一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種液體型凝血時(shí)間（TT)檢測(cè)試 劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶時(shí)間（T虹ombin time, TT)檢測(cè)的原理是適量的凝血酶將血漿樣品中的纖 維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，從而使血漿凝固，凝固所需的時(shí)間即為凝血酶時(shí)間（TT)。
[0003] 凝血酶時(shí)間是檢測(cè)凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)功能的一個(gè)簡(jiǎn)便試驗(yàn)，其檢測(cè) 對(duì)臨床的疾病診斷有重要價(jià)值。
[0004] 凝血酶時(shí)間檢測(cè)測(cè)定過程受多種因素的影響，其中試劑的質(zhì)量是關(guān)鍵因素，由于 目前國(guó)產(chǎn)的凝血試劑普遍存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、敏感性差的問題，致使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，不 同的臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室之間測(cè)得的結(jié)果難W比較，因此目前臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的試劑絕大部 分為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。另一方面，由于試劑中重要組分一-凝血酶的穩(wěn)定性不好，目前 國(guó)內(nèi)外的凝血酶試劑幾乎均為凍干粉劑型，使用前需要進(jìn)行復(fù)溶，操作麻煩、瓶間差異大， 且試劑復(fù)溶后質(zhì)量穩(wěn)定性差。而液體型的試劑雖然可W直接使用，方便操作，瓶間差小，更 適合自動(dòng)化儀器的操作，但因?yàn)殚L(zhǎng)期保存過程中，穩(wěn)定性不理想，限制了其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本領(lǐng)域需要開發(fā)一種穩(wěn)定的液體型的凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，基于此，本發(fā)明提供 了一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑及其制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了 W下技術(shù)方案：
[0007] 一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，含有凝血酶、氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清 白蛋白、明膠，且溶劑為水。
[000引 其抑值為6.0?8.0。
[0009] 所述氨基酸選自甘氨酸或丙氨酸。
[0010] 所述聚己二醇的分子量范圍在8000-20000。
[0011] 所述凝血酶的酶活性為5?80IU/血。
[001引還包括緩沖鹽。
[0013] 還包括疊氮化鋼。
[0014] 所述氨基酸的質(zhì)量體積百分比為1 %?5% ;
[0015] 聚己二醇的質(zhì)量體積百分比為0.4%?1% ;
[0016] 甘露醇的質(zhì)量體積百分比為3%?10% ;
[0017] 牛血清白蛋白的質(zhì)量體積百分比為3%?12% ;
[0018] 明膠的質(zhì)量體積百分比為0. 1 %?0. 5%。
[0019] 一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑的制備方法，包括：
[0020] 將氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠溶解在水中得到凝血酶保護(hù)液， 調(diào)節(jié)抑值6. 0?8. 0 ;
[0021] 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試 劑，所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑中凝血酶的酶活性為5?80IU/血。
[0022] 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試 劑的步驟包括：
[0023] 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中 凝血酶的酶活性為3000?lOOOOIU/mL ;
[0024] 將所述凝血酶母液用所述凝血酶保護(hù)液分別稀釋，獲得若干稀釋度溶液并滴定， 根據(jù)滴定結(jié)果選取一個(gè)稀釋度；
[0025] 根據(jù)所述稀釋度，用所述凝血酶保護(hù)液稀釋所述凝血酶母液，得到所述液體型凝 血酶時(shí)間檢測(cè)試劑。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0027] 1)試劑生產(chǎn)過程簡(jiǎn)化，生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，無凍干過程，生產(chǎn)成本低；
[002引。使用為即開即用型，不需復(fù)溶，操作方便；
[0029] 3)不存在因所用水的質(zhì)量或體積差異造成的差異，瓶間變異在3% W內(nèi)；
[0030] 4)試劑穩(wěn)定性高，瓶間一致性好，37°C熱穩(wěn)定在30天W上，2?8°C密封儲(chǔ)存可穩(wěn) 定18個(gè)月W上；
[0031] 5)綜合比價(jià)，本發(fā)明方法制備的液體試劑較市面普遍使用的干粉試劑具有明顯優(yōu) 勢(shì)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑制備方法流程示意圖。
[0033] 圖2是本發(fā)明凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑制備方法流程第二示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0035] 參照?qǐng)D1，一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑制備方法，包括W下步驟：
[0036] 將氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠溶解在水中得到凝血酶保護(hù)液， 調(diào)節(jié)抑值6.0?8.0 ;
[0037] 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試 劑，所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑中凝血酶的酶活性為5?80IU/血。
[003引如圖2所示，一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑制備方法，包括W下步驟：
[0039] 將氨基酸、聚己二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠溶解在水中得到凝血酶保護(hù)液， 調(diào)節(jié)抑值6. 0?8. 0 ;
[0040] 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中 凝血酶的酶活性為3000?lOOOOIU/mL ;
[0041] 將所述凝血酶母液用所述凝血酶保護(hù)液分別稀釋，獲得若干稀釋度溶液并滴定， 根據(jù)滴定結(jié)果選取一個(gè)稀釋度；
[0042] 根據(jù)所述稀釋度，用所述凝血酶保護(hù)液稀釋所述凝血酶母液，得到所述液體型凝 血酶時(shí)間檢測(cè)試劑。
[0043] 本申請(qǐng)還公開了一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，含有凝血酶、氨基酸、聚己二 醇、甘露醇、牛血清白蛋白和明膠，溶劑為水，抑為6. 0-8.0。其中，氨基酸優(yōu)選甘氨酸或丙 氨酸，聚己二醇優(yōu)選分子量8000-1000的聚己二醇。
[0044] 本申請(qǐng)中甘氨酸、甘露醇與其他試劑組分配合能夠很好地保持凝血酶在液體試劑 中的穩(wěn)定性，制備的液體型試劑在2?8°C密封儲(chǔ)存18個(gè)月后，用該試劑進(jìn)行凝血酶時(shí)間 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果偏移在10% W內(nèi)。另外，該試劑還可化含有緩沖鹽，W更好地維持試劑的pH 值，W更好地保持凝血酶的活性。該試劑還可W含有防腐劑，W抑制試劑中維生物的生長(zhǎng)， 有利于該液體型試劑的長(zhǎng)期保存。常用的診斷試劑的防腐劑均可使用，例如疊氮鋼。
[0045] 下面W-個(gè)具體實(shí)施例具體介紹一個(gè)液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑的組成、制備方 法，W及穩(wěn)定性性能。
[0046] 實(shí)施例1凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑的制備方法
[0047] 1凝血酶保護(hù)液配制：稱取Tris6. 06g (50mmol/L)、甘氨酸12g (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1.2% )、PEG200005g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5% )、BSA 35g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 5% )、明膠2g(質(zhì)量分 數(shù)為0. 2% )、甘露醇40g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 4% )、疊氮鋼Ig(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% )，加入1L純 化水，攬拌使其充分溶解，用0. Imol/L的化OH調(diào)抑為7. 0。
[0048] 2過濾除菌：用水潤(rùn)濕0. 45 y m的=醋酸纖維素，緊貼放在抽濾過濾器砂巧上對(duì)保 護(hù)液進(jìn)行抽濾，收集濾液得到濾清的凝血酶保護(hù)液，去除少量配制中的不溶物。
[0049] 3凝血酶母液配制：取1支1血規(guī)格、50000IU/血的凝血酶凍干品，加入1血凝血 酶保護(hù)液，室溫10分鐘，間隔上下顛倒使其充分溶解，然后轉(zhuǎn)移至裝有9血凝血酶保護(hù)液的 小燒杯中，混勻得到lOmL凝血酶母液。
[0050] 4凝血酶母液的稀釋和滴定：
[0化1] 1)用凝血酶保護(hù)液對(duì)凝血酶母液按1:100、1:150、1:200、1:400進(jìn)行稀釋配制凝 血酶時(shí)間檢測(cè)試劑各2血，分別記為A、B、C、D四組。
[0化2] 2)上述A、B、C、D四組小樣分別上血凝儀對(duì)30例醫(yī)院報(bào)告為正常的新鮮（2h內(nèi)） 血漿樣本W(wǎng)及Siemens血凝正常水平質(zhì)控品Ci-Trol 1進(jìn)行測(cè)檢測(cè)，檢測(cè)方法為：取待測(cè)血 漿或質(zhì)控品100 y L 37°C育溫3分鐘，然后加入100 y L凝血酶試劑，W Sysmex CA-1500血 凝儀凝固法進(jìn)行檢測(cè)。
[0053] 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)稀釋比例在1:150?1:400范圍內(nèi)，各樣本結(jié)果均在20s內(nèi)，滿足行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)要求。
[0054] 如取5血凝血酶母液，加入到剩余全部1L保護(hù)液中，稀釋比例約為1:200,得到1L 凝血酶試劑，混勻即為凝血酶時(shí)間（TT)檢測(cè)試劑。
[0055] 5凝血酶時(shí)間們）試劑性能檢測(cè)：
[0056] 1)準(zhǔn)確性檢測(cè)
[0化7] 上述凝血酶試劑上Sysmex CA-1500血凝儀對(duì)30例醫(yī)院報(bào)告為正常的新鮮（2h 內(nèi)）血漿樣本，檢測(cè)方法同上。結(jié)果如下表1 :
[0化引表1凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑測(cè)試結(jié)果 [0059]
[0060]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，含有凝血酶、氨基酸、聚乙二醇、甘露 醇、牛血清白蛋白、明膠，且溶劑為水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，其pH值為6. O? 8. 0〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，所述氨基酸選自 甘氨酸或丙氨酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，所述聚乙二醇的 分子量范圍在8000-20000。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，所述凝血酶的酶 活性為5?80IU/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，還 包括緩沖鹽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，還包括疊氮化鈉。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，其特征在于，所述氨基酸的質(zhì) 量體積百分比為1 %?5% ; 聚乙二醇的質(zhì)量體積百分比為0. 4%?1% ; 甘露醇的質(zhì)量體積百分比為3%?10% ; 牛血清白蛋白的質(zhì)量體積百分比為3%?12% ; 明膠的質(zhì)量體積百分比為〇. 1 %?〇. 5%。
9. 一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于，包括： 將氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠溶解在水中得到凝血酶保護(hù)液，調(diào)節(jié) pH 值 6. 0 ?8. 0 ; 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑， 所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑中凝血酶的酶活性為5?80IU/mL。
10. 如權(quán)利要求9所述制備方法，其特征在于，取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù) 液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑的步驟包括： 取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中得到凝血酶母液，所述凝血酶母液中凝血 酶的酶活性為3000?10000IU/mL ; 將所述凝血酶母液用所述凝血酶保護(hù)液分別稀釋，獲得若干稀釋度溶液并滴定，根據(jù) 滴定結(jié)果選取一個(gè)稀釋度； 根據(jù)所述稀釋度，用所述凝血酶保護(hù)液稀釋所述凝血酶母液，得到所述液體型凝血酶 時(shí)間檢測(cè)試劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑及其制備方法，制備方法包括如下步驟：將氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠溶解在水中得到凝血酶保護(hù)液，調(diào)節(jié)pH值6.0～8.0；取凝血酶凍干粉溶解在所述凝血酶保護(hù)液中，得到所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，所述液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑中凝血酶的酶活性為5～80IU/mL。一種液體型凝血酶時(shí)間檢測(cè)試劑，含有凝血酶、氨基酸、聚乙二醇、甘露醇、牛血清白蛋白、明膠，且溶劑為水。發(fā)明試劑生產(chǎn)過程簡(jiǎn)化，生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單，無凍干過程，生產(chǎn)成低；使用為即開即用型；瓶間變異小；試劑穩(wěn)定性高。
【IPC分類】G01N33-86
【公開號(hào)】CN104569446
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510058508
【發(fā)明人】艾峰, 肖國(guó)偉, 潘仁斌
【申請(qǐng)人】上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日