專利名稱：一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定的方法及裝置，屬于食品分析領域。本發(fā)明還可以與多種流動注射分析系統(tǒng)聯(lián)用，用于各種乳制品中三聚氰胺含量的快速、 準確、自動測定。
背景技術：
三聚氰胺是一種白色無味氮雜環(huán)有機化合物，其含氮量為66.7%，約為蛋白質的 4倍，由于目前乳制品中蛋白質的檢測方法一凱氏定氮法(J. Dairy Sci., 1978，61(7): 870-873)無法區(qū)分蛋白氮和非蛋白氮，因此一些不法商人將三聚氰胺添加進乳制品以提高乳制品的表觀蛋白質含量。三聚氰胺進入人體后會逐步水解，生成三聚氰酸，三聚氰胺再與三聚氰酸結合形成氰尿酸三聚氰胺，從而引起泌尿系統(tǒng)結石，危害身體健康。2007年4月發(fā)生在美國的“寵物食品事件”(WHO Expert Meeting Report, 2008)，以及2008年9月發(fā)生在中國的“三聚氰胺牛奶事件”(WHO Expert Meeting Report, 2008)就是因為食品中被非法添加了三聚氰胺所造成。因此，目前對乳制品中三聚氰胺含量的快速監(jiān)測就具有很重要的社會意義。乳制品中三聚氰胺的測定方法，主要有高效液相色譜法(J. Agr. Food Chem., 2000，48(8): 3353-3；358)、液相色譜-質譜法(Anal. Chim. Acta, 2005, 530(2) 237-243)、氣相色譜-質譜法(Biomed. Environ. Sci. , 2009，22(2) 87-94)、毛細管電泳法(J. Agr. Food Chem. , 2009，57(3) 807-811)、紅外光譜法(J. Agr. Food Chem., 2009，57(10) 3974-3980)、核磁共振光譜法(J. Agr. Food Chem. , 2009，57(16) 7194-7199)等。液相色譜法為目前日常使用的方法，其靈敏度較高，最低檢出限在0. 05-2. Omg Γ1 的范圍，但其分析成本高、樣品前處理過程復雜且重現(xiàn)性差，而且每小時僅能分析2 3樣； 毛細管電泳法分析成本低，環(huán)保，最低檢出限為0.5 mg L—1，但其分析速度也很慢，每小時僅能分析兩個樣；近紅外光譜法和核磁共振光譜法的分析速度有所提高，每小時可以處理 4飛樣，但其靈敏度低，最低檢出限為1 mg L—1。限制上述方法分析速度的關鍵問題是，樣品的預處理過程和檢測過程均由手工分別獨立進行，操作過程繁瑣，自動化程度低，無法適用于大批量乳制品樣品的快速篩查和分析。2008年，我國頒發(fā)了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三種測定方法 (GB/T 22388-2008)，即，高效液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法和氣相色譜_質譜聯(lián)用法。三種方法除聯(lián)用的檢測器不同外，樣品的預處理及測定過程大體相同。三種方法具體的樣品預處理及測定操作過程如下乳液樣品蛋白質沉淀后，取其上清液5mL，加入5mL水混合均勻，讓該混合液自然流過一根混合型陽離子交換固相萃取柱，待混合液全部流出后，再依次用3mL水和3mL甲醇清洗萃取柱；當萃取柱中的清洗液體完全流出后，再用6mL氨化甲醇溶液(5. 096，ν/ν)洗脫；洗脫液于50°C下用氮氣吹干，殘留物(相當于0.4 g樣品)用ImL 液相色譜的流動相定容，渦旋混合lmin，微孔濾膜過濾后，用于液相色譜檢測。液相色譜法的檢出限為ang L—1，相對標準偏差小于10%。當用氣相色譜-質譜法檢測時，氮氣吹干得到的殘留物需先進行衍生化后再進行測定。其操作過程為取氮氣吹干殘留物，加入600 μ L的吡啶和200 μ L衍生化試劑，混勻，70°C反應30 min后，供氣相色譜-質譜法檢測；氣相色譜-質譜法的檢出限為0.05 mg L—1，相對標準偏差小于10%。上述方法存在以下缺點1).樣品預處理過程與檢測過程均由手工操作，其過程繁瑣、自動化程度低，人為誤差大，重現(xiàn)性差(RSD<10%)，不能適用于大量樣品的快速分析； 2).混合型陽離子交換固相萃取柱的清洗和洗脫過程中有機試劑耗量大，不但危害分析工作者的身體健康，同時也增大了環(huán)境污染；3).樣品預處理過程與檢測過程耗時長，分析速度慢，僅為2 3樣/h，不適用于大批量乳制品樣品的快速分析；4).流出萃取柱的洗脫液無法直接測定，需先經(jīng)過烘干處理后再溶解，這不但造成有機溶劑揮發(fā)污染環(huán)境，同時也增長了樣品的前處理時間，影響了整體的分析速度；5).固相萃取柱均為一次性使用，這不但大幅度增加了測定成本(萃取柱價格10-15元/支)、廢品處理成本及資源浪費，而且也增大了前處理的誤差來源，最終影響了分析方法的準確度和精密度；6).樣品富集與樣品洗脫的液體流向只能為同一方向，使洗脫液流經(jīng)萃取柱、洗脫三聚氰胺的時間增長，使?jié)饪s的三聚氰胺又被稀釋，最終導致離子交換效率降低、測定靈敏度降低。另外，美國專利(US 2011/0008809 Al)公開了一種酶催化分光光度法測定食品中三聚氰胺的方法。方法的核心是利用三聚氰胺脫氨酶(melamine deaminase, MDA)催化三聚氰胺分解為三聚氰酸二酰胺和氨氣，釋放出的氨氣用Berthelot顯色反應測定，根據(jù)顏色的深淺間接定量樣品中的三聚氰胺。其具體操作過程是取蛋白質沉淀后的乳制品上清液30mL流過陽離子交換固相萃取柱，再用2mL乙腈和0. 5%(ν/ν)冰乙酸混合液、2mL 0. 5%(ν/ν)冰乙酸、2mL甲醇依次清洗，用0. 6mL 3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉(Na-MOPS)的甲醇液(0. 09g mL—1)和0. 6mL甲醇依次洗脫，洗脫液烘干后剩余物質用0. 6mL超純水溶解，作為待測液；分別取待測液0. 2mL與反應容器中，并加入500mg Γ1 MDA溶液0. 02mL，在室溫下反應10-15min，再加入顯色劑顯色，在630nm處測定產(chǎn)物的吸光度值。但是，該方法的缺點是1)樣品仍需進行陽離子交換固相萃取前處理，且為手工操作，過程繁瑣且誤差大；2) — 次前處理時間為40min，酶催化反應時間為10-15min，顯色反應時間為30min，因此分析耗時太長(SOmin/樣)，無法實現(xiàn)批量樣品的快速測定；3)柱清洗液中含有乙酸，會在清洗液中將萃取柱中部分三聚氰胺洗脫丟失；此外，Na+的離子交換能力小于-NH3+,所以Na-MOPS 洗脫液洗脫的三聚氰胺量較少，這些都會降低測定靈敏度；4)所用酶試劑價格昂貴，分析成本增高，不利于方法的推廣應用。目前，國內針對乳制品中三聚氰胺測定的預處理過程的專利有兩個(CN 201331461; CN 101776664)。兩者的核心技術均是膜萃??；一個采用了半透膜萃取，另一個為中空纖維膜萃取，兩套裝置設計基本相同；前者的待測液處于萃取膜管內，懸空于樣品瓶中間，瓶內為待萃取的原樣，三聚氰胺分子量較小，可通過半透膜進入膜內的待測液中；后者的三聚氰胺通過中空纖維膜孔內的有機相進入膜另一側水相，實現(xiàn)對樣品中三聚氰胺的萃??；萃取后抽取膜內待測液進行下一步測定。但是這兩種方法的不足之處是1)預處理過程仍為手工操作；2)除三聚氰胺外，樣品中仍有一些有機物雜質通過萃取膜進入待測液
6中，無法達到對三聚氰胺高選擇性萃取的目的；3)樣品用量大；4)膜萃取時間長(140min/ 樣)，分析速度慢；5)萃取過程中使用的正辛醇、甲苯等溶劑毒性大，危害健康和環(huán)境。此外，還有一種與HPLC聯(lián)用測定乳制品中三聚氰胺含量的自動在線柱微萃取系統(tǒng)(Food Anal. Methods, 2010)。該預處理系統(tǒng)由兩個六通閥、兩個泵、一個毛細管聚合物整體柱及色譜分離檢測系統(tǒng)組成。聚合物整體柱連接于閥B的采樣環(huán)上，樣品由注射器注入采樣環(huán)，同時載流(0. 1%冰乙酸，ν/ν)在泵A的作用下流經(jīng)閥A和閥B的采樣環(huán)；流動相在泵B的作用下流經(jīng)閥B、色譜柱、檢測器，給出基線信號；當閥A的采樣環(huán)充滿樣品并切換至注入位，樣品被載流推動進入閥B的采樣環(huán)；在此過程中三聚氰胺通過離子交換吸附在整體柱上；閥B切換至注入位，流動相流過萃取柱，其中NH4+將柱中的三聚氰胺交換下來，并被流動相帶入色譜柱進行分離、檢測。此方法缺點是1)分析速度慢，僅為2樣h—1; 2)萃取過程流量太小(0. ImL mirT1)，使得三聚氰胺萃取的同時大量有機雜質也吸附于萃取柱內，不能達到高度選擇性提取三聚氰胺的目的；3)洗脫流量也太低(0. ImL mirT1)，導致萃取柱內大量有機雜質被洗脫進入色譜柱，這不僅影響測定結果，也影響色譜柱的使用壽命; 4)閥B采樣時流動相流量瞬間變化大，會引起測定系統(tǒng)穩(wěn)定性變差、色譜系統(tǒng)壓力波動， 影響儀器及色譜柱的壽命；5)洗脫液為酸性環(huán)境(流動相pH 2. 5)，且洗脫流量僅為0. ImL mirT1，因此，洗脫過程中被交換下來的三聚氰胺陽離子還會再次交換在萃取柱上，導致洗脫效果變差；6)無法實現(xiàn)多柱并聯(lián)使用，實現(xiàn)加快分析速度；7)萃取速度慢，洗脫液中雜質較多，因此難以同色譜以外的測定系統(tǒng)聯(lián)用，應用范圍窄。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法及及實現(xiàn)該方法的裝置，解決現(xiàn)階段技術存在的問題，實現(xiàn)前處理操作及測定過程的自動化，簡化操作，減少試劑用量，利于環(huán)境保護，提高分析速度、精密度和準確度。本發(fā)明的技術方案是由測定方法和測定裝置組成。本發(fā)明的測定原理三聚氰胺(C3N3- (NH2) 3)為弱堿性化合物，在酸性環(huán)境 (pH<7. 0)下三聚氰胺分子中的三個-NH2RK*- NH3+,即三聚氰胺是以陽離子的形式存在 (C3N3-(NH3+)3)，所以通過離子交換反應能有效地實現(xiàn)樣品中三聚氰胺的富集；因此，本發(fā)明選擇了帶有離子交換功能的磺酸基團(R-SO3-H)的混合型陽離子交換固相萃取劑作為萃取柱的填料。測定時，先用氨化甲醇溶液(NH4+)將萃取柱中填料上的R-S03_H變?yōu)镽-SO3-NH4, 當乳液樣品流過萃取柱時，樣品中的(MV)3-C3N3與萃取柱中填料上的R-SO3-NH4進行交換，形成R-SO3_( NH3+)3-C3N3，而吸附在萃取柱上；同時，由于乳液樣品還含一些有機成分， 在樣品富集過程中，也會通過范德華力吸附在萃取柱的基質上而留在柱中，乳液樣品中其它未交換的物質則直接流出萃取柱；當清洗液流過萃取柱時，靠范德華力吸附的一部分有機雜質被甲醇溶解排除萃取柱外，而離子交換的三聚氰胺仍然留在萃取柱中；當洗脫液流過萃取柱時，其中的NH4+與柱中的R-S03_(M^)3-C3N3再進行離子交換，將(M^)3-C3N3交換下來；(NH3+) 3-C3N3在堿性洗脫液環(huán)境下轉化為中性的C3N3- (NH2) 3,并溶解在甲醇中，且此時的三聚氰胺分子無法再次交換在萃取柱上，保證了離子交換的徹底性。交換下來的三聚氰胺以“濃縮樣品塞”的形式隨洗脫液一同流出萃取柱，直接進入裝置單元(B)中的采樣環(huán)進行分離、檢測。裝置單元(B)中的液相色譜測定的酸度條件為pH 3.0，三聚氰胺再變成(NH3+) 3-C#3，并與流動相中庚烷磺酸鈉通過靜電結合(-NH3+與-SO3-)形成非極性離子化合物，在反相色譜柱中得到很好的保留和分離；液相色譜的響應信號與“濃縮樣品塞”中三聚氰胺的濃度相關，因此，在一定的預處理及測定條件下，液相色譜的響應信號與乳液樣品中三聚氰胺濃度成線性關系，根據(jù)此響應信號，可得到乳液樣品中三聚氰胺的濃度。裝置單元 (A)重復上述程序，可進行下一個樣品的預處理。本發(fā)明的測定過程當裝置單元(A)開始運作時，第一步，泵A轉動，泵B停止，多功能閥處于位置I，第一個乳液樣品在泵A的動力作用下，通過樣品入口管、樣品泵管、樣品出口管、進入三通連接器，又經(jīng)三通出口管、多功能閥的第四連接管、進入萃取柱2，樣品中的三聚氰胺與萃取柱2中填料上的陽離子交換基團發(fā)生離子交換，未交換的物質經(jīng)第五連接管、多功能閥的第二排廢管排出，萃取柱2在此狀態(tài)經(jīng)過一定時間對乳液樣品中三聚氰胺進行富集；與此同時，洗脫液在泵A的動力作用下，通過洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管、多功能閥的第六連接管，進入萃取柱1，對萃取柱1進行再生，然后經(jīng)多功能閥的第三連接管、第二連接管、第一連接管、過濾器、第七連接管，流入裝置單元(B)中采樣閥的采樣定量環(huán)，最后從第三排廢口排出，萃取柱1處于填料的再生狀態(tài)；第二步，泵A停止，泵 B轉動，多功能閥仍處于位置I，柱清洗液在泵B的動力作用下，通過清洗液入口管、清洗液泵管、清洗液出口管、進入三通連接器，又經(jīng)三通出口管、多功能閥的第四連接管、進入萃取柱2，將殘留在萃取柱內、未能交換的其他水溶性或脂溶性雜質洗出，然后經(jīng)第五連接管、多功能閥的第二排廢口排出，萃取柱2處于填料的清洗狀態(tài)；萃取柱1仍處于再生狀態(tài)；第三步，泵A轉動，泵B停止，多功能閥切換至位置II，洗脫液在泵A的動力作用下通過洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管、多功能閥的第五連接管，進入萃取柱2，洗脫液中的陽離子與萃取柱2內填料上吸附的三聚氰胺發(fā)生離子交換，在填料再生的同時、將三聚氰胺洗脫下來，并以“濃縮樣品塞”的形式隨洗脫液從第四連接管流出，然后，經(jīng)多功能閥的第一連接管、過濾器、第七連接管，流入采樣閥的采樣定量環(huán)，進行樣品體積的定量，最后從第三排廢口排出，萃取柱2處于三聚氰胺洗脫、填料再生的狀態(tài)；與此同時，第二個乳液樣品在泵A的動力作用下，通過樣品入口管、樣品流泵管、樣品出口管、進入三通連接器，又經(jīng)三通出口管、多功能閥的第三連接管、進入萃取柱1，樣品中的三聚氰胺在萃取柱1中發(fā)生離子交換，未交換的物質經(jīng)第六連接管、多功能閥的第一排廢管排出，萃取柱1在此狀態(tài)經(jīng)過一定時間對第二個乳液中三聚氰胺進行富集；在此過程中，泵C連續(xù)轉動，采樣閥處于采樣位置，流動相在泵C的作用下經(jīng)流動相入閥管、采樣閥、色譜柱入口連接管、進入色譜柱，又經(jīng)色譜柱出口連接管流過流通式光學檢測器，最后由第四排廢口流出，響應信號給出一個穩(wěn)定的基線；當分別從兩支萃取柱流出的洗脫液中的三聚氰胺“濃縮樣品塞”正好處于裝置單元⑶的采樣環(huán)內時，采樣閥切換至注入位置，流動相將注入的“樣品塞”推進色譜柱，進行進一步分離，然后進入流通式光學檢測器檢測吸光度值，最后從第四排廢管流出；實測曲線由計算機根據(jù)儲存的線性方程進行處理并輸出測定結果；計算機同時根據(jù)程序自動控制閥與泵的轉動。本發(fā)明的測定裝置它由裝置單元(A)和裝置單元(B)組成。裝置單元(A)由泵 A、泵B、洗脫液、乳液樣品、柱清洗液、洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管、樣品入口管、樣品泵管、樣品出口管、清洗液入口管、清洗液泵管、清洗液出口管、三通連接器、三通出口管、多功能閥、第一連接管、第二連接管、過濾器、第一排廢口、第二排廢口、第三連接管、第四連接管、萃取柱1、萃取柱2、第五連接管、第六連接管、第七連接管構成。裝置單元(B) 由流動相、流動相入閥管、泵C、采樣閥、采樣定量環(huán)、第三排廢口、色譜柱入口連接管、色譜柱、色譜柱出口連接管、流通式光學檢測器、計算機、第四排廢管組成(如圖1)。在本發(fā)明中，萃取柱1的樣品富集流路，由樣品入口管、樣品泵管、樣品出口管、三通連接器、三通出口管、多功能閥、第三連接管、萃取柱1、第六連接管、第一排廢口連接而成。萃取柱1清洗流路，由清洗液入口管、清洗液泵管、清洗液出口管、三通連接器三通出口連接管、多功能閥、第三連接管、萃取柱1、第六連接管、多功能閥、第一排廢口連接而成。萃取柱1洗脫流路，由洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管、多功能閥、第六連接管、萃取柱1、第三連接管連接而成，其出口通過多功能閥的第二連接管、第一連接管、過濾器、第七連接管、采樣閥的采樣定量環(huán)連接。萃取柱2的樣品富集流路，由樣品入口管、樣品泵管、 樣品出口管、三通連接器、三通出口管、多功能閥、第四連接管、萃取柱2、第五連接管、多功能閥的第二排廢口連接而成。萃取柱2的清洗流路，由清洗液入口管、清洗液泵管、清洗液出口管、三通連接器三通出口連接管、多功能閥、第四連接管、萃取柱2、第五連接管、多功能閥的第二排廢口連接而成。萃取柱2的洗脫流路，由洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管、多功能閥、第五連接管、萃取柱2、第四連接管連接而成，其出口通過多功能閥的第一連接管、過濾器、第七連接管、與采樣閥的采樣定量環(huán)連接。流動相流路由流動相入閥管、 采樣閥、色譜柱入口連接管、色譜柱、色譜柱出口連接管、流通式光學檢測器、第四排廢口連接。實測結果由計算機處理。本發(fā)明中的多功能閥、采樣閥、泵A、泵B、泵C的轉動或停止， 用計算機控制。本發(fā)明各組成部分結構特征如下
本發(fā)明中雙萃取柱的富集、清洗、洗脫過程都在計算機的控制下連續(xù)、自動、交替進行。 萃取柱的長度為3(Tl00mm、內徑為2 5mm，填料粒徑為2(Γ60 μ m,質量為3(Tl00mg。兩支萃取柱的樣品富集與樣品洗脫的流向相反，可以增強洗脫液與萃取柱內填料上三聚氰胺的交換能力，提高測定的靈敏度；萃取柱中的填料是具有陽離子交換作用的各種固相混合型陽離子交換萃取劑等。本發(fā)明的柱清洗液用于清洗乳液樣品中除三聚氰胺外的其他水溶性和脂溶性物質，由甲醇與超純水的混合液構成；其流量為0. 5^2. 5mL mirT1。本發(fā)明的洗脫液用于洗脫吸附在萃取柱內填料上的三聚氰胺，由廣10%(v/v)的氨化甲醇構成，其流量為0. 5^5mL mirT1 ；洗脫液經(jīng)洗脫液入口管、洗脫液泵管、洗脫液出口管流入多功能閥，然后分別通過第六連接管和第五連接管進入萃取柱1和萃取柱2，其中的陽離子與萃取柱中吸附的三聚氰胺發(fā)生離子交換，交換下來的三聚氰胺以“濃縮樣品塞”形式隨洗脫液流出，直接進入采樣閥的采樣定量環(huán)內，進行定量、注入、分離和檢測；此“濃縮樣品塞”可直接進入色譜系統(tǒng)、流動注射分析系統(tǒng)的采樣定量環(huán)內；流出萃取柱的洗脫液無需再烘干、再溶解等步驟。本發(fā)明的第二連接管除去，將與第二連接管對接的多功能閥的兩端用實心連接螺絲堵上，第三連接管和萃取柱1除去，將第六連接管對接萃取柱1的一端插入洗脫液，可形成一種單支萃取柱的連續(xù)自動前處理系統(tǒng)；同理，將對應于萃取柱2的相關流路除去，也可形成另一種單支萃取柱的連續(xù)自動前處理系統(tǒng)。本發(fā)明的裝置單元(A)可與各種液相或氣相色譜儀直接聯(lián)用；也可用反應盤管替代色譜柱，載流替代流動相，添加適當?shù)脑噭┝髀?，將裝置單元(B)變成流動注射分光光度系統(tǒng)或流動注射熒光光度系統(tǒng)后再聯(lián)用。本發(fā)明的連接系統(tǒng)的管路材質是聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料細管，各種連接管的內徑在0. 5^1. 5mm范圍；采樣定量環(huán)的體積為2(Γ200 μ L，乳液樣品的流量為0. 5^2. 0 mL HiirT1 ；使用的泵可以是多個多通道或多個單通道蠕動泵、多個柱塞泵或其他流體動力裝置。本發(fā)明的三聚氰胺測定范圍為0. 5 50 mg L—1，線性相關系數(shù)(r) >0. 9990 ；相對標準偏差(RSD)小于3. 88% (n=ll)；分析速度30樣h-1左右。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是樣品富集、萃取柱清洗、樣品洗脫以及三聚氰胺“濃縮樣品塞”的測定都能連續(xù)、自動、交替進行，裝置操作簡便、測定速度快、重現(xiàn)性好，靈敏度高。本發(fā)明的特點是
a)在計算機控制下雙萃取柱連續(xù)自動交替進行樣品富集、柱清洗、樣品洗脫的過程。用本發(fā)明對樣品前處理，其結果是誤差小、RSD (<3. 88%)優(yōu)于國標法給定值(<10%)。b)清洗液和洗脫液的用量少。清洗液用量從國標法的6mL次―1降低至0. 5mL 次―1;洗脫液用量從國標法的6mL次―1降低至0.75mL次―1。這不但降低了對分析人員身體危害，同時也減少了對環(huán)境的污染。c)本發(fā)明分析速度快。樣品處理和測定速度從國標法的2-3樣IT1提高至30樣 IT1左右。能適用于大批量乳制品樣品的快速篩查和分析。d)本發(fā)明中洗脫液用量僅為0. 75mL次―1，甲醇用量僅為0. 7mL次―1，洗脫液中的雜質極小，用液相色譜測定時，不會影響測定結果。e)從萃取柱中流出的洗脫液攜帶三聚氰胺的“濃縮樣品塞”可直接進入檢測系統(tǒng)的采樣定量環(huán)內，進行定量、注入、分離和檢測，無需烘干和再溶解步驟。這不但避免了有機溶劑揮發(fā)污染環(huán)境的問題，同時也縮短了樣品的前處理時間，提高了整體的分析速度。f)實現(xiàn)了萃取柱在流路系統(tǒng)的重復使用。這不但大幅度降低了測定成本、廢品處理成本、資源浪費，而且也減少了前處理的誤差來源，提高了方法的重現(xiàn)性和最終結果的準確度。g)樣品富集與樣品洗脫的流向在萃取柱相反，使三聚氰胺洗脫率提高。洗脫液以樣品富集的相反方向流入萃取柱時，很容易將富集于萃取柱入口附近的高濃度三聚氰胺快速洗脫出來；洗脫時間的縮短可降低“濃縮試樣塞”中三聚氰胺再次被稀釋的程度，最終導致離子交換效率和測定靈敏度的提高。h)本發(fā)明的流路系統(tǒng)簡單、易于操作、易于裝配、可靠性高，萃取柱使用壽命長。i)本發(fā)明的裝置單元(A)可單獨作為一種乳液中三聚氰胺測定的自動前處理裝置使用，也可以直接與液相色譜儀、氣相色譜儀、流動注射分光光度計、流動注射熒光光度計聯(lián)用。本發(fā)明適用于乳制品中三聚氰胺含量的快速自動測定；所涉及的科學領域有化學儀表、分析化學等多種學科，是交叉學科的綜合研究成果，具有很重要的使用意義和社會價值。


圖1.乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置示意圖中1泵A、2泵B、3洗脫液、4乳液樣品、5柱清洗液、6a洗脫液入口管、6洗脫液泵管、 6b洗脫液出口管、7a樣品入口管、7樣品泵管、7b樣品出口管、8a清洗液入口管、8清洗液泵管、汕清洗液出口管、9三通連接器、10三通出口管、11多功能閥、12第一連接管、13第二連接管、14過濾器、15第一排廢口、16第二排廢口、17第三連接管、18第四連接管、19萃取柱 1、20萃取柱2、21第五連接管、22第六連接管、23第七連接管構成；裝置單元(B)由M流動相、25流動相入閥管、沈泵C、27采樣閥、觀采樣定量環(huán)、四第三排廢口、30色譜柱入口連接管、31色譜柱、32色譜柱出口連接管、33流通式光學檢測器、34計算機、35第四排廢口。
圖2實施例1三聚氰胺的標準曲線圖3實施例2樣品流量對靈敏度影響的曲線圖4實施例3樣品體積對靈敏度影響的曲線圖5實施例4清洗液用量對靈敏度影響的曲線圖6實施例5清洗液流量對靈敏度影響的曲線圖7實施例6洗脫液流量對靈敏度影響的曲線圖8實施例7洗脫液中氨水的濃度對靈敏度影響的曲線圖。
具體實施例方式結合附圖對本發(fā)明的實施方式作進一步描述 實施例1
本實施例是分別用不同濃度的三聚氰胺標準溶液考察本發(fā)明的濃縮效果。自動前處理系統(tǒng)的實驗條件柱清洗液(5)為超純水與甲醇(1+1)的混合液，其流量為1. 05mL mirT1， 用量為2. 5mL ；乳液樣品(4)體積為6 mL，其流量為1. 2mL mirT1 ；洗脫液(3)為7. 0%(ν/ν) 氨化甲醇溶液，其流量為1. 48mL mirT1，洗脫時間為30s ；萃取柱2(20)的長度為40mm、內徑為3mm，填料粒徑為45 μ m，質量為60mg;第一連接管(12)使用了長25 cm，內徑0. 8 mm的聚四氟乙烯管；三通出口管(10)、第一連接管(12)、第四連接管(18)、第五連接管(21)和第七連接管(23)的長度分別為25、25、20、13和25 cm,內徑均為0. 8 mm ；液相色譜系統(tǒng)的實驗條件流動相(24)為乙腈-庚烷磺酸鈉/檸檬酸緩沖液(體積比15 + 85)，其流量為0.8 mL mirT1 ；采樣定量環(huán)(28)的體積為60 μ L ；流通式光學檢測器(30)的檢測波長為237nm ； 色譜柱(31)為C8 (5ym，4.6X150 mm)。將本發(fā)明(見圖1)的裝置單元㈧連接成單萃取柱連續(xù)自動前處理系統(tǒng)，用相同的三聚氰胺標液作為測試樣品(濃度范圍0. 5 50 mg 廠1)。首先，用手工直接將三聚氰胺標液注入液相色譜系統(tǒng)，得到一系列吸光度值；然后，再通過裝置單元(A)將三聚氰胺標液富集預處理后自動注入液相色譜系統(tǒng)，得到另一系列的吸光度值；結果見圖2?？梢钥闯?，用本發(fā)明測定得到的三聚氰胺標準曲線斜率要高于手工直接注入法，本發(fā)明的靈敏度高于手工法，即本發(fā)明的確實現(xiàn)了三聚氰胺標液的自動預處理。實施例2
本實施例對本發(fā)明的重現(xiàn)性、含三聚氰胺的四種乳制品以及加標回收率進行了測定。 重現(xiàn)性(H=Il)的測定結果見表1，加標回收率結果見表2。根據(jù)表1數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明
11測定結果的RSD<3. 88%，即精度遠高于國標的給定值(RSD<10. 0%)。根據(jù)表2數(shù)據(jù)可以看出， 本發(fā)明的加標回收率在95. 4-108. 1%之間，結果令人滿意?？梢姳景l(fā)明能完全滿足乳制品中三聚氰胺含量測定的前處理及快速測定要求。
權利要求
1.一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法，其特征在于當裝置單元(A)開始運作時，第一步，泵A (1)轉動，泵B (2)停止，多功能閥(11)處于位置I，第一個乳液樣品(4)在泵A(I)的動力作用下，通過樣品入口管(7a)、樣品泵管(7)、樣品出口管(7b)、進入三通連接器(9)，又經(jīng)三通出口管(10)、多功能閥(11)的第四連接管(18)、進入萃取柱2(20)， 樣品中(4)的三聚氰胺與萃取柱2 (20)中填料上的陽離子交換基團發(fā)生離子交換，未交換的物質經(jīng)第五連接管(21)、多功能閥(11)的第二排廢管(16)排出，萃取柱2 (20)在此狀態(tài)經(jīng)過一定時間對乳液樣品中三聚氰胺進行富集；與此同時，洗脫液(3)在泵A (1)的動力作用下，通過洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管(6)、洗脫液出口管(6b)、多功能閥(11)的第六連接管(22)，進入萃取柱1 (19)，對萃取柱1 (19)進行再生，然后經(jīng)多功能閥(11)的第三連接管(17)、第二連接管(13)、第一連接管(12)、過濾器(14)、第七連接管(23)，流入裝置單元(B)中采樣閥(27)的采樣定量環(huán)(28)，最后從第三排廢口(29)排出，萃取柱1 (19) 處于填料的再生狀態(tài)；第二步，泵A (1)停止，泵B (2)轉動，多功能閥(11)仍處于位置I， 柱清洗液(5 )在泵B (2 )的動力作用下，通過清洗液入口管(8a)、清洗液泵管(8 )、清洗液出口管(Sb)、進入三通連接器(9)，又經(jīng)三通出口管(10)、多功能閥(11)的第四連接管(18)、 進入萃取柱2(20)，將殘留在萃取柱內、未能交換的其他水溶性或脂溶性雜質洗出，然后經(jīng)第五連接管(21)、多功能閥(11)的第二排廢口(16)排出，萃取柱2 (20)處于填料的清洗狀態(tài)；萃取柱1 (19)仍處于再生狀態(tài)；第三步，泵A (1)轉動，泵B (2)停止，多功能閥(11) 切換至位置II，洗脫液(3)在泵A (1)的動力作用下通過洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管 (6)、洗脫液出口管(6b)、多功能閥(11)的第五連接管(21)，進入萃取柱2 (20)，洗脫液(3) 中的陽離子與萃取柱2 (20)內填料上吸附的三聚氰胺發(fā)生離子交換，在填料再生的同時、 將三聚氰胺洗脫下來，并以“濃縮樣品塞”的形式隨洗脫液(3)從第四連接管(18)流出，然后，經(jīng)多功能閥(11)的第一連接管(12)、過濾器(14)、第七連接管(23)，流入采樣閥(27)的采樣定量環(huán)(28)，進行樣品體積的定量，最后從第三排廢口(29)排出，萃取柱2 (20)處于三聚氰胺洗脫、填料再生的狀態(tài)；與此同時，第二個乳液樣品(4)在泵A (1)的動力作用下， 通過樣品入口管(7a)、樣品流泵管(7)、樣品出口管(7b)、進入三通連接器(9)，又經(jīng)三通出口管(10)、多功能閥(11)的第三連接管(17)、進入萃取柱1 (19)，樣品中的三聚氰胺在萃取柱1 (19)中發(fā)生離子交換，未交換的物質經(jīng)第六連接管(22)、多功能閥(11)的第一排廢管(15)排出，萃取柱1 (19)在此狀態(tài)經(jīng)過一定時間對第二個乳液中三聚氰胺進行富集；在此過程中，泵C (26)連續(xù)轉動，采樣閥(27)處于采樣位置，流動相(24)在泵C (26)的作用下經(jīng)流動相入閥管(25)、采樣閥(27)、色譜柱入口連接管(30)、進入色譜柱(31)，又經(jīng)色譜柱出口連接管(32)流過流通式光學檢測器(33)，最后由第四排廢口(35)流出，響應信號給出一個穩(wěn)定的基線；當分別從兩支萃取柱(19，20)流出的洗脫液(3)中的三聚氰胺“濃縮樣品塞”正好處于裝置單元(B)的采樣環(huán)(28)內時，采樣閥(27)切換至注入位置，流動相(24)將注入的“樣品塞”推進色譜柱(31)，進行進一步分離，然后進入流通式光學檢測器 (33)檢測吸光度值，最后從第四排廢管(35)流出；實測曲線由計算機(34)根據(jù)儲存的線性方程進行處理并輸出測定結果；計算機(34)同時根據(jù)程序自動控制閥與泵的轉動。
2.一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置，其特征在于由裝置單元(A)和裝置單元(B)組成；裝置單元(A)由泵A (1)、泵B (2)、洗脫液(3)、乳液樣品(4)、柱清洗液(5)、洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管(6)、洗脫液出口管(6b)、樣品入口管(7a)、樣品泵管(7)、樣品出口管(7b)、清洗液入口管(8a)、清洗液泵管(8)、清洗液出口管(Sb)、三通連接器(9)、三通出口管(10)、多功能閥(11)、第一連接管(12)、第二連接管(13)、過濾器(14)、 第一排廢口(15)、第二排廢口(16)、第三連接管(17)、第四連接管(18)、萃取柱1(19)、萃取柱2 (20)、第五連接管(21)、第六連接管(22)、第七連接管(23)構成；裝置單元(B)由流動相(24)、流動相入閥管(25)、泵C (沈)、采樣閥(27)、采樣定量環(huán)(28)、第三排廢口(29)、色譜柱入口連接管(30)、色譜柱(31)、色譜柱出口連接管(32)、流通式光學檢測器(33)、計算機(34)、第四排廢管(35)組成；萃取柱1(19)的樣品富集流路由樣品入口管(7a)、樣品泵管 (7)、樣品出口管(7b)、三通連接器(9)、三通出口管(10)、多功能閥(11)、第三連接管(17)、 萃取柱1 (19)、第六連接管(22)、第一排廢口(15)連接而成；萃取柱1 (19)清洗流路由清洗液入口管(8a)、清洗液泵管(8)、清洗液出口管(Sb)、三通連接器(9)三通出口連接管 (10)、多功能閥(11)、第三連接管(17)、萃取柱1 (19)、第六連接管(22)、多功能閥(11)、第一排廢口(15)連接而成；萃取柱1 (19)洗脫流路由洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管(6)、洗脫液出口管(6b)、多功能閥(11)、第六連接管(22)、萃取柱1 (19)、第三連接管(17)連接而成，其出口通過多功能閥(11)的第二連接管(13)、第一連接管(12)、過濾器(14)、第七連接管(23)、采樣閥(27)的采樣定量環(huán)(28)連接；萃取柱2 (20)的樣品富集流路由樣品入口管 (7a)、樣品泵管(7)、樣品出口管(7b)、三通連接器(9)、三通出口管(10)、多功能閥(11)、第四連接管(18)、萃取柱2 (20)、第五連接管(21)、多功能閥(11)的第二排廢口(16)連接而成；萃取柱2(20)的清洗流路由清洗液入口管(8a)、清洗液泵管(8)、清洗液出口管(Sb)、三通連接器(9)三通出口連接管(10)、多功能閥(11)、第四連接管(18)、萃取柱2 (20)、第五連接管(21)、多功能閥(11)的第二排廢口(16)連接而成；萃取柱2 (20)的洗脫流路由洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管(6)、洗脫液出口管(6b)、多功能閥(11)、第五連接管(21)、萃取柱2 (20)、第四連接管(18)連接而成，其出口通過多功能閥(11)的第一連接管(12)、過濾器(14)、第七連接管(23)、與采樣閥(27)的采樣定量環(huán)(28)連接；流動相流路由流動相入閥管(25)、采樣閥(27)、色譜柱入口連接管(30)、色譜柱(31)、色譜柱出口連接管(32)、 流通式光學檢測器(33)、第四排廢口(35)連接；實測結果由計算機(34)處理；本發(fā)明中的多功能閥(11)、采樣閥(27)、泵A (1)、泵B (2)、泵C (26)的轉動或停止，用計算機(34)控制。
3.如權利要求1所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法，其特征在于 兩支萃取柱(19，20)的富集、清洗、洗脫過程都在計算機(34)的控制下連續(xù)、自動、交替進行；萃取柱(19，20)為混合型陽離子交換固相萃取柱，其長度為3(Tl00mm、內徑為2 5mm， 填料為鍵合有磺酸基團的極性高聚物聚苯乙烯/ 二乙烯苯基質，其粒徑為2(Γ60μπι，質量為3(Tl00mg ；兩支萃取柱(19，20)的樣品富集與樣品洗脫的流向相反，增強了洗脫液(3) 與萃取柱(19，20)上三聚氰胺的交換能力，增大了測定的靈敏度；萃取柱中的填料具有陽離子交換作用。
4.如權利要求1所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法，其特征在于 柱清洗液(5)用于清洗乳液樣品中除三聚氰胺外的其他水溶性和脂溶性物質，由超純水或甲醇與超純水的混合液構成；其流量為0. 5^2. 5mL mirT1 ；洗脫液(3)用于洗脫吸附在萃取柱(19，20)內填料上的三聚氰胺，由廣10%(v/v)氨化甲醇的構成，其流量為0.5飛mL mirT1 ；乳液樣品的流量為0. 5 2. 0 mL mirT1。
5.如權利要求2所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置，其特征在于 洗脫液(3)經(jīng)洗脫液入口管(6a)、洗脫液泵管(6)、洗脫液出口管(6b)流入多功能閥(11)， 然后分別通過第六連接管(22)和第五連接管(21)進入萃取柱1 (19)和萃取柱2 (20)， 其中的陽離子與萃取柱(19，20)中吸附的三聚氰胺發(fā)生離子交換，交換下來的三聚氰胺以 “濃縮樣品塞”形式隨洗脫液(3)流出，直接進入采樣閥(27)的采樣定量環(huán)(28)內，進行定量、注入、分離和檢測；此“濃縮的樣品塞”可直接進入液相色譜系統(tǒng)、或流動注射分析系統(tǒng)的采樣定量環(huán)(28)內；流出萃取柱(19，20)的洗脫液(3)無需烘干、再溶解等步驟，縮短了測定時間，節(jié)省了試劑用量。
6.如權利要求2所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置，其特征在于 可將第二連接管(13)除去，將與第二連接管(13)對接的多功能閥的兩端用實心連接螺絲堵上，第三連接管(17)和萃取柱1 (19)除去，將第六連接管(22)對接萃取柱1 (19)的一端插入洗脫液(3)，形成一種單支萃取柱的連續(xù)自動前處理系統(tǒng)；同理，將對應于萃取柱2 (20)的相關流路除去，也可形成另一種單支萃取柱的連續(xù)自動前處理系統(tǒng)。
7.如權利要求2所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置，其特征在于 可與液相色譜儀直接聯(lián)用；也可用反應盤管替代色譜柱(31)，試劑載流替代流動相，將裝置單元(B)變成流動注射分光光度系統(tǒng)或流動注射熒光光度系統(tǒng)后再聯(lián)用。
8.如權利要求2所述的一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定裝置，其特征在于 連接系統(tǒng)的管路材質是聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料細管，各種連接管的內徑在0.5 1. 5 mm 范圍，長度在10 50cm范圍內；采樣定量環(huán)(28)的體積為2(T200yL;使用的泵可以是多個多通道或單通道蠕動泵、多個柱塞泵或其他流體動力裝置。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳制品中三聚氰胺含量快速自動測定方法及裝置，屬于食品分析領域。單元(A)在操作程序下，第一步，多功能閥在狀態(tài)I，泵A轉動，泵B停止，第一樣品流入柱2進行三聚氰胺富集，洗脫液流入柱1對其再生；第二步，泵A停止，泵B轉動，清洗液流入柱2，清洗其中雜質；第三步，多功能閥切換至狀態(tài)II，洗脫液流入柱2對其洗脫和再生；柱2中的三聚氰胺被洗脫液交換下來，以“樣品塞”的形式直接進入單元(B)的采樣環(huán)，進行體積定量、注入、再分離、檢出，響應信號由計算機處理；與此同時，第二樣品進入柱1進行富集，重復柱2過程。本發(fā)明自動化程度高、重現(xiàn)性好、分析速度在30樣/h左右；本發(fā)明的單元(A)可與各種流動注射分析系統(tǒng)聯(lián)用。
文檔編號G01N21/31GK102262163SQ201110114090
公開日2011年11月30日 申請日期2011年5月4日 優(yōu)先權日2011年5月4日
發(fā)明者李永生 申請人:四川大學