一種從去冷膠血漿中制備人凝血酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種人凝血酶，具體來(lái)說(shuō)是一種從去冷膠血漿中 制備人凝血酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人凝血酶（human thrombin)是一種絲氨酸蛋白酶，分子量37KD，由1條3kD的輕 鏈和另1條31kD的重鏈通過二硫鍵連接而成，主要功能是將可溶性的纖維蛋白原水解成不 溶性的纖維蛋白，并通過激活凝血因子XIII使纖維蛋白交聯(lián)形成網(wǎng)狀，從而起到止血的作 用。正常情況下，人血液循環(huán)中的凝血酶以非活化的形式即以凝血酶原存在，在體內(nèi)或體表 出現(xiàn)出血傾向時(shí)，凝血酶原通過一系列復(fù)雜的過程轉(zhuǎn)換成具有活化形式的凝血酶。利用現(xiàn) 代生物制藥技術(shù)，可以將血漿中所含的凝血酶原制成凍干人凝血酶，常以干粉或溶液局部 涂于傷口及手術(shù)處來(lái)控制毛細(xì)血管血液滲出，如骨出血及扁桃腺摘除和拔牙時(shí)出血等。進(jìn) 行局部止血時(shí)，常用氯化鈉注射液溶解成50~200IU/mL的溶液噴霧或用本品干粉噴灑于 創(chuàng)面，有時(shí)也可口服，用于胃和十二指腸出血。目前凝血酶的應(yīng)用范圍正日漸擴(kuò)大，由單純 的局部外敷發(fā)展到外科手術(shù)、耳鼻喉、口腔、婦產(chǎn)、泌尿及消化道等部位止血。凝血酶另一個(gè) 廣泛的用途在于與人纖維蛋白原配伍，組成人纖維蛋白粘合劑，利用雙聯(lián)給藥裝置將凝血 酶與纖維蛋白原混合后噴射至創(chuàng)口處瞬間成膠止血。其中的凝血酶可不經(jīng)過血液凝固的前 期階段而直接使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，使血液快速凝固、填塞出血點(diǎn)而達(dá)到止血目 的，故可適用于各種原因引起的出血癥狀，如消化道、氣管、各種手術(shù)出血等，近年在組織修 復(fù)、腫瘤靶位治療等領(lǐng)域也有相關(guān)的研究進(jìn)展，因此，隨著該藥臨床使用日漸廣泛，凝血酶 的生產(chǎn)技術(shù)顯得越來(lái)越重要。
[0003] 凝血酶的制備通常是經(jīng)過一系列工序獲得凝血酶原的粗品，然后用特定方式進(jìn)行 激活，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，再?duì)凝血酶進(jìn)行純化，經(jīng)超濾、濃縮獲得凝血酶原液，按所 需規(guī)格進(jìn)行無(wú)菌分裝，然后進(jìn)行凍干，最后獲得凍干粉成品.按最新藥典要求整個(gè)制備過 程中必須經(jīng)過脂包膜病毒和非脂包膜病毒的滅活或去除步驟。
[0004] 提取凝血酶原的原料有血漿、去冷膠血漿及cohn組分三沉淀等，由于血漿中含有 人凝血因子VIII，如果從血漿中直接制備凝血酶，則對(duì)人凝血因子VIII的生產(chǎn)造成影響， 而從組分三沉淀中制備凝血酶，雖然利用了廢棄沉淀，但由于cohn組分三沉淀已經(jīng)過三次 乙醇沉淀，凝血酶原損失較多，且由于乙醇的存在，凝血酶原的穩(wěn)定性也受到一定損害，故 以cohn組分三沉淀為起始原料的凝血酶制備工藝，得率較低，制品穩(wěn)定性較差，特別是，如 果血制品生產(chǎn)線已含有從去冷膠血漿中生產(chǎn)凝血酶原復(fù)合物（PCC)的生產(chǎn)線設(shè)置，則凝血 酶原即凝血因子II大部分被提取，組分III沉淀中幾乎不含凝血酶原，此時(shí)組分III就不 再適合做為凝血酶的起始原料了。所以，綜合考慮，以去冷膠血漿為原料制備凝血酶是較佳 選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種從去冷膠血漿中制備人凝血 酶的方法，所述的這種從去冷膠血漿中制備人凝血酶的方法解決了現(xiàn)有技術(shù)的制備人凝血 酶的方法工藝流程復(fù)雜、激活條件苛刻、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、病毒滅活不徹底及制品外觀不佳的技 術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明提供了一種從去冷膠血漿中制備人凝血酶的方法，包括如下步驟：
[0007] 1) -個(gè)用陰離子樹脂吸附去冷膠血漿中的凝血酶原的步驟；根據(jù)去冷膠血漿的 體積，稱取陰離子樹脂，所述陰離子樹脂和去冷膠血漿的質(zhì)量體積比為〇. 5-1. 5g :1L，將陰 離子樹脂用熱注射用水充分溶脹，所述的熱注射用水的溫度不低于70°C，然后再用冷注射 用水冷卻，所述的冷注射用水的溫度為10~25°C，然后用平衡緩沖液A平衡后加到去冷膠 血漿中，在10-30°C，緩慢攪拌0. 5-1. 5小時(shí)，用濾網(wǎng)過濾，收集樹脂，濾出的血漿進(jìn)入后續(xù) 產(chǎn)品的加工程序中；
[0008] 2)用平衡緩沖液A連續(xù)沖洗樹脂，平衡緩沖液A用量為溶脹后的陰離子樹脂質(zhì)量 的4-8倍，然后用洗脫緩沖液A緩慢、連續(xù)洗脫樹脂，洗脫緩沖液A用量為溶脹后的陰離子 樹脂質(zhì)量的2-6倍，收集洗脫液即為凝血酶原溶液；
[0009] 3) -個(gè)激活凝血酶原的步驟；在10~30°C條件下，在上述洗脫液中加入娃藻土， 所述的硅藻土的質(zhì)量為上述洗脫液質(zhì)量的0. 1~1 %，攪拌0. 5-1小時(shí)，加入0. 5-1M CaCL2 溶液，溫和攪拌2-10小時(shí)，將凝血酶原激活；
[0010] 4)加入質(zhì)量百分比濃度為25-50%聚乙二醇溶液，所述的聚乙二醇的加入量為步 驟3)溶液的2-8%，攪拌0. 5-2小時(shí)；
[0011] 5)過濾，后洗濾芯，收集濾液即凝血酶溶液，棄去沉淀；
[0012] 6) -個(gè)采用S/D病毒滅活處理的步驟，在上述的濾液中加磷酸三丁脂，所述的磷 酸三丁脂的加入量為所述的濾液的〇? 3%，然后加入Tween-80,所述的Tween-80的加入量 為所述的濾液的1%，在24-26°C下緩慢攪拌6~7小時(shí)；
[0013] 7) -個(gè)采用陽(yáng)離子柱層析純化凝血酶的步驟，將以上溶液降溫至5~20°C，上陽(yáng) 離子柱進(jìn)行層析；先用平衡緩沖液B進(jìn)行洗滌；再用洗脫緩沖液B進(jìn)行洗脫，收集洗脫液， 即純化的凝血酶溶液；在洗脫液中及時(shí)加入穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑的質(zhì)量為凝血酶溶液的 1-5% ；
[0014] 8)用0.45 ym濾芯進(jìn)行澄清過濾，收集濾液；后進(jìn)行超濾濃縮并透析，最后濃縮至 合適的活力單位；
[0015] 9)加入穩(wěn)定劑，所述的穩(wěn)定劑的質(zhì)量為上述超濾濃縮溶液的1-5%;按產(chǎn)品規(guī)格調(diào) 節(jié)凝血酶溶液效價(jià)至500-550IU/ml，調(diào)PH值至6. 50-7. 50 ;
[0016] 10)用0. 10 ym的濾芯串聯(lián)20nm的除病毒濾芯進(jìn)行除病毒過濾，過濾的溫度為 5 ~25。。；
[0017] 11)用0. 22 ym的濾芯進(jìn)行除菌過濾，后分裝；
[0018] 12) -個(gè)凍干的步驟；
[0019] 13) -個(gè)進(jìn)行干熱病毒滅活的步驟；將凍干粉在100°C水浴中加熱30分鐘，進(jìn)行干 熱病毒滅活處理獲得人凝血酶。
[0020] 進(jìn)一步的，所述的陰離子樹脂為DEAE-Sephadex A-50樹脂。
[0021] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述的連續(xù)洗滌或洗脫是指在在樹脂桶中，一邊攪拌一邊加 入洗滌或洗脫緩沖液，同時(shí)從樹脂桶底閥排出洗滌液或洗脫液的過程。
[0022] 進(jìn)一步的，所述的平衡緩沖液A由檸檬酸鈉和NaCL水溶液組成，所述的平衡緩 沖液A中，所述的檸檬酸鈉的濃度為0. 01-0. 02M，所述的NaCL的濃度為0. 1-0. 2M，PH為 6. 50-7. 50 ;所述的洗脫緩沖液A由檸檬酸鈉和NaCL水溶液組成，所述的洗脫緩沖液A中， 所述的檸檬酸鈉的濃度為〇. 01-0. 02M，所述的NaCL的濃度為0. 5-1. 0M，所述的洗脫緩沖溶 液的 PH6. 50-7. 50。
[0023] 進(jìn)一步的，所述的平衡緩沖液B由檸檬酸鈉和NaCL水溶液組成，所述的平衡緩 沖液B中，所述的檸檬酸鈉的濃度為0. 01-0. 02M，所述的NaCL的濃度為0. 1-0. 2M，PH為 6. 60-7. 50 ;所述的洗脫緩沖液B由檸檬酸鈉和NaCL水溶液組成，所述的洗脫緩沖液B中， 所述的檸檬酸鈉的濃度為〇. 01-0. 02M，所述的NaCL的濃度為0. 5-1. 5M，所述的緩沖溶液的 PH6. 60-7. 50。
[0024] 進(jìn)一步的，步驟3)中，所述的CaCL2的最終濃度為0. 02M-0. 2M ;
[0025] 進(jìn)一步的，步驟7)所述的陽(yáng)離子樹脂是CM-Sepharose FF，SP-Sepharose FF或 SP-S印hadex C-50批量處理樹脂中的任何一種。
[0026] 進(jìn)一步的，步驟7)所述的穩(wěn)定劑為甘氨酸。
[0027] 進(jìn)一步的，步驟9)所述的穩(wěn)定劑為甘氨酸。
[0028] 進(jìn)一步的，步驟12)所述的凍干的步驟如下：
[0029]先將制品預(yù)冷至0-5°C，然后將擱板溫度設(shè)為-50°C以下，使制品溫度達(dá)到-40°C 及以下，然后迅速將制品溫度升至-20~-30°C，保溫1-3小時(shí)，再重新將