一種單組份tmb顯色液的終止液及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物體外診斷試劑，特別是涉及一種單組份TMB顯色液的終止液及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 體外診斷試劑領(lǐng)域的酶聯(lián)免疫法（ELISA)檢測(cè)技術(shù)中，常使用TMB(3, 3'，5, 5'-四 甲基聯(lián)苯胺）作為HRP (辣根過(guò)氧化物酶）顯色底物。相對(duì)其它顯色底物而言，TMB以顯色 高效、無(wú)毒、不致癌、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)成為ELISA檢測(cè)的主流顯色劑。在ELISA檢測(cè)時(shí)，HRP 酶催化過(guò)氧化物釋放出氧使TMB被氧化成藍(lán)色的產(chǎn)物，加入酸性的終止液終止反應(yīng)后，藍(lán) 色溶液變成橙黃色，在450nm波長(zhǎng)有最大吸收峰。終止的原理：以硫酸為主要成分的終止液 為例，加入終止液后，一方面，硫酸破壞了 HRP酶的活性，使酶的催化功能喪失；另一方面， 由于pH降低，可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有最大消 光系數(shù)。如不及時(shí)終止反應(yīng)，本底會(huì)同時(shí)加深，進(jìn)而影響結(jié)果的正確判斷，故終止對(duì)ELISA 具有重要意義。
[0003] 目前ELISA試劑盒中，TMB的終止液主要有酸和堿兩類：酸類主要為鹽酸及硫酸， 而堿類則為NaOH及SDS (十二烷基硫酸鈉）。NaOH由于易與空氣中的二氧化碳反應(yīng)產(chǎn)生 變質(zhì)，而較少應(yīng)用；至于1% SDS (十二烷基硫酸鈉）雖有論文進(jìn)行過(guò)研究，但由于其終止后 有較強(qiáng)的褪色作用，結(jié)果不穩(wěn)定，基本僅停留于實(shí)驗(yàn)室使用。對(duì)于酸類中的鹽酸，濃度多為 1%或2M(即mol/1，下同），終止效果尚可，但由于鹽酸易揮發(fā)，多次開蓋會(huì)使溶質(zhì)減少，進(jìn) 而影響終止液的終止效果及檢測(cè)精密度，故商品化應(yīng)用不多。
[0004] 硫酸作為終止液的主要成分，由于穩(wěn)定、易獲取、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為主流。其所 配制的硫酸濃度各異，包括最高達(dá)2M，最低為0. 2M。而終止液的具體加量：一般雙組份TMB 底物液各加 A與B液50 μ 1后，再加2M的終止液50 μ 1 ;而對(duì)于單組份TMB底物液，則多采 用0. 2-0. 8Μ的更低濃度硫酸作為終止液，而與TMB加量相同，例如100 μ 1的TMB底物液， 加入100 μ 1的終止液。
[0005] 對(duì)于傳統(tǒng)的2mol/l的硫酸終止液，多用于雙組份ΤΜΒ，較少應(yīng)用于單組份TMB中。 原因有：（1)單組份TMB中的TMB含量較雙組份中的低，故不需高達(dá)2M的硫酸來(lái)終止，過(guò)量 的硫酸反而會(huì)使本底加深，導(dǎo)致陰陽(yáng)性對(duì)比度較差，最終讀數(shù)不穩(wěn)定。（2)2M的硫酸有較強(qiáng) 的腐蝕性，對(duì)操作者易造成傷害。（3)使用剩余的終止液對(duì)環(huán)境產(chǎn)生了危害。故現(xiàn)在更多是 使用低濃度的硫酸作為終止液，如〇. 2-0. 8M。
[0006] 基于低濃度的硫酸即稀硫酸在常溫條件下可穩(wěn)定保存，故其可直接保存于常溫， 在冬季時(shí)，特別是廣東、海南及臺(tái)灣省以外的省份，冬季實(shí)驗(yàn)室保存或運(yùn)輸時(shí)多在〇°C以下， 易使室溫保存的終止液產(chǎn)生凍結(jié)；此外，在控溫不穩(wěn)的冰箱冷藏層，終止液也可能出現(xiàn)凍 結(jié)。凍結(jié)的終止液有以下缺點(diǎn)：解凍需要耗費(fèi)時(shí)間；如未完全融化、不均勻會(huì)導(dǎo)致硫酸的 濃度產(chǎn)生變化，影響實(shí)驗(yàn)精密度。
[0007] 單組份TMB顯色液日趨成為商品化ELISA試劑盒主流，目前很少有專門針對(duì)單組 份TMB顯色液的終止液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種專門針對(duì)單組份TMB顯色液的終止液，其作 用高效且可穩(wěn)定的保存于四季室溫。
[0009] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括硫酸和二乙二醇。
[0010] 所述硫酸的濃度為〇· 3-0. 5mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3-5%。
[0011] 所述硫酸的濃度為〇. 4mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3%。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有硫酸和二乙二醇的組合物的用途，用于單組份TMB顯色 液的終止液的制備。
[0013] 組合物中所述硫酸的濃度為0. 3-0. 5mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為 3-5 % 〇
[0014] 組合物中所述硫酸的濃度為0. 4mol/L，所述二乙二醇的重量體積比為3%。
[0015] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0016] (1)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液是專門針對(duì)單組份TMB底物液設(shè)計(jì)的，終止 后不產(chǎn)生沉淀，1小時(shí)內(nèi)讀數(shù)仍穩(wěn)定。
[0017] (2)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液采用的是低濃度的硫酸，可以減少對(duì)操作 者的傷害，并且可以降低對(duì)環(huán)境的危害。
[0018] (3)本發(fā)明單組份TMB顯色液的終止液具有防凍設(shè)計(jì)，通過(guò)其含有的特有防凍成 分與低濃度的硫酸以一定比例組合使用，作用高效，且在冬季低溫環(huán)境使用而不凍結(jié)，更加 穩(wěn)定和可靠。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括如下濃度的各組分：
[0020] 硫酸 0· 3-0. 5mol/L
[0021] 二乙二醇 3-5% (w/v)
[0022] 所述硫酸的濃度為0. 3M及以上，可確保足量的硫酸用于終止，同時(shí)也維持一個(gè)較 強(qiáng)的酸性環(huán)境，抑制微生物的生長(zhǎng)。而硫酸的濃度為0. 5M以上時(shí)，終止后的穩(wěn)定性不夠，易 引起讀數(shù)的變化。如高值樣本時(shí)，可能帶來(lái)部分沉淀，故選擇〇. 3-0. 5M。
[0023] 所述二乙二醇，也稱一縮二乙二醇、二乙二醇醚或二甘醇。能與乙醇、乙醚、丙酮和 乙二醇混溶，不溶于苯和四氯化碳，溶于水。味辛辣并微甜，有吸濕性。由于部分抗凍成分易 造成終止反應(yīng)的干擾。故在抗凍劑的類型及其濃度上的選擇上需要特別慎重，如甘油等物 質(zhì)量大時(shí)粘度增大，不利于終止反應(yīng)的高效進(jìn)行。而二乙二醇則不會(huì)對(duì)ELISA的終止造成 干擾，有與甘油相當(dāng)?shù)目箖鲂Ч蓾M足常見的近零攝氏度的抗凍的情況，如_5°C至0°C ; 同時(shí)其安全性較好；其濃度選擇為3-5% (w/v)時(shí)更有利于終止反應(yīng)的高效進(jìn)行。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述單組份TMB顯色液的終止液的制備方法，包括如下步驟：
[0025] 取16. 0-26. 8ml (即0· 3-0. 5mol)的硫酸，加入800ml的去離子水，再在其中加入 26. 9-44. 8ml (即30-50g)的二乙二醇，用去離子水定容至1L，混合均勾，盛放于塑料試劑瓶 中密封存于室溫，即為單組份TMB顯色液的終止液。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 本實(shí)施例提供了一種單組份TMB顯色液的終止液，包括如下濃度的各組分：
[0028] 硫酸 0· 4mol/L
[0029] 二乙二醇 3%(w/v)
[0030] 本實(shí)施例還提供了上述單組份TMB顯色液的終止液的制備方法，包括如下步驟：
[0031] 取21. 4ml (即0. 4mol)的硫酸，加入800ml的去離子水，再在其中加入26. 9ml (即 30g)的二乙二醇，用去離子水定容至1L，混合均勻，盛放于塑料試劑瓶中密封存于室溫，即 為單組份TMB顯色液的終止液。
[0032] 其中濃酸和二乙二醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，成本較低。
[0033] 本實(shí)施例單組份TMB顯色液的終止