一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法
【專利摘要】一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法。該制備方法包括：取洗凈的導電基底預處理后，在其基底層的導電面上均勻涂布金屬納米層，干燥后完成電極的第一層修飾；將納米金屬氧化物與生物粘合劑按體積比1：1?3混合，取5?20μL混合液均勻涂布于金屬納米層之上得金屬氧化物納米層，再次干燥得半成品；配制0.5?20mg mL?1的膽固醇氧化酶溶液，取2?7μL的膽固醇氧化酶溶液均勻涂布在金屬氧化物納米層之上，干燥形成酶層，即完成生物傳感器的制備。本發(fā)明具有經(jīng)濟、簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，且制備簡單，可用于膽固醇的定量檢測，對于高度敏感的膽固醇生物傳感器的開發(fā)具有深遠意義。
【專利說明】一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法
[0001]
技術(shù)領域
[0002]本發(fā)明涉及生物傳感器的制備，尤其涉及一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇酶生物傳感器的制備。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]膽固醇是一種性質(zhì)類似脂肪的物質(zhì)，具有重要的生物功能，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及留體激素的原料。膽固醇經(jīng)代謝還能轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類固醇激素、7-脫氫膽固醇，并且7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射就會轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3，所以膽固醇并非是對人體有害的物質(zhì)。
[0005]但是，血清中膽固醇含量越高，就越有可能得動脈粥樣硬化、心臟病等疾病。在血清中膽固醇正常含量應低于200 mgdL—超過240 mgdL—1將被視為血脂含量高。實際上，用于檢測膽固醇濃度的生物傳感器已有發(fā)表，但基于金屬納米顆粒的生物傳感器備受關注，這是因為金屬納米材料具有獨特的特征，如催化活性、光學、電子和磁特性等。而在眾多金屬中，常用來作為電極材料的多為金、銀、鉑和鈀等。利用這些金屬納米材料獨特的物理性質(zhì)和化學性質(zhì)，生物傳感器的性能目前已經(jīng)提高到一個新的水平。不僅可以使其快速化、微型化及多功能化，而且它還具有靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性高、響應速度快、檢測范圍寬和耐負荷性高等優(yōu)點。
[0006]而金屬氧化物，如氧化鋅(ZnO)是非常重要的一類氧化物半導體材料，均屬于寬禁帶半導體，可以為酶的固定提供更多的活性位點，可以高效吸附酶且保持酶的活性，有效提高酶活性中心與電極之間的電子傳輸速率，實現(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移，最終獲得高靈敏度的電化學傳感性能。納米尺度的ZnO有豐富多樣的微觀形貌，同時也具有高比表面積、良好的生物相容性、無毒性、化學及光化學穩(wěn)定性、電化學活性及高電子傳輸能力等特點，使得ZnO納米結(jié)構(gòu)在光電、聲表面波、場發(fā)射、壓電、太陽能電池和傳感等器件上有重要應用，通過納米結(jié)構(gòu)的調(diào)控及摻雜等手段，還可以進一步對性能進行優(yōu)化和改進。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種基于金屬納米材料與納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，結(jié)合電化學技術(shù)，利用金屬納米材料與納米金屬氧化物合成簡易、電學性能優(yōu)異和傳感器制備簡單等特性，獲得工藝簡單、低成本的膽固醇生物傳感器的生產(chǎn)方式。
[0009 ]為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為: 一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
步驟I，取洗凈的導電基底預處理后，在其基底層的導電面上均勻涂布金屬納米層，再在相對溫度為30%-40%、溫度為18 0C -28 °C下干燥，完成電極的第一層修飾；
步驟2，將納米金屬氧化物與生物粘合劑按體積比I: 1-3混合，取5-20yL混合液均勻涂布于金屬納米層之上得金屬氧化物納米層，再次在相對溫度為30%_40%、溫度為18°C_28°C下干燥得半成品；
步驟3，配制0.5-20mg mL—1的膽固醇氧化酶溶液，取2_7yL的膽固醇氧化酶溶液均勻涂布在金屬氧化物納米層之上，同樣在相對溫度為30%-40%、溫度為18°C_28°C環(huán)境下干燥形成酶層，即完成生物傳感器的制備。
[0010]作為制備方法改進的是，步驟I中金屬納米層的材料為金納米顆粒、銀納米顆粒或銀納米線中任一種。
[0011 ]作為制備方法改進的是，步驟2中金屬氧化物納米層的材料為納米氧化鋅。
[0012]作為制備方法改進的是，步驟2中生物粘合劑為羧甲基纖維素、殼聚糖或全氟化膜中任一種。
[0013]作為制備方法改進的是，步驟2中金屬氧化物與生物粘合劑按體積I: I混合而成。
[0014]作為制備方法改進的是，步驟3中所取膽固醇氧化酶溶液的體積為5yL。
[0015]作為制備方法改進的是，步驟3中膽固醇氧化酶溶液的配制分為兩步:第一步，稱取0.05-2mg的膽固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL，pH為5_9的磷酸緩沖液，得膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液;第二步，取IyL的膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液，加入9yL，pH為5-9的磷酸緩沖液制成。
[0016]作為膽固醇氧化酶溶液配制優(yōu)選的是，所述磷酸緩沖液的pH均為7。
[0017]
有益效果
本發(fā)明提供的這種制備膽固醇生物傳感器的方法具有很大的優(yōu)勢:
首先，用自組裝法將膽固醇氧化酶，固定在氧化鋅(ZnO)材料及金納米粒子修飾的電極表面，制成一種新型的高靈敏的電化學傳感器，實現(xiàn)了低電位下對膽固醇的檢測，，該傳感器靈敏度高，重現(xiàn)性好，性能穩(wěn)定，且對膽固醇的選擇性好，快捷，方便。
[0018]其次，巧妙的利用了氧化鋅(ZnO)的優(yōu)良性能，電化學活性及高電子傳輸能力等特點，同時加上金納米粒子的化學穩(wěn)定性和催化活性，最終獲得高靈敏度的電化學傳感性能。
[0019]最后，發(fā)明設計用價格低廉的氧化鋅(ZnO)納米材料代替貴重金屬納米粒子固定制作酶電極，不僅保持了納米粒子對酶的強吸附和酶的活性，而且大大降低了電極制作的成本，在臨床診斷上是很重要的，本發(fā)明經(jīng)濟、簡單、快速、靈敏，且制備簡單，可以低成本的批量生產(chǎn)，對有電化學生物傳感器的應用推廣具有深遠意義。
【附圖說明】
[0020]圖1，以裸ITO電極(曲線a) ;Ch0x修飾的ZnO/ITO電極(曲線b) ;Ch0x修飾的Au/CMC/ITO電極(曲線C )以及ChOx修飾的ZnO/Au/CMC/1TO電極(曲線d )檢測200mg/dL的膽固醇溶液中(PH7.0)的信號。[0021 ]圖2，用葡萄糖，草酸，檸檬酸，L-半胱氨酸，抗壞血酸及膽固醇分別對ChOx/ZnO/Au/CMC/1TO電極進行特異性的性能檢測。
[0022]
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例只是用于更加清楚地說明本發(fā)明的性能，而不能僅局限于下面的實施例。
[0024]
實施例1
步驟1，取洗凈的氧化錫導電玻璃(ΙΤ0)，其尺寸為20mmX5mm，預處理，即將洗凈的氧化錫導電玻璃(ITO)浸沒在700C的體積比5:1:1的水、30%的雙氧水、30%的氨水中90min，然后用流水沖洗，在50 °(:烤箱干燥。之后將預處理的氧化錫導電玻璃(ITO)電極浸沒在2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES )乙醇溶液中12h，形成胺硅單層膜。用無水乙醇洗三遍，晾干，完成對氧化錫導電玻璃(ITO)的處理。將金納米顆粒(AuNPs)超聲5-10分鐘，然后取2yL的金納米顆粒(AuNPs)溶液點在預處理的氧化錫導電玻璃(ITO)的導電面上，室內(nèi)環(huán)境下干燥，形成一層厚薄均勻的金納米顆粒膜。
[0025]步驟2，配制羧甲基纖維素(CMC)溶液，即稱量Img的羧甲基纖維素(CMC)，加入110μL的pH為7的磷酸緩沖液，超聲混勻，待用;將20 mg mL—1的納米氧化鋅溶液與羧甲基纖維素(CMC)溶液以體積比1:1的比例混合，超聲使其分散均勻。取1yL氧化鋅溶液與羧甲基纖維素(CMC)溶液的混合溶液點在金納米顆粒膜之上，室內(nèi)環(huán)境下干燥得半成品。
[0026]步驟3，稱取Img的膽固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL的pH為7磷酸緩沖液，作為膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液，取IyL的膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液，加入9yL的pH為7磷酸緩沖液，濃度為I Omg mL-1 ο，
取5yL的膽固醇氧化酶(ChOx)的使用液點于金屬氧化物納米層之上，同樣在室內(nèi)環(huán)境下干燥得酶層，即完成生物傳感器的制備。
[0027]如圖1所示，在200mg/dL的膽固醇溶液中(pH7.0 )，分別用裸ITO電極(曲線a) ; ChOx修飾的ZnO/1TO電極(曲線b) ; ChOx修飾的Au/CMC/1TO電極(曲線c )以及ChOx修飾的ZnO/Au/CMC/IT0電極(曲線d)做檢測，發(fā)現(xiàn)金屬氧化物納米層修飾的電極能夠靈敏檢測出膽固醇濃度。
[0028]
實施例2
步驟1，取洗凈的氧化錫導電玻璃(ΙΤ0)，其尺寸為20mmX5mm，預處理，即將洗凈的氧化錫導電玻璃(ITO)浸沒在700C的體積比5:1:1的水、30%的雙氧水、30%的氨水中90min，然后用流水沖洗，在50 °(:烤箱干燥。之后將預處理的氧化錫導電玻璃(ITO)電極浸沒在2%的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES )乙醇溶液中12h，形成胺硅單層膜。用無水乙醇洗三遍，晾干，完成對氧化錫導電玻璃(ITO)的處理。:取處理的氧化錫導電玻璃(ITO)，將金納米顆粒(AuNPs)超聲5-10分鐘，然后取2yL的金納米顆粒(AuNPs)溶液點在預處理的氧化錫導電玻璃(ITO)的導電面上，室內(nèi)環(huán)境下干燥，形成一層厚薄較均勻的金納米顆粒膜。
[0029]步驟2，配制質(zhì)量比為1%的殼聚糖溶液，即稱量1mg的殼聚糖，加入980yL的去離子水和1yL的乙酸，超聲混勻，待用;將20 mg mL—1的氧化鋅溶液與1%的殼聚糖溶液以1:1的比例混合，超聲使其分散均勻。取1yL氧化鋅溶液與1%的殼聚糖溶液的混合溶液點在金納米顆粒膜之上，室內(nèi)環(huán)境下干燥，形成第二層厚薄較均勻的納米氧化鋅與殼聚糖的混合膜。
[0030]步驟3，稱取Img的膽固醇氧化酶(ChOx)，溶于1yL的pH為7磷酸緩沖液，作為膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液，取IyL的膽固醇氧化酶(ChOx)的儲備液，加入9yL的pH為7磷酸緩沖液，濃度為I Omg mL-1 ο，
取5yL的膽固醇氧化酶(ChOx)的使用液點于金屬氧化物納米層之上，同樣在室內(nèi)環(huán)境下干燥得酶層，即完成生物傳感器的制備。
[0031]如圖2所示，修飾了 ChOx的ZnO/Au/CMC/ITO電極對膽固醇的檢測具有專一性，對于其他干擾因素，如葡萄糖，草酸，檸檬酸，L-半胱氨酸，抗壞血酸，均可排除干擾，保持檢測的特異性。
[0032]以上對于實施例的詳細說明僅作為實例提供，并非以此限制本發(fā)明多樣化的實施方式。
【主權(quán)項】
1.一種基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I，取洗凈的導電基底預處理后，在其基底層的導電面上均勻涂布金屬納米層，再在相對溫度為30%-40%、溫度為18 0C -28 °C下干燥，完成電極的第一層修飾； 步驟2，將納米金屬氧化物與生物粘合劑按體積比I: 1-3混合，取5-20yL混合液均勻涂布于金屬納米層之上得金屬氧化物納米層，再次在相對溫度為30%_40%、溫度為18°C_28°C下干燥得半成品； 步驟3，配制0.5-20mg mL—1的膽固醇氧化酶溶液，取2_7yL的膽固醇氧化酶溶液均勻涂布在金屬氧化物納米層之上，同樣在相對溫度為30%-40%、溫度為18°C_28°C環(huán)境下干燥形成酶層，即完成生物傳感器的制備。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟I中金屬納米層的材料為金納米顆粒、銀納米顆?；蜚y納米線中任一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟2中金屬氧化物納米層的材料為納米氧化鋅。4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟2中生物粘合劑為羧甲基纖維素、殼聚糖或全氟化膜中任一種。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟2中金屬氧化物與生物粘合劑按體積1:1混合而成。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:步驟3中所取膽固醇氧化酶溶液的體積為5yL。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟3中膽固醇氧化酶溶液的配制分為兩步:第一步，稱取0.05-2mg的膽固醇氧化酶，溶于10yL，pH為5-9的磷酸緩沖液，得膽固醇氧化酶的儲備液;第二步，取UiL的膽固醇氧化酶的儲備液，加入9yL，pH為5-9的磷酸緩沖液制成。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于納米金屬及納米金屬氧化物的膽固醇生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述磷酸緩沖液的pH均為7。
【文檔編號】G01N27/327GK105954335SQ201610275333
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】黃維, 侯婷, 侯一婷, 吳瓊
【申請人】南京郵電大學