一種快速診斷坦布蘇病毒的膠體金試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及了一種快速診斷坦布蘇病毒的膠體金 試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 坦布蘇病毒感染是我國于2010年新發(fā)生的一種傳染性疾病，2010年春夏之交，江 浙地區(qū)突然出現(xiàn)鴨產(chǎn)蛋下降，之后迅速波及福建、廣東、廣西、安徽、江蘇、江西、河南、山東、 河北和北京等地的鴨場，經(jīng)過病原分離和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷，該病的病原為黃病毒屬中的 坦布蘇病毒（Tembusuvirus，TMUV) 〇
[0003] 本病夏秋季發(fā)生更嚴(yán)重，蛋鴨、肉鴨生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生；本病危害多個品種，包括 蛋鴨中的紹興鴨、縉云麻鴨、山麻鴨、金定鴨、康貝爾鴨、臺灣白改鴨，肉種鴨中的櫻桃谷鴨 和北京鴨，野鴨等；該病發(fā)病率高，死亡率較低，一般在5%以下，有繼發(fā)感染時也可高達(dá) 30%。10~25日齡肉鴨和產(chǎn)蛋鴨更易感。鵝、雞也有發(fā)病的報道。該病一年四季均可發(fā) 生，但夏秋季節(jié)多發(fā)，冬季也能發(fā)生。雛鴨、育成鴨感染該病后以病毒性腦炎為特征，病鴨癱 瘓，站立不穩(wěn)，行走時雙腳向外叉開、呈八字腳、頭部振顫、走路時容易翻滾、腹部朝上、兩腿 呈游泳狀掙扎。病鴨腹瀉，排白綠稀便，有的還排褐色糞便，脫水、蹼干燥。嚴(yán)重病例者采食 困難，痙攣倒地不起，兩腿向后踢蹬最后衰竭死亡。產(chǎn)蛋鴨以產(chǎn)蛋下降為特征，鴨突然發(fā)病， 大群鴨精神尚好，采食下降，糞便稀薄、變綠。產(chǎn)蛋鴨采食量突然下降，較正常鴨采食下降約 40 %~50%，體溫升高，精神沉郁，排綠色稀便，部分鴨癱瘓，個別鴨出現(xiàn)精神沉郁，流淚，喙 出血等癥狀。2~3天后，產(chǎn)蛋量急劇下降，在1~2周內(nèi)，產(chǎn)蛋率從80%~90%或90%以 上下降至10%以下，每日降幅可達(dá)5%~20%，30~35天后廣蛋率逐漸恢復(fù)。因此，該病 造成了養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響和制約了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
[0004] 坦布蘇病毒的基因組核酸為單股正鏈RNA，其分子量大小約為10. 5Kb左右，病毒 的基因組長度為10990個核苷酸。黃病毒基因組是由5'非編碼區(qū)（5'non-codingregion， NCR)，3' 非編碼區(qū)（3'untranslatedregion，UTR)及一個開放性閱讀框（openreading frame，0RF)組成。病毒的基因組開放閱讀框（0RF)編碼一個多聚蛋白，由3426個氨基酸 構(gòu)成，可以裂解為3個結(jié)構(gòu)蛋白（E、C、M蛋白）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3， NS4A，NS4B，NS5)。黃病毒基因組RNA具有感染性，并且攜帶所有遺傳信息，在病毒復(fù)制增殖 的過程中，具有mRNA作用。因此該病毒基因組既可以復(fù)制下一代RNA，也可以翻譯出該病毒 的蛋白。坦布蘇E蛋白為黃病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其在病毒吸附、組裝及病毒與被侵染宿主 的細(xì)胞膜融合過程中起到重要的作用；E蛋白也是黃病毒的主要抗原，含有多種類型的抗 原表位，這些抗原表位可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答，并使機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。
[0005]目前，針對鴨坦布蘇病毒已建立的檢測方法主要是分子生物學(xué)檢測方法，如套式 RT-PCR、LAMP、地高辛、熒光定量PCR等方法；血清學(xué)方法諸如間接ELISA和雙抗體夾心 ELISA方法檢測坦布蘇病毒的相關(guān)報道。雖然普通的分子生物學(xué)檢測方法檢測特異性較好， 診斷靈敏度高，但是耗時時間甚長，耗材昂貴，不適合基層檢測。血清學(xué)檢測方法較分子生 物學(xué)方法耗時較短，操作較為簡便，但由于其存在較大的非特異性而容易存在假陽性問題， 從而影響對疾病的診斷，因此，迫切需要研發(fā)一種更簡便、快速地對大量樣品進(jìn)行TMUV的 檢測的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的空白，本發(fā)明提供了一種快速診斷坦布蘇病毒的膠體金試紙 條，包括PVC底板，所述的底板一端設(shè)置有樣品墊，樣品墊的一端通過金標(biāo)墊與硝酸纖維素 膜相連接，硝酸纖維素膜的另一端與吸水墊相連接，所述的金標(biāo)墊上包被有抗坦布蘇病毒 E蛋白單克隆抗體一一膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條包抗坦布蘇病毒E 蛋白單克隆抗體的檢測區(qū)和一條包被羊抗鼠二抗的對照區(qū)，采用這種結(jié)構(gòu)的試紙條具有特 異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，能 廣泛應(yīng)用于基層對于樣品的檢測。
[0007] 本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案是：
[0008] 發(fā)明人首先獲得了抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體A12D3和C12D1，其中抗坦布蘇 病毒E蛋白單克隆抗體A12D3和C12D1是分別通過雜交瘤細(xì)胞（CCTCCC201546)和（CCTCC C201547)獲得的；
[0009] 所述的雜交瘤細(xì)胞是通過純化的坦布蘇病毒E蛋白作為免疫抗原免疫的小鼠脾 細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞采用PEG融合法進(jìn)行細(xì)胞融合以及后續(xù)有限稀釋法亞克隆所獲得 的；
[0010] 利用上述的抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體A12D3,發(fā)明人將其與膠體金混合制 備獲得了抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體A12D3-膠體金標(biāo)記物，并將其作為包被物制備 獲得了金標(biāo)墊；
[0011] 同時發(fā)明人利用抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體C12D1包被于檢測區(qū)，羊抗鼠二 抗包被于對照區(qū)；
[0012] 利用上述的金標(biāo)墊、檢測區(qū)和對照區(qū)，發(fā)明人進(jìn)一步的設(shè)計并制造了對應(yīng)的試紙 條，所述試紙條包括PVC底板，所述的底板一端設(shè)置有樣品墊，樣品墊的一端通過金標(biāo)墊與 硝酸纖維素膜相連接，硝酸纖維素膜的另一端與吸水墊相連接，所述的金標(biāo)墊上包被有抗 坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體A12D3-膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條 包被有抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體C12D1的檢測區(qū)和一條包被羊抗鼠二抗的對照區(qū)。 [0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試紙條中采用了抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體一膠 體金標(biāo)記物和抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體對樣品進(jìn)行檢測，特異性高，且操作簡便、快 速，結(jié)果顯示直觀、準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，較之現(xiàn)有采用的各種檢測方法更加快捷，且 不需要特殊儀器設(shè)備，更適合于基層臨床樣品檢測。
[0014] 利用上述的試紙條，可用來檢測鴨泄殖腔內(nèi)容物或喉頭粘液等可能含有坦布蘇病 毒的樣品，將上述樣品用試紙條進(jìn)行檢測，當(dāng)檢測區(qū)和對照區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶時，證明樣品 感染了坦布蘇病毒；若僅有對照區(qū)出現(xiàn)紅色條帶，則證明樣品未感染坦布蘇病毒；若沒有 紅色條帶出現(xiàn)，則考慮該試紙條失效。
[0015] 綜上所述，采用這種結(jié)構(gòu)的試紙條具有特異性強(qiáng)，操作簡便、快速，結(jié)果顯示直觀、 準(zhǔn)確，減少投資和檢測成本，應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，能廣泛應(yīng)用于基層對于樣品的檢測。
[0016] 保藏信息
[0017] 保藏時間：2015年7月12日
[0018] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC
[0019] 保藏編號：CCTCCNO:C2〇l546
[0020] 保藏單位地址：中國武漢大學(xué)
[0021] 分類命名：雜交瘤細(xì)胞株A12D3
[0022] 保藏時間：2015年7月12日
[0023] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC
[0024] 保藏編號：CCTCCNO:C2〇l547
[0025] 保藏單位地址：中國武漢大學(xué)
[0026] 分類命名：雜交瘤細(xì)胞株A12D1
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明所述試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0028] 圖中1為樣品墊，2為金標(biāo)墊，3為檢測區(qū)，4為對照區(qū)，5為硝酸纖維素膜，6為吸水 墊，7為PVC底板；
[0029] 圖2為不同稀釋度的坦布蘇病毒尿囊液檢測結(jié)果灰度圖，
[0030] 其中1:1，1:10, 1:50, 1:100, 1:1000分別為病毒尿囊液稀釋度，下面的紅線為檢 測區(qū)紅線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1
[0032] -種快速診斷坦布蘇病毒的膠體金試紙條，包括PVC底板7,所述的底板7 -端 設(shè)置有樣品墊1，樣品墊1的一端通過金標(biāo)墊2與硝酸纖維素膜5相連接，硝酸纖維素膜 5的另一端與吸水墊6相連接，所述的金標(biāo)墊2上包被有抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體 A12D3-膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜5上設(shè)置有一條包抗坦布蘇病毒E蛋