本發(fā)明涉及電化學(xué)生物傳感器
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器及其制備、應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
：酚類化合物是環(huán)境中廣泛存在的一類有機(jī)污染物，主要來(lái)自化工、醫(yī)藥、煉焦等工業(yè)排放及農(nóng)藥降解，威脅人類用水安全。隨著人們對(duì)環(huán)境安全意識(shí)的逐步提高，迫切要求快速準(zhǔn)確地測(cè)量地表水及飲用水的安全狀況。目前對(duì)于酚類有機(jī)污染物的主要測(cè)定方法有色譜法、紫外分光光度法、流動(dòng)注射分析法等。但這些方法都存在著儀器昂貴、樣品預(yù)處理、操作過(guò)程復(fù)雜、分析周期長(zhǎng)以及對(duì)工作人員的操作水平要求高等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，無(wú)法滿足環(huán)境中酚類化合物的準(zhǔn)確快速檢測(cè)的要求。生物傳感器是基于生物組分對(duì)底物進(jìn)行專一的識(shí)別，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)器將產(chǎn)生的信號(hào)以光、電等形式傳遞出來(lái)，通過(guò)信號(hào)大小定量檢測(cè)底物的一項(xiàng)新技術(shù)。因其具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、在復(fù)雜的體系中進(jìn)行在線連續(xù)監(jiān)測(cè)，特別是它的高度自動(dòng)化、微型化與集成化的特點(diǎn)，使其在近幾十年獲得蓬勃而迅速的發(fā)展。生物傳感器技術(shù)已經(jīng)成為一個(gè)非?；钴S的工程技術(shù)研究領(lǐng)域，它在國(guó)民經(jīng)濟(jì)的各個(gè)部門如食品、制藥、化工、臨床檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用前景。酪氨酸酶生物傳感器因其靈敏度高、分析速率快、選擇性好等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于酚類化合物的檢測(cè)；如圖4所示，是酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器與酚類化合物的反應(yīng)原理圖。如圖5所示，是酪氨酸酶對(duì)單酚化合物及雙酚化合物的催化循環(huán)示意圖。但酪氨酸酶是一種具有生物催化活性的蛋白質(zhì)，在生物體外容易失去活性，在生物傳感器應(yīng)用中，生物酶需要被固定在一個(gè)基板上以實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞或者增大表面積以達(dá)到效率放大作用。利用各種固定方法將生物敏感元件固定于基板表面并保持活性是生物傳感器發(fā)展的重要方向?，F(xiàn)有的酪氨酸酶?jìng)鞲衅髌毡榇嬖诘膯?wèn)題是制備方法復(fù)雜、成本高、操作和存儲(chǔ)穩(wěn)定性不夠高等。經(jīng)查閱相關(guān)專利文獻(xiàn)，公開(kāi)號(hào)為102854233a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種“基于修飾電極的酪氨酸酶生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用”，通過(guò)在玻碳電極表面沉積納米金粒子，之后吸附l-賴氨酸薄膜，在l-賴氨酸薄膜上加載有序介孔碳載納米金，最后吸附酪氨酸酶。其制備過(guò)程中所使用的納米金材料昂貴，制備過(guò)程復(fù)雜，并且酪氨酸酶的用量為0.05mg/μl-0.1mg/μl，酪氨酸酶用量大，生產(chǎn)成本很高。公開(kāi)號(hào)為102928488a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種“酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)水體環(huán)境中酚類化合物的方法”，利用親水性離子液體與介孔碳制備復(fù)合材料，再將酪氨酸酶加入到復(fù)合材料中制備酪氨酸酶工作電極。介孔碳材料的制備過(guò)程復(fù)雜，需要使用濃硫酸，并且制備過(guò)程中需要升溫750-950度，使用有機(jī)溶劑，易造成環(huán)境污染，酪氨酸酶的用量為2.5-20mg/ml，生產(chǎn)成本較高。公開(kāi)號(hào)為103278541a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種“用于檢測(cè)雙酚a的電化學(xué)生物傳感器及其制備方法和應(yīng)用”，使用石墨烯/金復(fù)合物以及殼聚糖來(lái)修飾固定酪氨酸酶電極，使用的金及生物材料價(jià)格昂貴，需要多種有機(jī)及無(wú)機(jī)試劑，并且使用酪氨酸酶的濃度高達(dá)4.5mg/ml。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器及其制備、應(yīng)用方法，所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器具有選擇性好、催化活性高、反應(yīng)速度快、檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)下限低、操作穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)多種酚類化合物進(jìn)行定量分析；其制備方法簡(jiǎn)單、成本低廉、適用于在線檢測(cè)，易于應(yīng)用在實(shí)際工業(yè)及環(huán)境檢測(cè)。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器，包括對(duì)電極、參比電極和工作電極；其特征在于，所述工作電極為下述三種電極中的一種：1)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極；2)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極；3)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極是在玻碳電極的檢測(cè)端滴涂氧化石墨烯的甲苯溶液，制備氧化石墨烯修飾的玻碳電極；再將氧化石墨烯修飾的玻碳電極表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制備三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極；最后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極上，制備得到修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極是在玻碳電極表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制備伯胺基修飾的玻碳電極，再將伯胺基修飾的玻碳電極表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制備三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極；最后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極上，制備得到表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O是將碳?xì)蛛姌O浸沒(méi)在三聚氯氰的甲苯溶液中，制備三聚氯氰修飾的碳?xì)蛛姌O，然后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰修飾的碳?xì)蛛姌O上，制備得到表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極的制備方法具體包括如下步驟：1)制備氧化石墨烯的甲苯溶液：使用甲苯為溶劑，配制氧化石墨烯濃度為1～5mg/ml的氧化石墨烯甲苯溶液，將所配制的溶液超聲波震蕩1小時(shí)以上，備用；2)制備三聚氯氰的甲苯溶液：使用甲苯為溶劑，配制三聚氯氰濃度為1～50mmol/l的三聚氯氰甲苯溶液；3)制備酪氨酸酶溶液：使用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，配制濃度為0.05～1mg/ml的酪氨酸酶溶液；4)制備表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極：將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次以上，每次不少于5分鐘，之后氮?dú)飧稍?；在干燥后的玻碳電極表面先滴涂氧化石墨烯甲苯溶液，固定后用甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍铮蝗缓蟮瓮咳勐惹杓妆饺芤?，固定后?jīng)甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍?；然后再在電極表面滴涂酪氨酸酶溶液并固定；以上各溶液在電極表面的固定時(shí)間均為15分鐘～24小時(shí)；所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極的制備方法具體包括如下步驟：1)將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次以上，每次不少于5分鐘，之后氮?dú)獯蹈桑?)在干燥后的玻碳電極表面先滴涂體積比為20％～30％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小時(shí)以上，之后用甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍铮蝗缓蟮瓮繚舛葹?～50mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分鐘以上，再經(jīng)甲苯清洗，氮?dú)飧稍铮蛔詈笤谠摬Ｌ茧姌O表面滴涂濃度為0.05～1mg/ml的酪氨酸酶溶液，溶劑采用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，室溫放置1小時(shí)以上；3)將修飾后的玻碳電極放入緩沖溶液中攪拌清洗3次以上，每次至少5分鐘，去除表面弱吸附的酶分子，將該酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器保存于4℃條件下備用。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O是將碳?xì)蛛姌O的制備方法具體包括如下步驟：1)將碳?xì)蛛姌O放入去離子水中，超聲波清洗10分鐘以上；2)將清洗好的碳?xì)蛛姌O真空干燥，之后浸沒(méi)于1～50mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小時(shí)以上；固定后用甲苯溶液清洗，真空干燥；再將三聚氯氰修飾后的碳?xì)蛛姌O浸沒(méi)于0.05～1mg/ml酪氨酸酶溶液中；溶劑采用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，室溫放置24小時(shí)以上；3)將修飾后的碳?xì)蛛姌O放入緩沖溶液中攪拌清洗3次以上，每次至少5分鐘，去除表面吸附弱的酶分子，將該酪氨酸酶生物傳感器保存于4℃條件下備用。所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液或britton-robinson緩沖溶液。應(yīng)用所述一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酚類化合物的方法，采用工作電極、參比電極和對(duì)電極建立三電極系統(tǒng)，其中銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極；三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，將工作電極的檢測(cè)端置于待測(cè)溶液中，通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)出待測(cè)溶液中苯醌的還原電流的大小，然后根據(jù)底物濃度與檢測(cè)電流的校正曲線，測(cè)定待測(cè)溶液中的酚類化合物的含量。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明采用三聚氯氰作為偶聯(lián)劑將酪氨酸酶固定在氧化石墨烯修飾的玻碳電極上，三聚氯氰分別與酪氨酸酶的伯氨基及氧化石墨烯所含的羥基形成化學(xué)鍵，從而實(shí)現(xiàn)酪氨酸酶在電極上的固定；與采用其他修飾方法的酪氨酸酶生物傳感器相比，具有反應(yīng)速度快、檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)下限低、操作穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；2)可用于對(duì)多種酚類化合物進(jìn)行定量分析，適用范圍廣；3)所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器制備方法簡(jiǎn)單、成本低廉；4)適用于在線檢測(cè)，易于應(yīng)用在實(shí)際工業(yè)及環(huán)境檢測(cè)，為生物傳感器的發(fā)展帶來(lái)更大的進(jìn)步，對(duì)于實(shí)現(xiàn)酚類化合物的快速檢測(cè)具有一定的理論及現(xiàn)實(shí)意義。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極制備過(guò)程示意圖。圖2是本發(fā)明所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極制備過(guò)程示意圖。圖3是本發(fā)明所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O制備過(guò)程示意圖。圖4是酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器與酚類化合物的反應(yīng)原理圖。圖5是酪氨酸酶對(duì)單酚化合物及雙酚化合物的催化循環(huán)示意圖。圖6是裸玻碳電極、修飾酪氨酸酶的玻碳電極、修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極對(duì)鄰苯二酚溶液的響應(yīng)圖。圖7是修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極對(duì)鄰苯二酚的定電位響應(yīng)圖。圖8是裸玻碳電極、修飾酪氨酸酶的玻碳電極、修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極的電化學(xué)交流阻抗譜圖。圖9是修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極對(duì)不同底物的校正曲線。圖10是酪氨酸酶/三聚氯氰/碳?xì)蛛姌O(a)及酪氨酸酶/碳?xì)蛛姌O(b)對(duì)鄰苯二酚的檢測(cè)圖。(a:0.1μm；b:0.3μm；c:1μm；d:3μm；e:10μm；f:30μm；g:100μm)圖11是酪氨酸酶/三聚氯氰/碳?xì)蛛姌O對(duì)鄰苯二酚(10μm)的定電位流動(dòng)注射曲線。圖12是裸碳?xì)蛛姌O(a)、酪氨酸酶/碳?xì)蛛姌O(b)、酪氨酸酶/三聚氯氰/碳?xì)蛛姌O(c)的循環(huán)伏安曲線。圖13是裸碳?xì)蛛姌O(a)、酪氨酸酶/碳?xì)蛛姌O(b)、酪氨酸酶/三聚氯氰/碳?xì)蛛姌O(c)的電化學(xué)交流阻抗譜圖。圖中：1.玻碳電極2.氧化石墨烯修飾的玻碳電極3.三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極4.表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極5.3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極6.三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極7.表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極8.碳?xì)蛛姌O9.三聚氯氰修飾的碳?xì)蛛姌O10.表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O圖中各符號(hào)含義：gce：玻碳go：氧化石墨烯go/gce：氧化石墨烯修飾的玻碳電極cc：三聚氯氰cc/go/gce：三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極tyr/cc/go/gce：表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極baregce:裸玻碳電極tyr/gce:表面修飾酪氨酸酶的玻碳電極具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步說(shuō)明：本發(fā)明所述一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器，包括對(duì)電極、參比電極和工作電極；其特征在于，所述工作電極為下述三種電極中的一種：1)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極；2)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極；3)表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O。如圖1所示，所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極是在玻碳電極的檢測(cè)端滴涂氧化石墨烯的甲苯溶液，制備氧化石墨烯修飾的玻碳電極；再將氧化石墨烯修飾的玻碳電極表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制備三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極；最后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰/氧化石墨烯修飾的玻碳電極上，制備得到修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極。如圖2所示，所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極是在玻碳電極表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制備伯胺基修飾的玻碳電極，再將伯胺基修飾的玻碳電極表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制備三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極；最后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極上，制備得到表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極。如圖3所示，所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O是將碳?xì)蛛姌O浸沒(méi)在三聚氯氰的甲苯溶液中，制備三聚氯氰修飾的碳?xì)蛛姌O，然后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰修飾的碳?xì)蛛姌O上，制備得到表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極的制備方法具體包括如下步驟：1)制備氧化石墨烯的甲苯溶液：使用甲苯為溶劑，配制氧化石墨烯濃度為1～5mg/ml的氧化石墨烯甲苯溶液，將所配制的溶液超聲波震蕩1小時(shí)以上，備用；2)制備三聚氯氰的甲苯溶液：使用甲苯為溶劑，配制三聚氯氰濃度為1～50mmol/l的三聚氯氰甲苯溶液；3)制備酪氨酸酶溶液：使用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，配制濃度為0.05～1mg/ml的酪氨酸酶溶液；4)制備表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極：將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次以上，每次不少于5分鐘，之后氮?dú)飧稍铮辉诟稍锖蟮牟Ｌ茧姌O表面先滴涂氧化石墨烯甲苯溶液，固定后用甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍?；然后滴涂三聚氯氰甲苯溶液，固定后?jīng)甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍?；然后再在電極表面滴涂酪氨酸酶溶液并固定；以上各溶液在電極表面的固定時(shí)間均為15分鐘～24小時(shí)；所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極的制備方法具體包括如下步驟：1)將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次以上，每次不少于5分鐘，之后氮?dú)獯蹈桑?)在干燥后的玻碳電極表面先滴涂體積比為20％～30％的3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小時(shí)以上，之后用甲苯溶液清洗，氮?dú)飧稍铮蝗缓蟮瓮繚舛葹?～50mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分鐘以上，再經(jīng)甲苯清洗，氮?dú)飧稍铮蛔詈笤谠摬Ｌ茧姌O表面滴涂濃度為0.05～1mg/ml的酪氨酸酶溶液，溶劑采用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，室溫放置1小時(shí)以上；3)將修飾后的玻碳電極放入緩沖溶液中攪拌清洗3次以上，每次至少5分鐘，去除表面弱吸附的酶分子，將該酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器保存于4℃條件下備用。所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O是將碳?xì)蛛姌O的制備方法具體包括如下步驟：1)將碳?xì)蛛姌O放入去離子水中，超聲波清洗10分鐘以上；2)將清洗好的碳?xì)蛛姌O真空干燥，之后浸沒(méi)于1～50mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小時(shí)以上；固定后用甲苯溶液清洗，真空干燥；再將三聚氯氰修飾后的碳?xì)蛛姌O浸沒(méi)于0.05～1mg/ml酪氨酸酶溶液中；溶劑采用濃度為1～100mm、ph值為3.5～9.5的緩沖溶液，室溫放置24小時(shí)以上；3)將修飾后的碳?xì)蛛姌O放入緩沖溶液中攪拌清洗3次以上，每次至少5分鐘，去除表面吸附弱的酶分子，將該酪氨酸酶生物傳感器保存于4℃條件下備用。所述緩沖溶液為磷酸緩沖溶液或britton-robinson緩沖溶液。應(yīng)用所述一種酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酚類化合物的方法，采用工作電極、參比電極和對(duì)電極建立三電極系統(tǒng)，其中銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極；三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，將工作電極的檢測(cè)端置于待測(cè)溶液中，通過(guò)電化學(xué)工作站檢測(cè)出待測(cè)溶液中苯醌的還原電流的大小，然后根據(jù)底物濃度與檢測(cè)電流的校正曲線，測(cè)定待測(cè)溶液中的酚類化合物的含量。石墨烯是一種由碳原子以sp2雜化方式形成的蜂窩狀平面薄膜，是一種只有一個(gè)原子層厚度的準(zhǔn)二維材料，是目前發(fā)現(xiàn)的最薄、強(qiáng)度最大、導(dǎo)電導(dǎo)熱性能最強(qiáng)的一種新型納米材料，并被稱為“新材料之王”。它被廣泛的應(yīng)用于生物電子元器件的制備中。三聚氯氰是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，具有廣泛的用途，它是農(nóng)藥工業(yè)的中間體，是制造活性染料的原料，可做有機(jī)工業(yè)生產(chǎn)的各種助劑，如熒光增白劑、紡織物防縮水劑、表面活性劑等，是橡膠促進(jìn)劑和國(guó)防用于制造炸藥的原料之一，也是醫(yī)藥農(nóng)藥工業(yè)用于合成藥物的原料。本發(fā)明采用三聚氯氰作為偶聯(lián)劑將酪氨酸酶固定在氧化石墨烯修飾的玻碳電極上，三聚氯氰分別與酪氨酸酶的伯氨基及氧化石墨烯所含的羥基形成化學(xué)鍵而將酪氨酸酶固定在電極上。將三聚氯氰用于生物電化學(xué)傳感器的制備，在生物傳感器的制備中是非常少見(jiàn)的。與裸電極及其他修飾的酪氨酸酶生物傳感器相比，三聚氯氰與酪氨酸酶通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)所制備的生物傳感器制備簡(jiǎn)單、反應(yīng)速度快、檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)下限低、具有良好的操作穩(wěn)定性及儲(chǔ)存穩(wěn)定性(如圖6-圖13所示；)，且所用材料成本低廉。以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。【實(shí)施例1】本實(shí)施例采用酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)溶液中的酚類化合物，酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器包括對(duì)電極、參比電極和工作電極；其中工作電極為表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極。本實(shí)施例所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器的具體制備步驟如下：1)將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次，每次5分鐘，之后氮?dú)獯蹈伞?)在清洗好的玻碳電極的表面首先固定氧化石墨烯，之后通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)方法固定三聚氯氰，最后再通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)方法固定酪氨酸酶；具體操作方法是：在干燥后的玻碳電極表面先滴涂氧化石墨烯濃度為5mg/ml的氧化石墨烯甲苯溶液，吸附1小時(shí)，甲苯清洗，氮?dú)飧稍?；然后滴涂三聚氯氰濃度?0mmol/l三聚氯氰甲苯溶液，固定24小時(shí)，再經(jīng)甲苯清洗，氮?dú)飧稍?；最后在玻碳電極表面滴涂濃度為0.5mg/ml的酪氨酸酶溶液，溶劑采用磷酸緩沖溶液(pbs)，緩沖溶液的濃度為0.1mol/l，ph為6.5，室溫放置1小時(shí)；3)將修飾后的玻碳電極放入濃度為0.1mol/l的pbs溶液中攪拌清洗3次，每次5分鐘，去除表面弱吸附的酶分子，將表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極保存于4℃條件下備用。采用酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酚類化合物的步驟如下：將修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/氧化石墨烯的玻碳電極作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，對(duì)待測(cè)溶液中的酚類化合物的濃度進(jìn)行檢測(cè)。工作條件：所用的電解液為0.1mol/l的磷酸緩沖溶液。在ph＝4.5-9.0范圍內(nèi)測(cè)定酪氨酸酶生物傳感器對(duì)酚類化合物的電流響應(yīng)值，優(yōu)化結(jié)果，選定ph＝6.5為最佳ph值，在此ph值下，響應(yīng)電流大且穩(wěn)定。本實(shí)施例中，酪氨酸酶生物傳感器對(duì)不同底物的檢測(cè)情況如表1所示：表1酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同底物情況底物反應(yīng)時(shí)間(s)檢測(cè)下限(nm)靈敏度(na/m)線性范圍(m)鄰苯二酚～353630.005-50苯酚～391420.01-100多巴胺～319430.01-100dopac～372520.07-70【實(shí)施例2】本實(shí)施例采用酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)溶液中酚類化合物，所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器包括對(duì)電極、參比電極和工作電極；其中工作電極為表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極。表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極的制備過(guò)程如下：在玻碳電極表面滴涂3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，制備伯胺基修飾的玻碳電極，再將伯胺基修飾的玻碳電極表面滴涂三聚氯氰的甲苯溶液，制備三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極，最后將酪氨酸酶固定在三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷修飾的玻碳電極上，制備得到表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極。本實(shí)施例所述酪氨酸酶生物傳感器的制備步驟：1)將玻碳電極依次用粒徑為1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二鋁粉末拋光，然后依次在去離子水和乙醇中各超聲清洗3次，每次5分鐘，之后氮?dú)獯蹈伞?)在清洗好的玻碳電極的表面首先固定3-氨丙基三乙氧基硅烷，在玻碳電極表面引入伯氨基，之后通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)方法固定三聚氯氰，最后再通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)方法固定酪氨酸酶，具體操作方法是：在干燥后的玻碳電極表面先滴涂25％(體積比)3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，吸附1小時(shí)，之后甲苯清洗，氮?dú)飧稍?；然后滴?0mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液，固定15分鐘，再經(jīng)甲苯清洗，氮?dú)飧稍铩Ｗ詈笤谠摬Ｌ茧姌O表面滴涂0.5mg/ml酪氨酸酶溶液，溶劑采用磷酸緩沖溶液(pbs)，緩沖溶液的濃度為0.1mol/l，ph值為6.5，室溫放置1小時(shí)；3)將修飾后的玻碳電極放入0.1mol/l的pbs溶液中攪拌清洗3次，每次5分鐘，去除表面弱吸附的酶分子，將表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極保存于4℃條件下備用。采用本實(shí)施例所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)酚類化合物的過(guò)程如下：將表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰/3-氨丙基三乙氧基硅烷的玻碳電極作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，對(duì)待測(cè)溶液中的酚類化合物的濃度進(jìn)行檢測(cè)。工作條件：所用的電解液為0.1mol/l的磷酸緩沖溶液。在ph＝4.5-9.0范圍內(nèi)測(cè)定酪氨酸酶生物傳感器對(duì)酚類化合物的電流響應(yīng)值，優(yōu)化結(jié)果，選定ph＝6.5為最佳ph值，在此ph值下，響應(yīng)電流大且穩(wěn)定。本實(shí)施例采用先在玻碳表面先修飾偶聯(lián)基團(tuán)，應(yīng)用共價(jià)偶聯(lián)的方法形成共價(jià)鍵，把酪氨酸酶固定在玻碳電極上；所制備的酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器對(duì)不同底物的檢測(cè)情況如表2所示：表2酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同底物情況【實(shí)施例3】本實(shí)施例采用酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)溶液中酚類化合物，所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器包括對(duì)電極、參比電極和工作電極；其中工作電極為表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O。碳?xì)蛛姌O表面含有-oh等基團(tuán)，方便進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。本實(shí)施例所述表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O的制備步驟如下：1)將碳?xì)蛛姌O放入去離子水中，超聲波清洗10分鐘；2)將清洗好的碳?xì)蛛姌O真空干燥，之后浸沒(méi)于50mmol/l三聚氯氰的甲苯溶液中，固定24小時(shí)；固定后用甲苯清洗，真空干燥。再將三聚氯氰修飾后的碳?xì)蛛姌O浸沒(méi)于0.25mg/ml酪氨酸酶溶液中。溶劑采用磷酸緩沖溶液(pbs)，緩沖溶液的濃度為0.1mol/l，ph為6.5，室溫放置24小時(shí)；3)將修飾后的碳?xì)蛛姌O放入0.1mol/l的pbs溶液中攪拌清洗3次，每次5分鐘，去除表面吸附弱的酶分子，將表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O保存于4℃條件下備用。采用本實(shí)施例所述酪氨酸酶生物傳感器檢測(cè)酚類化合物，將表面修飾酪氨酸酶/三聚氯氰的碳?xì)蛛姌O作為工作電極，銀/氯化銀作為參比電極，鉑電極作為對(duì)電極，建立三電極系統(tǒng)，將三電極系統(tǒng)與電化學(xué)工作站連接，對(duì)待測(cè)溶液中的酚類化合物的濃度進(jìn)行檢測(cè)。工作條件：所用的電解液為0.1mol/l的磷酸緩沖溶液。在ph＝4.5-9.0范圍內(nèi)測(cè)定酪氨酸酶生物傳感器對(duì)酚類化合物的電流響應(yīng)值，優(yōu)化結(jié)果，選定ph＝6.5為最佳ph值，在此ph值下，響應(yīng)電流大且穩(wěn)定。本實(shí)施例所述酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器對(duì)不同底物的檢測(cè)情況如表3：表3酪氨酸酶電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同底物情況底物反應(yīng)時(shí)間(s)檢測(cè)下限(nm)靈敏度(na/m)線性范圍(m)鄰苯二酚～44.61970.1-10苯酚～4201000.5-10多巴胺～450870.1-10dopac～4100600.1-10以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12