團(tuán)如稀土螯合 物、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅蛋白、水母發(fā)光蛋白標(biāo)記物、 生物素/親和素、旋光標(biāo)記物和穩(wěn)定自由基。
[0026] 本發(fā)明抗體和抗體片段分子也可交聯(lián)細(xì)胞毒性因子，例如白喉毒素、蓖麻毒素A 鏈、a-八疊球菌、Phytoiaccaamericana蛋白、PAPI，PAPII和PAPS、苦瓜抑制物、局限 曲霉素、酚霉素和依諾霉素。
[0027] 對(duì)本發(fā)明的抗體或抗體片段對(duì)應(yīng)的氨基酸或核苷酸序列進(jìn)行淺顯的或微小的修 改也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，包括（但絕不限于）把一個(gè)氨基酸殘基替換成另外一個(gè)具有 類似特征的氨基酸。具有特征類似的氨基酸被本領(lǐng)域所熟知。例如可互相替換的極性/ 親水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸；可互相替換的非極性/疏水氨基酸，包括甘胺酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替換的酸性氨基酸，包 括天冬氨酸和谷氨酸；可以互相替換的堿性氨基酸，包括組胺酸、賴氨酸和精氨酸。
[0028] 本發(fā)明所述的抗體、抗體片段或抗體突變體的表達(dá)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技 術(shù)，將獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，克隆到不同的表達(dá)載體中，使該基因有效地 連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。選擇和使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序 列。該抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入到不同的載體，或者更通常地，這兩種基因都 被插入到同一個(gè)表達(dá)載體中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法（例如，連接抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)性 限制位點(diǎn)，或者，如果不存在限制位點(diǎn)，進(jìn)行平端連接）將該抗體基因插入到表達(dá)載體中。 本文所述的該抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于產(chǎn)生任何抗體同類型的全長(zhǎng)抗體基因，其通 過(guò)以這樣的方式將它們插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá) 載體，使得VH片段有效連接到載體中的重鏈恒定（CH)片段，VL片段有效連接到載體中的輕 鏈恒定（CL)片段。此外或可選地，該重組表達(dá)載體可以編碼