一種同時(shí)測定人血漿中oxc以及代謝產(chǎn)物mhd和mhd-g的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種同時(shí)測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法， 屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 癲癇（Epil印sy)是一種世界范圍內(nèi)常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床特征為腦神經(jīng) 細(xì)胞反復(fù)發(fā)作的異常放電引起的大腦功能失調(diào)，因其病程長，致殘率高，成為兒科神經(jīng)系統(tǒng) 中發(fā)病率最高、危害最為嚴(yán)重的疾病。如不能很好的控制，將會對腦神經(jīng)造成不可逆的損 傷，嚴(yán)重影響兒童的生長發(fā)育，給患兒、家庭和社會帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力。
[0003] 奧卡西平（Oxcarbazepine，0XC)是一種新型的治療癲癇局部發(fā)作 和全身強(qiáng)直陣攣性發(fā)作的藥物。奧卡西平（OXC)進(jìn)入機(jī)體后，肝細(xì)胞溶質(zhì)酶 (AKR1C1, AKR1C2, AKR1C3, AKR1C4, CBRl和CBR3)能夠迅速將其轉(zhuǎn)化為活性代謝物10, 11-二 氫，10-羥基卡馬西平（MHD)，并發(fā)揮藥理作用，MHD在UGT催化下又進(jìn)一步與葡萄糖醛酸結(jié) 合排出體外，小部分MHD被氧化成無藥理活性的10, 11-二羥基卡馬西平（DHD)，90%以上 的藥物以代謝產(chǎn)物形式通過尿液排出：葡萄糖醛酸結(jié)合物（49% )、MHD(27% )、DHD(3% )、 其他代謝產(chǎn)物（13% )，OXC少于1% ;不到4%原藥從糞便中排出。由此可見，代謝是OXC 體內(nèi)消除的主要形式，MHD與UGT的II相結(jié)合反應(yīng)，是OXC在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化最重要的途 徑，影響UGT活性將會干擾MHD體內(nèi)代謝，從而改變MHD血藥濃度，導(dǎo)致治療失敗甚至引發(fā) 嚴(yán)重不良反應(yīng)，將對患者用藥安全造成極大危害。
[0004] 高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS)是檢測藥物濃度最常用的方法，具有靈敏 度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以對多種微量化合物同時(shí)進(jìn)行檢測。因此，通過同時(shí)檢測人體內(nèi) 0XC、MHD、MHD-G的血藥濃度，可以更加準(zhǔn)確的監(jiān)測OXC在體內(nèi)動態(tài)的代謝變化情況，以及判 斷是否由于OXC代謝減少或UGT基因突變導(dǎo)致MHD治療藥物濃度的降低。
[0005] 目前，經(jīng)過系統(tǒng)驗(yàn)證的HPLC-MS/MS方法只能同時(shí)檢測OXC和MHD，但也具有缺 陷：如走樣時(shí)間車交長（IOmin) (High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneousquantification ofcarbamazepine, oxcarbazepi ne，and their main metabolites in human serum. Ther Drug Monit. 2012,34(I):53-58)、 處理方法復(fù)雜（提取法）（Simultaneous quantitative analysis of
[0006] oxcarbazepine and 10, ll-dihydr〇-l〇-hydroxycarbamazepine inhuman plasma by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Pharm Biomed Anal. 2007,45(2) :304-311)。對于MHD-G的檢測方法未查到相關(guān)文獻(xiàn)，也未見同時(shí)檢測 0XC、MHD、MHD_G的文獻(xiàn)報(bào)道，本發(fā)明首次建立了 0XC、MHD、MHD_G人血漿內(nèi)的HPLC-MS/MS測 定方法，為OXC的臨床血藥濃度的檢測奠定了堅(jiān)實(shí)的方法學(xué)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種同時(shí)測定人血漿中OXC以及代謝 產(chǎn)物MHD和MHD-G的檢測方法。
[0008] 按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，一種同時(shí)測定人血漿中OXC以及代謝產(chǎn)物MHD和 MHD-G的檢測方法，步驟為：
[0009] (1)血漿樣品預(yù)處理：取血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)硝基安定，再加入乙腈沉淀蛋白，速 度離心取上清液，得到預(yù)處理后的血漿樣品；
[0010] ⑵色譜：將步驟⑴預(yù)處理后的血漿樣品進(jìn)行液相色譜分離：色譜條件中色譜 柱：Phenomenex kinetex XB-C18柱；流動相：乙腈：水體積比為50:50,水中含有質(zhì)量濃度 為0· 1%的甲酸；流速：250~300 yL/min ;柱溫：30~40°C ;進(jìn)樣量：10yL ;
[0011] (3)質(zhì)譜：離子源：電噴霧離子化ESI離子源，方式掃描：選擇反應(yīng)檢測掃描SRM， 噴霧電壓：3500~4000V，鞘氣：20~50psi，輔助氣：10~20arb，毛細(xì)管溫度：350°C，離子 源溫度：300°C ;
[0012] (4)計(jì)算：采用內(nèi)標(biāo)法，以0XC、MHD、MHD-G和內(nèi)標(biāo)硝基安定的峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn) 曲線方程，計(jì)算〇XC、MHD、MHD-G的血藥濃度。
[0013] 步驟⑴具體為：取血漿樣品150 μ L，加入1000ng/mL內(nèi)標(biāo)硝基安定溶液15 μ L， 再加入乙腈285 μ L，禍旋混勾5~lOmin，13000rpm離心10~15min，離心后取上清液。
[0014] 步驟（1)所述血漿樣品為含OXC、MHD、MHD-G的血漿。
[0015] 步驟（2)中色譜柱長度為100mm，內(nèi)徑為2. 1mm，填料粒徑為2. 6 μ m〇
[0016] 步驟（3)中檢測離子具體如下：0XC選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z253. 2 - m/ ζ180· 2CE:28eV ;MHD 選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 255. 2 - m/zl94. 2CE:21eV ;MHD-G 選 擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 431. I - m/zl94. 2CE:28eV ;內(nèi)標(biāo)硝基安定選擇性反應(yīng)檢測 離子[M+H]+m/z 282. 3 一 m/z 236. 2CE:22eV。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] (1)預(yù)處理方法簡便：采用一步蛋白沉淀法，適用于常規(guī)檢測。
[0019] (2)專屬性強(qiáng)，采用Phenomenex kinetex XB-C18色譜柱進(jìn)行分離，乙腈：水 (水中含有質(zhì)量濃度為〇. 1 %的甲酸）的混合液作為流動相，等度洗脫，OXC的保留時(shí)間約 為I. 24min，MHD的保留時(shí)間約為I. 07min，MHD-G保留時(shí)間約為1.0 Omin，內(nèi)標(biāo)硝基安定 (Nitrazepam)的保留時(shí)間約為I. 55min，四者具有良好的分離度，可在3min內(nèi)完成測定。此 外，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾兩者的測定。
[0020] (3)靈敏度高：血漿中OXC、MHD、MHD-G最低定量限為10、50、125ng/mL。
[0021] (4)檢測快速：3min完成樣品的一次測定，時(shí)間短，因此適合大批量的生物樣品的 檢測。
[0022] (5)樣品用量?。簝H需150 μ L血漿樣品，即可測定出準(zhǔn)確濃度。
[0023] (6)本發(fā)明方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡便，為OXC、MHD、MHD-G的血藥濃度 測定提供依據(jù)。本方法的〇XC、MHD、MHD-G血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為10~750ng/mL、50~ 10000ng/mL、125~5000ng/mL，低QC日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均小于20 % ;中、高QC日 內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均小于15%。
【附圖說明】
[0024] 圖1為空白人血漿質(zhì)譜圖。
[0025] 圖2為空白人血漿中加入OXC、MHD、MHD-G和內(nèi)標(biāo)硝基安定（Nitrazepam)的質(zhì)譜 圖。
[0026] 圖3為人血漿OXC的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0027] 圖4為人血漿MHD的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0028] 圖5為人血漿MHD-G的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明，然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施 例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā) 明。
[0030] 實(shí)施例：人血漿OXC、MHD和MHD-G濃度的測定
[0031] 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0032] 奧卡西平，純度>99. 8%，批號：100657-201102,購于中國食品藥品檢定研究院； 10, 11-二氫-10-羥基卡馬西平，純度>98%，批號：D449135,購于百靈威公司；10, 11-二 氫-10-羥基卡馬西平葡萄糖醛酸結(jié)合物，純度>95. 5 %，批號：MD114541501，購于英國 carbosynth公司；硝基安定，批號：9201，購于國家麻醉品實(shí)驗(yàn)室；甲醇，批號：HX080973,乙 腈，批號：HX086245,均購于CNW公司；甲酸，批號：T20090811，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司；水為超純水（Milli-Q純水機(jī)）自制。
[0033] 液相色譜系統(tǒng)：ACCELA autosampler，ACCELA 1250pump，美國 Thermo Fisher 公 司；MS/MS系統(tǒng)：TSQ QuantumAccess型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧離子化ESI離 子源，美國Thermo Fisher公司；數(shù)據(jù)米集：LC QUAN?2. 6軟件，美國Thermo Fisher公司； XW-80A微型旋渦混合儀，上海醫(yī)大儀器廠；Z233MK-2高速離心機(jī)，德國HERMLE公司；BT25S 型分析天平，德國Sartorius公司。HGC-12A氮吹儀，天津衡奧公司。
[0034] 液質(zhì)條件
[0035] 1、液相色譜條件：
[0036] 色譜柱：Phenomenex kinetex XB-C18 (2. 6 μ m，2. 1 X 100mm);流動相：乙臆：水 (水中含有質(zhì)量濃度為〇.1%的甲酸）=50:50(￥八）；流速：200~30(^1711^11 ;柱溫：30~ 35°C ;進(jìn)樣量：10yL。
[0037] 2、質(zhì)譜條件：
[0038] 離子源：電噴霧離子化ESI離子源，方式掃描：選擇反應(yīng)檢測掃描（SRM)，噴霧電 壓：3500~4000V，鞘氣：20~50psi，輔助氣：10~20arb，毛細(xì)管溫度：350°C，離子源溫 度：300°C。檢測離子：0XC選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H] +m/z 253. 2 - m/zl80. 2CE:28eV ; MHD選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 255. 2 - m/zl94. 2CE:21eV ;MHD-G選擇性反應(yīng)檢測離 子[M+H]+m/z 431. 1 - m/zl94. 2CE:28eV ;內(nèi)標(biāo)硝基安定選擇性反應(yīng)檢測離子[M+H]+m/z 282.3 - m/z 236.2CE:22eV ;
[0039] 實(shí)驗(yàn)過程
[0040] I、0XC、MHD、MHD-G和內(nèi)標(biāo)硝基安定標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
[0041] 精密稱取OXC標(biāo)準(zhǔn)品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成lmg/mL OXC儲備液。精 密量取適量OXC儲備液用甲醇依次稀釋，配成濃度分別為100、200、500、1000、2500、5000、 7500ng/mL的OXC標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0042] 精密稱取MHD標(biāo)準(zhǔn)品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成lmg/mL MHD儲備液。精密量 取適量MHD儲備液用甲醇依次稀釋，配成濃度分別為500、1250、5000、20000、50000、80000、 100000ng/mL的MHD標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0043] 精密稱取MHD-G標(biāo)準(zhǔn)品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成lmg/mL MHD-G儲備液。 精密量取適量MHD-G儲備液用甲醇依次稀釋，配成濃度分別為1250、2500、5000、10000、 20000、40000、50000ng/mL 的 MHD-G 標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0044] 精密稱取內(nèi)標(biāo)硝基安定標(biāo)準(zhǔn)品少量，置于容量瓶中，甲醇配置成lmg/mL硝基安定 儲備液。精密量取適量儲備液用甲醇稀釋，配置成濃度為lOOOng/mL硝基安定標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0045] 2、專屬性
[0046] 取150 μ L空白人血漿，加入300 μ L乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻5~10min，13000rpm 離心10~15min，取上清液10 μ L進(jìn)行L