用于制備凝血酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用給定BaSO4試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝血酶原來源生產(chǎn)凝血酶的方法，以及評估給定BaSO4試劑用于制備凝血酶的適合性的方法。在至少一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括使給定BaSO4試劑的樣品與凝血酶原來源接觸，以獲得BaSO4吸附的凝血酶原，并且隨后評估BaSO4吸附的凝血酶原的促凝活性。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括相對于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性評估的步驟。
【專利說明】
用于制備凝血酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及凝血酶生產(chǎn)領(lǐng)域，并且更具體而言，涉及評估給定BaS04試劑用作凝血 酶制備中的凝血酶原吸附劑的適合性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶是通過催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而促進(jìn)血液凝固的絲氨酸蛋白酶。 凝血酶還負(fù)責(zé)活化血小板并且通過多重蛋白酶解反饋機(jī)制間接負(fù)責(zé)其自身生產(chǎn)和抑制的 調(diào)節(jié)。凝血酶還涉及因子VIII、因子V、因子XI、因子XIII和蛋白質(zhì)C的活化。凝血酶作為 凝血因子而廣泛用于臨床應(yīng)用中，通過將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白來止住傷口的出血。 凝血酶是外科敷料的常見組分，并且已與纖維蛋白原及其他凝血蛋白質(zhì)組合用于二組分止 血系統(tǒng)諸如纖維蛋白膠、粘合劑和密封劑中。
[0003] 凝血酶通過前體（酶原）凝血酶原的蛋白酶解活化而產(chǎn)生。為了產(chǎn)生凝血酶，凝 血酶原必須在兩個(gè)位點(diǎn)處被切割，生成中間產(chǎn)物。凝血酶原在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為凝血酶通過凝血 酶原酶復(fù)合物催化，所述凝血酶原酶復(fù)合物包括活化的因子X和因子V，并且在鈣離子的存 在下在帶負(fù)電的磷脂膜上裝配。
[0004] 凝血酶可通過使凝血酶原來源（諸如血漿或血液級分）與固體吸附劑接觸由凝 血酶原進(jìn)行制造，所述固體吸附劑能夠吸附來自凝血酶原來源的凝血酶原，例如硫酸鋇 (BaS0 4)。固體吸附劑通常使用洗滌溶液進(jìn)行洗滌，以去除污染物諸如未結(jié)合的蛋白質(zhì)，并 且隨后使用洗脫溶液由其洗脫凝血酶原。在另外的任選純化和加工步驟后，洗脫的凝血酶 原可通過使用活化劑例如鈣離子活化而轉(zhuǎn)化為凝血酶。
[0005] 據(jù)報(bào)道當(dāng)使用不同BaS04試劑，諸如得自不同制造商的BaS04試劑，或甚至由特定 制造商生產(chǎn)的不同試劑批次時(shí)，在來自給定體積的凝血酶原來源的凝血酶得率中存在顯著 差異。
[0006] 在報(bào)道中已提出凝血酶得率中的差異至少部分可歸于通過不同BaS04K劑的凝 血酶原吸附中的變化，并且吸附能力是選擇BaS0 4K劑用于凝血酶原吸附的關(guān)鍵因素。 Surgenor和Neortker (1952)陳述某些BaS<Vii劑在吸附來自血衆(zhòng)的凝血酶原方面比其他 試劑更有效，而Voss D. (1965)注意到當(dāng)使用不同BaS04試劑用于吸附凝血酶原復(fù)合物時(shí)， 在吸附相同量的凝血酶原復(fù)合物所需的BaS0 4量中發(fā)現(xiàn)顯著差異，并且推測這是由于其晶 體結(jié)構(gòu)中的差異。然而，在本
【申請人】的情況下，已測試了不同BaS0#W*的形態(tài)，并且未測 定到顯著差異。另外，一些離子例如Ca 2+據(jù)報(bào)道促成對于不同BaS04批次的不同吸附率，并 且在本文情況下，在不同BaS0 4批次中Ca2+的存在也沒有顯著不同。
[0007] 凝血酶制造商嘗試通過借助于試誤法從多重不同BaS04試劑中選擇合適的BaSO 4 試劑來增加凝血酶得率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明在其一些實(shí)施例中涉及使用給定BaS04試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝 血酶原來源生產(chǎn)凝血酶的方法，以及通過下述評估給定BaS04試劑用于制備凝血酶的適合 性的方法：使給定BaS04試劑與凝血酶原來源接觸，以獲得BaSO 4吸附的凝血酶原，并且在 一些實(shí)施例中，相對于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性，評估BaS04吸附的凝血酶原的促凝活 性。
[0009] 接觸在本文中以其最廣泛的含義使用，并且指任何類型的組合動(dòng)作，所述組合動(dòng) 作例如使凝血酶原來源與BaS04達(dá)到足夠緊密的接近，使得在BaSO 4和來源中的凝血酶原 之間將發(fā)生結(jié)合相互作用。接觸包括但不限于將來源混合、摻合和/或加入BaS04ft，或?qū)?BaS04加入來源內(nèi)。
[0010] 在本發(fā)明中，驚訝地發(fā)現(xiàn)凝血酶原與一些BaS04試劑接觸觸發(fā)轉(zhuǎn)化成凝血酶（即 凝血酶原轉(zhuǎn)化成其中間體和/或凝血酶）。據(jù)發(fā)現(xiàn)這是在生產(chǎn)過程結(jié)束時(shí)妥協(xié)凝血酶得率 的過早轉(zhuǎn)化。
[0011] 在本文描述的方法的一些實(shí)施例中，在凝血酶原轉(zhuǎn)化成其中間體和/或凝血酶后 出現(xiàn)促凝活性。此類中間體可在凝血酶原至凝血酶的蛋白酶解轉(zhuǎn)化期間形成。中間體的非 限制性例子是前凝血酶和間凝血酶（meizothrombin)。
[0012] 本文描述的方法的一些實(shí)施例允許鑒定適合用作凝血酶原吸附劑的BaS04試劑， 優(yōu)選在使用給定BaS0 4K劑作為大規(guī)模凝血酶生產(chǎn)過程的一部分的吸附劑之前。
[0013] 具體地，在一些實(shí)施例中，使給定BaS04試劑的樣品與凝血酶原來源接觸，以由其 吸附凝血酶原，獲得BaS0 4K附的凝血酶原，并且隨后評估BaSO 4吸附的凝血酶原的促凝活 性。通常，BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性越低，給定BaSO 4試劑越適合用作凝血酶原吸 附劑。在一些實(shí)施例中，給定BaS04試劑用作制備凝血酶過程中的凝血酶原吸附劑的適合 性通過BaS0 4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于正常哺乳動(dòng)物血漿例如正常人血漿的促凝 活性指示。
[0014] 正常哺乳動(dòng)物血漿諸如人血漿是眾所周知的預(yù)期用作各種凝血測試的校準(zhǔn)血漿 的合并或單一供體血漿制劑。
[0015] 正常人血漿可以是通過下述獲得的無菌血漿：合并例如來自八個(gè)或更多個(gè)健康成 人的全血的液體部分（檸檬酸鉀或檸檬酸鈉或兩者的溶液已加入其中），并且使其暴露于 紫外線以破壞細(xì)菌和病毒污染物。
[0016] 正常人血衆(zhòng)可以是Unicalibrator凝血測試校準(zhǔn)血衆(zhòng)00625。
[0017] 至少在某些情況下，本文描述的方法消除了通過試誤法選擇合適BaS04K劑的需 要。
[0018] 本文描述的方法的一些實(shí)施例是快速和易于使用的，并且潛在提供了時(shí)間和/或 生產(chǎn)成本的節(jié)省。本文描述的方法的一些實(shí)施例允許增加來自給定凝血酶原來源的凝血酶 侍率。
[0019] 本發(fā)明的方面和實(shí)施例在下文說明書和所附權(quán)利要求中描述。
[0020] 根據(jù)本文描述的一些實(shí)施例的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用給定BaS04K劑作為 凝血酶原的吸附劑，由凝血酶原來源制備凝血酶的方法，該方法包括：
[0021] a.提供給定BaS04K劑和凝血酶原來源；
[0022] b.在允許來自凝血酶原來源的凝血酶原被給定BaS04試劑吸附的條件下，使給定 BaS04試劑的樣品和凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；以及
[0023] c.評估BaSO/及附的凝血酶原的促凝活性，
[0024] 其中當(dāng)c.的評估通過比較BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血 漿的促凝活性進(jìn)行時(shí)，給定BaS0 4試劑用于制備凝血酶的適合性通過BaSO/及附的凝血酶原 的促凝活性不大于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性指示。
[0025] 根據(jù)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了使用給定BaS04試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝 血酶原來源制備凝血酶的方法，該方法包括上文的步驟a至c，并且還包括：
[0026] d.在允許凝血酶原吸附的條件下，使合適的BaS(V^凝血酶原來源接觸；
[0027] e.使用洗脫緩沖液，從BaS04吸附的凝血酶原中洗脫含凝血酶原級分；
[0028] f.對洗脫的級分實(shí)施允許凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的條件，從而獲得凝血酶。
[0029] 在一些實(shí)施例中，該方法包括在步驟"e"后收集洗脫的級分。
[0030] 在一些實(shí)施例中，該方法基本上避免凝血酶原過早轉(zhuǎn)化成凝血酶。"凝血酶原過早 轉(zhuǎn)化成凝血酶"意指凝血酶原在步驟"d"時(shí)轉(zhuǎn)化成凝血酶。
[0031] 通常，如本文公開的術(shù)語"洗脫"可與術(shù)語"解吸"互換使用。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施例中，在凝血酶制備中允許凝血酶原吸附至BaS04的條件包括pH 7. 4-8. 6和/或濃度范圍為約1% -22% (w/v)例如約1%的BaS04。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施例中，在凝血酶制備期間的洗脫緩沖液包含鈣螯合鹽諸如濃度為 3. 0-4. 4% (w/v)的檸檬酸鈉和/或具有在6. 3和7. 4之間的pH。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施例中，允許凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的條件包括對凝血酶原實(shí)施活化劑 諸如鈣離子。
[0035] 根據(jù)本文描述的一些實(shí)施例的進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了評估給定BaS04試劑用 于由凝血酶原來源制備凝血酶的適合性的方法，該方法包括：
[0036] a.提供給定BaS(Vii劑和凝血酶原來源；
[0037] b.在允許來自凝血酶原來源的凝血酶原吸附至給定BaS04試劑的條件下，使給定 BaS04試劑的樣品和凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；
[0038] c.評估BaSO/及附的凝血酶原的促凝活性，
[0039] 其中當(dāng)c.的評估通過比較BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血 漿的促凝活性進(jìn)行時(shí)，給定BaS0 4試劑用于制備凝血酶的適合性通過BaSO 4吸附的凝血酶原 的促凝活性不大于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性指示。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用給定BaS04試劑作為凝 血酶原吸附劑，由凝血酶原來源制備凝血酶的方法，該方法包括：
[0041] a.提供給定BaS(Vii劑和凝血酶原來源；
[0042] b.在允許來自凝血酶原來源的凝血酶原被給定BaS04試劑吸附的條件下，使給定 BaS04試劑的樣品和凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；以及
[0043] c.評估BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性，在一些實(shí)施例中，給定BaSO 4試劑用作 制備凝血酶過程中的凝血酶原吸附劑的適合性通過BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性不大 于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性指示。在一些實(shí)施例中，c.的評估通過比較BaS0 4吸附的 凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性來進(jìn)行。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于評估給定BaS04試劑 用作由凝血酶原來源制備凝血酶中的凝血酶原吸附劑的適合性的方法，該方法包括：
[0045] a.提供給定BaS(Vii劑和凝血酶原來源；
[0046] b.在允許來自凝血酶原來源的凝血酶原被給定BaS04試劑吸附的條件下，使給定 BaS04試劑的樣品和凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；以及
[0047] c.評估BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性。在一些實(shí)施例中，給定BaSO 4試劑用 作制備凝血酶過程中的凝血酶原吸附劑的適合性通過BaSO/及附的凝血酶原的促凝活性不 大于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性指示。在一些實(shí)施例中，c.的評估通過比較BaS0 4吸附 的凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性來進(jìn)行。
[0048] 在本文公開的方法的一些實(shí)施例中，評估促凝活性包括執(zhí)行促凝測定。
[0049] 在本文公開的方法的一些實(shí)施例中，促凝測定包括功能測定，諸如選自凝血測定 (諸如NAPTT測定、APTT測定、蛋白酶生色測定的功能測定或指示測定（諸如免疫測定）。
[0050] 在一些實(shí)施例中，獲得的洗脫物具有不小于0. 8的NAPTT比的BaS04試劑視為適 用于制備凝血酶。
[0051] 在一些實(shí)施例中，獲得的洗脫物具有0. 8或更小的NAPTT比或者立即在視覺上 觀察到凝塊（凝塊在鈣添加后以及在凝血時(shí)間可在凝固劑測量機(jī)器中記錄之前發(fā)生）的 BaS04試劑視為不適用于制備凝血酶。
[0052] 在本文公開的方法的一些實(shí)施例中，凝血酶原來源選自血漿（諸如草酸鹽血漿） 或血漿級分。在一些此類實(shí)施例中，凝血酶原來源包括從哺乳動(dòng)物（諸如人、馬、牛和豬） 中收獲的血漿。在一些實(shí)施例中，凝血酶原來源包括豬血漿。在一些實(shí)施例中，凝血酶原來 源是重組凝血酶原。在一些實(shí)施例中，對凝血酶原來源實(shí)施病毒滅活處理。例如，來源是溶 劑/洗滌劑（SD)處理的血漿。
[0053] "溶劑洗滌劑（SD)病毒滅活處理"通常指通過破壞其脂質(zhì)包膜而使有包膜病毒或 脂質(zhì)包被病毒滅活的過程。該處理可通過添加洗滌劑（諸如Triton X-45、Triton X-100 或聚山梨酸酯80)和溶劑[諸如三（正丁基）磷酸酯（ΤηΒΡ)、二或三烷基磷酸酯]來進(jìn)行。 用于滅活脂質(zhì)包被病毒的溶劑-洗滌劑組合可以是本領(lǐng)域已知的任何溶劑-洗滌劑組合， 諸如ΤηΒΡ和Triton Χ-100 ;聚山梨酸酯80和膽酸鈉以及其他組合。
[0054] 所用的一種或多種溶劑/ 一種或多種洗滌劑濃度可以是本領(lǐng)域中常用的那些，例 如如US5094960A、US4789545A中所進(jìn)行的。所用的一種或多種溶劑/ 一種或多種洗滌劑濃 度可以是>0. 1% ΤηΒΡ和>0. 1% Triton X-100的組合。所用的一種或多種溶劑/ 一種或 多種洗滌劑濃度可以是1% Triton X-100和0. 3% ΤηΒΡ的組合。然而，其他溶劑/洗滌劑 組合和合適的條件將對本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員顯而易見。
[0055] 在一個(gè)實(shí)施例中，0· 5% Tween-80 和 0· 15% ΤηΒΡ 用于 SD 處理。pH 在 7. 4-8. 6 的 范圍內(nèi)。使溶液在室溫下溫育1小時(shí)。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施例中，1% Tween-80和0· 3% ΤηΒΡ用于SD處理。pH在7. 4-8. 6的范 圍內(nèi)。使溶液在室溫下溫育6小時(shí)。
[0057] 在本文公開的方法的一些實(shí)施例中，使給定BaS04K劑的樣品和凝血酶原來源接 觸包括將約1%至約22%或約1%至約10% (w/v)BaS04K劑加入凝血酶原來源（例如收 獲的血漿）中。在一些實(shí)施例中，加入約1% (w/v)BaS04試劑。
[0058] 在一些實(shí)施例中，允許來自凝血酶原來源的凝血酶原被給定BaS04試劑吸附的條 件包括pH 7. 4-8. 6。在一些實(shí)施例中，該條件包括例如在20°C -25°C范圍內(nèi)的室溫。
[0059] 凝血酶原通過BaS04試劑的吸附可以成批模式或充滿BaSO 4的柱進(jìn)行。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施例中，凝血酶原通過BaS04的吸附以成批模式在室溫下例如在25°C下 以pH 7. 4-8. 6進(jìn)行2小時(shí)。
[0061] 在本文描述的方法的一些實(shí)施例中，評估BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性是吸 附至BaSO#劑時(shí)的BaSO 4吸附的凝血酶原的促凝活性。
[0062] 在一些實(shí)施例中，本文公開的方法還包括在"b"之后且在"c"之前，從BaS04試劑 中洗脫BaS0 4吸附的凝血酶原中的至少一些；并且其中評估BaSO 4吸附的凝血酶原的促凝 活性是洗脫的BaS04吸附的凝血酶原中的至少一些的促凝活性。在一些此類實(shí)施例中，從 BaS04試劑中洗脫BaSO 4吸附的凝血酶原中的至少一些包括使BaSO 4試劑與pH不小于6. 0 且不大于7. 0的洗脫溶液接觸。
[0063] 在一些實(shí)施例中，洗脫溶液的pH不小于6. 1，不小于6. 2且甚至不小于6. 3。在一 些實(shí)施例中，洗脫溶液的pH不超過6. 5,不超過6. 6且甚至不超過6. 7,或在約pH6. 3和6. 7 之間。在一些實(shí)施例中，洗脫溶液的pH在6. 3和7. 4之間。
[0064] 在一些實(shí)施例中，洗脫溶液包含螯合鹽。在一些實(shí)施例中，洗脫溶液中的螯合鹽濃 度為約0. 2% (w/v)至約4. 4% (w/v)或約3. 0% (w/v)至約4. 4% (w/v)。在一些實(shí)施例 中，螯合鹽包含檸檬酸鈉。在一些實(shí)施例中，洗脫溶液中的檸檬酸鈉濃度為約0.2% (w/v) 至約 4. 4% (w/v)或約 3. 0% (w/v)至約 4. 4% (w/v)。
[0065] 在一些實(shí)施例中，給定BaS04試劑是包含按（重量/重量）計(jì)至少75 % (w/w) BaSO 4 的試劑，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97. 5%且甚至至少88% (w/ w) BaS04。
[0066] 除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。此外，描述、材料、方法和實(shí)例僅是例示性的并且不預(yù) 期是限制性的。類似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。
[0067] 如本文所用，術(shù)語"給定BaS04試劑"指來自指定供應(yīng)商的指定批次的BaSO 4試劑。 不同的給定BaS04試劑因此可以是由不同供應(yīng)商提供的試劑，或由相同供應(yīng)商提供的不同 試劑批次。
[0068] 如本文所用，術(shù)語"促凝活性"指促進(jìn)血液凝固。
[0069] 如本文所用，術(shù)語"包含"、"包括"、"具有"及其語法變體應(yīng)視為指定所述特征、整 數(shù)、步驟或組分，但不排除一種或多種另外特征、整數(shù)、步驟、組分或其組的添加。這些術(shù)語 涵蓋術(shù)語"由…組成"和"基本上由…組成"。
[0070] 如本文所用，不定冠詞"一個(gè)"和"一種"意指"至少一個(gè)/種"或"一個(gè)或多個(gè)/ 一 種或多種"，除非上下文另有明確說明。
[0071] 如本文所用，術(shù)語"約"指±10%。
【附圖說明】
[0072] 本發(fā)明的一些實(shí)施例在本文中參考附圖進(jìn)行描述。說明書連同附圖使得本發(fā)明的 一些實(shí)施例可如何實(shí)踐對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見。附圖用于例示性討論的目的， 并且不試圖顯示比本發(fā)明的基本理解所需更詳細(xì)的實(shí)施例的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。為清楚起見，附圖 中描繪的一些物體未按比例繪制。
[0073] 在附圖中：
[0074] 圖1顯示了得自大規(guī)模的BaS04吸附的凝血酶原樣品的洗脫物的Western印跡分 析，所述大規(guī)模的BaS0 4吸附的凝血酶原樣品在使用來自不同供應(yīng)商的BaS04試劑的凝血酶 生產(chǎn)規(guī)模制造期間制備；
[0075] 圖2顯示了得自豬血漿的洗脫物的Western印跡分析，所述豬血漿使用來自相同 供應(yīng)商的不同BaS0 4K劑批次制備；
[0076] 圖3顯示了得自豬血漿的洗脫物的Western印跡分析，所述豬血漿使用來自不同 供應(yīng)商的BaS0 4試劑制備。
【具體實(shí)施方式】
[0077] 本發(fā)明在其一些實(shí)施例中涉及使用給定BaS04試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝 血酶原來源制備凝血酶的方法，以及通過下述評估給定BaS0 4試劑用于制備凝血酶的適合 性的方法：使給定BaS04試劑與凝血酶原來源接觸，以獲得BaSO 4吸附的凝血酶原，并且在 一些實(shí)施例中，相對于正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性，評估BaS04吸附的凝血酶原的促凝活 性。
[0078] 本文教導(dǎo)的原理、用途和具體實(shí)施可參考所附說明書得到更好理解。在精讀說明 書后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明而無需過度努力或?qū)嶒?yàn)。
[0079] 在詳細(xì)說明至少一個(gè)實(shí)施例之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不一定在其應(yīng)用中限制于下述 說明書中所示的組分和/或方法的構(gòu)建和排列的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有以各種方式實(shí)踐或 實(shí)施的其他實(shí)施例。本文采用的措辭和術(shù)語用于描述性目的且不應(yīng)視為限制性的。
[0080] SM
[0081] 材料和方法
[0082] 材料
[0083] 提供的是如下表1中所示的BaS04試劑：
[0084] 表 1 iBaSO^ 試劑
[0085]
[0086] 氯化鈉得自Sigma-Aldrich(目錄號S1679,分析純，按重量計(jì)至少99. 0% )。
[0087] 檸檬酸三鈉二水合物得自Sigma-Aldrich (目錄號S1804,分析純，按重量計(jì)至少 99.0%)。草酸鹽豬血（包括0.25% (w/w)草酸鹽溶液）得自Kibbutz Lahav(Israel)的 屠宰場。
[0088] BaS04吸附的凝血酶原在凝血酶的大規(guī)模生產(chǎn)期間獲得（在本文中也稱為大規(guī)模 樣品），其中用于吸附凝血酶原的8 &504選自上表1中限定的BaSO 4試劑A、B1之一。
[0089] 丁weenK-80 得自 Sigma-Aldrich(目錄號 P8074, BioXtra，聚乙二醇脫水山梨糖 醇單油酸酯）。
[0090] 三正丁基磷酸酯（ΤηΒΡ)得自Merck-Millipore (目錄號100002,藥品級）。
[0091] 濾器 1. 2 μ m 得自 Sartorius Stedim India Pvt Ltd. (Bangalore, India)(目錄 號8&11：〇|3〇把_'!2300)，并且濾器0.45+0.2以1]1得自3&1'1:〇1'；[118 3七6(1;[111111(11&?￥1:1^(1.(目 錄SartoporeK 300)。
[0092] 對于凝膠電泳，預(yù)鑄的聚丙稀酰胺凝膠得自Bio-Rad Laboratories Inc.(微型凝 膠4-20 %得自目錄號：456-1096)。
[0093] 綿羊抗人凝血酶得自 Affinity Biologicals Inc. (Canada)(目錄號 SAHT-IG)
[0094] 抗綿羊IgG堿性磷酸酶綴合物得自Sigma-Aldrich (目錄號A-5187)。
[0095] 實(shí)例1 :溶劑/洗滌劑（SD)病毒滅活血漿的制備
[0096] 在冰上遞送草酸鹽豬血。將血液以5, 000g(5440rpm)的相對離心力（ref)和4°C的 溫度離心15分鐘。收集包含血漿的上清液，分成等分試樣（300-500ml)且冷凍貯存于-30°C 下直至需要時(shí)。
[0097] 對于SD處理血漿（"SD血漿"）的制備，將冷凍貯存的血漿的等分試樣在37°C下 解凍大約1小時(shí)，然后經(jīng)過1. 2 μπι濾器，隨后經(jīng)過0. 45+0. 2 μπι濾器。在pH 7. 4-8. 6下， 加入0. 5% Tween-80和0. 15% (v/v)TnBP用于SD處理。將溶液在室溫下攪拌1小時(shí)，并 且pH監(jiān)控在7. 4-8. 6下。
[0098] 實(shí)例2 :由豬SD血漿制備實(shí)驗(yàn)宰規(guī)樽的BaSO^吸附的凝血酶原洗脫物
[0099] 使上文實(shí)例1中所述的SD血漿作為凝血酶原來源與表1中列出的給定BaS04K 劑的樣品接觸。
[0100] 具體地，對于表1中列出的六種BaS04K劑中的每一種：
[0101] ⑴將BaS04(l% w/v)試劑的樣品加入一單位SD血漿中。
[0102] (ii)使用磁力攪拌器將SD血漿/BaS04試劑混合物在25°C下攪拌2小時(shí)（pH 7. 4-8. 6)，允許SD血漿中的凝血酶原被BaS04試劑吸附。
[0103] (iii)將混合物以5, 000g(5, 440rpm)在4°C下離心15分鐘。
[0104] (iv)將上清液和沉淀物（包括BaS04K附的凝血酶原）分離，并且將每種沉淀物 分開貯存于_80°C下直至需要時(shí)。
[0105] (v)在使用之前，將沉淀物在室溫（20-25 °C )下解凍15分鐘。
[0106] (vi)將沉淀物以1:1. 4比的BaS04:洗滌緩沖液（w/w)重懸于洗滌緩沖液（78mM NaCl pH 6. 9-7. 1)中，并且使用滾管機(jī)（tuberoller)在室溫下混合15分鐘。
[0107] (vii)隨后將在洗滌緩沖液中的沉淀物以5, 000g(5, 440rpm)在4°C下離心15分 鐘，并且收集上清液且貯存于_80°C下直至需要時(shí)。將該步驟重復(fù)兩次（即總共進(jìn)行三次洗 滌）。
[0108] (viii)在洗滌步驟后，將洗滌的沉淀物（包含BaSO/及附的凝血酶原）以1:1.4 比的BaS0 4:洗脫緩沖液（w/w)重懸于洗脫緩沖液（3%檸檬酸鈉 pH 6. 3-6. 7)中，并且使用 滾管機(jī)混合15分鐘。
[0109] (ix)隨后將沉淀物/洗脫緩沖液以5, 000g(5, 440rpm)在4°C下離心15分鐘。將 含凝血酶原洗脫物收集到置于冰上的干凈容器內(nèi)，并且將洗脫步驟重復(fù)四次（即，總共執(zhí) 行五個(gè)洗脫循環(huán)）。
[0110] GO將來自五個(gè)洗脫循環(huán)的洗脫物（含有解吸的凝血酶原）合并成單一洗脫物， 通過0. 2 μ m PVDF濾器過濾且在干凈的容器中貯存于-80°c下，直至通過NAPTT或Western 印跡進(jìn)行測試時(shí)。
[0111] 實(shí)例3 :由豬SD血漿制備大規(guī)樽的BaSO^吸附的凝血酶原洗脫物
[0112] 由豬血漿制備冷凍的凝血酶原吸附的BaS04的大規(guī)模樣品）。
[0113] 使用的BaS04試劑是如表1中限定的A和B1。
[0114] SD使用1 % Tween-80和0.3% ΤηΒΡ用于SD處理進(jìn)行。pH在L 4-8. 6的范圍內(nèi)。 使溶液與SD -起在24-26°C下溫育6小時(shí)。
[0115] 在大規(guī)模樣品中，步驟v代替實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品中的相應(yīng)步驟，并且將樣品加工直 到步驟X。
[0116] 實(shí)例4 :洗脫物的凝血酶原和凝血酶含量的Western印跡分析
[0117] 使用Biuret方法執(zhí)行如上文實(shí)例2和3中所述獲得的洗脫物各自（每種洗脫物 對應(yīng)于表1的六種BaS<V^劑之一）中的總蛋白質(zhì)測量，以便計(jì)算用于Western印跡測定 的裝載體積，并且驗(yàn)證殘留未結(jié)合的蛋白質(zhì)及其他污染物通過洗滌步驟（vi和vii)去除。
[0118] 為了獲得來自洗脫物中每一種的蛋白質(zhì)的更好分辨，使用SDS-PAGE梯度微型預(yù) 鑄凝膠（4%-20%)在還原條件下分離來自洗脫物樣品的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到 硝酸纖維膜上。使用綿羊抗人凝血酶和二抗、與堿性磷酸酶綴合的抗綿羊IgG執(zhí)行Western 印跡。
[0119] 發(fā)現(xiàn)一些BaS04吸附的凝血酶原樣品包含凝血酶（參見下文"結(jié)果"部分）。
[0120] 實(shí)例5 :洗脫物的促凝活件
[0121] 使用非活化部分凝血活酶時(shí)間（NAPTT)測定，評估由豬SD血漿制備的八種洗脫物 (如實(shí)例2中的6種和如實(shí)例3中的2種）中每一種的促凝活性，基本上如Ph. Eur. (2. 6. 22) 中所述。簡言之且如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，NAPTT測定包括將磷脂（兔腦磷脂）和 鈣離子（如CaCl 2)同時(shí)加入測試的洗脫物或吸附的BaS04吸附的凝血酶原樣品以及正常人 血衆(zhòng)對照[Unicalibrator凝血測試校準(zhǔn)血衆(zhòng)00625](其固有地含有凝血酶原）丐離子通 過將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶而起始測試樣品中的凝血。凝血酶通過將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn) 化為不溶性纖維蛋白而引起凝塊形成。凝血時(shí)間使用凝血計(jì)（ST ART4Stago機(jī)器）進(jìn)行測 量。
[0122] 更具體而言，將45 μ 1人血漿加入四個(gè)測試孔各自中。對于對照樣品，將45 μ 1 TBS/白蛋白緩沖液加入兩個(gè)對照孔各自中，并且將45 μ 1稀釋的測試樣品加入兩個(gè)另外的 對照孔各自中。隨后將45 μ 1兔腦磷脂0. 02%溶液加入四個(gè)測試孔各自中，隨后通過輕輕 搖動(dòng)和在37°C下溫育1分鐘來混合孔的內(nèi)容物。通過將45 μ 1 0. 025Μ CaCl2(先前在37°C 下溫育）加入所有孔內(nèi)起始反應(yīng)，并且測量凝血時(shí)間。NAPTT比計(jì)算為測試樣品的凝血時(shí)間 (以秒計(jì)）除以正常人血漿對照的凝血時(shí)間。
[0123] 發(fā)現(xiàn)在其中鑒定活性凝血酶的洗脫物中（實(shí)例4)，凝血時(shí)間基本上短于正常人血 漿對照的凝血時(shí)間。發(fā)現(xiàn)在一些洗脫物中凝血是立即的。發(fā)現(xiàn)在一些洗脫物中凝血時(shí)間超 過450秒。
[0124] 發(fā)現(xiàn)起因于BaS04Bl和B2的洗脫物在過程結(jié)束時(shí)獲得凝血酶的高得率。
[0125] 結(jié)果指示NAPTT測定可用于鑒定用于凝血酶生產(chǎn)的合適BaS04試劑。
[0126] 實(shí)例6 :由豬SD血漿制備BaSO^吸附的凝血酶原
[0127] 對于表1中的六種BaS04K劑中的每一種重復(fù)上文步驟（i)-(ii)。
[0128] 使用非活化部分凝血活酶時(shí)間（NAPTT)測定，評估由豬SD血漿制備的吸附的 BaS04吸附的凝血酶原樣品的促凝活性。
[0129] 結(jié)果
[0130] Western ￡口跡分析
[0131] 使用BaS04試劑A和B1 (表1)的洗脫物（實(shí)例3)的Western印跡分析呈現(xiàn)于圖 1中。
[0132] 泳道編號代表下述：
[0133] 1-MW 梯
[0134] 2-人凝血酶原標(biāo)準(zhǔn)
[0135] 3 -使用BaS04試劑A獲得的大規(guī)模洗脫物
[0136] 4 -使用BaS04試劑B1獲得的大規(guī)模洗脫物
[0137] 5-人前凝血酶2標(biāo)準(zhǔn)
[0138] 6-人α凝血酶標(biāo)準(zhǔn)
[0139] 在圖1中，在使用BaS04試劑Β1獲得的大規(guī)模洗脫物（泳道4)中，對應(yīng)于凝血酶 原的條帶是清晰可見的。
[0140] 在圖1中，在使用BaS04試劑A獲得的大規(guī)模洗脫物（泳道3)中，對應(yīng)于凝血酶 原的條帶是幾乎看不見的。對應(yīng)于凝血酶原中間體蛋白質(zhì)以及α凝血酶的其他條帶是顯 而易見的。
[0141] 使用BaS04試劑Α、Β1和Β2 (表1)得自豬SD血漿的洗脫物（實(shí)例2)的Western 印跡分析呈現(xiàn)于圖2中。
[0142] 泳道編號代表下述：
[0143] 1-MW 梯
[0144] 2 -人凝血酶原標(biāo)準(zhǔn)
[0145] 3 -使用BaS04試劑A獲得的洗脫物
[0146] 4 -使用BaS04試劑B1獲得的洗脫物
[0147] 5 -使用BaS04試劑B2獲得的洗脫物
[0148] 6-人α凝血酶標(biāo)準(zhǔn)
[0149] 圖2中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示使用由相同供應(yīng)商供應(yīng)的不同BaS04批次獲得的洗脫物 (B1-泳道4，B2-泳道5)展示相似的條帶模式。使用BaS0 4試劑A獲得的洗脫物（泳道3) 作為參考運(yùn)行。
[0150] 使用BaS04試劑A、B2、D2、D1和C得自豬SD血漿的洗脫物（實(shí)例2)的Western 印跡分析呈現(xiàn)于圖3中。
[0151] 泳道編號代表下述：
[0152] 1-MW 梯
[0153] 2-人凝血酶原標(biāo)準(zhǔn)
[0154] 3 -使用BaS04試劑A獲得的洗脫物
[0155] 4 -使用BaS04試劑B2獲得的洗脫物
[0156] 5 -使用BaS04試劑D2獲得的洗脫物
[0157] 6 -使用BaS04試劑D1獲得的洗脫物
[0158] 7 -使用BaS04試劑C獲得的洗脫物
[0159] 8-人前凝血酶2標(biāo)準(zhǔn)
[0160] 9-人α凝血酶標(biāo)準(zhǔn)
[0161] 圖3中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示使用藥品級BaS04得自豬SD血漿的洗脫物（C-泳道7， D1-泳道6)顯示相似的條帶模式，包括對應(yīng)于凝血酶原和中間體的條帶。該條帶模式類似 于使用BaS04試劑A獲得的洗脫物（泳道3)的條帶模式。用白色標(biāo)準(zhǔn)級BaS0 4獲得的洗脫 物（"D2"-泳道5)顯示對應(yīng)于凝血酶原的弱得多的條帶以及對應(yīng)于中間體和α凝血酶的 更強(qiáng)烈的條帶。使用試劑Β2獲得的洗脫物（泳道4)顯示最強(qiáng)烈的凝血酶原條帶和對應(yīng)于 中間體的最弱條帶。
[0162] ΝΑΡΡΤ測宙結(jié)果
[0163] 表2 :ΝΑΡΤΤ測宙結(jié)果概括
[0166] 使用BaS04試劑Α、Bl、Β2、C、D1和D2獲得的大規(guī)模和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模洗脫物的ΝΑΡΤΤ 測定結(jié)果呈現(xiàn)于表2中。
[0167] 結(jié)果顯示與凝血酶原來源無關(guān)，通過Western印跡顯示具有很少或無凝血酶的 BaS04試劑B1和B2引起比對照血漿更慢的凝血。
[0168] 結(jié)果還顯示與凝血酶原來源無關(guān)，通過Western印跡顯示具有顯著凝血酶含量的 BaS04試劑A顯示比對照血漿更快的凝血。
[0169] 包括使用不同BaS04K劑得自血漿的BaSO 4吸附的凝血酶原的洗脫物使用Western 印跡就蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析，并且使用ΝΑΡΤΤ就促凝活性進(jìn)行分析。
[0170] Western印跡分析結(jié)果（圖1)顯示在來自使用BaS04試劑A和B獲得的樣品的洗 脫物（分別為泳道3和4)之間的結(jié)合模式差異。該結(jié)果提出使用試劑A獲得的樣品中的 凝血酶原已經(jīng)歷至凝血酶的部分轉(zhuǎn)化。
[0171] 在NAPTT凝血測定中，當(dāng)測試使用BaS04試劑A獲得的洗脫物時(shí)立即形成凝塊，而 在使用試劑B獲得的洗脫物中，即使在450秒后也未觀察到凝血。應(yīng)當(dāng)指出的是如事實(shí)上 觀察到的，正常人血漿預(yù)期在NAPTT測定中在約200-300秒內(nèi)產(chǎn)生凝塊，如表2中可見。
[0172] 各種不同的BaS04試劑用于從豬SD血漿中分離凝血酶原且用于生產(chǎn)凝血酶。藥 品級BaS0 4試劑A、C和D1獲得不滿意的結(jié)果，如同更低級的BaSO 4試劑A和D2 -樣，而一 些藥品級的BaS04試劑B1和B2提供優(yōu)良結(jié)果。
[0173] 結(jié)果顯示使用的具體BaS04試劑顯著影響B(tài)aSO 4吸附的凝血酶原的促凝活性和凝 血酶得率。
[0174] 還顯示凝血酶原中的至少一些轉(zhuǎn)化為凝血酶和/或凝血酶中間體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 促凝測定可如本文描述的用于定性測定給定BaS0 4試劑是否適合用作凝血酶原吸附劑和在 過程結(jié)束時(shí)產(chǎn)生增加得率的凝血酶。
[0175] 應(yīng)當(dāng)理解，為清晰起見，在分開實(shí)施例的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征，也可 在單個(gè)實(shí)施例中組合提供。相反，為簡便起見，在單個(gè)實(shí)施例的上下文中描述的本發(fā)明的各 種特征還可分開地或以任何合適的亞組合或如本發(fā)明的任何其他所述實(shí)施例中合適地提 供。在各個(gè)實(shí)施例的上下文中所述的某些特征不應(yīng)視為這些實(shí)施例的基本特征，除非實(shí)施 例如果沒有這些元件將是不起作用的。
[0176] 盡管本發(fā)明已與其具體實(shí)施例結(jié)合進(jìn)行描述，但顯而易見的是許多替代形式、修 飾和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，預(yù)期涵蓋屬于所附權(quán)利要求的范圍 內(nèi)的所有此類替代形式、修飾和變化。
[0177] 本申請中的任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)解釋為此類參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明 的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。
[0178] 實(shí)例7 :在從BaSOA式劑中洗脫凝血酶原后的凝血酶原活化
[0179] 由BaS04A和B1洗脫的凝血酶原（如下表中限定的）如下進(jìn)行活化：
[0180]
[0181] 將洗脫的凝血酶原溶液與CaCl2(6g/升）和甘氨酸（10g/升）混合，并且調(diào)整pH。 接下來，將溶液通過〇. 22 μ Μ濾器過濾，并且在20-25°C下溫育8小時(shí)，隨后在2-8°C下溫育 最高至72小時(shí)。與使用BaS04A作為吸附劑獲得的凝血酶得率相比較，使用BaS0 4Bl作為吸 附劑獲得的得率高約9倍。
[0182] 實(shí)例證實(shí)在大規(guī)模凝血酶制造之前選擇合適的BaS04試劑是有利的，以便使凝血 酶得率達(dá)到最大。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使用給定BaSO 4試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝血酶原來源制備凝血酶的方 法，所述方法包括： a. 提供所述給定BaS04試劑和所述凝血酶原來源； b. 在允許來自所述凝血酶原來源的凝血酶原被所述給定BaS04試劑吸附的條件下，使 所述給定BaS0 4K劑的樣品和所述凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；以 及 c. 評估所述BaS04K附的凝血酶原的促凝活性， 其中當(dāng)c.的評估通過比較所述BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血 漿的促凝活性進(jìn)行時(shí)，所述給定BaS04試劑用于制備凝血酶的適合性通過所述BaSO 4吸附的 凝血酶原的促凝活性不大于所述正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性指示。2. -種使用給定BaSO 4試劑作為凝血酶原的吸附劑，由凝血酶原來源制備凝血酶的方 法，所述方法包括權(quán)利要求1所述的步驟"a"至"c"，并且還包括： d. 在允許凝血酶原吸附的條件下，使合適的BaS04與凝血酶原來源接觸； e. 使用洗脫緩沖液，從所述BaS04吸附的凝血酶原中洗脫含凝血酶原級分； f. 對所洗脫的級分實(shí)施允許凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的條件，從而獲得凝血酶。3. -種用于評估給定BaSO 4試劑用作由凝血酶原來源制備凝血酶中的凝血酶原吸附劑 的適合性的方法，所述方法包括： a. 提供所述給定BaS<V^劑和凝血酶原來源； b. 在允許來自所述凝血酶原來源的凝血酶原被所述給定BaS04試劑吸附的條件下，使 所述給定BaS0 4K劑的樣品和所述凝血酶原來源接觸，從而獲得BaSO 4吸附的凝血酶原；以 及 c. 評估所述BaS04K附的凝血酶原的促凝活性， 其中當(dāng)c.的評估通過比較所述BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性與正常哺乳動(dòng)物血 漿的促凝活性進(jìn)行時(shí)，所述給定BaS04K劑用作制備凝血酶過程中的凝血酶原吸附劑的適 合性通過所述BaS0 4吸附的凝血酶原的促凝活性不大于所述正常哺乳動(dòng)物血漿的促凝活性 指示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中評估促凝活性包括執(zhí)行促凝測定。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述促凝測定包括功能測定。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述功能測定是凝血測定。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述凝血測定選自NAPTT測定、APTT測定和蛋白 酶生色測定。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述凝血酶原來源選自血漿或血漿 級分。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述血漿包括草酸鹽血漿。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述凝血酶原來源包括從哺乳動(dòng)物 中收獲的血漿。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物選自人、馬、牛和豬。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中允許來自所述凝血酶原來源的凝 血酶原被所述給定BaS04試劑吸附的所述條件包括pH 7. 4-8. 6。13. 根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述給定BaSO 4試劑的樣品和 所述凝血酶原來源接觸包括將約1 % (w/v)BaS04試劑加入所收獲的血漿中，所述收獲的血 漿為所述凝血酶原來源。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中評估所述BaSO 4吸附的凝血酶原 的促凝活性是吸附至所述BaS04試劑時(shí)的所述BaSO 4吸附的凝血酶原的促凝活性。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，還包括： 在"b"之后且在"c"之前，從所述BaS04K劑中洗脫所述BaSO 4吸附的凝血酶原中的至 少一些；并且 其中評估所述BaS04吸附的凝血酶原的促凝活性是所洗脫的BaSO 4吸附的凝血酶原中 的至少一些的促凝活性。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中從所述BaSO 4吸附的凝血酶原中洗脫含凝血酶 原級分包括使用在約6. 3和7. 4的pH下的鈣螯合鹽。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述螯合鹽包含檸檬酸鈉。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述檸檬酸鈉的濃度為約3% (w/v)至約4. 4% (w/v)〇19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述凝血酶原來源包括豬血漿。20. 根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)評估多于一種BaSO 4試劑時(shí)，選 擇合適的BaS04試劑用于吸附凝血酶原。
【文檔編號】C12N9/74GK105985940SQ201510064089
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月6日
【發(fā)明人】L·韋斯曼, D·塞拉, I·諾爾, 江彩霞, 安寶昌
【申請人】廣州倍繡生物技術(shù)有限公司, 奧姆里克斯生物藥品有限公司