本發(fā)明涉及食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種食品中三聚氰胺的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
三聚氰胺（Melamine），俗稱密胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，為純白色單斜棱晶體。三聚氰胺是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂的原料，還可以用作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。
食品工業(yè)上通常采用凱氏定氮法，通過測定氮含量來推算蛋白質(zhì)含量，三聚氰胺的含氮量為66％，常被不法分子違法添加到食品中，以造成蛋白質(zhì)含量達(dá)標(biāo)的假象。
然而，這種添加三聚氰胺的食品不僅沒有真正增加蛋白質(zhì)的含量，其毒副作用反而會給我們的身體健康帶來危害。由于三聚氰胺具有較強(qiáng)的黏性，進(jìn)入人體后水解生成三聚氰胺，容易在體內(nèi)吸附形成結(jié)石的草酸、鞣酸及鈣等物質(zhì)，并沉淀在泌尿系統(tǒng)中。長期攝入三聚氰胺會造成泌尿系統(tǒng)損害，會損害人體和動物的生殖、泌尿系統(tǒng)，產(chǎn)生腎、膀胱結(jié)石。
2008年，我國爆發(fā)了三鹿嬰幼兒奶粉添加三聚氰胺的事件，該事件被曝光的起因在于食用了添加三聚氰胺奶粉的嬰幼兒產(chǎn)生了腎結(jié)石病癥?？梢姡矍璋窊饺肴橹破返淖鞣ㄒ呀?jīng)直接挑戰(zhàn)食品安全，并威脅著我們的健康。因此，為了杜絕食品中添加三聚氰胺，需要一種針對食品中的三聚氰胺進(jìn)行檢測的方法。
現(xiàn)有的三聚氰胺檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。這些方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)三聚氰胺的精確檢測，但其靈敏度、反應(yīng)效率均有一定的不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度更高、反應(yīng)時間短的食品中三聚氰胺的檢測試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中三聚氰胺的檢測試劑盒，包括：1）三聚氰胺校準(zhǔn)品；2）三聚氰胺-羧基磁珠連接物試劑；3）酶結(jié)合物；4）化學(xué)發(fā)光底物；5）清洗液。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的三聚氰胺-羧基磁珠連接物試劑的主要成份是三聚氰胺偶聯(lián)羧基磁珠連接物。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的羧基磁珠的粒徑為2～3μm，表面活性基團(tuán)為羧基（-COOH）。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的酶結(jié)合物的主要成份是堿性磷酸酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的化學(xué)發(fā)光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)。
所述的食品中三聚氰胺的檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
1）配制三聚氰胺校準(zhǔn)品；
2）將三聚氰胺連接到羧基磁珠上制備連接物，用磁珠緩沖液稀釋連接物到一定濃度，制備出連接物試劑；
3）用酶標(biāo)記三聚氰胺結(jié)合蛋白，制備酶結(jié)合物；
4）配制化學(xué)發(fā)光底物；
5）配制清洗液；
6）分裝以上各試劑，組成成品。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的三聚氰胺校準(zhǔn)品的配制，包括以下步驟：
1）校準(zhǔn)品緩沖液的配制：稱取5g Tris堿、9g氯化鈉（NaCl）、0.6g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入5g兔血清白蛋白，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；
2）將三聚氰胺純品粉末用校準(zhǔn)品緩沖液溶解，配制成為1μg/ml的濃溶液，隨后依次稀釋出5個濃度，分別為：10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml；加上0點(diǎn)，共6個濃度的校準(zhǔn)品梯度值。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的三聚氰胺-羧基磁珠連接物試劑的制備，包括以下步驟：
1）準(zhǔn)確稱取三聚氰胺5mg，溶解于純水中，終濃度為2.5mg/ml，得到三聚氰胺溶液；
2）配制pH值7.0的25mmol/L的磷酸鹽緩沖液：稱取NaH2PO4·H2O 1.5g、Na2HPO4·2H2O 2.5g、氯化鈉（NaCl）3g，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉或碳酸氫鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.0±0.1，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.0±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；
3）配制5mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC），用二甲基亞砜（DMSO）溶解；
4）往三聚氰胺溶液中加入80μL的5mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC）進(jìn)行活化，20～22℃反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；
5）量取10mg羧基磁珠，將羧基磁珠放置于磁架上靜置2分鐘，移除上清，用pH＝7.0的25mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三次后加入磷酸鹽緩沖液保存，使磁珠濃度為20mg/ml；
6）將活化后的三聚氰胺溶液加入清洗后的羧基磁珠中，并將反應(yīng)液中磁珠濃度調(diào)整為5mg/ml，20～22℃反應(yīng)35分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；
7）配制磁珠緩沖液：稱取12g Tris堿、9g氯化鈉（NaCl）、0.5ml吐溫-20、1g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入1g干酪素鈉，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；
8）反應(yīng)完成后移除上清，用25mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三次后加入1ml磁珠緩沖液進(jìn)行保存；使用時用磁珠緩沖液稀釋成濃度為0.03mg/ml的工作液。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的酶結(jié)合物的制備，包括以下步驟：
1）取堿性磷酸酶1.0mg，將濃度調(diào)整為6mg/ml；
2）稱取5mg磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC），用二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行溶解，終濃度為15mg/ml，加入5μL至堿性磷酸酶中，20～22℃反應(yīng)15分鐘；
3）用分子篩層析法根據(jù)分子量的差別對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，收集活化后的堿性磷酸酶溶液；
4）取純品三聚氰胺結(jié)合蛋白0.5mg，加入活化后的堿性磷酸酶緩沖液中，2～8℃反應(yīng)4小時，最后用分子篩層析法將酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白提純出來；
5）酶結(jié)合物緩沖液配制：稱取12g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、9g氯化鈉（NaCl）、6g甘油、0.6g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入10g兔血清白蛋白，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；
6）將結(jié)合物用酶結(jié)合物緩沖液稀釋至酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白濃度為2μg/ml即為工作液。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的化學(xué)發(fā)光底物的配制，包括以下步驟：準(zhǔn)確稱取3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽（AMPPD）0.5g、三羥甲基氨基甲烷（Tris）18g、氯化鈉（NaCl）100g、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）0.02g，純化水定容至1000ml，調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物溶液pH值為9.4±0.05。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的清洗液的配制，包括以下步驟：稱取1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、8.5g氯化鈉（NaCl）、1g吐溫-20，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用2mol/L檸檬酸鈉溶液調(diào)整溶液pH值到7.8±0.1，補(bǔ)加純化水定容至1000ml，過濾后混勻待用。
利用所述的食品中三聚氰胺的檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，步驟為：
（1）向平底試管中加入50μL樣本或者校準(zhǔn)品；
（2）向平底試管中加入50μL磁分離試劑；
（3）向平底試管中加入40μL三聚氰胺結(jié)合蛋白堿性磷酸酶結(jié)合物；
（4）將平底試管放置在渦旋混勻儀上混勻30秒，然后置于37℃反應(yīng)20分鐘；
（5）將平底試管放置在磁架上靜置2分鐘后倒掉上清，拍干，加入清洗液500μL，混勻20秒；
（6）重復(fù)步驟（5）兩次；
（7）將拍干的平底試管放入免疫分析儀中進(jìn)行檢測。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過三聚氰胺與固相載體直接穩(wěn)定連接的方法，既可保證與固相載體連接的穩(wěn)定性、又能保證三聚氰胺分子得到充分暴露，同時還通過引入磁性微粒擴(kuò)大有效反應(yīng)面積，建立了靈敏度更高、反應(yīng)時間更短的三聚氰胺化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，該試劑盒可適用于各種發(fā)光檢測儀器。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
本發(fā)明實(shí)施例中，一種食品中三聚氰胺的檢測試劑盒，包括：1）三聚氰胺校準(zhǔn)品；2）三聚氰胺-羧基磁珠連接物試劑；3）酶結(jié)合物；4）化學(xué)發(fā)光底物；5）清洗液。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml。三聚氰胺-羧基磁珠連接物試劑的主要成份是三聚氰胺偶聯(lián)羧基磁珠連接物。羧基磁珠的粒徑為2～3μm，表面活性基團(tuán)為羧基（-COOH）。酶結(jié)合物的主要成份是堿性磷酸酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白?；瘜W(xué)發(fā)光底物的主要成份是(3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽)。
所述的食品中三聚氰胺的檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
1）配制三聚氰胺校準(zhǔn)品，包括：校準(zhǔn)品緩沖液的配制：稱取5g Tris堿、9g氯化鈉（NaCl）、0.6g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入5g兔血清白蛋白，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；將三聚氰胺純品粉末用校準(zhǔn)品緩沖液溶解，配制成為1μg/ml的濃溶液，隨后依次稀釋出5個濃度，分別為：10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml；加上0點(diǎn)，共6個濃度的校準(zhǔn)品梯度值；
2）將三聚氰胺連接到羧基磁珠上制備連接物，用磁珠緩沖液稀釋連接物到一定濃度，制備出連接物試劑，包括：準(zhǔn)確稱取三聚氰胺5mg，溶解于純水中，終濃度為2.5mg/ml，得到三聚氰胺溶液；配制pH值7.0的25mmol/L的磷酸鹽緩沖液：稱取NaH2PO4·H2O 1.5g、Na2HPO4·2H2O 2.5g、氯化鈉（NaCl）3g，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉或碳酸氫鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.0±0.1，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.0±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；配制5mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC），用二甲基亞砜（DMSO）溶解；往三聚氰胺溶液中加入80μL的5mg/ml的磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC）進(jìn)行活化，20～22℃反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；量取10mg羧基磁珠，將羧基磁珠放置于磁架上靜置2分鐘，移除上清，用pH＝7.0的25mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三次后加入磷酸鹽緩沖液保存，使磁珠濃度為20mg/ml；將活化后的三聚氰胺溶液加入清洗后的羧基磁珠中，并將反應(yīng)液中磁珠濃度調(diào)整為5mg/ml，20～22℃反應(yīng)35分鐘，反應(yīng)過程中充分混勻；配制磁珠緩沖液：稱取12g Tris堿、9g氯化鈉（NaCl）、0.5ml吐溫-20、1g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入1g干酪素鈉，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；反應(yīng)完成后移除上清，用25mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌三次后加入1ml磁珠緩沖液進(jìn)行保存；使用時用磁珠緩沖液稀釋成濃度為0.03mg/ml的工作液；
3）用酶標(biāo)記三聚氰胺結(jié)合蛋白，制備酶結(jié)合物，包括：取堿性磷酸酶1.0mg，將濃度調(diào)整為6mg/ml；稱取5mg磺基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-1-羧環(huán)己烷（SMCC），用二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行溶解，終濃度為15mg/ml，加入5μL至堿性磷酸酶中，20～22℃反應(yīng)15分鐘；用分子篩層析法根據(jù)分子量的差別對反應(yīng)混合物進(jìn)行純化，收集活化后的堿性磷酸酶溶液；取純品三聚氰胺結(jié)合蛋白0.5mg，加入活化后的堿性磷酸酶緩沖液中，2～8℃反應(yīng)4小時，最后用分子篩層析法將酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白提純出來；酶結(jié)合物緩沖液配制：稱取12g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、9g氯化鈉（NaCl）、6g甘油、0.6g Proclin-300，加入900ml純化水，用2mol/L檸檬酸鈉將pH值調(diào)節(jié)至7.2±0.1；加入10g兔血清白蛋白，定容至1000ml后復(fù)測pH值，使之處于7.2±0.1，0.22μm過濾后于2～8℃保存；將結(jié)合物用酶結(jié)合物緩沖液稀釋至酶標(biāo)記的三聚氰胺結(jié)合蛋白濃度為2μg/ml即為工作液；
4）配制化學(xué)發(fā)光底物，包括：準(zhǔn)確稱取3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽（AMPPD）0.5g、三羥甲基氨基甲烷（Tris）18g、氯化鈉（NaCl）100g、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）0.02g，純化水定容至1000ml，調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物溶液pH值為9.4±0.05；本化學(xué)發(fā)光底物為針對堿性磷酸酶的環(huán)二氧乙烷類底物，需要在2～8℃條件下避光保存，用時緩慢混勻；
5）配制清洗液，包括：稱取1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）、8.5g氯化鈉（NaCl）、1g吐溫-20，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用2mol/L檸檬酸鈉溶液調(diào)整溶液pH值到7.8±0.1，補(bǔ)加純化水定容至1000ml，過濾后混勻待用；
6）分裝以上各試劑，組成成品。
利用所述的食品中三聚氰胺的檢測試劑盒進(jìn)行檢測的方法，步驟為：
（1）向平底試管中加入50μL樣本或者校準(zhǔn)品；
（2）向平底試管中加入50μL磁分離試劑；
（3）向平底試管中加入40μL三聚氰胺BP堿性磷酸酶結(jié)合物；
（4）將平底試管放置在渦旋混勻儀上混勻30秒，然后置于37℃反應(yīng)20分鐘；
（5）將平底試管放置在磁架上靜置2分鐘后倒掉上清，拍干，加入清洗液500μL，混勻20秒；
（6）重復(fù)步驟（5）兩次；
（7）將拍干的平底試管放入免疫分析儀中進(jìn)行檢測。
檢測結(jié)果的判斷：將所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品發(fā)光強(qiáng)度值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的發(fā)光強(qiáng)度值再乘以100，以抑制率為縱坐標(biāo)，三聚氰胺濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
相對發(fā)光強(qiáng)度（%）=RLU/RLU0，RLU是標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品溶液測定的發(fā)光強(qiáng)度，RLU0是空白（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的發(fā)光強(qiáng)度值。
試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度
準(zhǔn)確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準(zhǔn)確度常用回收率表示。精密度又稱可重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。
按照樣品前處理方法，以1.0ng/ml、2.0ng/ml兩個濃度的三聚氰胺分別對牛奶、奶粉樣品進(jìn)行添加回收，每種樣品每個濃度測定5個平行，用三批試劑盒進(jìn)行測定，計(jì)算樣品的回收率及精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛奶樣品中三聚氰胺的添加回收率范圍在85.6～99.2%，奶粉樣品中三聚氰胺的添加回收率范圍在84.3～92.8%。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。
試劑盒的特異性
以三聚氰胺作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)三聚氰胺的交叉反應(yīng)率為100%，用于抗體交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與三聚氰胺結(jié)構(gòu)或者功能相似的藥物：三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺。按試劑盒步驟操作，但加入的競爭物分別為不同的三聚氰胺類似物，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計(jì)算各競爭物50%抑制濃度（IC50）。交叉反應(yīng)率（%CR）即為抗體對三聚氰胺的IC50與抗體對三聚氰胺競爭物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，各三聚氰胺類似物的交叉反應(yīng)率均＜1%，說明該試劑盒具有良好的特異性。
本發(fā)明通過三聚氰胺與固相載體直接穩(wěn)定連接的方法，既可保證與固相載體連接的穩(wěn)定性、又能保證三聚氰胺分子得到充分暴露，同時還通過引入磁性微粒擴(kuò)大有效反應(yīng)面積，建立了靈敏度更高、反應(yīng)時間更短的三聚氰胺化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，該試劑盒可適用于各種發(fā)光檢測儀器。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個實(shí)施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。