一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用固定床柱層析技術(shù)從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：（1）去除冷沉淀血漿，使用預(yù)先經(jīng)EDTA溶液和枸櫞酸鈉溶液清洗過的纖維素深層濾板過濾；（2）深層過濾后的血漿在固定床上樣時(shí)經(jīng)過0.2μm的濾芯膜在線過濾；（3）裝填有陰離子交換凝膠CaptoDEAE的固定床層析柱使用緩沖液A平衡2~5個(gè)柱體積，血漿上樣流速為60~120cm/h，用緩沖液B洗滌層析柱，用緩沖液C洗脫層析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX計(jì)算，PCC的收率可以達(dá)到75%~90%，比活性可以達(dá)到5.5IU/mg以上。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品和血液制品生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及血液制品生產(chǎn)中人凝血 酶原復(fù)合物的固定床柱層析分離純化方法。 一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 人凝血酶原復(fù)合物（Prothrombin Complex, PCC)是經(jīng)由健康人血楽提取的，主要 含有人凝血因子II、VII、IX、X的血漿蛋白制品。中國(guó)藥典要求該制品中人凝血因子IX效 價(jià)不低于10iu/ml，其比活不小于0. 5IU/ml。該產(chǎn)品主要用于治療和預(yù)防由于II、VII、IX、 X因子缺乏引起的出血，如乙型血友病、肝病等。
[0003] PCC -般選用DEAES印hadex A50凝膠生產(chǎn)，由于該凝膠溶脹系數(shù)在不同鹽濃度下 變化較大，國(guó)內(nèi)外血液制品企業(yè)在實(shí)際生產(chǎn)中均采用批式吸附生產(chǎn)工藝，即將凝膠直接與 反應(yīng)罐中的血漿混勻，吸附完成后直接過濾出凝膠再進(jìn)行洗滌和洗脫。批式吸附方法為開 放式操作，操作繁瑣，且有凝膠泄漏和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。雖然也有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道使用擴(kuò)張 床技術(shù)生產(chǎn)PCC，但是真正在生產(chǎn)中應(yīng)用的案例未見報(bào)道，可見擴(kuò)張床技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用還 不成熟。通用電氣公司（GE)曾經(jīng)專門開發(fā)了 Streamline系列帶有石英核心的凝膠品種專 門用于擴(kuò)張床技術(shù)，但是經(jīng)過幾年的推廣發(fā)現(xiàn)實(shí)用性很差，現(xiàn)已基本被淘汰。
[0004] 使用固定床層析技術(shù)直接從血漿中吸附PCC的生產(chǎn)工藝未見相關(guān)報(bào)道，其主要原 因有以下兩點(diǎn)： 第一、過濾澄清技術(shù)對(duì)血漿分離純化工藝的限制。由于血漿成分復(fù)雜，除了含有血漿蛋 白之外，還含有少量的血細(xì)胞或者碎片，脂肪或乳糜顆粒等不溶物，不溶物粒徑大小不一， 脂肪或乳糜還導(dǎo)致血漿具有較大的粘度。這些特性使大規(guī)模的血漿過濾澄清工藝很難實(shí) 現(xiàn)。同時(shí)因?yàn)檠獫{中含有大量的凝血因子，帶負(fù)電荷的過濾介質(zhì)可能會(huì)給凝血因子提供激 活表面，引起凝血反應(yīng)，造成不可挽回的損失，對(duì)血液制品的生產(chǎn)造成巨大的影響。
[0005] 第二、傳統(tǒng)工藝中普遍使用的DEAESephadex A50凝膠，由于溶脹系數(shù)變化較大而 不適合固定床層析工藝。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于使用固定床柱層析技術(shù)從血漿中吸附PCC，并經(jīng)過洗滌和洗脫 制備PCC。特別是在保證血漿凝血因子不被激活的前提下，實(shí)現(xiàn)了血漿的較大規(guī)模深層過 濾和精細(xì)過濾，并篩選出適合吸附和分離純化PCC的凝膠，直接用于固定床層析柱，用層析 技術(shù)從血漿中直接吸附并純化得到PCC，徹底解決傳統(tǒng)批式吸附工藝容易引起污染，交叉污 染，凝膠泄漏以及操作繁雜等問題。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案主要包括：（1)去除冷沉淀血漿；（2)血漿過濾，使血漿 達(dá)到柱層析所要求的過濾精度和澄清度，并確保在過濾過程和過濾后血漿中的凝血因子不 被激活或滅活；（3)固定床柱層析技術(shù)純化PCC，用陰離子交換凝膠直接從血漿捕獲PCC，使 其他血漿蛋白從層析柱直接流穿，對(duì)層析柱進(jìn)行洗滌和洗脫，從而獲得純化的PCC。具體的 技術(shù)方案如下： 上述具體步驟為 (1) 去除冷沉淀： 將新鮮冰凍人血漿在融化混勻后，經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)去除血漿中的冷沉淀，得到離心后 的血漿上清液； (2) 血漿過濾 使用EDTA溶液對(duì)過濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，再用枸櫞酸鈉溶液對(duì)過濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，并洗去 殘留的EDTA，沖洗完成后排干設(shè)備內(nèi)的溶液，用于血漿過濾，所采用的過濾材質(zhì)為藥用級(jí)別 纖維素濾板； (3) 固定床柱層析分離純化PCC 將凝膠裝填在固定床層析柱內(nèi)，柱床體積與上樣的血漿量的比例為1: l(Tl: 50,裝填好 的層析柱使用緩沖液Α平衡2飛個(gè)柱體積，經(jīng)過深層過濾后的血漿使用0. 2 μ m的濾芯進(jìn)行 在線的膜過濾后泵入層析柱，上樣流速為6(Tl2〇Cm/h，用緩沖液B洗滌層析柱，用緩沖液C 洗脫層析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX的活性計(jì)算，PCC的收率可以達(dá)到759Γ90%，比 活性可以達(dá)到5. 5IU/mg以上。
[0008] 上述EDTA溶液的濃度為0· 1%-10%，用量為10(T300L/m2。
[0009] 上述枸櫞酸鈉溶液的濃度為0. 29Γ10%，用量為10(T300L/m2。
[0010] 上述步驟（2)血漿過濾中，所述纖維素濾板的層數(shù)為單層或雙層。
[0011] 上述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液A由25mmol/L枸櫞酸鈉 和20mmol/L鹽酸精氨酸組成，所述緩沖液的PH為7. 0。
[0012] 上述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液B由25mmol/L枸櫞酸鈉 /20mmol/L鹽酸精氨酸和0. 1?0. 4mol/L的NaCl組成。
[0013] 上述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液C由25mmol/L枸櫞酸鈉 /20mmol/L鹽酸精氨酸和0· 5?1. Omol/L的NaCl組成。
[0014] 上述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述凝膠為陰離子交換凝膠Capto DEAE〇
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：血漿經(jīng)過深層過濾和0. 2μπι的膜過濾，可以達(dá)到固定床層 析工藝所需的澄清度，能有效提高上樣過程中的線速度；并能保證過濾后血漿中凝血因子 和酶不被激活或滅活，仍保留其活性。過濾后的血漿采用固定床層析技術(shù)，使用Capto DEAE 凝膠直接捕獲血漿中的PCC，在提高了 PCC的收率和比活性的同時(shí)，避免了現(xiàn)有的批式吸附 工藝的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了血漿的短時(shí)間、高流速、密閉管道式處理；避免了污染、交叉污染、凝膠 泄漏的風(fēng)險(xiǎn)；簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，減輕工作人員勞動(dòng)強(qiáng)度。
[0016]

【具體實(shí)施方式】： 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明 并不局限于此。
[0017] 實(shí)施例1 :血漿深層過濾 選擇不同的濾板及相應(yīng)的夾具進(jìn)行組裝。按照下表中的清洗方式進(jìn)行清洗，過濾后的 血漿2?8°C放置24h，觀察血漿凝固情況。

【權(quán)利要求】
1. 一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，包括去除冷沉淀、血漿過濾和固定床 柱層析分離純化PCC。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述具體步驟為 (1) 去除冷沉淀： 將新鮮冰凍人血漿在融化混勻后，經(jīng)連續(xù)流離心機(jī)去除血漿中的冷沉淀，得到離心后 的血漿上清液； (2) 血漿過濾 使用EDTA溶液對(duì)過濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，再用枸櫞酸鈉溶液對(duì)過濾材質(zhì)進(jìn)行清洗，并洗去 殘留的EDTA，沖洗完成后排干設(shè)備內(nèi)的溶液，用于血漿過濾，所采用的過濾材質(zhì)為藥用級(jí)別 纖維素濾板； (3) 固定床柱層析分離純化PCC 將凝膠裝填在固定床層析柱內(nèi)，柱床體積與上樣的血漿量的比例為1: l(Tl: 50,裝填好 的層析柱使用緩沖液Α平衡2飛個(gè)柱體積，經(jīng)過深層過濾后的血漿使用0. 2 μ m的濾芯進(jìn)行 在線的膜過濾后泵入層析柱，上樣流速為6(Tl2〇Cm/h，用緩沖液B洗滌層析柱，用緩沖液C 洗脫層析柱，得到PCC制品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述EDTA溶液的濃度為0. 1%-10%，用量為10(T300L/m2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述枸櫞酸鈉溶液的濃度為〇. 29Γ10%，用量為10(T300L/m2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述步驟（2)血漿過濾中，所述纖維素濾板的層數(shù)為單層或雙層。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液A由25mmol/L枸櫞酸鈉和20mmol/ L鹽酸精氨酸組成，所述緩沖液的PH為7. 0。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液B由25mmol/L枸櫞酸鈉/20mmol/ L鹽酸精氨酸和0. 1~0. 4mol/L的NaCl組成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述緩沖液C由25mmol/L枸櫞酸鈉/20mmol/ L鹽酸精氨酸和0· 5?L Omol/L的NaCl組成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從血漿中吸附人凝血酶原復(fù)合物的方法，其特征在于： 所述步驟（3)固定床柱層析分離純化PCC中，所述凝膠為陰離子交換凝膠Capto DEAE。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104109202SQ201410340403
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月17日
【發(fā)明者】馬山, 張翠萍, 朱孟沼, 周安, 馬杰, 董雪, 吳菲菲, 陳振, 陳晨, 席智贏, 菅長(zhǎng)永 申請(qǐng)人:山東泰邦生物制品有限公司