本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于電化學(xué)生物傳感器檢測1,5-脫水葡萄糖醇的方法。

背景技術(shù)：

1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-anhydroglμcitol，1,5-AG)是一種生理指標(biāo)，檢測方法主要有氣相色譜法、全酶法、液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)等。公開號為CN101522895發(fā)明專利，公開一種1,5-脫水葡萄糖醇的測定方法，使用由氨基酸形成具有山梨糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)來檢測1,5-AG。公開號CN101558296的發(fā)明專利，公開一種測定1,5-脫水葡萄糖醇的方法，使用少量全血測定1,5-脫水葡萄糖醇而無需借助于離心機(jī)等，包括預(yù)先消除或轉(zhuǎn)化干擾1,5-脫水葡萄糖醇測定的葡萄糖和/或其衍生物；然后進(jìn)行測定1,5-脫水葡萄糖醇，其中不進(jìn)行血細(xì)胞分離而在原樣全血中消除或轉(zhuǎn)化這種葡萄糖和/或其衍生物，不進(jìn)行血細(xì)胞分離而讓用于測定1,5-脫水葡萄糖醇的酶發(fā)揮作用，以及電化學(xué)測定1,5-脫水葡萄糖醇。因此，這種測定方法能夠用于在床邊或醫(yī)學(xué)檢查室中1,5-脫水葡萄糖醇的快速測定或用于由患者在家中對其進(jìn)行自測。公開號為CN102175670A的發(fā)明，公開一種新的血液1,5-脫水葡萄糖醇含量的方法，通過吡喃糖氧化酶催化1,5-脫水葡萄糖醇生成1,5-脫水果糖和H₂O₂；4-氨基安替比啉(4-AAP)、3-羥基-2,4，6-三羥基苯甲酸(HTIB)和H₂O₂在辣根過氧化物酶的催化作用下生成醌類化合物；利用比色分析原理確定血液中1,5-脫水葡萄糖醇水平。這些檢測方法操作復(fù)雜，無法滿足快速檢測的需求。Fμkμmμra,Tajima,et,al. Fμlly enzymatic method for determining 1,5-anhydro-

D-glμcitol in serμm.clinciachemistry,1994,40(11):2013-2016.報(bào)道的全酶法雖然有抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但是這種方法需要在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行，成本較高，適用于醫(yī)學(xué)的臨床實(shí)驗(yàn)室，無法滿足現(xiàn)場檢測的需要。電解質(zhì)-絕緣體-半導(dǎo)體（EIS）型化學(xué)傳感器敏感單元結(jié)構(gòu)為Si₃N₄/SiO₂/Si，由于具有靈敏度高、選擇性好、易于微型化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，對于發(fā)展快速簡便、價(jià)廉、高靈敏度、便攜化的醫(yī)學(xué)檢測儀器，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于EIS結(jié)構(gòu)電化學(xué)生物傳感器檢測1,5-AG的方法；利用電化學(xué)生物傳感器，基于酶催化銀沉積反應(yīng)，建立一種基于EIS型電化學(xué)傳感器檢測1,5-AG的方法，檢測限為40μg/mL。

本發(fā)明基于酶催化銀沉積反應(yīng)，所涉及到的主要方程式為：

本發(fā)明是在Labview測試系統(tǒng)上完成的，Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；并進(jìn)一步采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線，計(jì)算出ΔV，得出ΔV與所加1,5-AG濃度的線性關(guān)系，通過計(jì)算得到1,5-AG的濃度。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1：EIS結(jié)構(gòu)傳感器敏感單元的修飾

（1）將硅片依次在乙醇、丙酮、純水中超聲清洗；

（2）滴加NaOH溶液，靜置、清洗；滴加巰丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液于硅片表面，靜置，用清水沖洗干凈，得到巰基硅烷化的敏感單元；

（3）在氯金酸溶液中，加入鹽酸羥胺溶液，反應(yīng)；

（4）用PEG-20000和純水洗滌，得到納米金溶液；

（5）滴加納米金溶液于巰基硅烷化后的硅基表面，靜置后用水清洗，得到修飾了納米金粒子的硅片；

步驟2：EIS結(jié)構(gòu)傳感器生物傳感界面的構(gòu)建

（1）在修飾了納米金粒子的硅片表面滴加吡喃糖氧化酶（PROD），孵育；

（2）孵育完成后用純水將未固定的酶洗去，裝配到檢測儀器中去，完成EIS結(jié)構(gòu)傳感器生物傳感界面的構(gòu)建；

步驟3：1,5-AG的工作曲線繪制

（1）在固定了PROD的硅片表面滴加標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行孵育；

（2）在孵育得到的硅片表面滴加AgNO₃的溶液，避光孵育得到沉積有單質(zhì)銀的敏感單元；

（3）將敏感單元裝配到檢測儀器中去，通過Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；并進(jìn)一步采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線；

（4）得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的I-V曲線后，計(jì)算出ΔV，繪制1,5-AG工作曲線，計(jì)算相關(guān)性系數(shù)和檢測限；

步驟4：待測樣品的檢測

（1）將待測樣品滴加在固定了PROD的硅片表面，進(jìn)行孵育；

（2）在孵育得到的硅片表面滴加用甘氨酸氫氧化鈉緩沖液配制的AgNO₃溶液，避光孵育得到沉積有單質(zhì)銀的敏感單元；

（3）將敏感單元裝配到檢測儀器中去，通過Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電化學(xué)生物傳感器偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線，計(jì)算出ΔV；

（4）根據(jù)步驟4所述工作曲線，得到所述待測樣品溶液中1,5-AG的濃度。

進(jìn)一步，步驟1中，所述氫氧化鈉的濃度為1mol/L；

進(jìn)一步，步驟1中，所述巰丙基三乙氧基硅烷與乙醇溶液的體積比為1:99；

進(jìn)一步，步驟2中，所述氯金酸溶液中氯金酸與水的體積比為1:99；

進(jìn)一步，步驟2中，所述PEG-2000的濃度為50g/L；

進(jìn)一步，步驟3中，所述AgNO₃濃度為10mM；

進(jìn)一步，所述孵育溫度為37℃；

其中，步驟1提供一個(gè)清潔的硅片表面，為形成完整、穩(wěn)定、牢固、導(dǎo)電性好的高分子聚合膜提供條件。步驟1中高分子聚合膜的形成為步驟2中生物識別分子PROD的固定提供位點(diǎn)，從而構(gòu)成特異性識別1,5-AG的生物傳感界面，為步驟3中1,5-AG的電化學(xué)檢測提供測試平臺，實(shí)現(xiàn)1,5-AG的電化學(xué)檢測?？梢姴襟E1-3相互支撐，共同作用，才能利用酶催化銀沉積反應(yīng)實(shí)現(xiàn)電化學(xué)檢測1,5-AG。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.高分子聚合膜可為生物識別分子PROD酶的固定提供位點(diǎn)，并有利于電子的傳遞。

2.在金納米材料表面進(jìn)行的免疫反應(yīng)是一種界面反應(yīng)體系，可提高PROD與1,5-AG的反應(yīng)效率。

3.本發(fā)明建立的檢測1,5-AG方法的有益效果在于能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測。

附圖說明

圖1 EIS型電化學(xué)傳感器檢測系統(tǒng)示意圖

圖2 EIS結(jié)構(gòu)傳感器生物傳感界面的構(gòu)建圖

圖3 不同濃度1,5-AG的I-V曲線圖

圖4 基于EIS電化學(xué)傳感器方法檢測1,5-AG工作曲線

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。該實(shí)施例僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施方式而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施方式所做的任何簡單修改，等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

圖1為EIS型電化學(xué)傳感器檢測系統(tǒng)示意圖，檢測原理為：當(dāng)利用調(diào)制的激勵(lì)光源照射硅片硅襯底部位時(shí)，會(huì)激發(fā)硅片產(chǎn)生電子-空穴對，電子空穴對在耗盡層電場作用下定向移動(dòng)從而在外部回路中產(chǎn)生受調(diào)制的光電流，通過調(diào)節(jié)加在電解液與硅片襯底之間的直流偏置電壓，可以獲得每個(gè)敏感區(qū)的光電流隨外加偏置電壓變化的I-V響應(yīng)曲線，不同濃度的電解液與固液界面間會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)大小的膜電位，膜電位與外加偏置電壓一起作用于EIS型傳感器的耗盡層，會(huì)使其I-V曲線沿偏置電壓方向（X軸）發(fā)生一定程度的偏移。

對于整個(gè)檢測系統(tǒng)而言，通過Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；并進(jìn)一步采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線。

EIS結(jié)構(gòu)傳感器生物傳感界面的構(gòu)建，PROD在敏感單元上的固定方法如圖2所示，采用硅烷/納米金復(fù)合膜作為固定化生物活性物質(zhì)的載體，利用靜電吸附作用來實(shí)現(xiàn)吡喃糖氧化酶在EIS結(jié)構(gòu)電化學(xué)傳感器敏感單元上的固定。該載體具有低溫制備、熱穩(wěn)定性、生物兼容性以及非水溶液中的幾乎不溶脹性等，酶或蛋白質(zhì)固定在硅基表面，可以同時(shí)保持它們原有的活性，特別適合用于制備生物傳感器。

實(shí)施步驟如下：

1. EIS結(jié)構(gòu)傳感器敏感單元的修飾

將硅片依次在無水乙醇、丙酮和清水中，分別超聲清洗5 min，然后用移液槍在硅片上滴加20μL 1mol/L的氫氧化鈉溶液，靜置30min，完成對硅片表面的活化；用清水沖洗3次，再用液槍滴加20μL 1%巰丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，靜置12 h，完成硅基表面的巰基硅烷化；取1mL 1.0%氯金酸溶液，加入5mL 80mmol/L鹽酸羥胺溶液后，反應(yīng)3h，依次用50g/L的PEG-20000和純水洗滌，得到納米金溶液。在巰基硅烷后的硅片上滴加20μL的納米金溶液，在常溫下靜置8h，然后用純水沖洗干凈，即得到硅烷/納米金復(fù)合膜修飾的EIS結(jié)構(gòu)傳感器基片。

2. EIS結(jié)構(gòu)傳感器生物傳感界面的構(gòu)建

在修飾了納米金粒子的硅片表面滴加20 μL 1 mg/ml PROD，在常溫下孵育3h，孵育完成后用純水將未固定的酶洗去，完成將PROD酶在硅片上的固定；

3. 1,5-AG的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在固定了PROD的硅片表面滴加20μL 濃度分別為0 μg/ML，100 μg/mL，125 μg/mL，150 μg/mL，175 μg/mL的1,5-AG溶液，于37℃下孵育30min；免疫反應(yīng)完成后，在電極表面滴加AgNO₃溶液，于常溫下孵育30min，得到沉積有單質(zhì)銀的敏感單元，通過Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；并進(jìn)一步采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線，如圖3所示；計(jì)算出ΔV，結(jié)果見表1所示；繪制出的1,5-AG標(biāo)準(zhǔn)曲線，工作曲線見圖4，線性關(guān)系為：Y=0.00174X+0.00726，線性相關(guān)系數(shù)R²=0.9929。

表1 不同濃度1,5-AG 電壓偏移量

4. 待測樣品的檢測：

測血清中1,5-AG的含量時(shí)首先要排除血清中葡萄糖的干擾，因此要用到葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，影響準(zhǔn)確性還會(huì)有抗壞血酸和膽紅素的干擾，因?yàn)樗麄儠?huì)消耗反應(yīng)過程中的過氧化氫，因此還要用到抗壞血酸氧化酶和膽紅素氧化酶，在排除以上因素的干擾后，在固定了PROD的硅片表面滴加20 μL濃度分別為200ug/mL，225ug/ml，300ug/ml，350ug/ml，400ug/ml，在37℃的條件下孵育30min，在孵育得到的硅片硅片表面滴加用甘氨酸氫氧化鈉配制的AgNO₃的溶液，避光孵育得到沉積有單質(zhì)銀的敏感單元，通過Labview測試系統(tǒng)提供EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的偏置電壓、驅(qū)動(dòng)信號；并進(jìn)一步采集EIS結(jié)構(gòu)電容型電化學(xué)傳感器的輸出信號，對采集到的信號進(jìn)行放大、濾波、轉(zhuǎn)換處理，求光電流有效值，最后繪制I-V特性曲線，算出ΔV，根據(jù)步驟3得到的工作曲線算出待測樣品的濃度；結(jié)果見表2

表2 不同濃度1,5-AG樣本的檢測