一種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒含有如下物質(zhì)：1）結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；2）經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗CD3的抗體；3）經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗γ-干擾素的抗體；4）高爾基體阻斷劑；所述熒光染料A和所述熒光染料B所發(fā)熒光顏色不同。本發(fā)明提供了一種新的可用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的方法，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明可直接利用外周血進(jìn)行抗原刺激，無需分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡便，成本較低，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒及其應(yīng)用，特別涉及一種基于流式細(xì)胞術(shù)利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，據(jù)WHO資料估計(jì)，全球約三分之一的人口受結(jié)核分枝桿菌隱性感染，每年新發(fā)活動(dòng)性感染病例九百多萬，死亡一百萬例以上。近年來，我國結(jié)核病發(fā)病率居高不下，每年新發(fā)病例超過一百萬，死亡近二十萬例，對(duì)我國公民的健康、社會(huì)的安定和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展帶來嚴(yán)重的危害。
[0003]結(jié)核病的早期診斷對(duì)于控制患者疾病進(jìn)展和感染的蔓延具有重要意義。目前，結(jié)核病臨床診斷仍然缺乏高靈敏度和高特異性的手段。傳統(tǒng)的結(jié)核菌素皮下試驗(yàn)所用的抗原(PPD)因?yàn)槟軌蚋ń槊?BCG)的接種產(chǎn)生交叉反應(yīng)使得其產(chǎn)生較高比例的假陽性，而臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)核菌培養(yǎng)則有時(shí)間長，陽性率低等缺陷。另外，基于X射線透射和臨床表現(xiàn)的診斷則特異性較低，容易與其他肺部感染或疾病相混淆。
[0004]免疫學(xué)研究表明，結(jié)核分枝桿菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，其分泌的一些蛋白能夠激發(fā)高水平的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，而針對(duì)這些蛋白中包含的T細(xì)胞表位特異性T細(xì)胞檢測(cè)給TB的診斷帶來了新的機(jī)遇。通過結(jié)核桿菌與BCG菌株基因組的研究比較發(fā)現(xiàn)了在所有BCG菌株中完全缺失的基因片段RDl，針對(duì)RDl區(qū)編碼的蛋白ESAT-6和CFP-10特異性T細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IFN-Y的檢測(cè)(IGRAs)，催生了兩種商品化結(jié)核診斷試劑盒，即基于酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISP0T)的T-SP0T.TB和基于酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)的QuantiFERON-TB Gold。目前，這兩種診斷試劑盒已經(jīng)分別于2007年和2008年在美國得到FDA批準(zhǔn)上市，作為結(jié)核病臨床診斷的輔助手段。ELISP0T方法需要對(duì)外周血樣本進(jìn)行分離，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后方可進(jìn)行后續(xù)的抗原刺激等試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)與檢測(cè)儀器的要求較高，在臨床單位的普及率不高。
[0005]然而，中國特殊的結(jié)核病流行病學(xué)及生態(tài)環(huán)境、由于專利保護(hù)產(chǎn)生的高成本，使得這些診斷產(chǎn)品并不適用于中國廣泛的臨床診斷應(yīng)用，因此亟需開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的結(jié)核病快速診斷試劑。此外絕大多數(shù)免疫檢測(cè)方法如ELISP0T方法均需要首先從全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后方可進(jìn)行檢測(cè)，因此開發(fā)一種利用全血直接進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的方法可大大提聞相關(guān)試劑在臨床的適用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒。
[0007]本發(fā)明所提供的利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，具體可含有如下物質(zhì):
[0008](I)結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；
[0009]所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1_19所示氨基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成；
[0010](2)經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗⑶3的抗體；
[0011](3)經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體；
[0012](4)聞爾基體阻斷劑；
[0013]所述熒光染料A和所述熒光染料B所發(fā)熒光顏色不同。
[0014]在所述試劑盒中，所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫中的多肽既可為每條獨(dú)立包裝，也可按照等質(zhì)量混合以后一起包裝。
[0015]在本發(fā)明中，所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽組成。
[0016]在所述試劑盒中，還含有說明書；
[0017]所述說明書中記載:按照包括如下步驟的方法檢測(cè)待測(cè)個(gè)體是否被結(jié)核分枝桿菌感染:
[0018]Ca)向離體的待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育 14-18h (如 18h)；
[0019](b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4_6h (如6h)；
[0020](c)將步驟(b)的體系離心后，向沉淀中加入細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15_25min (如20min),再加入通透緩沖液；
[0021](d)向步驟(C)的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗⑶3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體，避光反應(yīng)20-30min (如30min);
[0022](e)將步驟(d)的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)；
[0023](f)結(jié)果判斷:若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測(cè)，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對(duì)照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測(cè)個(gè)體被結(jié)核分枝桿菌感染或候選被結(jié)核分枝桿菌感染；反之，則所述待測(cè)個(gè)體未被結(jié)核分枝桿菌感染或候選未被結(jié)核分枝桿菌感染；
[0024]所述對(duì)空對(duì)照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述“向待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟；
[0025]所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞:所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體。
[0026]所述雙陽性細(xì)胞的比例為雙陽性細(xì)胞的數(shù)量占被檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比。
[0027]在本發(fā)明中，所述外周血為人外周血，所述抗CD3的抗體為抗人CD3的抗體，所述抗Y-干擾素的抗體為抗人Y-干擾素的抗體。
[0028]在所述試劑盒中，所述抗CD3的抗體進(jìn)一步為抗CD3的單克隆抗體；所述抗Y-干擾素的抗體進(jìn)一步為抗Y-干擾素的單克隆抗體。
[0029]更加具體的，在本發(fā)明中，所述經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗CD3的抗體為經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗⑶3的單克隆抗體；所述經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體為經(jīng)R-藻紅蛋白(R-PE)標(biāo)記的抗Y -干擾素的單克隆抗體。
[0030]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗⑶3的單克隆抗體具體為北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為6610004。所述經(jīng)R-藻紅蛋白(R-PE)標(biāo)記的抗Y-干擾素的單克隆抗體具體為eBioscience公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為12-7319-81。所述高爾基體阻斷劑具體為eBioscience公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為00-4506-51 ο
[0031]為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，所述試劑盒中還可含有作為陽性對(duì)照的T細(xì)胞非特異性刺激物。
[0032]所述T細(xì)胞非特異性刺激物可為植物凝集素(PHA)或刀豆蛋白A (ConA)0
[0033]進(jìn)一步，所述試劑盒中還可含有細(xì)胞固定液和/或通透緩沖液和/或染色緩沖液。
[0034]在本發(fā)明中，所述細(xì)胞固定液、所述通透緩沖液和所述染色緩沖液均為進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行前處理過程中的常用試劑。具體而言，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述細(xì)胞固定液為eBioscience產(chǎn)品，貨號(hào)為00-8222-49 ;所述通透緩沖液為eBioscience產(chǎn)品，貨號(hào)為00-8333-56;所述染色緩沖液為北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為 6910031。
[0035]除以上外，所述試劑盒中還可含有其他流式檢測(cè)所需試劑及耗材。
[0036]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述試劑盒的制備方法。
[0037]所述試劑盒的制備方法，具體可包括將所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體和所述高爾基體阻斷劑分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0038]所述試劑盒在利用外周血體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用為非疾病診斷性應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)外周血中是否含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞的方法。所述方法為非疾病診斷性方法。
[0040]本發(fā)明所提供的檢測(cè)外周血中是否含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞的方法，具體可包括如下步驟:
[0041]Ca)向離體的待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育 14-18h (如 18h)；
[0042](b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4_6h (如6h)；
[0043](c)將步驟(b)的體系離心后，向沉淀中加入所述細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15_25min(如20min),再加入所述通透緩沖液；
[0044](d)向步驟(C)的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗⑶3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體，避光反應(yīng)20-30min (如30min);
[0045](e)將步驟(d)的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入所述染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)；
[0046](f)結(jié)果判斷:若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測(cè)，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對(duì)照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測(cè)外周血中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞；反之，則所述待測(cè)外周血中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞；
[0047]所述對(duì)空對(duì)照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述“向待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟；
[0048]所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞:所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體。[0049]所述雙陽性細(xì)胞的比例為雙陽性細(xì)胞的數(shù)量占被檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比。
[0050]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(a)中，所述“向待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”為:向每500 μ I的所述待測(cè)外周血中加入的每條多肽的質(zhì)量均為10 μ go
[0051]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(b)中，所述高爾基體阻斷劑的用量可為所述待測(cè)外周血體積的1/250。
[0052]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(b)中，在37°C孵育4_6h (如6h)后，還可包括如下步驟:加入所述待測(cè)外周血4倍體積的所述染色緩沖液。
[0053]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(c)中，所述離心為25°C 1500rpm離心3min。所述細(xì)胞固定液的加入量可為所述待測(cè)外周血體積的2/5。
[0054]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(c)中，所述“加入所述通透緩沖液”具體為:加入所述待測(cè)外周血4倍體積的所述通透緩沖液,離心(如1500rpm) 3min,棄上清，向沉淀中再加入所述待測(cè)外周血4倍體積的所述通透緩沖液,離心(如1500rpm) 3min,棄上清，向沉淀中再加入所述待測(cè)外周血1/5體積的所述通透緩沖液。
[0055]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(d)中，所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗⑶3的抗體的用量為所述待測(cè)外周血體積的8/500 ;所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體的用量為所述待測(cè)外周血體積的1/100。
[0056]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(d)中，在所述避光反應(yīng)20_30min (如30min)后，還包括如下步驟:加入所述待測(cè)外周血8倍體積的所述染色緩沖液。
[0057]在以上所述試劑盒或所述方法的步驟(e)中，所述離心為1500rpm離心3min。所述染色緩沖液的加入量為所述待測(cè)外周血體積的1/5。
[0058]本發(fā)明提供了一種新的可用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的胞內(nèi)因子染色方法，并且實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明可直接利用外周血進(jìn)行抗原刺激，無需分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)具有較高的靈敏度和特異性，且操作簡便，臨床適用性強(qiáng)，成本較低，可以用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0059]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0060]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0061]實(shí)施例1、利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒的開發(fā)
[0062]本發(fā)明所提供的利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒包含:
[0063]1、結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫；
[0064]所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1_19所示氨基酸序列組成的19條多肽組成；
[0065]2、陽性對(duì)照刺激物-植物凝集素(PHA)溶液；
[0066]3、細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板；
[0067]4、FITC (異硫氰酸突光素)標(biāo)記人0)3單克隆抗體,R-PE (R-phycoerythrin, R-藻紅蛋白)標(biāo)記人Y-干擾素單克隆抗體；
[0068]5、高爾基體阻斷劑(BrefeldinA);[0069]6、細(xì)胞固定液與通透緩沖液。
[0070]7、其他流式檢測(cè)檢測(cè)所需試劑及耗材。
[0071]實(shí)施例2、應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染臨床檢測(cè)
[0072]一、外周血樣本的采集
[0073]志愿者病例的篩選標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下臨床診斷標(biāo)準(zhǔn):
[0074](I)臨床主治醫(yī)生根據(jù)志愿者臨床表現(xiàn)確診為肺結(jié)核；
[0075](2)結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)菌落呈陽性；
[0076](3) X射線影像呈現(xiàn)肺部病變；
[0077](4)結(jié)核菌素皮下試驗(yàn)結(jié)果為陽性，斑點(diǎn)直徑大于1cm。
[0078]健康志愿者篩選標(biāo)注為同時(shí)滿足以下:
[0079](I)無結(jié)核臨床癥狀；
[0080]( 2 )無其他疾病或感染。
[0081]經(jīng)過篩選的個(gè)體經(jīng)臨床醫(yī)生體檢合格后，由試驗(yàn)者告知具體項(xiàng)目流程及所需血液的數(shù)量，經(jīng)志愿者同意并簽署知情同意書，臨床醫(yī)生將對(duì)志愿者進(jìn)行采血。最終本項(xiàng)目篩選了 11例結(jié)核病志愿者和7例健康志愿者，采血時(shí)使用含有肝素鋰抗凝的一次性真空采血管(格雷納，奧地利)，每名志愿者采血約20-25ml，采血后立即顛倒防止凝血。
[0082]二、應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染臨床檢測(cè)
[0083](一)本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法
[0084]結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫溶液的配置:將19條多肽分別每條以DMSO溶解，再等質(zhì)量(以多肽質(zhì)量計(jì))混合，再用RPIM1640培養(yǎng)基稀釋至每條多肽的終濃度為20 μ g/ml，備用。
[0085]1、抗原刺激:
[0086]在一塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入志愿者外周血500 μ I/孔,每例樣本分為3孔,其中I孔加入500 μ I結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫溶液、I孔加入500 μ I植物凝集素(PHA)溶液(Sigma，貨號(hào)L1668 ;配制方法:以細(xì)胞培養(yǎng)基溶解至濃度為50 μ g/ml)(陽性對(duì)照)，另I孔加入500 μ I RPIM1640培養(yǎng)基(空白對(duì)照)，蓋上蓋子，在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中孵育18小時(shí)。
[0087]2、添加阻斷劑:
[0088]在步驟I孵育18小時(shí)后，向每孔中加入2μ I高爾基體阻斷劑(BrefeldinA)(eBioscience公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為00-4506-51)，繼續(xù)孵育6小時(shí)。防止Y -干擾素分泌到胞外。
[0089]3、后續(xù)處理及結(jié)果獲取:
[0090](I)孵育結(jié)束后，迅速在每孔加入2ml染色緩沖液(北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為6910031)，混勻轉(zhuǎn)入流式管中，在25°C條件下用水平離心機(jī)1500rpm離心3min,棄上清。
[0091](2)每管中加入200 μ I細(xì)胞固定液(eBioscience產(chǎn)品，貨號(hào)為00-8222-49)，振勻，避光反應(yīng)20min。
[0092](3)每管加入2ml通透緩沖液(eBioscience產(chǎn)品，貨號(hào)為00-8333-56)，振勻1500rpm離心3min,棄上清。并重復(fù)該步驟一次。[0093](4)振蕩重懸，每管加入100μ I通透緩沖液(eBioscience產(chǎn)品，貨號(hào)為00-8333-56)，再加入胞內(nèi)熒光抗體FITC-⑶3 (北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為 6610004) 8 μ 1，PE-1FN y (eBioscience 公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為 12-7319-81)5 μ 10加完后，振勻，避光反應(yīng)30min。
[0094](5)振蕩重懸，每管加入4ml染色緩沖液(北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為6910031), 1500rpm離心3min,棄上清。
[0095](6)每管加入100μ I染色緩沖液(北京曠博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為6910031)，振蕩重懸后上Becton Dickinson FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果分析應(yīng)用 CellsQuest 軟件。
[0096]陽性反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn):雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對(duì)照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上(所述雙陽性細(xì)胞的比例為雙陽性細(xì)胞的數(shù)量大于上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比)，說明待測(cè)外周血中含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞，從而判定相應(yīng)的個(gè)體被結(jié)核分枝桿菌感染。所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞:所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體。本實(shí)施例中所有結(jié)核病例或健康志愿者外周血對(duì)結(jié)核抗原的反應(yīng)均按照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化并作出陽性或陰性反應(yīng)判斷，每個(gè)樣本反應(yīng)值超過此標(biāo)準(zhǔn)判定為陽性反應(yīng)，低于此標(biāo)準(zhǔn)判定為陰性反應(yīng)。
[0097]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0098](二)ELISP0T 對(duì)照方法
[0099]采用現(xiàn)有商品化T-SP0T.TB試劑盒(Oxford Immunotec公司產(chǎn)品)進(jìn)行。本試劑盒中包括酶標(biāo)抗體、ESAT-6多肽庫和CFP-10多肽庫及顯色底物等。
[0100]l、PBMCs的分離及抗原刺激
[0101](I)先將新鮮采集的外周血用121°C高壓滅菌冷卻后的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)稀釋一倍，即20ml外周血加入到20ml的PBS中混勻，將稀釋的血樣小心加入到事先準(zhǔn)備好的15ml淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品，貨號(hào)LTS10771)中，加入時(shí)十分小心，緩慢加入，避免界面混亂。
[0102](2) 25°C條件下用水平離心機(jī)700g或2000rpm/min離心20min，剎車時(shí)減速調(diào)到
最慢。離心后的樣品分四層，將上層血漿用巴斯德移液管吸出，之后小心吸出淋巴細(xì)胞層至新的離心管中。
[0103](3 )用等體積的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4 )等體積稀釋吸出的淋巴細(xì)胞層，之后離心(2000rpm，10min，25°C)。棄掉上清，重懸后加入無血清RPM1640培養(yǎng)基約7ml清洗，離心1500rpm，5min，25°C。注:此步驟時(shí)若發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞較多，可以加入紅細(xì)胞裂解液裂解掉紅細(xì)胞，6ml紅細(xì)胞裂解液,裂解5min,到時(shí)間后加入6ml PBS, 1500rpm離心5min。
[0104](4)棄上清，重懸，加7_8ml含10% (體積分?jǐn)?shù))血清(Hyclone)的RPM1640培養(yǎng)基清洗，離心 1500rpm, 5min, 25°C。
[0105](5)棄掉上清后用3ml含10% (體積分?jǐn)?shù))血清的RPM1640培養(yǎng)基重懸，取適量于血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并最終調(diào)整至2.5 X IO6細(xì)胞/ml密度。
[0106](6)每個(gè)結(jié)核病例及健康志愿者分得的PBMCs同時(shí)進(jìn)行T-SP0T.TB檢測(cè)，刺激物分兩孔，I孔加入50 μ I ESAT-6多肽庫(試劑盒隨附)，另I孔加入50 μ I CFP-10多肽庫(試劑盒隨附)。再向每孔中加入100 μ I步驟(5)稀釋后的PBMCs細(xì)胞，加完后將ELISP0T板置37°C，5%C02條件下孵育18小時(shí)。
[0107]2、后續(xù)處理及結(jié)果獲取:
[0108](1)孵育結(jié)束后，棄掉孔內(nèi)細(xì)胞液，迅速在每孔加入200μ I常溫的去離子水清洗2次，之后PBST清洗3次。
[0109](2)去除洗液，在吸水紙上用力扣干，每孔加入50μ I稀釋的酶標(biāo)檢測(cè)抗體(試劑盒隨附)，室溫孵育2h。
[0110](3)顯色:去除酶標(biāo)檢測(cè)抗體溶液，PBST清洗3次，之后PBS清洗2次。在吸水紙上用力扣干，之后每孔加入50 μ I顯色底物溶液(試劑盒隨附)，室溫孵育7分鐘后，當(dāng)看到清晰的斑點(diǎn)時(shí)，用蒸餾水沖洗膜的雙面以中止反應(yīng)。
[0111](5)37°C或室溫下晾干，之后將ELISP0T板用自動(dòng)讀板儀(C.T.L)對(duì)ELI SPOT孔內(nèi)反應(yīng)的點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，之后調(diào)整參數(shù)并進(jìn)行質(zhì)量控制，給出最終反應(yīng)結(jié)果。
[0112]陽性反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn):ELISP0T結(jié)果按照T-SP0T.TB試劑盒說明書進(jìn)行判斷。
[0113]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0114]結(jié)果顯示，以上應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行臨床檢測(cè)的方法在結(jié)核病例中的檢測(cè)敏感度達(dá)到100% (11/11)，且與7名健康志愿者結(jié)果比較，特異性達(dá)100%，與作為對(duì)照的ELISP0T法相比，基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。且三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均如表1所示。因此，應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒能夠有效的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染。
[0115]表1應(yīng)用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行臨床檢測(cè)的方法與ELISP0T法診斷特異性和靈敏
度
[0116]統(tǒng)計(jì)
[0117]
【權(quán)利要求】
1.一種利用外周血檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，含有如下物質(zhì): (1)結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫； 所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫由序列表中序列1-19所示氨基酸序列組成的19條多肽中的全部或部分組成； (2)經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗⑶3的抗體； (3)經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體； (4)聞爾基體阻斷劑； 所述熒光染料A和所述熒光染料B所發(fā)熒光顏色不同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有說明書； 所述說明書中記載:按照包括如下步驟的方法檢測(cè)待測(cè)個(gè)體是否被結(jié)核分枝桿菌感染: (a)向離體的待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育14-18h ； (b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4-6h； (c)將步驟(b)的體系離心后，向沉淀中加入細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15-25min，再加入通透緩沖液； Cd)向步驟(c)的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體，避光反應(yīng)20-30min ； (e)將步驟(d)的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)； (f)結(jié)果判斷:若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測(cè)，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對(duì)照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測(cè)個(gè)體被結(jié)核分枝桿菌感染或候選被結(jié)核分枝桿菌感染；反之，則所述待測(cè)個(gè)體未被結(jié)核分枝桿菌感染或候選未被結(jié)核分枝桿菌感染； 所述對(duì)空對(duì)照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述“向待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟； 所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞:所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述抗CD3的抗體為抗CD3的單克隆抗體；和/或 所述抗Y-干擾素的抗體為抗Y-干擾素的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述經(jīng)熒光染料A標(biāo)記的抗CD3的抗體為經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗CD3的單克隆抗體；和/或 所述經(jīng)熒光染料B標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體為經(jīng)R-藻紅蛋白標(biāo)記的抗Y-干擾素的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有T細(xì)胞非特異性刺激物； 所述T細(xì)胞非特異性刺激物具體為植物凝集素或刀豆蛋白A。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有細(xì)胞固定液和/或通透緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有染色緩沖液。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒的制備方法，包括將所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體、所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體和所述高爾基體阻斷劑分別單獨(dú)包裝的步驟。
9.權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒在利用外周血體外檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染引起的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)中的應(yīng)用。
10.一種檢測(cè)外周血中是否含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞的方法，包括如下步驟: (a)向離體的待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫，37°C孵育14-18h ； (b)向步驟(a)的體系中加入所述高爾基體阻斷劑，37°C孵育4-6h； (c)將步驟(b)的體系離心后，向沉淀中加入所述細(xì)胞固定液，避光反應(yīng)15-25min,再加入所述通透緩沖液； Cd)向步驟(c)的體系中加入所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗Y -干擾素的抗體 ，避光反應(yīng)20-30min ； (e)將步驟(d)的體系離心，取細(xì)胞沉淀，加入所述染色緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)； Cf)結(jié)果判斷:若經(jīng)所述流式細(xì)胞儀檢測(cè)，雙陽性細(xì)胞的比例大于0.2%，且為空白對(duì)照組中雙陽性細(xì)胞比例的兩倍以上，則所述待測(cè)外周血中含有或候選含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞；反之，則所述待測(cè)外周血中不含有或候選不含有結(jié)核分枝桿菌特異性T細(xì)胞； 所述對(duì)空對(duì)照組為:與如上步驟(a)_ (f)相比，僅缺少步驟(a)中所述“向待測(cè)外周血中加入所述結(jié)核分枝桿菌Rv3615c混合多肽肽庫”的步驟； 所述雙陽性細(xì)胞為被如下兩種抗體同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞:所述經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗CD3的抗體和所述熒光染料標(biāo)記的抗Y-干擾素的抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103760345SQ201410022450
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】石佳, 李啟靖, 董劍峰, 張衛(wèi)紅 申請(qǐng)人:北京曠博生物技術(shù)有限公司