本發(fā)明涉及一種xanthone類化合物及其單晶的制備方法與作為抗海分枝桿菌藥物的應(yīng)用，特別是涉及一種對(duì)海分枝桿菌(mycobacteriummarinum)具有極強(qiáng)的抑制作用的xanthone類化合物及其單晶制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)核分枝桿菌導(dǎo)致的結(jié)核病仍然是全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重威脅。據(jù)who最新報(bào)道，在2014年，約有960萬(wàn)新病例發(fā)生，150萬(wàn)人死于該病，有48萬(wàn)人發(fā)展為多重抗藥性結(jié)核病。我國(guó)占有全世界人口的20%，結(jié)核病對(duì)我國(guó)亦構(gòu)成極大的威脅。然而，研究結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)的感染機(jī)制是困難的，原因是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，需較高的生物安全措施，成本高，動(dòng)物模型少等。海分枝桿菌(mycobacteriummarinum)為一種腐生性非典型分枝桿菌，天然宿主為魚(yú)類、兩棲類，人類感染屬機(jī)會(huì)感染?；蚪M比較分析表明海分枝桿菌(m.marinum)與結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)的親緣關(guān)系很近，這兩種病原菌引起的疾病特征在某些方面也很相似，如肉芽腫。利用海分枝桿菌對(duì)結(jié)核分枝桿菌發(fā)病機(jī)理的決定性因素研究是一種優(yōu)良模型，且安全系數(shù)高?，F(xiàn)如今，隨著在家庭中通過(guò)魚(yú)缸養(yǎng)殖觀賞魚(yú)的流行，感染海分枝桿菌的幾率也在增加，其導(dǎo)致人類慢性的皮膚損傷，膿毒性關(guān)節(jié)炎等。臨床上大多數(shù)有效的抗海分枝桿菌治療為聯(lián)合使用利福平、克拉霉素等抗生素，且需立即用藥。由于海分枝感染還不是很普遍，加上多樣化的臨床表現(xiàn)，往往會(huì)導(dǎo)致誤診或者延遲治療，導(dǎo)致病情惡化而難以治愈。因而尋找更高效的抗海分枝桿菌藥物尤其是結(jié)構(gòu)新穎的抗海分枝桿菌藥物已成為急需解決的課題。海洋微生物獨(dú)特的生存環(huán)境(高壓、高鹽、缺氧、避光等)，促使海洋微生物代謝產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、活性很好的化合物，為開(kāi)發(fā)新型抗海分枝桿菌藥物或者潛在的抗結(jié)核藥物提供了重要來(lái)源。但是關(guān)于海洋微生物來(lái)源的具有抗海分枝桿菌活性的化合物的報(bào)道還相當(dāng)少，尤其是具有潛在開(kāi)發(fā)成為抗結(jié)核藥物的海洋來(lái)源化合物的報(bào)道。(who.globaltuberculosiscontrol2015.robinl.;lalitar.,currentopinioninmicrobiology(2008),11(3),277-283.stinear,t.p.;seemann,t.,etal.genomeresearch(2008),18(5),729741.rieraj.;conesax.,etal.archivesoforthopaedicandtraumasurgery(2016),136(1),131134.babamahmoodif.;nikkhahanb.;babamahmoodia.,iranianredcrescentmedicaljournal(2014),16(2),e10120.fengy.m.;xuh.s.,etal.diagnosticmicrobiologyandinfectiousdisease(2011),71,267272.cheungj.p.;fungb.,etal.journaloforthopaedicsurgery(2010),18(1),98103.andpreviousannualreports)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)源于海洋真菌的xanthone類化合物及其單晶的制備方法與作為抗海分枝桿菌活性的應(yīng)用，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。菌種保藏信息：保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2014年4月3日；保藏編號(hào)：cgmcc8994；分類命名：penicilliumsp.本發(fā)明提供式i化合物1和2或其藥學(xué)上可接受的鹽：或其藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明提供式i化合物1和2的制備方法，其特征在于先在菌種培養(yǎng)基中對(duì)真菌penicilliumsp.(ta33-1)進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)該真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進(jìn)行正相硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析后，再經(jīng)hplc高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，即為化合物1和2。

上述制備方法中菌種培養(yǎng)基優(yōu)選含有葡萄糖0.1%–5.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為0–30°c，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為3–15天；發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選含有大米1.0%–80.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為0–30°c，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為20–100天；所述的正相硅膠柱層析采用的固定相優(yōu)選200–300目硅膠，流動(dòng)相優(yōu)選體積比為20%–100%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑；所述sephadexlh-20凝膠柱層析采用的流動(dòng)相優(yōu)選體積比為氯仿:甲醇=1:1的混合溶劑；所述hplc高效液相制備色譜中采用的色譜柱：常規(guī)odsc18柱，優(yōu)選為kromasil10×250mm,5μm，流速優(yōu)選為1.0–5.0ml/min，流動(dòng)相優(yōu)選體積比為20%–70%的甲醇-水混合溶劑。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供式ⅰ化合物1的晶體，晶體數(shù)據(jù)：空間群為p-1，晶胞參數(shù)為a=7.123(4)?,b=8.069(4)?,c=11.596(6)?,α=93.86(3)o,β=93.56(3)o,γ=102.58(3)o,v=646.99(505)?³,z=2,dc=1.593g/cm³,f(000)=324,μ=1.144mm^–1。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供上述式i化合物1晶體的制備方法，其特征在于將式i化合物1溶于甲醇、乙醇、水、四氫呋喃或丙酮中的任一種或幾種，靜置緩慢結(jié)晶即可得到式i化合物1的晶體。

上述晶體的制備方法中靜置緩慢結(jié)晶的條件優(yōu)選在0–30^oc下，靜置1–30天。

本發(fā)明從海洋真菌中獲得xanthone類化合物對(duì)海分枝桿菌具有強(qiáng)的抑制活性，可用作抗海分枝桿菌藥物，應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明的另一實(shí)施方式中提供一種抗海分枝桿菌藥物，其特征在于包括式ⅰ化合物1和2或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。

本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指非毒性的無(wú)機(jī)或有機(jī)酸和/或堿的加成鹽。可參見(jiàn)“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.1986,33,201–217。

附圖說(shuō)明

圖1為式i化合物1的xrd圖。

上述的xanthone類化合物在制備抗海分枝桿菌藥物中的應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

為了便于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，下面提供的實(shí)施例對(duì)其做了更詳細(xì)的說(shuō)明。但是這些實(shí)施例僅供更好地理解發(fā)明而并非用來(lái)限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實(shí)施方式不限于以下內(nèi)容。

實(shí)施例1

(1)花柳珊瑚內(nèi)生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖1.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、瓊脂1.0%、氯化鈉3.0%，其余為水，使用時(shí)制成試管斜面，真菌菌株在30°c下培養(yǎng)3天。

(2)花柳珊瑚內(nèi)生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有大米40.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉3.0%，其余為水；真菌菌株于28°c培養(yǎng)90天。

(3)式i化合物1和2的提取分離

取60瓶步驟(2)得到的菌絲體，用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏分別進(jìn)行正相硅膠柱層析(固定相為200–300目硅膠；流動(dòng)相為100%乙酸乙酯溶劑)、sephadexlh-20凝膠柱層析(氯仿：甲醇=1：1的混合溶劑，體積比)后，再經(jīng)hplc高效液相制備色譜分離(色譜柱為kromasil10×250mm，5μm，流速為2.0ml/min，流動(dòng)相為35%的甲醇-水混合溶劑，體積比)，將所得洗脫液濃縮，得黃色結(jié)晶，即為式i化合物1和2。

式i化合物1和2的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)：

化合物1:黃色晶體；¹hnmr(500mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):13.60(1h,s,h-8),6.80(1h,s,h-4),6.28(1h,d,j=1.5hz,h-5),6.17(1h,d,j=1.5hz,h-7),2.78(3h,s,h-11).¹³cnmr(125mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz)183.5(c,c-9),165.1(c,c-6),164.8(c,c-8),158.1(c,c-10a),153.5(c,c-4a),152.6(c,c-3),141.8(c,c-2),125.7(c,c-1),112.5(c,c-1a),103.9(c,c-9a),100.9(ch,c-4),98.5(ch,c-7),93.6(ch,c-5),13.9(ch3,c-11).

化合物2:黃色晶體；¹hnmr(500mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):13.58(1h,s,h-8),6.32(1h,d,j=2.0hz,h-5),6.16(1h,d,j=2.0hz,h-7),2.73(1h,s,h-1),¹³cnmr(125mhz,acetone-d6,δ,ppm,j/hz):183.1(c,c-9),164.1(c,c-8),163.8(c,c-6),157.1(c,c-10a),141.7(c,c-2),115.4(c,c-1a),111.2(c,c-1),103.1(c,c-9a),97.6(ch,c-7),92.9(ch,c-5),12.3(ch3,c-11).

實(shí)施例2

(1)花柳珊瑚內(nèi)生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有葡萄糖0.1%–5.0%(重量百分比，下同)、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、瓊脂0.1%–3.0%、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，使用時(shí)制成試管斜面，真菌菌株在0–30°c下培養(yǎng)3–15天。

(2)花柳珊瑚內(nèi)生真菌penicilliumsp.(ta33-1)的發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有大米1.0%–80.0%(重量百分比，下同)、氯化鈉0.05%–5%，其余為水，真菌菌株于0–30°c培養(yǎng)20–100天。

(3)式i化合物1和2的提取分離

取10–60瓶步驟(2)所得的將所得菌絲體用氯仿-甲醇混合液(1:1)浸提3次減壓濃縮后，用乙酸乙酯萃取3次得粗浸膏；乙酸乙酯相粗浸膏濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析(固定相為本領(lǐng)域常規(guī)正相硅膠，流動(dòng)相為50%–100%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑，體積比)、sephadexlh-20凝膠柱層析(流動(dòng)相為氯仿:甲醇=1:1的混合溶劑，體積比)后，再經(jīng)hplc高效液相制備色譜(色譜柱為本領(lǐng)域常規(guī)odsc18柱，流速為1.0–5.0ml/min，流動(dòng)相為20%–70%的甲醇-水混合溶劑，體積比)，將所得洗脫液濃縮，得黃色結(jié)晶，即為式i化合物1和2。

其中式ⅰ化合物1和2的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致。

實(shí)施例1–2中未具體指明的其他菌種培養(yǎng)、發(fā)酵條件，以及正相硅膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱層析分離、高效液相色譜分離等其他實(shí)驗(yàn)操作條件均為本領(lǐng)域常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作條件，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要，進(jìn)行合理的選擇。

實(shí)施例3

取式ⅰ化合物11.5mg溶解在裝有500μl甲醇、乙醇、水、四氫呋喃或丙酮中任一種的小瓶中，于0°c下靜置30天后，緩慢結(jié)晶即得式i化合物1的晶體。

實(shí)施例4

取式ⅰ化合物13mg溶解在裝有1000μl甲醇、乙醇、四氫呋喃或丙酮中任一種或幾種的小瓶中，于30°c下靜置1天后，緩慢結(jié)晶即得式ⅰ化合物1的晶體。

上述晶體的晶體數(shù)據(jù)：空間群為p-1，晶胞參數(shù)為a=7.123(4)?,b=8.069(4)?,c=11.596(6)?,α=93.86(3)o,β=93.56(3)o,γ=102.58(3)o,v=646.99(505)?³,z=2,dc=1.593g/cm³,f(000)=324,μ=1.144mm^–1。

實(shí)施例5

在菌種培養(yǎng)基中對(duì)海洋真菌penicilliumsp.(ta33-1)進(jìn)行菌種培養(yǎng)，再在發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)該真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得發(fā)酵液過(guò)濾，除去菌體，將濾液濃縮后，用乙酸乙酯萃??；萃取液濃縮后分別進(jìn)行正相硅膠柱層析、sephadexlh-20凝膠柱層析后，再經(jīng)hplc高效液相制備色譜，將所得洗脫液濃縮，得黃色晶體，即為式ⅰ化合物1和2，其結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致。其中所述菌種培養(yǎng)基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、粗海鹽、水，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含有大米、粗海鹽、蛋白胨、水；所述的色譜分離為正相硅膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱層析和高效液相色譜分離。

為了探索更廣泛的適用于制備本發(fā)明式ⅰ化合物1和2的方法，本實(shí)施例中菌種培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的添加，均按本領(lǐng)域中常規(guī)比例添加或按任意比例添加，色譜分離時(shí)所用硅膠的規(guī)格、sephadexlh-20凝膠的規(guī)格、色譜柱的型號(hào)及洗脫溶劑的選擇，均為本領(lǐng)域的常規(guī)選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上述常規(guī)選擇的制備方法，均能得到發(fā)明的黃色晶體，即式ⅰ化合物1和2，其結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實(shí)施例1中相應(yīng)數(shù)據(jù)一致，僅僅存在個(gè)別化合物在純度及收率方面的微小差異。

實(shí)施例1–3的結(jié)果表明，按照本領(lǐng)域常規(guī)的菌種培養(yǎng)、發(fā)酵條件，常規(guī)的正相硅膠柱色譜分離、sephadexlh-20凝膠柱色譜分離、高效液相色譜分離的條件對(duì)海洋真菌penicilliumsp.(ta33-1)進(jìn)行菌種培養(yǎng)、發(fā)酵、分離純化，均能得到本發(fā)明式ⅰ結(jié)構(gòu)的化合物1和2。本發(fā)明式ⅰ化合物1和2的制備方法，優(yōu)選實(shí)施例1–2中記載的方法。

實(shí)施例6

本發(fā)明式ⅰ化合物1和2的抗海分枝桿菌活性按照如下文獻(xiàn)測(cè)試方法測(cè)試：wangc,wangj,huangy,chenh.,liy.,zhongl.,cheny.,chens.,wangj.,kangj.,pengy.,yangb.,liny.,shez.,laix.,anti-mycobacterialactivityofmarinefungus-derived4-deoxybostrycinandnigrosporin.molecules,2013,18(2):17281740.

試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的式i化合物1和2對(duì)海分枝桿菌感染具有很強(qiáng)的抑制作用，其mic分別為40.75μm和50.61μm，陽(yáng)性藥利福平為2.34μm。

實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的xanthone類化合物1和2對(duì)海分枝桿菌感染具有很強(qiáng)的抑制活性，可將其制成抗海分枝桿菌藥物，甚至抗結(jié)核桿菌藥物，并且花柳珊瑚內(nèi)生真菌penicilliumsp.(ta33-1)可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，保證了式i化合物1和2的天然來(lái)源，具有廣闊的應(yīng)用前景。