基于納米金催化顯色體系的pH及尿素的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系 的PH響應及其用于pH值和尿素測定的方法，屬于分析化學和納米技術領域。
【背景技術】
[0002] pH值是化學和生物系統(tǒng)中常用的一項重要指標，其影響著其許多化學反應和生化 反應。醫(yī)學上，體內pH值的改變伴隨著很多疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，pH值的測定在化學和 生物領域具有重要的意義。目前，PH的測量方法主要分為指示劑法、金屬電極法(氫電極法， 醌氫醌電極法，銻電極法）和玻璃電極法等。發(fā)展新的溶液PH的測定方法仍然十分重要。
[0003] 尿素是人體蛋白質代謝的終產物，由肝臟產生，經血液運輸至腎臟以尿液形式排 出。尿素的生成量取決于蛋白質的攝入量、組織蛋白質的分解代謝以及肝功能狀況。尿素 是臨床及生物化學一個重要的目標分析物，它是評價尿毒癥毒素水平、腎臟及肝臟細胞功 能的重要標志。目前，尿素的測定方法包括：氨電極法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脫氫酶 偶聯(lián)法，脲酶-亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)法等。
[0004] 可提供肉眼識別信號的比色法檢測，具有簡單，快速，適用于實時和現(xiàn)場檢測等優(yōu) 點?；诩{米金的色度傳感器近年來得到了廣泛關注，其中的大部分均是基于納米金聚集 或聚集再分散過程中的等離子體耦合而產生的顏色變化。納米金已越來越多地應用于比色 法檢測細胞、蛋白質、DNA、金屬離子和小分子等。
[0005] 本發(fā)明利用納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系 在不同PH條件下的顯色差異，構建了一種簡便、靈敏的pH值測定新方法。將該體系與脲酶 催化尿素水解體系結合，建立了尿素檢測的新方法。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯 胺鹽酸鹽顯色體系的PH及尿素的測定方法。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：本發(fā)明所述的基于納米金催化顯 色體系的PH或尿素的測定方法，其特征是利用納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四 甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系在不同PH條件下的顯色差異，從而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸 收光譜特征隨PH值的變化，能直接用于pH值測定；或者通過納米金催化過氧化氫氧化 3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系與脲酶催化尿素水解反應體系耦合，從而表現(xiàn)出 溶液顏色和紫外吸收光譜特征隨尿素濃度的變化，能用于尿素含量的測定。
[0008] 上述所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液 溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶 液由從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米 金粒徑為13 nm，濃度為3. I nmoL/L，4 ° C保存。
[0009] 本發(fā)明所述的基于納米金催化顯色體系的pH測定方法，其特征是將不同pH的 濃度為10 mmoL/L的磷酸緩沖液、質量分數為30%的過氧化氫、濃度為16 mmoL/L的 3,3'，5,5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽與納米金溶液按體積比為13:4:1 :2混合，37° C溫浴 10分鐘后，立即加入0.2 mL、體積分數為20%的硫酸溶液終止上述反應，目視觀察顏色特 征或測定吸光度值A45tl，當目視觀察顏色特征時，隨著pH的增大，顯色體系的顏色逐漸由 深黃色變?yōu)榈S色；當測定吸光度值八 45(|時，隨著pH的增大而吸光度值A 45(|逐漸減小，在 6. 40~6. 60范圍內吸光度值八45。與pH呈線性關系；所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法 制得：1毫升〇. I g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升 〇. I g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流15分鐘后，將反應 溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3. I nm〇L/L，4 ° C保存。
[0010] 所述磷酸緩沖液、過氧化氫、3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽與納米金溶液混合 后的總體積為I mL。 toon] 本發(fā)明所述的基于納米金催化顯色體系的尿素測定方法，其特征是將脲酶溶液 加入到0. 6 mL其含不同濃度尿素的濃度為10 mmoL/L，pH=6. 40的磷酸緩沖液中，搖勻后 37° C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0.2 mL質量分數為30%的過氧化氫溶液、0.05 mL 濃度為16 mm〇L/L的3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和0. 10 mL納米金溶液，混合 均勻后37° C溫浴10分鐘，立即加入0. 2 mL體積分數為20%的硫酸溶液終止反應，測定 吸光度值A45tl，隨著尿素濃度的增大顯色體系的A 45tl值逐漸減小，在0. 02~0. 4 mmoL/L范圍 內，顯色體系的A45tl值與尿素濃度呈線性關系，檢測限為0. 005 mm〇L/L ;所使用的納米金采 用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升〇. I g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮 沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回 流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3. I nmoL/ L，4 ° C保存。
[0012] 所使用的脲酶溶液的體積為0. 05 mL，濃度為18 U/mL。
[0013] 本發(fā)明所述基于納米金催化顯色體系的人尿液中尿素測定方法，包括如下步驟： 取新鮮人尿液，調節(jié)pH至6. 40后，用10 mm〇L/L，pH=6. 40的磷酸緩沖液稀釋400倍，取0. 1 mL稀釋液加入到0. 5 mL濃度為10 mmoL/L，pH=6. 40的磷酸緩沖液中，再加入0. 05 mL 18 U/mL的脲酶溶液，搖勻后37° C溫浴30分鐘，反應結束后，加入0. 2 mL質量分數為30%的 過氧化氫溶液、0.05 mL濃度為16 mm〇L/L的3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和0.10 mL納米金溶液，混合均勻后37° C溫浴10分鐘，立即加入0. 2 mL體積分數為20%的硫酸 溶液終止反應，測定吸光度值A45tl，通過標準曲線進行定量，獲得尿液中的尿素含量。
[0014] 所使用的納米金采用檸檬酸三鈉還原法制得：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解 于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升0.1 g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由 從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流15分鐘后，將反應溶液慢慢冷卻至室溫，所得的納米金粒 徑為13 nm，濃度為3. I nmoL/L，4 ° C保存。
[0015] 具體地說，本發(fā)明采用的技術方案為： (一）納米金的制備 以下過程中使用的所有玻璃器皿均經過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。納米金 的制備：1毫升0.1 g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫 升〇. I g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流15分鐘后，將反 應溶液慢慢冷卻至室溫。所得的納米金粒徑為13 nm，濃度為3. I nm〇L/L，4 ° C保存。 [0016](二）pH 的測定 將0· 2 mL 30% (m/m)的過氧化氫溶液、0· 05 ml濃度為16 mmoL/L的3, 3'，5, 5' -四 甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（TMB)溶液和0. 10 mL步驟(一）制備的納米金溶液加入到0. 65 mL不 同pH的磷酸緩沖溶液（10 mm〇L/L)中，混合均勻后37° C溫浴10分鐘。立即加入0. 2 mL 20% (V/V)的硫酸溶液終止上述反應，目視觀察顏色的變化或測定450 nm波長處的吸光度 值(A45(i)。根據溶液顏色與比色標準系列比較或通過吸光度值標準曲線進行pH測定。
[0017](三）尿素的測定 將0.05 mL 18 U/mL的脲酶溶液加入到0.6 mL含不同濃度尿素的磷酸緩沖液中（10 mmoL/L，pH=6. 40)，搖勻后37° C溫浴30分鐘。反應結束后，加入0. 2 mL 30%(m/m)的過氧 化氫溶液、〇. 05 mL濃度為16 mm〇L/L的3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽溶液和0. 10 mL 步驟(一）制備的納米金溶液，混合均勻后37° C溫浴10分鐘。立即加入0.2 mL 20% (V/ V)的硫酸溶液終止反應，測定吸光度值A45tl。通過吸光度值標準曲線進行尿素含量測定。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點： (1)本發(fā)明利用納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系 在不同PH條件下的顯色差異，從而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征隨pH值的變化，可 以直接用于PH值測定；通過納米金催化過氧化氫氧化TMB顯色體系與脲酶催化尿素水解反 應體系耦合，從而表現(xiàn)出溶液顏色和紫外吸收光譜特征隨溶液中尿素濃度的變化，可以用 于尿素含量的測定。
[0019] (2)本方法所使用的納米金直接由檸檬酸三鈉還原氯金酸得到，無需進行進一步 的修飾，制備過程簡單快速。
[0020] (3)檢測步驟簡單，不涉及任何復雜、貴重的儀器，檢測成本低。
[0021] (4)本發(fā)明對樣品的處理要求低。
[0022] (5)本發(fā)明的檢測靈敏度高，pH測定的響應區(qū)間僅為0. 2個pH (6. 40~6. 60)，分 光光度法測定尿素的檢測限為〇. 005 mmoL/L。
【附圖說明】
[0023] 圖1為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系在不 同pH下的顏色變化外觀圖。
[0024] 圖2為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系在不 同pH條件下吸光度值A45tl的變化圖。
[0025] 圖3為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系的吸 光度值~5(|與pH的線性關系圖。
[0026] 圖4為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系的吸 光度值A45tl與隨尿素濃度的變化圖。
[0027] 圖5為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系的吸 光度值A45tl與尿素濃度的線性關系圖。
[0028] 圖6為納米金催化過氧化氫氧化3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽顯色體系與不 同干擾物作用后的吸光度值八45(|變化圖。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1 : 1毫升〇. I g/L的氯金酸溶液溶解于100毫升水中，回流加熱煮沸后迅速加入3毫升 〇. I g/L的檸檬酸三鈉溶液，反應溶液由從淺黃色變成酒紅色，繼續(xù)回流15分鐘后，將反應 溶液慢慢冷卻至室溫。所得的