本發(fā)明涉及電化學(xué)組織傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于犁鼻器組織的電化學(xué)生物傳感器、其制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
動(dòng)物體能夠釋放出大量的化學(xué)物質(zhì),這些化學(xué)物質(zhì)在動(dòng)物種內(nèi)個(gè)體間起著傳遞信息的作用，哺乳動(dòng)物化學(xué)信號(hào)物質(zhì)的來(lái)源十分復(fù)雜，包括有尿、糞便和特化腺體的分泌物，這些化學(xué)信號(hào)物質(zhì)稱之為信息素。每一種動(dòng)物的個(gè)體氣味是來(lái)源于身體不同部位的氣味信號(hào)的混合，因此這些混合物具有種的特征，即種內(nèi)個(gè)體具有一定的相似性，而種與種之間是有一定區(qū)別的。這種種內(nèi)相似對(duì)于動(dòng)物種內(nèi)個(gè)體間化學(xué)通訊，有著重要的生物學(xué)意義而種間差異對(duì)于動(dòng)物的生殖隔離、躲避天敵等有著重要的意義。目前尚未有簡(jiǎn)單的傳感器可以起到識(shí)別上述信息素的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供了一種基于犁鼻器組織的電化學(xué)生物傳感器、其制備方法及其用途，實(shí)現(xiàn)的目的為提供一種快速、靈敏的傳感器，可以識(shí)別到動(dòng)物的信息素，并給予反饋，為犁鼻器受體蛋白與鼠尿中各種化合物的動(dòng)力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，并為鼠害的防治方面做出重要的技術(shù)貢獻(xiàn)。
為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明包括以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供的基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括如下步驟，(1)玻碳電極的預(yù)處理；
(5)將淀粉-海藻酸鈉溶液溶膠均勻涂抹于聚碳酸酯微孔膜上，取體外犁鼻器組織置于兩層聚碳酸酯微孔膜之間，形成測(cè)定膜；
(6)將步驟(2)制成的測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中，然后用磷酸緩沖溶液沖洗測(cè)定膜；
(7)將步驟(3)沖洗后的測(cè)定膜固定于玻碳電極表面，即制得基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器。
進(jìn)一步的，所述步驟(4)還包括將制備好的傳感器浸于NaCl生理鹽水中備用，存放時(shí)間≤24h。
優(yōu)選的，所述NaCl生理鹽水的濃度為0.9％，存放溫度為4-8℃。放入該濃度的生理鹽水中可保持活性，防止活性下降。
進(jìn)一步的，所述步驟(1)所述玻碳電極預(yù)處理包括下述過(guò)程：將玻碳電極依次分別用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒徑的氧化鋁漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為1∶1配置的混合液、無(wú)水乙醇、超純水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0～－1.0V、掃描速度為100mV/s的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線。
進(jìn)一步的，所述淀粉-海藻酸鈉溶膠溶液采用下述方法制備：將可溶性淀粉溶解于戊二醛水溶液中，加熱并攪拌，配制成淀粉溶液，將淀粉溶液在室溫下放置過(guò)夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)，得到醛基化淀粉膠溶液，醛基化淀粉膠溶液再與海藻酸鈉溶液混合，得到淀粉-海藻酸鈉溶膠混合溶液。
進(jìn)一步的，所述可溶性淀粉的質(zhì)量為1-2g，戊二醛水溶液的體積為100ml，且戊二醛水溶液的濃度為1-2％。
進(jìn)一步的，所述加熱溫度為75-85℃，攪拌的時(shí)間為25-35min。
進(jìn)一步的，所述醛基化淀粉膠溶液與的海藻酸鈉溶液以1：1的體積比混合，且海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為1.5-2.5％。
進(jìn)一步的，所述步驟(2)中的聚碳酸酯微孔膜直徑為25mm、孔徑為0.22um。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)中CaCl2溶液的濃度為4.5-5.5％，測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中時(shí)間為10-15s，所述沖洗測(cè)定膜的磷酸緩沖溶液濃度為10mmol/L,PH為7.0-7.2。上述操作使海藻酸鈉與Ca2+離子交聯(lián)，形成穩(wěn)定的螯合物，從而使海藻酸鈉溶液瞬時(shí)凝膠化，成為良好的固定劑，且采用磷酸緩沖溶液清洗，以除去膜上殘留的Ca2+、Cl-。
自然地，本發(fā)明也包括利用上述制備方法制得的電化學(xué)生物傳感器，該傳感器用于對(duì)大鼠分泌化合物的特異性識(shí)別用途。
采用上述技術(shù)方案，包括以下有益效果：以淀粉-海藻酸鈉溶膠封閉，以聚碳酸酯微孔膜固定犁鼻器組織構(gòu)成夾心式測(cè)定膜于玻碳電極上，構(gòu)建了一種犁鼻器電化學(xué)生物傳感器，可快速靈敏的對(duì)雌雄鼠尿進(jìn)行分辨，該種傳感器制備簡(jiǎn)單，為進(jìn)一步研究犁鼻器受體蛋白與信息素之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系提供了一種選擇。此外，該方法在在鼠害防治中對(duì)特有化合物成分的篩選具有重要的應(yīng)用潛力。
附圖說(shuō)明
圖1為犁鼻器電化學(xué)傳感器對(duì)雌雄鼠尿檢測(cè)的響應(yīng)曲線；
圖中，曲線1為體外培養(yǎng)的雄性犁鼻器對(duì)雌鼠尿液檢測(cè)的曲線；
曲線2為體外培養(yǎng)的雄性犁鼻器對(duì)雄鼠尿液檢測(cè)的曲線；
曲線3為體外培養(yǎng)的雌性犁鼻器對(duì)雄鼠尿液檢測(cè)的曲線；
曲線4為體外培養(yǎng)的雌性犁鼻器對(duì)雌鼠尿液檢測(cè)的曲線。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例一：本發(fā)明公開(kāi)的一種基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括如下步驟，(1)玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極依次分別用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒徑的氧化鋁漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為1∶1配置的混合液、無(wú)水乙醇、超純水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0～－1.0V、掃描速度為100mV/s的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線；
(2)將淀粉-海藻酸鈉溶液溶膠均勻涂抹于聚碳酸酯微孔膜上，取體外犁鼻器組織置于兩層聚碳酸酯微孔膜之間，形成測(cè)定膜，所述淀粉-海藻酸鈉溶膠溶液采用下述方法制備：將1g可溶性淀粉溶解于100ml濃度為1％的戊二醛水溶液中，75℃加熱并攪拌，攪拌的時(shí)間為25-35min，配制成淀粉溶液，將淀粉溶液在室溫下放置過(guò)夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)，得到醛基化淀粉膠溶液，醛基化淀粉膠溶液再與質(zhì)量濃度為1.5％海藻酸鈉溶液按照1：1的體積比混合，得到淀粉-海藻酸鈉溶膠混合溶液；
(3)將步驟(2)制成的測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中，然后用磷酸緩沖溶液沖洗測(cè)定膜；所述步驟(3)中CaCl2溶液的濃度為4.5％，測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中時(shí)間為10-15s，所述沖洗測(cè)定膜的磷酸緩沖溶液濃度為10mmol/L,PH為7.0-7.2；
(4)將步驟(3)沖洗后的測(cè)定膜固定于玻碳電極表面，即制得基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器，備好的傳感器浸于濃度為0.9％的NaCl生理鹽水中，存放溫度為4-8℃?zhèn)溆?，存放時(shí)間≤24h。
所述步驟(2)中的聚碳酸酯微孔膜直徑為25mm、孔徑為0.22um。
實(shí)施例二：本發(fā)明公開(kāi)的一種基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括如下步驟，(1)玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極依次分別用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒徑的氧化鋁漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為1∶1配置的混合液、無(wú)水乙醇、超純水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0～－1.0V、掃描速度為100mV/s的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線；
(2)將淀粉-海藻酸鈉溶液溶膠均勻涂抹于聚碳酸酯微孔膜上，取體外犁鼻器組織置于兩層聚碳酸酯微孔膜之間，形成測(cè)定膜，所述淀粉-海藻酸鈉溶膠溶液采用下述方法制備：將2g可溶性淀粉溶解于100ml濃度為2％的戊二醛水溶液中，85℃加熱并攪拌，攪拌的時(shí)間為25-35min，配制成淀粉溶液，將淀粉溶液在室溫下放置過(guò)夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)，得到醛基化淀粉膠溶液，醛基化淀粉膠溶液再與質(zhì)量濃度為2.5％海藻酸鈉溶液按照1：1的體積比混合，得到淀粉-海藻酸鈉溶膠混合溶液；
(3)將步驟(2)制成的測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中，然后用磷酸緩沖溶液沖洗測(cè)定膜；所述步驟(3)中CaCl2溶液的濃度為5.5％，測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中時(shí)間為10-15s，所述沖洗測(cè)定膜的磷酸緩沖溶液濃度為10mmol/L,PH為7.0-7.2；
(4)將步驟(3)沖洗后的測(cè)定膜固定于玻碳電極表面，即制得基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器，備好的傳感器浸于濃度為0.9％的NaCl生理鹽水中，存放溫度為4-8℃?zhèn)溆?，存放時(shí)間≤24h。
所述步驟(2)中的聚碳酸酯微孔膜直徑為25mm、孔徑為0.22um。
實(shí)施例三：本發(fā)明公開(kāi)的一種基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器的制備方法，包括如下步驟，(1)玻碳電極的預(yù)處理：將玻碳電極依次分別用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒徑的氧化鋁漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為1∶1配置的混合液、無(wú)水乙醇、超純水清洗；在1mol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0～－1.0V、掃描速度為100mV/s的循環(huán)伏安法活化電極，重復(fù)掃描直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線；
(2)將淀粉-海藻酸鈉溶液溶膠均勻涂抹于聚碳酸酯微孔膜上，取體外犁鼻器組織置于兩層聚碳酸酯微孔膜之間，形成測(cè)定膜，所述淀粉-海藻酸鈉溶膠溶液采用下述方法制備：將1.5g可溶性淀粉溶解于100ml濃度為1.5％的戊二醛水溶液中，80℃加熱并攪拌，攪拌的時(shí)間為25-35min，配制成淀粉溶液，將淀粉溶液在室溫下放置過(guò)夜，使淀粉與戊二醛得到充分的交聯(lián)，得到醛基化淀粉膠溶液，醛基化淀粉膠溶液再與質(zhì)量濃度為2％海藻酸鈉溶液按照1：1的體積比混合，得到淀粉-海藻酸鈉溶膠混合溶液；
(3)將步驟(2)制成的測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中，然后用磷酸緩沖溶液沖洗測(cè)定膜；所述步驟(3)中CaCl2溶液的濃度為5％，測(cè)定膜浸入CaCl2溶液中時(shí)間為10-15s，所述沖洗測(cè)定膜的磷酸緩沖溶液濃度為10mmol/L,PH為7.0-7.2；
(4)將步驟(3)沖洗后的測(cè)定膜固定于玻碳電極表面，即制得基于犁鼻組織的電化學(xué)生物傳感器，備好的傳感器浸于濃度為0.9％的NaCl生理鹽水中，存放溫度為4-8℃?zhèn)溆?，存放時(shí)間≤24h。
所述步驟(2)中的聚碳酸酯微孔膜直徑為25mm、孔徑為0.22um。
經(jīng)上述制備方法得到的傳感器，可以用于對(duì)大鼠分泌化合物的特異性識(shí)別用途，例如下述試驗(yàn)內(nèi)容：
測(cè)定采用三電極系統(tǒng)，以固定有犁鼻器組織膜的玻碳電極作為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，以超純水作為測(cè)試底液。采用時(shí)間-電流曲線法，掃描電位-0.4V，掃描時(shí)間120s。以檢測(cè)鼠尿前后穩(wěn)定電流值(I1、I2)變化率進(jìn)行定量檢測(cè)。電流變化率ΔI＝I1I-1I2，令pCa＝14+lgC，以ΔI對(duì)pCa作圖。其檢測(cè)結(jié)果如下圖1所示，(1)雌鼠犁鼻器電化學(xué)傳感器對(duì)雄鼠尿在10-15-10-10濃度范圍內(nèi)響應(yīng)顯著，y＝-0.0054x2+0.1062x+0.2581(R2＝0.9155)；(2)雌鼠犁鼻器電化學(xué)傳感器對(duì)雌鼠尿在10-15-10-1濃度范圍均呈良好的線性關(guān)系，y＝0.0212x+0.5088(R2＝0.9668)；(3)雄鼠犁鼻器電化學(xué)傳感器檢測(cè)雌鼠尿10-15-10-1濃度范圍，其線性關(guān)系為y＝-0.0024x2+0.0505x+0.5149(R2＝0.9776)；(4)雄鼠犁鼻器電化學(xué)傳感器檢測(cè)雄鼠尿的電流響應(yīng)與濃度之間的關(guān)系與其它曲線不同，其線性關(guān)系為y＝-0.0044x2+0.068x+0.1365(R2＝0.867)，在10-15-10-1濃度范圍內(nèi)，電流變化率隨濃度先增大后減小，并在10-4時(shí)達(dá)到最大值?？梢愿鶕?jù)傳感器與鼠尿之間的電流響應(yīng)關(guān)系判斷鼠尿是雄性還是雌性。
參照?qǐng)D1所示，采用時(shí)間電流曲線法(掃描電位-0.4V，掃描時(shí)間120s)，以新制備的雌鼠犁鼻器電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)超純水，得到baseline；再在濃度為10-4雌鼠尿中連續(xù)檢測(cè)5次，每次檢測(cè)后均用超純水沖洗，結(jié)果顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.87％。采用同樣方法分別檢測(cè)雌鼠對(duì)雄鼠尿曲線3、雌鼠對(duì)雌鼠尿曲線4、雄鼠對(duì)雄鼠尿曲線2、雄鼠對(duì)雌鼠尿曲線1、的電流響應(yīng)，結(jié)果顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為：7.41％、4.5％、4.82％。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。