本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種凝血酶時間檢測試劑。
背景技術(shù)：
：凝血是由一系列凝血因子參與的復(fù)雜的生理過程，凝血系統(tǒng)包括凝血和抗凝兩個方面，兩者的動態(tài)平衡是正常機(jī)體維持體內(nèi)血液流動和防止血液流失的關(guān)鍵，凝血是血液由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)的過程。當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗凝物質(zhì)缺乏或纖維蛋白溶解異常時會導(dǎo)致血栓的形成，而當(dāng)今社會，隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，各類血栓性疾病日益成為影響人類生活質(zhì)量的因素，尤其是心、腦血管血栓性疾病，所以需要一種可以為臨床血栓與止血類疾病的診斷治療提供可靠診斷結(jié)果體外診斷試劑。凝血酶時間(TT)是一種快速檢測凝血共同通路上纖維蛋白原變成纖維蛋白的方法，是檢測凝血、抗凝及纖維蛋白原溶解系統(tǒng)功能的一個簡便試驗。凝血酶時間(TT)延長見于血漿纖維蛋白原減低或結(jié)構(gòu)異常；臨床應(yīng)用肝素，或在肝病、腎病及系統(tǒng)性紅斑狼瘡時的肝素樣抗凝物質(zhì)增多；纖溶蛋白溶解系統(tǒng)功能亢進(jìn)。凝血酶時間縮短見于血液中有鈣離子存在，或血液呈酸性等。凝血酶時間(TT)測定的是加入標(biāo)準(zhǔn)化凝血酶后纖維蛋白的形成時間，它的延長說明機(jī)體纖溶亢進(jìn)，所以在低(無)纖維蛋白原癥，DIC以及類肝素物質(zhì)存在(如肝素治療，SLE和肝臟疾病等)時出現(xiàn)延長。因此，凝血酶時間(TT)測定對檢測血栓性疾病的防治有重要意義，是血栓與止血檢測中的重要項目。根據(jù)NCCLSH21-A3《用于血液凝固檢測的樣品采集的指導(dǎo)方法》。抗凝劑選用105-109mmol/L，3.13％-3.2％(通常描述為3.2％)枸櫞酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，抗凝劑與抽血量比例為1:9。枸櫞酸根離子可與血中的鈣離子相結(jié)合，形成不易離解的可溶性絡(luò)合物，使血中鈣離子濃度降低，而產(chǎn)生抗凝作用。因此在正常的凝血機(jī)制中，必須有鈣離子的參與。而標(biāo)本采集過程中，為了血液抗凝，抗凝劑中的枸櫞酸根離子抑制了全血鈣離子，因此必須在試劑中加入鈣離子，以還原或補充被抑制的鈣離子。目前，市售含鈣離子的凝血酶時間檢測試劑存在穩(wěn)定性和重復(fù)性較差的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供了一種凝血酶時間檢測試劑。該凝血酶時間檢測試劑具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種凝血酶時間檢測試劑，包括凝血酶、HEPES、NaN3、蛋白胨和氯化鈣。作為優(yōu)選，各組分按如下配比配制：在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，各組分按如下配比配制：在本發(fā)明提供的另一實施例中，各組分按如下配比配制：在本發(fā)明提供的另一實施例中，各組分按如下配比配制：作為優(yōu)選，凝血酶時間檢測試劑還包括水。作為優(yōu)選，凝血酶時間檢測試劑中各組分用量為：作為優(yōu)選，凝血酶為牛凝血酶。本發(fā)明還提供了一種非診斷目的檢測凝血酶時間的方法，采用本發(fā)明的凝血酶時間檢測試劑檢測待測血漿的凝血時間。作為優(yōu)選，該方法為：將待測血漿在37℃條件下預(yù)溫3min，加入凝血酶時間檢測試劑在37℃條件下進(jìn)行凝血反應(yīng)，記錄凝血時間。作為優(yōu)選，凝血酶時間檢測試劑與待測血漿的體積比為(1～2)：(1～2)。在本發(fā)明提供的實施例中，凝血酶時間檢測試劑與待測血漿的體積比為1：1。本發(fā)明提供了一種凝血酶時間檢測試劑。該凝血酶時間檢測試劑包括凝血酶、HEPES、NaN3、蛋白胨和氯化鈣。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點：1、本發(fā)明通過研究反應(yīng)機(jī)理，在緩沖液中添加了Ca2+來模擬體內(nèi)凝血環(huán)境，從而能夠使試劑具有較好的臨床應(yīng)用價值；2、本發(fā)明試劑中緩沖液組分使凝血酶試劑復(fù)溶后37℃條件下能夠穩(wěn)定七天，與市售試劑相比重復(fù)性與穩(wěn)定性較好。因此，對于各級醫(yī)院來說，使用可靠、方便、減少浪費并降低醫(yī)療成本；3、本發(fā)明試劑對肝素和纖維蛋白原含量敏感，因此本發(fā)明試劑能夠為臨床血栓與止血類疾病的診斷治療以及臨床中肝素治療及溶纖治療監(jiān)測提供可靠的診斷結(jié)果。附圖說明圖1示利用蛋白電泳分析人、牛、豬凝血酶之間蛋白成分差異。具體實施方式本發(fā)明公開了一種凝血酶時間檢測試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的凝血酶時間檢測試劑中所用試劑或儀器均可由市場購得。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實施例1本實施例的凝血時間檢測試劑包括牛凝血酶4IU/mL、氯化鈣0.55％、HEPES1％、NaN31‰、蛋白胨2％；其余為純水。如果需要長期保存，需制成凍干品，用時再按此濃度復(fù)溶。實施例2本實施例的凝血時間檢測試劑包括牛凝血酶3IU/mL、氯化鈣0.25％、HEPES0.5％、NaN30.5‰、蛋白胨1％；其余為純水。實施例3本實施例的凝血時間檢測試劑包括牛凝血酶6IU/mL、氯化鈣0.75％、HEPES2％、NaN32‰、蛋白胨3％；其余為純水。試驗例1：本發(fā)明試劑盒的應(yīng)用1.檢測原理適量的凝血酶溶液作用于待測血漿，能夠?qū)⒀獫{中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白而凝固，凝固所需的時間即為待測血漿凝血酶時間(TT)。2.檢測步驟實施例1-3中任一凝血酶凍干品用一定體積的純水復(fù)溶。以賽科希德SF-400凝血測試儀為例，操作步驟如表1：表1本發(fā)明試劑盒操作步驟其它凝血測試儀檢測時，按照相應(yīng)的儀器說明書提供的參數(shù)操作。試驗例2：凝血酶種類的選擇利用蛋白電泳分析人、牛、豬凝血酶之間蛋白成分差異，分別配制人、牛、豬凝血酶1IU/μL，取8μL樣本電泳，120V恒壓1h，取蛋白膠染色并脫色。圖1表明，人、豬凝血酶的蛋白成分比較復(fù)雜，且雜蛋白的含量較大，而牛凝血酶的蛋白成分比較單一，主要為凝血酶和白蛋白，使用牛凝血酶能夠有效降低凝血酶本身對試劑的影響，所以本發(fā)明采用了牛凝血酶。試驗例3：最適緩沖液配比A緩沖液：HEPES0.5％，NaN30.5‰，氯化鈣0.25％，蛋白胨1％，其余為純水。B緩沖液：HEPES1％，NaN31‰，氯化鈣0.55％，蛋白胨2％，其余為純水。C緩沖液：HEPES2％，NaN32‰，氯化鈣0.75％，蛋白胨3％，其余為純水。上述緩沖液中牛凝血酶均為4IU/mL。凝血酶凍干品用純水復(fù)溶，按上述操作步驟在賽科希德凝血檢測儀SF-400上檢測A、B、C三種試劑的凝血酶時間(結(jié)果見表2)。表2三種不同配比緩沖液檢測結(jié)果比較(SF-400)表2結(jié)果顯示A、C緩沖液配制的試劑檢測結(jié)果分別在第6天和第5天出現(xiàn)延長，而B緩沖液配制的TT試劑穩(wěn)定性可以保持7天，所以B緩沖液為最適緩沖液。試驗例4：Ca2+對凝血酶時間的影響分別配制含有Ca2+和不含Ca2+的TT試劑，分別為：含Ca2+緩沖液(0.25％)：牛凝血酶4IU/mL，HEPES1％，NaN31‰，氯化鈣0.25％，蛋白胨2％，其余為純水。含Ca2+緩沖液(0.55％)：牛凝血酶4IU/mL，HEPES1％，NaN31‰，氯化鈣0.55％，蛋白胨2％，其余為純水。含Ca2+緩沖液(0.75％)：牛凝血酶4IU/mL，HEPES1％，NaN31‰，氯化鈣0.75％，蛋白胨2％，其余為純水。無Ca2+緩沖液：牛凝血酶4IU/mL，HEPES1％，NaN31‰，蛋白胨2％，其余為純水。在SF-400上檢測正常凝血質(zhì)控的凝血酶時間(結(jié)果見表3)。表3是否含Ca2+緩沖液檢測結(jié)果比較(SF-400)Ca2+是凝血過程中重要的Ⅳ因子，當(dāng)缺乏時就會導(dǎo)致凝血酶作用于纖維蛋白原形成的纖維蛋白不牢固，延長凝血所需時間，表3結(jié)果表明，當(dāng)試劑中加入0.55％Ca2+后能夠縮短凝血時間，模擬體內(nèi)凝血過程。試驗例5：凝血酶試劑復(fù)溶后與市售含鈣的TT試劑穩(wěn)定性比較凝血酶凍干品用一定體積的純水復(fù)溶，然后將復(fù)溶后試劑置于37℃保存。在SF-400血凝儀上測定同一正常質(zhì)控血漿(TT值：14～21s)，市售fisher試劑同步進(jìn)行測定。(結(jié)果見表4)表4表明，本發(fā)明的TT試劑在復(fù)溶后的七天內(nèi)測定結(jié)果比較穩(wěn)定，而市售試劑在第5天時開始明顯變化，這一結(jié)果對臨床檢驗科來說非常重要，因為它可以減少浪費，從而降低成本。表4與市售TT試劑穩(wěn)定性比較試驗例6：與市售fisherTT試劑重復(fù)性比較凝血酶凍干品用一定體積的純水復(fù)溶，按實施例一所述方法操作，重復(fù)測定10次。同一正常質(zhì)控血漿(TT值：14～21s)凝血酶時間(TT)在SF-400血凝儀上測得。(表5)表5表明，本發(fā)明的TT試劑與市售含鈣的試劑相比，變異系數(shù)(CV)較小，重復(fù)性較好。表5與市售TT試劑重復(fù)性比較(n＝10)試驗例7：凝血酶試劑對肝素的敏感性分析凝血酶凍干品用一定體積的純水復(fù)溶，以協(xié)和質(zhì)控血漿為基礎(chǔ)，配制含有不同濃度肝素的血漿標(biāo)本，并在賽科希德SF-400上檢測含肝素血漿對TT試劑的影響。(結(jié)果見表6)表6表明，本發(fā)明的TT試劑(3個批次)對肝素的敏感性很高，這一結(jié)果對臨床檢驗科來說非常重要，能夠有效監(jiān)測肝素治療的病人。表6不同濃度的肝素對TT的影響及糾正Lot1(2ml)sLot2(2ml)sLot3(4ml)s0IU/ml17.4/17.518.2/18.218.3/17.70.1IU/ml24.8/25.125.2/26.225.1/25.30.2IU/ml>200>200>2000.3IU/ml>200>200>200試驗例8：纖維蛋白原含量對凝血酶試劑的影響凝血酶凍干品用一定體積的純水復(fù)溶，以協(xié)和質(zhì)控血漿為基礎(chǔ)，利用咪唑緩沖液稀釋血漿來制備低纖維蛋白原含量血漿樣本，并在賽科希德SF-400凝血測試儀上監(jiān)測纖維蛋白原含量對TT試劑的影響。(表7)表7表明，本發(fā)明的TT試劑隨著血漿中纖維蛋白原的減少，其檢測結(jié)果在逐漸延長，說明本發(fā)明的TT試劑對血漿中纖維蛋白原的含量比較敏感，這一結(jié)果對臨床檢驗科來說非常重要，能夠有效監(jiān)測纖溶治療的患者。表7纖維蛋白原含量對TT的影響(用咪唑緩沖液稀釋2、4、6、8、10倍質(zhì)控品：C11D15J1)稀釋倍數(shù)Lot1(s)Lot2(s)Lot3(s)221.3/21.221.5/21.322.6/22.8425.8/25.826.6/26.829.2/28.9630.8/30.431.1/31.134.2/34.2834.8/34.935.4/35.138.7/38.61038.1/38.338.8/38.542.7/43.2以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3