專利名稱：治療和診斷分枝桿菌感染的化合物和方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及傳染病的檢測，治療和預防。特別是，本發(fā)明涉及治療包括結核分枝桿菌和鳥分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌感染的化合物和方法。本發(fā)明進一步涉及起非特異性免疫反應放大劑(amplifier)作用的化合物，和在接種疫苗或抗傳染病免疫治療中，以及在對免疫失調(diào)癥和癌癥的某些治療中使用這類非特異性免疫反應放大劑作為佐劑。
背景技術：
結核是一種慢性，傳染性疾病，它由結核分枝桿菌(M.tubuculosis)感染而引起。它是發(fā)展中國家中的主要疾病，并伴隨每年新增約8百萬病歷和3百萬死亡人數(shù)愈加成為世界發(fā)達地區(qū)中的難題。盡管這種感染在較長期間內(nèi)可能是無癥狀的，這種疾病最常見表現(xiàn)為肺部的慢性炎癥，導致發(fā)燒和呼吸道癥狀。如果延誤治療，可產(chǎn)生高發(fā)病率和死亡率。
雖然用持久的抗菌素治療一般能控制結核病，但是這類治療對預防該疾病的蔓延是不夠的。被感染的病人可能是無癥狀的，但在某段時間內(nèi)可有傳染性。此外，雖然遵循治療方案是關鍵的，但病人的行為難于監(jiān)控。有些病人并未完成療程，這可導致治療無效并產(chǎn)生出抗藥的分枝桿菌。
控制結核病蔓延需要有效的疫苗接種和該病的準確、早期診斷。目前，活菌疫苗接種是誘導保護性免疫力的最有效方法。為此目的所使用的最普通的分枝桿菌是Bacillus Calmette-Guerin(BCG)，即牛分枝桿菌的一種無毒株。然而，BCG的安全性和功效是引起爭論的一個根源，并且有些國家，如美國，不實施普及大眾的接種。一般使用皮試進行分枝桿菌感染的診斷，它包括皮內(nèi)接觸結核菌素PPD(純化的蛋白質衍生物)。注射后48-72小時，抗原特異性T細胞反應導致在該注射部位產(chǎn)生可測量的硬結，由此表明接觸了分枝桿菌抗原。然而，這種皮試一直有敏感性和特異性的問題，并且被BCG接種的個體無法與受感染的個體區(qū)分開。
已被用于結核病(還有麻風)免疫治療的一種并非眾所周知的分枝桿菌是牝牛分枝桿菌(Mycobacterium vaccae)，它對人類是非病原性的。然而很少有關于牝牛分枝桿菌與BCG比較的功效方面的資料，并且它還沒有被廣泛應用于普及大眾的疫苗接種。牛分枝桿菌BCG和牝牛分枝桿菌被認為含有可被接觸過結核桿菌感染的個體免疫系統(tǒng)識別的抗原化合物。
因此，在本領域仍存在一種對預防，治療和檢測結核病有效的化合物和方法的需要。
發(fā)明概述簡言之，本發(fā)明提供預防，治療和診斷分枝桿菌感染的化合物和方法，以及用于傳染病與癌癥的疫苗或免疫治療的佐劑。
首先，提供源于牝牛分枝桿菌的多肽，其包含一種抗原的致免疫部分，或此類抗原的變體。在一個實施方案中，所述抗原包含的氨基酸序列選自(a)序列鑒定號1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,114,117,118,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列；和(b)與如通過計算機算法PLASTP所測試的，序列鑒定號為1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,114,117,118,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列至少有約99％的概率是相同的序列。
其次，本發(fā)明提供含牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分的多肽，其中所述抗原包括由一種DNA分子編碼的氨基酸序列，所述DNA分子選自(a)序列鑒定號40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,113,115,116,120,122,123,132,133和136-138中描述的序列；(b)序列鑒定號40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,113,115,116,120,122,123,132,133和136-138中描述的序列的互補體；以及(c)與如計算機算法FASTA測試的(a)或(b)序列有至少約99％的概率是相同的序列。
還提供編碼本發(fā)明多肽的DNA序列，含這些DNA序列的表達載體，以及用這類表達載體轉化或轉染的宿主細胞。
另外，本發(fā)明提供含第一和第二發(fā)明多肽的融合蛋白或(另外的選擇)一種發(fā)明多肽與一種已知結核分枝桿菌抗原的融合蛋白。
在其他方面，本發(fā)明提供藥用組合物，其包含至少一種本發(fā)明多肽，或一種編碼此多肽的DNA分子，以及一種生理上可接受的載體。本發(fā)明還提供含至少一種上述多肽的疫苗和非特異性免疫反應放大劑，以及含至少一個編碼此類多肽和非特異性免疫反應放大劑的DNA序列。
還有一方面，為誘導病人的保護性免疫力而提供的方法包括給患者施用有效量的一種或多種上述多肽和免疫反應放大劑。
在本發(fā)明的進一步內(nèi)容中，為檢測患者的結核病提供方法和診斷試劑盒。在第一個實施方案中，所述方法包括用一種或多種上述多肽接觸患者皮膚細胞并檢測病人皮膚的免疫反應。在第二個實施方案中，所述方法包括用至少一種上述多肽接觸生物學樣品；并檢測所述樣品中與所述多肽結合之抗體或多肽的存在，由此檢測所述生物學樣品中的結核桿菌感染。適當?shù)纳飳W樣品包括全血，痰，血清，血漿，唾液，腦脊液和尿。
提供的診斷試劑盒包括與足以使所述多肽與病人皮膚細胞接觸的裝置結合的一種或多種上述多肽。本發(fā)明還提供含與檢測試劑結合的一種或多種本發(fā)明多肽之診斷試劑盒。
還有一方面，本發(fā)明提供與上述多肽結合的抗體(多克隆和單克隆抗體)，并提供在檢測結核桿菌感染中使用它們的方法。
本發(fā)明還提供促進對抗原的非特異性免疫反應的方法。在一個實施方案中，此類方法包括施用一種含選自如下的一種成分的組合物(a)去脂牝牛分枝桿菌細胞，(b)去糖基化牝牛分枝桿菌細胞；(c)去脂和去糖基化牝牛分枝桿菌細胞和(d)牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物。在第二個實施方案中，此類方法包括施用一種多肽，所述多肽包含一種抗原的致免疫部分，其中所述抗原包含的序列選自(a)序列鑒定號為114,117和118中描述的序列；(b)與序列鑒定號114,117和118中描述的序列至少有約97％一致性的序列。
還有另一方面，提供包括成分選自去脂牝牛分枝桿菌細胞，去糖基化牝牛分枝桿菌細胞，和去脂并去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞的組合物，和提供包括此類成分的疫苗以及使用此類組合物和疫苗以誘導患者保護性免疫力的方法。
這些方面以及本發(fā)明的其他方面將在參考下面詳細描述和附圖時變得顯而易見。本文公開的全部參考文獻特此引用以其全體作為參考，與分別引用各參考文獻一樣。
附圖簡述

圖1A和1B說明在用活結核分枝桿菌H37Rv感染前用高壓消毒過的牝牛分枝桿菌或未分級分離的牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物分別免疫小鼠的保護性作用。
圖2A和2B分別顯示按2維聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的牝牛分枝桿菌和結核分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的成份。
圖3是從牝牛分枝桿菌獲得的抗原85A蛋白質序列與從牛分枝桿菌，結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌獲得的相應蛋白質序列的比較。
圖4A(ⅰ)-(ⅳ)分別說明10微克，100微克和1毫克高壓消毒的牝牛分枝桿菌的非特異性免疫放大作用和75微克牝牛分枝桿菌未分級分離培養(yǎng)濾出物的非特異性免疫放大作用。圖4B(ⅰ)和(ⅱ)分別說明高壓消毒的牝牛分枝桿菌和去脂牝牛分枝桿菌的非特異性免疫放大作用。圖4C(ⅰ)說明整體高壓消毒的牝牛分枝桿菌的非特異性免疫放大作用。圖4C(ⅱ)說明糖脂已被從中除去的去脂牝牛分枝桿菌和用SDS提取的蛋白質的非特異性免疫放大作用。圖4C(ⅲ)表示圖4C(ⅱ)制劑的佐劑作用被蛋白裂解酶鏈酶蛋白酶處理而被破壞。圖4D表示加熱殺死的牝牛分枝桿菌(圖4D(ⅰ))，結核分枝桿菌(圖4D(ⅱ))，牛分枝桿菌BCG(圖4D(ⅲ))，草分枝桿菌(圖4D(ⅳ))和恥垢分枝桿菌(圖4D(ⅴ))的非特異性免疫放大作用。
圖5顯示從去脂和去糖基化牝牛分枝桿菌得到的SDS提取的蛋白質之聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結果。
圖6說明SDS提取的牝牛分枝桿菌蛋白質的不同分子量組分的非特異性免疫放大作用。
圖7說明SDS提取的牝牛分枝桿菌蛋白質的不同等電點組分之非特異性免疫放大作用。
圖8說明通過加熱殺死的牝牛分枝桿菌，凍干的牝牛分枝桿菌，去脂和去糖基化的牝牛分枝桿菌(被稱為“去脂牝牛分枝桿菌”)，和牝牛分枝桿菌糖脂誘導IL-12。
圖9說明，通過不同濃度的牝牛分枝桿菌重組蛋白質，加熱殺死的牝牛分枝桿菌，去脂和去糖基化的牝牛分枝桿菌(被稱為“去脂牝牛分枝桿菌”)，牝牛分枝桿菌糖脂和脂多糖在C57BL-6腹膜巨噬細胞(圖9A)；BALB/C腹膜巨噬細胞(圖9B)；和C3H/HeJ腹膜巨噬細胞(圖9C)刺激γ干擾素的產(chǎn)生。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明一般針對用于預防，治療和診斷包括結核分枝桿菌和鳥分枝桿菌感染在內(nèi)的分枝桿菌感染的組合物和方法。
大量的研究工作旨在闡明分枝桿菌感染(特別是結核分枝桿菌感染)的免疫反應機制。盡管巨噬細胞已顯示出作為結核分枝桿菌免疫的主要效應物起作用，T細胞是這種免疫力的主要誘導物。T細胞在防御結核分枝桿菌感染中的基礎作用通過結核分枝桿菌在愛滋病患者中頻繁出現(xiàn)而得到解釋，因為CD4 T細胞的耗竭與人免疫缺陷病毒(HIV)感染有關。在小鼠中，分枝桿菌激活的CD4 T細胞已顯示出是γ干擾素(IFN-γ)的潛在制造者，而后者又表現(xiàn)為巨噬細胞抗分枝桿菌作用的引發(fā)物。盡管人體中IFN-γ的作用尚不太清楚，已有些研究表明1,25-二羥-維生素D3，無論是單獨或結合IFN-γ或α腫瘤壞死因子使用時，都激活人巨噬細胞以抑制結核分枝桿菌的感染。而且，已知IFN-γ刺激人巨噬細胞產(chǎn)生1,25-二羥-維生素D3。同樣，IL-12已顯示出在刺激抵御結核分枝桿菌感染中起作用。CD4+T細胞和巨噬細胞的另一個特性是其激活CD8+細胞毒T細胞的能力，后者能殺傷被病原傳感染的細胞。CD8+T細胞業(yè)已顯示出殺巨噬細胞和其他藏有結核分枝桿菌的細胞能力。有關結核分枝桿菌感染的免疫學綜述參見Chan和Kaufmann的結核病發(fā)病機理，預防和控制，Bloom(編輯).ASMPress.Washington,DC,1994。
本發(fā)明的組合物包括含至少一種牝牛分枝桿菌抗原的一個致免疫部分(或其變體)的多肽。此類多肽刺激T細胞增殖和/或從被結核分枝桿菌感染的個體的T細胞分泌γ干擾素。在某些實施方案中，本發(fā)明多肽包含至少一種可溶性牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分。“可溶性牝牛分枝桿菌抗原”是一種牝牛分枝桿菌來源的蛋白質，其出現(xiàn)在牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物中。如本文所使用的，術語“多肽”包含任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質(即抗原)，其中氨基酸殘基通過偶聯(lián)肽鍵被連接起來。因此，含上述抗原之一的致免疫部分之多肽可完全由致免疫部分組成，或可含額外序列。所述額外序列可來源于天然牝牛分枝桿菌抗原或可以是異種的，并且此類序列可以(但非必須)是致免疫的。
本文所用“致免疫的”，意指在患者(如人)或生物學樣品中引起免疫反應的能力。特別是，在包括選自T細胞，NK細胞，B細胞和巨噬細胞(其中細胞來自結核分枝桿菌免疫的個體)的一個或多個細胞的生物學樣品中，致免疫的抗原能刺激細胞增殖，白細胞介素-12生產(chǎn)或γ干擾素生產(chǎn)。含至少一種或多種牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分的多肽一般可被用于檢測結核病或在患者中誘導對結核病的保護性免疫力。
本發(fā)明的組合物和方法還包括上述多肽的變體。本文使用的術語“變體”包含呈現(xiàn)與本發(fā)明序列有至少約50％，更優(yōu)選至少約70％，還更優(yōu)選至少約90％一致性的任何序列。一種“變體”更優(yōu)選是與本發(fā)明序列至少在約99％概率上是相同的任何序列。DNA序列的概率通過計算機算法FASTA(2.0u4版，1996年2月；Pearson W.R.等美國科學院學報，85:2444-2448,1998)來測量，被翻譯的DNA序列的概率通過計算機算法TBLASTX測量，而蛋白質序列的概率通過計算機算法BLASTP測量(Altschul,S.F.等分子生物學雜志.，215:403-410,1990)。因此，如上述任何試驗所測量的，術語“變體”包含那些其中隨機配對的概率(最小總概率)低于約1％的序列。
本發(fā)明多肽可與位于所述蛋白質N末端的信號(或先導區(qū))序列偶聯(lián)，該序列共翻譯或翻譯后指導所述蛋白質的轉運。所述多肽還可與接頭或其他序列偶聯(lián)以便利合成，純化或鑒定該多肽(例如多組氨酸)，或促進所述多肽與固相支持物的結合。例如，一種多肽可與免疫球蛋白Fc段偶聯(lián)。
一般來說，牝牛分枝桿菌抗原和編碼此類抗原的DNA序列可用各種方法中的任何方法來制備。例如，從牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物可分離可溶性抗原，如下所述。通過插入一個編碼所述抗原的DNA序列到一表達載體中并在適當宿主中表達該抗原也可經(jīng)重組生產(chǎn)抗原?？墒褂帽绢I域普通技術人員已知的各種表達載體的任何一種。在經(jīng)過含編碼重組多肽的DNA分子的表達載體轉化或轉染的任何適當宿主細胞中均可得到表達。適合的宿主細胞包括原核生物，酵母和高等真核生物細胞。優(yōu)選使用的宿主細胞是大腸桿菌，分枝桿菌，昆蟲，酵母或哺乳動物細胞系如COS或CHO。以此方式表達的DNA序列可編碼天然存在的抗原，天然存在的抗原之部分，或其他相應的變體。
編碼牝牛分枝桿菌抗原的DNA序列可通過在適當?shù)年蚺７种U菌cDNA或基因組DNA庫中篩選與被分離出的可溶性抗原之部分氨基酸序列的簡并寡核苷酸雜交的DNA序列來獲得。適當?shù)暮啿⒐押塑账峥杀辉O計和被合成，并且所述篩選可按例如在Maniatis等的分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，紐約冷泉港，1989中所述方法來進行。如下所述，可用聚合酶鏈式反應(PCR)從cDNA或基因組DNA文庫中分離核酸探針。然后用所分離的探針可進行所述文庫的篩選。
通過用特異性針對牝牛分枝桿菌抗原產(chǎn)生的抗血清(例如，兔或猴)篩選適當?shù)年蚺７种U菌表達庫也可分離編碼牝牛分枝桿菌抗原的DNA分子。
無論制備方法如何，本文所述抗原有誘導免疫反應的能力。特別是，所述抗原有誘導細胞增殖和/或在結核分枝桿菌免疫個體來源的T細胞，NK細胞，B細胞或巨噬細胞中產(chǎn)生細胞因子的能力(例如γ干擾素和/或白細胞介素-12的生產(chǎn))。結核分枝桿菌免疫個體是被認為由于已獲得了對結核分枝桿菌的有效T細胞反應能力而對結核病的發(fā)生有抵抗力的個體?；趯Y核病蛋白(PPD)的強陽性(即高于約10毫米直徑硬結)皮內(nèi)皮試反應和無任何結核病感染癥狀即可鑒別此類個體。
對用于評估一種抗原的致免疫反應的細胞型的選擇將取決于所需要進行的反應。例如，白細胞介素-12的產(chǎn)生最易于使用含B細胞或巨噬細胞的制劑進行評估。源于結核分枝桿菌免疫個體的T細胞，NK細胞，B細胞和巨噬細胞可使用本領域熟知的方法來制備。例如，可使用外周血單核細胞(PBMCs)制劑而無須進一步分離組分細胞。例如，使用FicollTM(Winthrop Laboraotries,NY)密度離心可制備PBMCs。在本文所述檢測中使用的T細胞可直接從PBMCs純化。或者，可使用針對分枝桿菌蛋白質發(fā)生反應而富集的T細胞系，或與個體分枝桿菌蛋白質反應的T細胞克隆。例如可通過用分枝桿菌蛋白質培養(yǎng)結核分枝桿菌免疫的個體來源的PBMCs細胞2-4周產(chǎn)生此類T細胞克隆。這使得僅擴展分枝桿菌蛋白質特異性T細胞，從而產(chǎn)生僅由此類細胞組成的細胞系。然后這些細胞可被克隆并用個體蛋白質檢測之(所使用的方法是本領域所熟知的)以便更精確定義個體T細胞的特異性。例如用下述方法可進行細胞增殖或T細胞，NK細胞，B細胞或巨噬細胞中細胞因子產(chǎn)生方面的檢測。
一般來說，致免疫抗原是那些刺激增殖或在T細胞，NK細胞，B細胞或巨噬細胞中產(chǎn)生細胞因子(即產(chǎn)生γ干擾素和/或白細胞介素-12)的抗原，所述細胞來自于至少約25％的結核分枝桿菌免疫個體。在這些致免疫抗原中，根據(jù)上述檢測中的反應程度和被觀察到反應的個體百分比可鑒定出有較強治療性能的多肽。此外，在從約25％以上的非結核分枝桿菌免疫個體來源的細胞中，有較強治療性能的抗原不會刺激離體細胞增殖或細胞因子產(chǎn)生，因而排除了那些不是特異性地由于結核分枝桿菌反應性細胞引起的反應。因此，在高比率的結核分枝桿菌免疫個體來源的T細胞，NK細胞，B細胞或巨噬細胞中誘導反應的那些抗原(對源于其他個體的細胞制劑有低的反應發(fā)生率)有較高的治療性能。
當作為疫苗施用時，有較高治療性能的抗原還可根據(jù)其減小實驗動物中結核分枝桿菌感染(或其他分枝桿菌感染)的嚴重性之能力而得到鑒定。用于實驗動物的適合疫苗制劑在下面詳細描述。
有較高診斷性能的抗原一般可根據(jù)在活動期結核病個體進行的內(nèi)皮皮試中引發(fā)反應(但在未受結核分枝桿菌感染的個體進行的皮試中不引發(fā)反應)的能力來鑒定。一般來說，皮試可按如下描述進行，至少約5毫米硬結的反應視為陽性。
本文描述的抗原致免疫部分可用眾所周知的技術來制備和鑒定，如1993年Raven出版的Paul，基礎免疫學第三版第243-247頁中總結的技術。此類技術包括篩選天然抗原多肽部分的致免疫性能。在這些篩選中，可使用本文描述的對代表性細胞增殖和細胞因子生產(chǎn)的檢測。一種多肽的致免疫部分是(在此類代表性檢測中)產(chǎn)生免疫反應(例如，細胞增殖，γ干擾素產(chǎn)生或白細胞介素-12產(chǎn)生)的部分，該反應基本類似于由全長抗原所產(chǎn)生的反應。換句話說，在本文描述的模型增殖檢測中，一個抗原的致免疫部分可產(chǎn)生至少約20％，優(yōu)選約65％并最優(yōu)選約100％的由全長抗原誘導的增殖?；蛘?，在本文描述的模型增殖測試中，一個致免疫部分也可刺激由全長抗原誘導的至少約20％，優(yōu)選約65％，并最優(yōu)選約100％γ干擾素和/或白細胞介素-12的產(chǎn)生。
牝牛分枝桿菌抗原的部分或其他變體可通過合成或重組方法而產(chǎn)生。使用本領域的普通技術人員熟知的技術可生產(chǎn)含低于約100個氨基酸，和一般低于約50個氨基酸的合成多肽。例如，使用任何市售固相技術，如Merrifield固相合成法，可合成此類多肽，在該合成法中，氨基酸被順序加入到增長的氨基酸鏈上。參見Merrifield，美國化學協(xié)會雜志。85:2149-2146,1963。自動合成多肽的設備可從供應商購得，如Perkin Elmer/Applied BioSystems,Inc.(Foster City,CA)，并且可按照廠商指導操作。用標準誘變技術，如寡核苷酸指導的位點專一性誘變，可制備天然抗原的變體。用標準技術還可除去所述DNA序列的片段以制備截短的多肽。
一般說，不管制備方法如何，所制備的本文公開的多肽是基本純的形式。所述多肽優(yōu)選至少約80％純，更優(yōu)選至少約90％純并最優(yōu)選至少約99％純。在下面詳述的某些優(yōu)選實施方案中，基本純的多肽摻入藥用組合物或疫苗中以在一個或多個本文公開的方法中使用。
本發(fā)明還提供含第一和第二發(fā)明的多肽或(可選擇地)本發(fā)明的一種多肽和一已知結核分枝桿菌抗原(如Andersen and Hansen，感染免疫學.57:2481-2488,1989中描述的38kD抗原)的融合蛋白，以及此類融合蛋白的變體。本發(fā)明融合蛋白還可在第一和第二多肽之間包括一個接頭肽。
用已知重組DNA技術可構建編碼本發(fā)明融合蛋白質的DNA序列以將編碼第一和第二多肽的分離的DNA序列裝配到一個適當?shù)谋磉_載體中。將編碼第一多肽的DNA序列的3’端(有或無肽接頭)連接到編碼第二多肽的DNA序列5’端，使所述序列的閱讀框的相位吻合以使所述兩個DNA序列的mRNA翻譯成為單一的融合蛋白，該蛋白保留了第一和第二多肽的生物學活性。
可使用肽接頭序列以分開第一和第二多肽一段距離，該距離足以保證每個多肽折疊成其二級和三級結構。使用本領域熟知的標準技術使這種肽接頭序列摻入到所述融合蛋白中。可根據(jù)下面因素選擇適當?shù)碾慕宇^序列(1)它們能夠采取靈活伸展的構像；(2)它們不能采取可干擾第一和第二多肽功能表位的二級結構；和(3)無與所述多肽功能表位發(fā)生反應的疏水或帶電的殘基。優(yōu)選的肽接頭序列含G1y,Asn和Ser殘基。其他近中性氨基酸，如Thr和Ala也可被用于所述接頭序列中?？杀皇钟杏玫挠米鼋宇^的氨基酸序列包括Maratea等，基因40:39-46,1985；Murphy等，美國科學院學報83:8258-8262,1986,U.S.專利號4,935,233和U.S.專利號4,751,180中所公開的序列。所述接頭序列可以是從1到約50氨基酸長度。當?shù)谝缓偷诙嚯暮杀挥糜诜珠_功能區(qū)和防止空間相互作用的非必需N-末端氨基酸區(qū)時，就不需要肽接頭序列。
用本領域普通技術人員已知的技術將編碼所述融合蛋白的連接好的DNA序列克隆到適合的表達載體。
另一方面，本發(fā)明提供使用一種或多種發(fā)明的多肽或融合蛋白(或編碼此類多肽或融合蛋白的DNA分子)在患者體內(nèi)誘導抗結核病的保護性免疫力的方法。如本文所使用的，“患者”指任何溫血動物，優(yōu)選指人。患者可患有一種疾病或可以沒有可檢測出的疾病或感染。換句話說，保護性免疫力可被誘導以預防或治療結核病。
在這方面，所述多肽，融合蛋白或DNA分子一般存在于一種藥用組合物或疫苗中。藥用組合物可包含一種或多種多肽，其中每種可含一個或多個上述序列(或其變體)，和包含一種生理可接受的載體。疫苗可包含一種或多種上述多肽和非特異性免疫反應放大劑，如一種佐劑或脂質體，多肽被摻入其中。這類藥用組合物和疫苗還可含其他分枝桿菌抗原，包括如上討論的摻入到融合蛋白中的或存在于分開的多肽中的抗原。
或者，本發(fā)明的疫苗可含編碼一個或多個如上述多肽之DNA，以便原位產(chǎn)生該多肽。在此類疫苗中，所述DNA可存在于本領域普通技術人員所熟知的各種運載系統(tǒng)的任何系統(tǒng)中，包括核酸表達系統(tǒng)，細菌和病毒表達系統(tǒng)。適當?shù)暮怂岜磉_系統(tǒng)含在患者中表達所必需的DNA序列(如適當?shù)膯幼雍徒K止子信號)。細菌運載系統(tǒng)包含細菌(如Bacillus-Calmette-Guerrin)的用法，該細菌在其細胞表面表達所述多肽的致免疫部分。在一個優(yōu)選實施方案中，用一種病毒表達載體(例如痘苗病毒或其他痘病毒，逆轉錄病毒，或腺病毒)可引入所述DNA，該實施方案可包含使用一種非病原性，或防御性復制感受態(tài)病毒。將DNA摻入到此類表達系統(tǒng)的技術是本領域所熟知的。所述DNA也可以是“裸露的”，例如Ulmer等在科學259:1745-1749,1993中所描述的和Cohen在科學259:1691-1692,1993中所綜述的。通過將所述DNA包被在高效轉運進入細胞的可被生物降解的珠上能增加裸DNA的吸入。
如上述的DNA疫苗可與本發(fā)明多肽或與已知的分枝桿菌抗原(如上述38KD抗原)同時或先后被施用。例如，可在施用編碼本發(fā)明多肽的DNA后施用一種抗原以增強所述疫苗的保護免疫作用。
施用的途徑和頻率以及劑量將隨各個個體而不同并可與使用BCG進行的免疫方法中所流行使用的途徑，頻率和劑量相對應。一般來說，可通過注射(例如皮內(nèi)，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)或皮下)，鼻內(nèi)施用(例如通過吸入)或口服，施用所述藥用組合物和疫苗。在1-36周間隔可使用1到3份之間的劑量。在3-4個月的間隔施用3份劑量，此后可定期給予加強疫苗接種。對各個患者可有不同的適用方案。當按上述方案施用時，適當?shù)膭┝渴悄苁够颊弋a(chǎn)生的免疫反應足以保護該患者在至少1-2年免受分枝桿菌感染的多肽或DNA的量。一般來說，存在于一份劑量中的多肽的量(或由一份劑量中所述DNA在原位所產(chǎn)生的多肽的量)范圍從每公斤宿主約1pg到約100mg，一般從約10pg到約1mg，并優(yōu)選從約100pg到約1微克。適合的劑量將隨患者的大小而不同，但一般范圍將在約0.1mL到約5mL。
盡管本領域普通技術人員所熟知的任何適當載體可用于本發(fā)明的藥用組合物中，但載體類型將隨施用的模式而有所不同。對于腸胃外施用來說，如皮下注射，所述載體優(yōu)選包含水，生理鹽水，乙醇，脂肪，臘或緩沖液。對經(jīng)口施用來說，可使用上述任何載體或固態(tài)載體，如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸鎂?？杀簧锝到獾奈⑶蝮w(例如，聚交酯半乳糖胺)也可被用做本發(fā)明的藥用組合物載體。例如，適當?shù)目缮锝到獾奈⑶蝮w被公開在美國專利號4,897,268和5,075,109中。
在本發(fā)明疫苗中可使用各種佐劑的任何一種以便非特異增強所述免疫反應。大多數(shù)佐劑含一種被稱為保護抗原免于迅速降解的物質，如氫氧化鋁或礦物油，和免疫反應的非特異性刺激因子，如脂質A，百日咳博德特氏菌，結核分枝桿菌，或如下討論的，牝牛分枝桿菌。有適當?shù)氖惺圩魟鏔reund’s不完全佐劑和Freund’s完全佐劑(Difco Laboratories,Detroit,MI)和Merck佐劑65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,NJ)。其他適當佐劑包括明礬，可生物降解微球體，單磷酸脂質A和QuilA。
另一方面，本發(fā)明提供使用一種或多種上述多肽經(jīng)皮試診斷結核病的方法。如本文所使用的，“皮試”是在患者身上直接進行的任何檢測，其中在皮內(nèi)注射一種或多種上述多肽后檢測到延遲類型的過敏(DTH)反應(如腫脹，變紅或皮炎)。優(yōu)選在注射后至少48小時，更優(yōu)選在48-72小時檢測所述反應。
所述DTH反應是細胞介導的免疫反應，該反應在經(jīng)過事先接觸所述實驗抗原(即，所使用的多肽致免疫部分，或其變體)的患者中較強。用尺子可對所述反應做肉眼測量。一般說，直徑大于約0.5cm，優(yōu)選直徑大于約1.0cm的反應是陽性反應(結核病的指標)。
用于皮試的本發(fā)明多肽優(yōu)選配制為含如上述的一種多肽和一種生理可接受的載體的藥用組合物。此類組合物一般含一種或多種上述多肽，在0.1毫升體積中其量的范圍從約1微克到約100微克，優(yōu)選從約10微克到約50微克。此類藥用組合物中使用的載體優(yōu)選是含適當防腐劑如酚和/或吐溫80吐溫TM的生理鹽水。
在一個優(yōu)選實施方案中，皮試使用的多肽有足夠大小以便其在反應期間仍保持在注射部位。一般說，至少9個氨基酸長度的多肽是足夠的。所述多肽還可優(yōu)選被巨噬細胞或樹狀細胞在注射的數(shù)小時內(nèi)降解以使其呈遞給T細胞。此類多肽可含一個或多個上述序列的重復片段或其他致免疫或非致免疫的序列。
另一方面，提供了使用一種或多種上述多肽(單獨或結合)檢測生物學樣品中分枝桿菌感染的方法。在使用多個多肽的實施方案中，非本文所特別描述的多肽，如上述38KD抗原亦可被包括在內(nèi)。如本文所使用的“生物學樣品”是從患者得到的任何含抗體的樣品。所述樣品優(yōu)選是全血，痰，血清，血漿，唾液，腦脊液或尿。所述樣品更優(yōu)選是從患者或血源得到的血，血清或血漿樣品。如下所述，多肽被用于檢測中以確定在所述樣品中相對于預定臨界值是否存在抗所述多肽的抗體。此類抗體的存在表明結核分枝桿菌感染的存在。
在使用一種以上的多肽的實施方案中，所用的多肽優(yōu)選是互補的(即，一種組成多肽能測出樣品中用另一種組成多肽測不出的感染)。通過分別使用每個多肽評估來源于已知被分枝桿菌感染的一系列患者血清樣品，一般可鑒定出互補的多肽。在用每個多肽確定了何種樣品檢測為陽性(如下述)之后，可配制能檢測多數(shù)(或全部)被測樣品中感染情況的兩種或兩種以上多肽組合物。例如，約25-30％來自結核病感染個體的血清是任何單一蛋白質(如上述38KD抗原)抗體陰性的。因此，互補多肽可與38KD抗原結合使用以促進診斷測試的敏感性。
利用一種或多種多肽檢測樣品中抗體的測試方案是本領域眾所周知的。例如，參見Harlow and Lane，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988。在一個優(yōu)選實施方案中，所述測試包含使用固定化在固體支持物上的多肽以結合和除去所述樣品中的抗體。然后用含報道基團的檢測試劑可檢測結合的抗體。適當?shù)臋z測試劑包括結合到抗體/多肽復合物的抗體和標記有報道基團的游離多肽(例如在半競爭性測試中的)?；蛘?，可使用競爭性測試，其中結合到所述多肽的抗體用報道基團標記并在所述抗原與所述樣品溫育之后使其與固定化抗原結合。所述樣品組分抑制被標記抗體與多肽結合的程度是該樣品與所述固定化多肽發(fā)生反應的能力的指標。
固體支持物可以是所述抗原可附著的任何固體物質。適當?shù)牟牧鲜潜绢I域眾所周知的。例如，所述固體支持物可以是微滴定板中的一個檢測孔?；蛳跛崂w維素或其他適當?shù)哪??；蛘咚鲋С治锸侵榛蚱桨?，如玻璃，玻璃纖維，乳膠或塑料物質如聚苯乙烯或聚氯乙烯。所述支持物也可以是鎂顆?；蚬饫w傳感器，例如在美國專利號5,359,681中描述的。
使用本領域眾所周知的各種技術可將所述多肽結合到固體支持物上。在本發(fā)明文章中，術語“結合”意指非共價聯(lián)系(如吸附)和共價附著，它可以是所述抗原與功能基團在所述支持物上的直接連接或通過交聯(lián)試劑的方式而形成的連接。優(yōu)選通過吸附而結合到微滴定板的孔或結合到膜上。在此類情況下，通過將所述多肽(在一種適當?shù)木彌_液中)與所述固體支持物接觸一段適當?shù)臅r間可達到吸附作用。接觸的時間隨溫度而不同，但一般是在約1小時到1天之間。一般來說，將塑料微滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的一個孔與約10ng到約1微克(并優(yōu)選100ng)范圍多肽的量相接觸就足以結合足夠量的抗原。
通過首先用能與所述支持物和所述多肽上的功能基團(如羥基或氨基)均起反應的雙功能試劑與該支持物反應，一般可實現(xiàn)多肽共價附著到固體支持物上。例如，使用苯醌或通過支持物上的醛基與多肽上的氨基和活性氫縮合可將所述多肽結合到含適當多聚體包被的支持物上(例如，參見Pierce免疫技術目錄和手冊，1991，在A12-A13)。
在某些實施方案中，所述測試是酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)。這種測試可通過首先將已被固定化在一種固體支持物上的多肽抗原與所述樣品接觸來進行，以使樣品中該多肽的抗體結合到固定化多肽上。然后從所述固定化多肽中除去未結合的樣品并加入能結合所述固定化抗體-多肽復合物的檢測試劑。然后，用適合于所述特異性檢測試劑的方法測定保持與所述固體支持物結合的檢測試劑的量。
更具體地說，一旦如上述將多肽固定在支持物上，一般就封閉了支持物上的其余蛋白質結合部位?？墒褂帽绢I域普通技術人員所熟悉的任何適當封閉試劑，如牛血清白蛋白或吐溫20TM(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)。然后，與所述樣品一起溫育所述固定化多肽，并使抗體結合到所述抗原。在溫育前，用適當?shù)南♂屢?，如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)稀釋該樣品。一般來說，合適的接觸時間(溫育時間)是足以檢測出存在于結核分枝桿菌感染的樣品中的抗體所經(jīng)歷的時間。優(yōu)選的是，所述接觸時間足以達到在結合與未結合抗體的平衡中至少95％結合的水平。通過檢測一段時間后而發(fā)生結合的水平，可容易測定達到平衡所必需的時間。在室溫下，一般約30分鐘的溫育時間是足夠的。
通過用適當緩沖液，如含0.1％吐溫20TM的PBS洗滌所述固體支持物可除去未結合的樣品。然后可加入檢測試劑到所述固體支持物。一種合適的檢測試劑是結合到固定化抗體-多肽復合物并可通過本領域已知各種方法的任何方法能檢測到的的任何化合物。所述檢測試劑優(yōu)選含偶聯(lián)到報道基團的一種結合試劑(例如，蛋白A，蛋白G，免疫球蛋白，凝集素或游離抗原)。優(yōu)選的報道基團包括酶(如辣根過氧化物酶)，底物，輔助因子，抑制劑，染料，放射性核素，發(fā)光基團，熒光基團和生物素。用本領域所知的標準方法可達到結合試劑與報道基團的偶聯(lián)。從許多商家來源(例如，Zymed Laboratories,SanFrancisco,CA，和Pierce,Rockford,IL)可買到偶聯(lián)到各種報道基團的常用結合試劑。
將所述檢測試劑與所述固定化抗體-多肽復合物溫育一段足以測出所述結合抗體的時間。根據(jù)生產(chǎn)商的指導或通過檢測一段時間后發(fā)生結合的水平，一般可確定合適的時間。然后除去未結合的檢測試劑并使用報道基團檢測結合的檢測試劑。檢測所述報道基團所使用的方法取決于該報道基團的性質。對放射性基團而言，閃爍記數(shù)或放射自顯影方法一般是適合的?？捎蔑@微鏡方法檢測染料，發(fā)光基團和熒光基團。使用偶聯(lián)到一種不同的報道基團(通常是一種放射性或熒光基團或一種酶)的抗生物素蛋白可檢測生物素。通過加入底物(一般經(jīng)過一段特定的時間)，然后通過分光光度術或其他反應產(chǎn)物分析可檢測酶報道基團。
為測定所述樣品中是否存在抗-分枝桿菌抗體，一般將從保持與所述固體支持物結合的報道基團檢測到的信號與相應于預定臨界值的信號比較。在一個優(yōu)選實施方案中，臨界值是與未受感染的受試者來源的樣品一起溫育所述固定化抗原時得到的信號平均值。在另一優(yōu)選實施方案中，所述臨界值是用Receiver Operator Curve，按照Sackett等的方法測定的，Clinical Epidemiology:A Basic Science ForClinical Medicine,Little Brown and Co.,1985,pp.106-107。一般來說，比預定臨界值高的信號被認為是分枝桿菌感染陽性。
在快速流過或試紙條檢測形式中也可進行所述測試，其中所述抗原被固定化在一種膜上，如纖維素膜。在流過檢測中，在所述樣品通過膜時，樣品中的抗體結合到固定化多肽上。然后當含檢測試劑的溶液流過所述膜時，檢測試劑(例如，蛋白A-膠體金)與抗體-多肽復合物結合。然后，如上述進行被結合的檢測試劑的檢測。在試紙條檢測形式中，多肽結合于其上的膜的一端被浸入含所述樣品的溶液中。樣品沿該膜遷移通過含檢測試劑的區(qū)域并到達固定化多肽的區(qū)域。在所述多肽上的檢測試劑的濃度表明所述樣品中抗-分枝桿菌抗體的存在。一般來說，位于該部位的檢測試劑濃度產(chǎn)生一種圖形如一條線，該線可肉眼判讀。沒有此圖形指示出陰性結果。一般說，對固定化在所述膜上的多肽的量進行篩選，以在所述生物學樣品含足以在ELISA(如上討論的)中產(chǎn)生陽性信號的抗體水平時，產(chǎn)生一種肉眼清晰可見的圖形。固定化在所述膜上的多肽的量優(yōu)選范圍從約25ng到約1微克，并更優(yōu)選從約50ng到約500ng。此類檢測一般用非常小量(例如一滴)患者血清或血液就能進行。
還存在許多適用于本發(fā)明多肽的其它測定方案。上面的描述僅僅試圖作為舉例性的。
本發(fā)明還提供抗所述發(fā)明多肽的抗體。通過本領域普通技術人員所熟知的各種技術之任何一種即可制備抗體。例如，參見Harlow和Lane，抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988。在一種此類技術中，含所述抗原多肽的免疫原開始被注射給大范圍內(nèi)的任何哺乳動物(例如，小鼠，大鼠，兔，綿羊和山羊)。優(yōu)選按預先確定的日程，結合一次或多次增強免疫給所述動物宿主注射免疫原，并定期對所述動物取血。然后通過例如親和層析用偶聯(lián)到適當固體支持物的多肽，從此類抗血清可純化對所述多肽特異的多克隆抗體。
用例如Kohler和Milstein，歐洲免疫學雜志.6:511-519,1976的技術及其改進方法可制備對目的物抗原多肽特異的單克隆抗體。簡言之，這些方法包括制備能產(chǎn)生含所需特異性(即，與目的多肽的反應性)之抗體的無限增殖細胞系。例如，從如上述免疫的動物得到的脾細胞可產(chǎn)生此類細胞系。然后，使用本領域眾所周知的任何技術，通過與骨髓瘤細胞融合伴侶(優(yōu)選與所述被免疫動物是同源的)融合可無限增殖化所述脾細胞。
從所得雜交瘤克隆的上清可分離單克隆抗體。此外，可使用各種技術提高產(chǎn)量，如將所述雜交瘤細胞系注射進適合的脊椎動物宿主(如小鼠)的腹腔。然后，從其腹水或其血液可收獲單克隆抗體。
用類似于上述或本領域技術人員熟知的其他技術也可將抗體使用在檢測分枝桿菌抗原存在的診斷檢測中，由此提供檢測患者的分枝桿菌感染，如結核分枝桿菌感染的方法。
本發(fā)明的診斷試劑還包括編碼一種或多種上述多肽(或其一部分或多部分)的DNA序列。例如，含受試DNA序列的至少10個連續(xù)寡核苷酸的引物可被用于聚合酶鏈反應(PCR)為基礎的檢測。同樣，含受試DNA序列的至少18個連續(xù)寡核苷酸的探針可被用于與特異序列雜交。PCR為基礎的檢測和雜交檢測技術均是本領域眾所周知的。因此，引物或探針可被用于檢測生物學樣品中，優(yōu)選的是痰，血液，血清，唾液，腦脊液或尿中結核分枝桿菌和其他分枝桿菌感染。含上述寡核苷酸序列的DNA探針或引物也可被單獨使用，互相結合使用，或與先前鑒定過的序列(如上面討論的38KD抗原)結合使用。
如上所討論的，有效的疫苗含至少兩種不同成分。第一種是含抗原的多肽，該抗原被巨噬細胞和其他抗原呈遞細胞加工并展現(xiàn)給CD4+T細胞或CD8+T細胞。這種抗原形成免疫反應的“特異”目標。疫苗的第二種成分是非特異性免疫反應放大劑，如佐劑或抗原被結合于其中的脂質體。佐劑放大針對結構上無關的化合物或多肽的免疫反應。幾種佐劑是從微生物制備的，如百日咳博德特氏菌，結核分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG。佐劑也可含設計成保護多肽抗原免于降解的成分，如氫氧化鋁或礦物油。
當一種疫苗的抗原成分含有指導對特異病原體(如結核分枝桿菌)進行免疫攻擊的多肽時，佐劑常能廣泛應用于許多不同的疫苗配方。某些病原體(如結核分枝桿菌)以及某些癌受到由T細胞指導的免疫攻擊(稱為細胞介導的免疫)的有效控制。其他病原，如脊髓灰質炎病毒，還需要由B細胞產(chǎn)生的抗體來抑制。這些不同種類的免疫攻擊(T細胞或B細胞)受不同的CD4+T細胞亞群(通常指Th1和Th2細胞)的控制。一種佐劑的理想特性是選擇性放大CD4+T細胞的Th1或Th2群之功能的能力。如下面實施例6中所示，已發(fā)現(xiàn)牝牛分枝桿菌和高壓消毒的牝牛分枝桿菌被修飾的形式具有佐劑特性。如本文所使用的，術語“被修飾的牝牛分枝桿菌”包括去脂的牝牛分枝桿菌細胞，去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞和既去脂又去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞(下文表示為DD-牝牛分枝桿菌)。而且，業(yè)已發(fā)現(xiàn)牝牛分枝桿菌產(chǎn)生的化合物能放大對牝牛分枝桿菌抗原以及其他來源之抗原的免疫反應。因此本發(fā)明提供增強對抗原發(fā)生免疫反應的方法，包括施用被殺死的牝牛分枝桿菌細胞，牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物或被修飾的牝牛分枝桿菌細胞。如下面詳述，進一步研究業(yè)已證明這種非特異性免疫放大作用是(至少部分是)由于牝牛分枝桿菌多肽具有與先前在結核分枝桿菌中鑒定出的熱休克蛋白65(GroEL)的同源性。
如下面實施例10中所述，還發(fā)現(xiàn)加熱殺死的牝牛分枝桿菌和牝牛分枝桿菌組分有細胞因子刺激特性。特別是，已發(fā)現(xiàn)加熱殺死的牝牛分枝桿菌，凍干牝牛分枝桿菌和DD-牝牛分枝桿菌刺激巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素12(IL-12)。從巨噬細胞產(chǎn)生IL-12被認為能增強Th1免疫反應的刺激作用。
通過解釋的方式而非限制的方式提供出下面的實施例。
實施例1用牝牛分枝桿菌免疫小鼠對結核病的影響本實施例闡明在用活結核分枝桿菌攻擊之前，使用牝牛分枝桿菌或牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物在小鼠中免疫接種產(chǎn)生的影響。
在無菌培養(yǎng)基90中(酵母提取物2.5克/升；蛋白胨，5克/升；葡萄糖，1克/升)于37℃培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)。通過離心收集所述細胞，并將其轉移到含葡萄糖的無菌Middlebrook7H9培養(yǎng)基中(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)，于37℃培養(yǎng)一天。然后離心所述培養(yǎng)基以沉降細菌，并除去培養(yǎng)濾出物。所述細菌沉降物以10毫克/毫升的濃度被重懸浮于磷酸緩沖生理鹽水中，該濃度相當于每毫升1010個牝牛分枝桿菌。然后將所述細胞懸液在120℃高壓消毒15分鐘。將該培養(yǎng)濾出物通過一個0.45微米的濾器進入無菌瓶中。
如圖1A所示，當用1毫克，100微克或10微克牝牛分枝桿菌免疫小鼠并在3周后用5×105菌落形成單位(CFU)的活結核分枝桿菌H37Rv感染，可見到免受感染的明顯保護作用。在此實施例中，收集感染3周后的小鼠脾，肝和肺組織，并測定活桿菌(以CFU表示)。當與來自非免疫的對照組小鼠比較時，在肝和肺組織中，桿菌數(shù)的降低超過2個對數(shù)值而在脾組織中超過1個對數(shù)值。用加熱殺死的結核分枝桿菌H37Rv免疫小鼠對隨后用活結核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠沒有明顯保護作用。
圖1B表明當用100微克牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物免疫小鼠時，并在3周后用5×105CFU結核分枝桿菌H37Rv感染，也可見到明顯保護作用。當感染3周后從小鼠收集脾，肝和肺組織時，測定活桿菌數(shù)(CFU)，與非免疫對照小鼠比較觀察到活菌數(shù)減少1-2個對數(shù)值。
實施例2來自牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的多肽的純化及特征鑒定本實施例闡明從培養(yǎng)濾出物制備牝牛分枝桿菌可溶性蛋白質。除非另有注釋，下面實施例中的全部百分比是每體積的重量。
在無菌培養(yǎng)基90中，37℃培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)。通過離心收集細胞并將其轉移到有葡萄糖的無菌Middlebrook7H9培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)一天。然后離心培養(yǎng)基(留下大部分細胞)并通過一只0.45微米的濾器將其濾入無菌瓶中。
通過冷凍干燥濃縮培養(yǎng)濾出物，并重新溶于MiliQ水中。通過0.45微米濾膜過濾除去少量不溶性物質。通過在含3,000千道爾頓分子量截留值(MWCO)膜的400毫升Amicon攪拌池中的濾膜過濾使所述培養(yǎng)濾出物脫鹽。用氮氣維持氣壓在50磅/平方英寸。通過膜過濾反復濃縮培養(yǎng)濾出物并用水稀釋直到所述樣品的傳導率小于1.0mS。這種方法將20升體積減小到50毫升。通過Brandford蛋白質測試法(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)測定蛋白質濃度。
通過離子交換層析在10毫摩爾Tris-HCI,pH8.0緩沖液平衡的Q-瓊脂糖(Pharmacia Biotech,Uppsale,Sweden)柱(16×100mm)上分級分離被脫鹽的培養(yǎng)濾出物。用線性梯度為0到1.0摩爾的氯化鈉在上述緩沖系統(tǒng)中洗脫多肽。在280納米波長監(jiān)測柱的洗脫液。
從所述離子交換柱洗脫收集的多肽被濃縮在一只400毫升含3,000MWCO膜的Amicon攪拌池中。用氮氣維持壓力在50磅/平方英尺。通過膜過濾反復濃縮所述多肽并用1％甘氨酸洗脫直到所述樣品的傳導率小于0.1mS。
然后，通過預制等電聚焦，在Rotofor裝置中(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)分級分離被純化的多肽。用含1.6％,pH3.5-5.0兩性電解質和0.4％,pH5.0-7.0兩性電解質的兩性電解質混合物(PharmaciaBiotech)建立所述pH梯度。醋酸(0.5M)作為陽極電解液，0.5M乙醇胺作為陰極電解液。按照廠商的指導，等電聚焦在12W恒功率下進行6小時。得到20個餾分。
匯合從等電聚焦得到的餾分，并在Vydac C4柱上(SeparationGroup,Hesperia,CA,USA)300?？讖?，5微米粒子大小(10×250毫米)純化所述多肽。用線性梯度的乙腈(0-80％v/v)在0.05％(v/v)三氟乙酸(TFA)中從柱中洗脫所述多肽。流速是2.0毫升/分鐘，并在220納米監(jiān)測HPLC洗脫液。收集含多肽的餾分以使各個樣品純度達到最大。
較為富集的多肽餾分在Vydac C4柱上(Separation Group)300?？讖?，5微米粒子大小(4.6×250毫米)被再次層析。用線性梯度為20-60％(v/v)乙腈在0.05％(v/v)FTA中，以流速1.0毫升/分鐘從柱中洗脫所述多肽。在220納米監(jiān)測柱洗脫液。含被洗脫多肽的餾分被收集以使各個樣品的純度最大化。得到約20個多肽樣品，并在聚丙烯酰胺凝膠上按照Laemmli(Laemmli,U.K.，自然277:680-685,1970)的方法分析它們的純度。
表現(xiàn)出含明顯污染的多肽餾分用Mono Q柱(Pharmacia Biotech)10微米粒子大小(5×50毫米)或用Vydac Diphenyl柱(SeparationsGroup)300埃孔徑，5微米粒子大小(4.6×250毫米)進一步被純化。用線性梯度為0-0.5摩爾氯化鈉在10毫摩爾Tris HCI pH8.0中從Mono Q柱洗脫多肽。用乙腈線性梯度(20-60％v/v)在0.1％TFA中從Vydac Dophenyl柱洗脫多肽。流速是1.0毫升/分鐘，并在220納米監(jiān)測兩柱的柱洗脫液。收集多肽峰值餾分并在如上述的15％聚丙烯酰胺凝膠上分析純度。
為測序，在BiobreneTM(Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision,Foster City,CA)處理的玻璃纖維濾器上分別干燥各多肽。帶有多肽的所述濾器被上載到Perkin Elmer/Applied BioSystemsProcise 492蛋白質測序儀并從氨基末端用傳統(tǒng)Edman化學法測序所述多肽。通過將PTH氨基酸衍生物的保留時間與適當?shù)腜TH衍生物標準比較確定每個多肽的氨基酸序列。
通過用內(nèi)切蛋白酶Lys-C消化所述抗原，或通過用溴化氰化學斷裂所述抗原也可測定一些抗原上的內(nèi)部序列。通過Vydac C18柱上的反相HPLC用流動相為0.05％(v/v)三氟乙酸在含0.05％(v/v)TFA(1％/分鐘)的乙腈梯度中分開這些方法任何之一所得到的肽。在214納米監(jiān)測所述洗脫液。通過其紫外吸收鑒別主要的內(nèi)部肽，并如上述監(jiān)測其N末端序列。
使用上述方法，分離到6種可溶性牝牛分枝桿菌抗原，稱為GVc-1,GVc-2,GVc-7,GVc-13,GVc-20和GVc-22。測定的GVc-1N-末端和內(nèi)部序列分別在SEQ ID NOS:1,2和3中給出；GVc-2的N末端序列在SEQ ID NO:4中給出；GVc-7的內(nèi)部序列在SEQ ID NOS:5-8中給出；GVc-13的內(nèi)部序列在SEQ ID NOS:9-11中給出；GVc-20的內(nèi)部序列在SEQ ID NO:12中給出；和GVc-22N端序列和內(nèi)部序列在SEQ ID NO:56-69中分別給出。本文所提供的每個內(nèi)部肽序列以推測存在于所述多肽的該部位之氨基酸殘基開始，所推測的部位基于已知的溴化氰(Met)或Lys-C(Lys)斷裂特異性。
除上述預制等電聚焦方法外，使用預制十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)純化步驟分離出三個另外的多肽，稱為GVc-16,GVc-18和GVc-21。特別是，含來自先前描述的預制等電聚焦純化步驟之多肽混合物的餾分，通過預制SDS-PAGE在15％聚丙烯酰胺凝膠上被純化。所述樣品被溶于還原樣品緩沖液中并載入凝膠。通過在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩爾3-(環(huán)己亞胺)-1-丙磺酸(CAPS)緩沖液中電印跡將所述分離的蛋白質轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。通過用Coomassie藍染色PVDF膜鑒定被轉移的蛋白質條帶。含最豐富多肽種類的PVDF膜區(qū)域被切下并直接引入PerkinElmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白質測序儀的樣品柱。如上述測定蛋白質序列。GVc-16,GVc-18和GVc-21的N末端序列分別在SEQ ID NOS:13,14和15中給出。
除上述層析方法之外，使用預制SDS-PAGE純化步驟分離出另外的抗原，稱為GVc-12,GVc-14,GVc-15,GVc-17和GVc-19。特別是，含來自前述Vydac C4 HPLC純化步驟的抗原混合物之餾分，通過預制SDS-PAGE在聚丙烯酰胺凝膠上被分級分離。所述樣品被溶于非還原型樣品緩沖液中并載入凝膠。通過在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩爾CAPS緩沖液中電印跡將所分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。通過用Coomassie藍染PVDF膜鑒定被轉移的蛋白質條帶。含最豐富多肽種類的PVDF膜區(qū)域被切下并直接引入Perkin Elmer/AppliedBioSystems Procise 492蛋白質測序儀的樣品柱。如上述測定蛋白質序列。測出的GVc-12,GVc-14,GVc-15,GVc-17和GVc-19 N末端序列分別在SEQ ID NOS:16-20中給出。
用GeneAssist系統(tǒng)將全部上述氨基酸序列與SwissProt數(shù)據(jù)庫(R32版)中的已知氨基酸序列比較。未得到任何與氨基酸序列GVc-2到GVc-22明顯的同源性。GVc-1的氨基酸序列被發(fā)現(xiàn)與先前從牛分枝桿菌和結核分枝桿菌所鑒定的序列有某些類似性。特別是，發(fā)現(xiàn)GVc-1與結核分枝桿菌MPT83(一種細胞表面蛋白質)以及MPT70有些同源性。這些蛋白質形成一個蛋白質家族的部分(Harboe等，Scand.J.Immunol.42:46-51,1995)。
隨后的研究導致分離出GVc-14和GVc-22的DNA序列(分別為SEQID NO:107和108)。GVc-14和GVc-22的相應預期氨基酸序列分別在SEQ ID NO:109和110給出。
擴增引物AD86和AD112(分別為SEQ ID NO:60和61)由氨基酸序列GVc-1(SEQ ID NO:1)和結核分枝桿菌MPT70基因序列設計而來。用這些引物，從牝牛分枝桿菌基因組DNA擴增出310bp的片段并將其克隆到含附加dTTP殘基的EcoRV消化的載體pBluescript(Stratagene)中。所述克隆的插入片段序列在SEQ IDNO:62中給出。
篩選被純化多肽在免疫的人類供體外周血細胞中誘導T細胞增殖和IFN-γ的能力。這些供體已知是PPD(結核分枝桿菌的純化蛋白質衍生物)皮試陽性，而且其T細胞顯示出PPD反應性增殖。供體PBMCs和來自牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的粗溶解性蛋白質被培養(yǎng)在含補充有10％(v/v)自身血清，青霉素(60微克/毫升)，鏈霉(100微克/毫升)和谷氨酰胺(2毫摩爾)的RPMT1640的培養(yǎng)基中。
3天后，從每個培養(yǎng)孔中移出50微升培養(yǎng)基以測定IFN-γ水平(如下所述)。所述平板進一步培養(yǎng)4天，然后再用1微居/孔氚標記的胸腺嘧啶脈沖18小時，收獲并用閃爍計數(shù)器測定氚吸收。在兩副本中被刺激的增殖均比單獨培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中觀察到的增殖高兩倍的餾分被認為是陽性。
用酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)檢測IFN-γ。用小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體(Endogen,Wobural,MA)1微克/毫升磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)在4℃包被ELSIA板4小時。室溫下，用含0.2％吐溫20的PBS封閉孔1小時。然后，在PBS/0.2％吐溫20中洗所述平板4次，在ELISA平板的培養(yǎng)基中被1∶2稀釋的樣品在室溫中培養(yǎng)過夜。再次洗所述平板，向每孔加入生物素標記的多克隆兔抗人IFN-γ血清(Endogen)(在PBS中被稀釋到1微克/毫升)。然后在室溫溫育所述平板1小時，洗平板并加入以1∶4,000稀釋于PBS中的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗生物素蛋白A(Vector Laboratories,Burlingame,CA)。在室溫進一步培養(yǎng)1小時后，洗平板并加入鄰苯二胺(OPD)底物。10分鐘后用10％(v/v)HCl終止反應。在490納米測定光密度(OD)。使兩個副本均產(chǎn)生高于單獨培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的平均OD兩倍的OD之餾分被認為是陽性。
含刺激外周血單核細胞(PBMC)T細胞增殖并產(chǎn)生IFN-γ的序列之多肽實例在表1中給出，其中(-)表明無活性，(+/-)表明有高于對照培養(yǎng)基背景活性不到兩倍的結果之多肽，(+)表明有背景以上兩倍到四倍活性的多肽，和(++)表明有背景之上四倍以上活性的多肽。
表1抗原增殖IFN-γGVc-1 ++ +/-GVc-2 - ++GVc-7 -/- -GVc-13 + -GVc-14 - +GVc-15 + +GVc-20 - +實施例3通過2維聚丙烯酰胺凝膠電泳從牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物純化和鑒定多肽用如下述2維聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)濾出物分離牝牛分枝桿菌可溶性多肽。除非另有注釋，下面實施例中全部百分率是每體積的重量。
在無菌培養(yǎng)基90中，37℃培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)。在含吐溫80和油酸/白蛋白/葡萄糖/過氧化氫酶添加劑的無菌Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中培養(yǎng)結核分枝桿菌菌株H37Rv(ATCC號27294)。通過離心收集細胞并轉移到含葡萄糖的無菌Middlebrook7H9培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)一天。然后，離心所述培養(yǎng)基(留下大部分細胞)并通過一只0.45微米的濾器過濾進入無菌瓶中。通過冷凍干燥濃縮培養(yǎng)濾出物并使其溶解于MilliQ水中。通過0.45μ膜過濾器過濾除去少量不溶性物質。
通過在一只含3,000MWCO膜的400毫升Amicon攪拌池中進行膜過濾使所述培養(yǎng)濾出物脫鹽。用氮氣保持壓力在60磅/平方英尺。通過膜過濾反復濃縮所述培養(yǎng)濾出物并用水稀釋直到樣品傳導率低于1.0mS。這種方法將20升體積減少到約50毫升。通過Bradford蛋白質測試(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)測定蛋白質濃度。
通過離子交換層析在用10毫摩爾Tris HCl緩沖液pH8.0平衡的Q-Sepharose(Pharmacia Biotech)(16×100毫米)柱上分級分離脫鹽的培養(yǎng)濾出物。用0到1.0摩爾線性梯度的氯化鈉在上述緩沖系統(tǒng)中洗脫多肽。所述柱洗脫液在280納米波長監(jiān)測。
從離子交換柱洗脫的多肽收集物通過預制2D凝膠電泳而被分級分離。含200-500微克多肽的樣品于尿素中配制成8M，并上載到聚丙烯酰胺等電聚焦棒狀凝膠(直徑2毫米，長150毫米，pH5-7)。等電聚焦步驟后，第一維凝膠被還原緩沖溶液平衡并上載到第二維凝膠(16％聚丙烯酰胺)。圖2A和2B分別是用牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物和結核分枝桿菌H37Rv培養(yǎng)濾出物觀察到的2-D凝膠帶型。通過在含10％(v/v)甲醇的pH11的10毫摩爾CAPS緩沖液中進行電印跡，將從第二維分離出的多肽轉移到PVDF膜。用Coomassie藍染色PVDF膜的蛋白質。將含感興趣的多肽的PVDF區(qū)域切下并直接引入到PerkinElmer/Applied BioSystems Procise 492蛋白質測序儀的樣品柱。用傳統(tǒng)Edman化學法對所述多肽從氨基末端開始測序。通過將PTH氨基酸衍生物的保留時間與適當?shù)腜TH衍生物標準比較測定所述氨基酸序列的每個多肽。用這些方法，分離出11個多肽，稱為GVs-1,GVs-3,GVs-4,GVs-5,GVs-6,GVs8,GVs-9,GVs-10,GVs-11,GVs-34和GVs-35。測出的這些多肽的N末端序列分別在SEQ ID NOS:21-29,63和64中給出。為延長先前得到的GVs-9氨基酸序列，用上述純化方法純化出更多的蛋白質。被延長的GVs-9氨基酸序列在SEQ ID NO:65中給出。進一步研究導致GVs-9的DNA序列的分離(SEQ ID NO:111)。相應預期的氨基酸序列在SEQ ID NO:112中給出。
用GeneAssist系統(tǒng)將所有這些氨基酸序列與SwissProt數(shù)據(jù)庫中已知氨基酸序列比較。除GVs-3,GVs-4,GVs-5和GVs-9外，沒有得到明顯同源性。發(fā)現(xiàn)GVs-9與2個以前鑒定的結核分枝桿菌蛋白質，即結核分枝桿菌角質酶前體和結核分枝桿菌假定的22.6KD蛋白質有某些同源性。GVs-3,GVs-4和GVs-5被發(fā)現(xiàn)與來源于麻風分枝桿菌(分別為SEQ ID NOS:30和31)，結核分枝桿菌(分別為SEQ ID NOS:32和33)和牛分枝桿菌(分別為SEQ ID NOS:34和35)的抗原85A和85B蛋白質，以及來源于麻風分枝桿菌(SEQ ID NO:36)和結核分枝桿菌(SEQ ID NO:37)的抗原85C蛋白質有一些類似性。源于牝牛分枝桿菌的本發(fā)明抗原85A蛋白質與結核分枝桿菌，牛分枝桿菌和麻風分枝桿菌的相應抗原之比較在圖3中描述。
實施例4牝牛分枝桿菌抗原85系列的DNA克隆策略通過聚合酶鏈反應(PCR)用設計針對抗原85基因組序列區(qū)域的簡并寡核苷酸來制備抗原85A,85B和85C(SEQ ID NOS:38和39)的探針，所述85基因組序列區(qū)域在一給定分枝桿菌種的兩科之間，以及在分枝桿菌種之間是保守的。這些寡核苷酸在降低的嚴格條件下被用于從牝牛分枝桿菌基因組DNA擴增靶序列。適當大小的0.5kb帶被鑒定，純化和克隆到加T尾的質粒pBluescript Ⅱ SK(Stratagene,LaJolla,CA)。隨機篩選24個獨立克隆中存在的抗原85PCR產(chǎn)物，然后用Perkin Elmer/Applied Biosystems Model 377自動測序儀和M13為基礎的引物(T3和T7)進行測序。GenBank數(shù)據(jù)庫的同源性檢索結果表明23個克隆含與公開的來自結核分枝桿菌和牛分枝桿菌的抗原85基因有明顯同源性的插入片段。約半數(shù)與抗原85C基因序列最為類似，其余的序列更類似于抗原85B序列。此外，這兩個推測的牝牛分枝桿菌抗原85基因組序列80％相互類似。由于這種高類似性，所述抗原85C PCR片段被選擇來在低嚴格條件下篩選牝牛分枝桿菌基因組庫的全部三種抗原85基因。
通過克隆BamHⅠ部分消化的牝牛分枝桿菌基因組DNA進入類似消化的λ載體中，在λZapExpress(Stratagege,La Jolla,CA)中創(chuàng)建牝牛分枝桿菌基因組庫，得到3.4×105獨立的空斑形成單位。為篩選之目的，將來自這些未擴增庫的2萬7千個空斑低密度鋪平板于8只100平方厘米平板上。對每個平板，一式雙份的空斑轉印物被轉印在Hybond-N-尼龍膜上(Amersham International,UnitedKingdom)，并在降低的嚴格條件(55℃)與放射標記的抗原85C PCR產(chǎn)物雜交。放射自顯影證明在這些條件下，79個空斑與抗原85C探針穩(wěn)定雜交。隨機選出供進一步分析的13只陽性雜交空斑并從所述庫平板移出，每一只陽性克隆被用于生成含約200只空斑的第二輪篩選平板。用Hybond-N+尼龍膜取每只平板的雙份轉印物，并在初級篩選中使用的條件下進行雜交。鑒定被篩選的13只平板中的每只平板上的多個陽性雜交空斑。從每個次級篩選平板挑出兩個分離良好的陽性噬菌體供進一步分析。使用體外切除，將26個空斑轉變成噬菌粒，并對其進行限制作圖。在此作圖基礎上可將克隆分組而成四類。用PerkinElmer/Applied Biosystems Model 377自動測序儀和T3與T7引物，得到來自每組數(shù)個代表的插入片段之3’和5’端的序列資料。使用帶有GeneAssist軟件包的GenBank數(shù)據(jù)庫的FASTA分析確定序列的同源性。這些克隆中的兩套被發(fā)現(xiàn)與牛分枝桿菌和結核分枝桿菌抗原85A基因同源，每套含牝牛分枝桿菌基因的3’或5’端(該基因在建庫期間由于含內(nèi)部BamHⅠ位點而被切開)。其余克隆被發(fā)現(xiàn)含與來自數(shù)個分枝桿菌種的抗原85B和85C同源的序列。為測定每個基因的其余核苷酸序列，構建適當?shù)膩喛寺〔ζ錅y序。用DNA Strider軟件將重疊序列進行對比。所確定的牝牛分枝桿菌抗原85A,85B和85C的DNA序列分別在SEQ ID NOS:40-42中給出，同時預期的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS+43-45中給出。
牝牛分枝桿菌抗原GVc-3和GVc-5被表達并純化如下。使用位于所述克隆的推測前導序列和3‘端下游的序列資料從GVc-3和GVc-5(分別為SEQ ID NO:40和42)設計擴增引物。GVc-3的引物序列在SEQ IDNO:66和67中給出，而GVc-5的引物序列在SEQ ID NO:68和69中給出。一個XhoⅠ限制位點被加入到GVc-3的引物，而EcoRⅠ和BamHⅠ限制位點被加入到GVc-5的引物以方便克隆。繼從基因組牝牛分枝桿菌DNA進行擴增之后，片段被克隆到pProEX HT原核表達載體的適當位點(Gibco BRL,Life Technologies,Gaithersburg,MD)并被測序以確認正確的閱讀框和方向。按照廠商的方法進行所述重組蛋白質的表達和純化。
牝牛分枝桿菌抗原GVc-4(抗原85B同源片段)中的一個片段的表達進行如下。如上所述，引物AD58和AD59被用于擴增來自牝牛分枝桿菌基因組DNA的485bp片段。用標準技術凝膠純化該片段并將其克隆到含附加dTTP殘基的EcoRⅤ消化的pBluescript中。測定來自5個克隆插入片段的堿基序列并發(fā)現(xiàn)相互之間是一致的。這些插入片段有與結核分枝桿菌的Ag 85B最高的同源性。所述克隆之一的插入片段被亞克隆到原核表達載體pProEX HT(Gibco BRL)的EcoRⅠ/XhoⅠ位點，并按照廠商的方法對其進行表達和純化。由于只有部分基因被表達，該克隆被重命名為GVc-4P。所述部分克隆的GVc-4P的氨基酸序列和DNA序列分別在SEQ ID NO:70和106中給出。
在隨后的研究中，用與上述相似的方法將GVc-3,GVc-4P和GVc-5再次克隆到另外選擇的載體pET16中(Norvagen,Madison,WI)。
如上述實施例2所述測試純化的重組子GVc-3,GVc-4P和GVc-5刺激T細胞增殖和PPD陽性人PBL(健康供體)中干擾素-γ生產(chǎn)的能力。該測試結果在表2中給出，其中(-)表明無活性，(+/-)表明多肽有比對照培養(yǎng)基背景活性高不到兩倍的結果，(+)表明多肽高出背景兩到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性，而ND表明沒有被測定。
表2

實施例5牝牛分枝桿菌抗原的DNA克隆策略使用為測定GVc-7的氨基酸序列(SEQ ID NOS:5-8)而設計的簡并寡核苷酸擴增牝牛分枝桿菌抗原GVc-7的84bp探針。該探針被用于篩選如實施例4中描述的牝牛分枝桿菌基因組DNA文庫。測定出的GVc-7核苷酸序列在SEQ ID NO:46中給出，而預期的氨基酸序列在SEQ ID NO:47中給出。將這些序列與基因庫中的序列比較表現(xiàn)出與假設的15.8kDa結核分枝桿菌膜蛋白有同源性。
序列SEQ ID NO:46被用于設計擴增引物(在SEQ ID NO:71和72中給出)以便使用推測的前導序列下游序列資料表達GVc-7基因的克隆。為方便克隆將XhoⅠ限制位點加入到所述引物中。繼從基因組牝牛分枝桿菌DNA擴增之后，將片段克隆到pProEX HT原核表達載體(Gibco BRL)的XhoⅠ位點并進行測序以確認正確的閱讀框和方向。融合蛋白質的表達和純化按照廠商的方法進行。在隨后的研究中，將GVc-7再次克隆到載體pET16中(Novage)。
如先前實施例2所述方法測試純化的重組子GVc-7刺激T細胞增殖和刺激PPD陽性(健康供體)的人PBL中γ干擾素產(chǎn)生的能力。結果在表3給出，其中(-)表明無活性，(+/-)表明多肽有比對照培養(yǎng)基背景活性高不到兩倍的結果，(+)表明多肽高出背景兩到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性。
表3

針對SEQ ID NO:6中給出的GVc-8多肽序列設計出豐余寡核苷酸探針并將其用于篩選如上描述的牝牛分枝桿菌基因組DNA文庫。陽性空斑被分離出。
鑒定出四個不同的基因組克隆，下文稱為GVs-8A,GVs-8B和GVs-8C和GVs-8D。被測定的GVs-8A,GVs-8B,GVs-8C和GVs-8D克隆之DNA序列分別在SEQ ID NOS:48-51中給出，同時相應的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS:52-55中被給出?？寺Vs-8A含表現(xiàn)出有些類似于已知原核纈氨酰tRNA合成酶的區(qū)域；GVs-8B顯示出有些類似于恥垢分枝桿菌天冬氨酸半醛脫氫酶；而GVs-8C顯示出有些類似于人流感病毒葉酰多谷氨酸合成酶基因。GVs-8D含一個開放閱讀框，它顯示有些類似于先前在結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌中鑒定的序列，但其功能尚未鑒定。
在隨后的研究中，用從SEQ ID NO:6給出的GVs-8序列設計的第二個豐余寡核苷酸(稱為MPG15；SEQ ID NO:73)篩選構建于λZAP表達載體(Stratagene)BamHⅠ位點中的牝牛分枝桿菌基因組DNA文庫。所述文庫的篩選在四甲基氯化銨(TMAC)存在下進行，以致核苷酸堿基對在不依賴于序列的標準溫度處解鏈(即A-T對和G-C對在相同溫度解鏈)。因此，雜交的嚴格性僅取決于被用做探針的寡核苷酸的長度和簡并性(Wood等，美國科學院學報，82:1585-1588,1985)。使用在低于適合的TMAC洗滌溫度～15℃的溫度下轉移和預雜交過夜的標準方法制備濾膜。雜交在新配制的含100pmol探針的雜交液中進行過夜。
寡核苷酸雜交儲備液1M NaCI 5M0.1M Tris pH81M5X Denhardt’s 100X0.05％ NaPPi 5％0.1％ SDS 10％0.1mg/ml酵母tRNA 10mg/ml125單位/ml肝素在計算的容許在TMAC洗滌緩沖液中有約4％鍺配的溫度下洗滌所述濾膜。更具體地說，所述洗滌方法包括下列洗滌步驟室溫6×SSC,0.05％ NaPPi中2×15分鐘；室溫TMAC洗滌液中(見下)1×15分鐘；在計算的嚴格溫度下，在TMAC洗滌液中2×15分鐘；室溫6×SSC,0.05％ NaPPi中1×15分鐘。
TMAC洗滌緩沖液3M四甲基氯化銨(TMAC)50mMTris pH8.00.2mM EDTA挑出陽性空斑并儲存在含20微升氯仿的1毫升SM緩沖液中。按上述方法反復篩選直到空斑純凈為止。
在ExAssist輔助噬菌體存在下按照廠商的方法從λZAP表達載體切下含所需插入片段的pBK-CMV噬菌粒。通過限制酶作圖和亞克隆鑒定含8kb插入片段(GVs-8D)的噬菌粒。在所述插入片段的3’端鑒定了一個開放閱讀框，而由此開放閱讀框編碼的抗原被命名為GV-33。在該插入片段中沒有發(fā)現(xiàn)對應于GVs-8的堿基序列，并推測GV-33是以TMAC篩選中的一種非特異性產(chǎn)物被獲得的。通過進一步亞克隆和堿基測序，確定了所述基因的3’端。所確定的GV-33部分DNA序列在SEQ ID NO:74中給出，同時，相應的預期氨基酸序列在SEQ IDNO:75中給出。所述克隆的3’端序列資料表現(xiàn)出與先前鑒定的結核分枝桿菌40.6kDa外膜蛋白有同源性。
用基于被確定的核苷酸序列的引物從牝牛分枝桿菌基因組DNA擴增所述部分GV-33基因。該DNA片段被克隆到含附加dTTP殘基的EcoRv消化的pBluescript(Stratagene)中，然后用EcoRⅠ和HindⅢ亞克隆將其轉移到pProEX HT表達載體(Gibco BRL)中。按照廠商的方法純化重組蛋白質。在隨后的研究中，GV-33被再次克隆到另選的載體pET16(Novagen)中。
純化的重組抗原刺激T細胞增殖和刺激從PPD陽性人PBL(健康供體)產(chǎn)生γ干擾素的能力如先前在實施例2中所描述的方法進行檢測。其結果在表4中給出，其中(-)表明無活性，(+/-)表明多肽有比對照培養(yǎng)基背景活性高不到兩倍的結果，(+)表明多肽高出背景兩到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性。
表4

實施例6
檢測來源于全牝牛分枝桿菌和牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的非特異性免疫放大劑本實施例闡明全牝牛分枝桿菌和牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的制備及其非特異性免疫放大作用或‘佐劑’性質。
如實施例1中描述的方法培養(yǎng)，收集和高壓消毒牝牛分枝桿菌。活牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物指從含葡萄糖的7H9培養(yǎng)基中的牝牛分枝桿菌24小時培養(yǎng)物得來的上清。通過用Virsonic超聲波發(fā)生器(Virtis,Disa,USA)在冰上四次30秒鐘爆破對高壓消毒的牝牛分枝桿菌進行超聲處理來制備去脂形式的牝牛分枝桿菌。然后離心所述物質(9000rpm,20分鐘，JA10轉子，制動(brake)=5)。得到的沉降物被重懸浮于100毫升氯仿/甲醇(2∶1)中，在室溫溫孵1小時；離心，并用氯仿/甲醇重復提取。通過離心得到沉降物，在真空中干燥，稱重并以每毫升50毫克重懸浮于PBS中作為去脂牝牛分枝桿菌。
通過在50％v/v乙醇中回流2小時從去脂牝牛分枝桿菌制劑除去糖脂。通過離心(10,000轉/分鐘，JA20轉子，15分鐘，制動(brake)=5)收集不溶性物質。用50％v/v乙醇在回流中反復再提取兩次。離心收集不溶性物質并在PBS中洗滌。通過重懸浮所述沉降物于含2％SDS的PBS中在56℃提取蛋白質2小時。通過離心收集不溶性物質并用2％SDS/PBS在56℃再重復所述提取兩次。匯集的SDS提取物被冷卻到4℃，并通過離心(10,000每分鐘轉數(shù)，JA20轉子，15分鐘，制動=5)除去沉淀的SDS。通過加入等體積的丙酮并在-20℃孵育2小時從所述上清沉淀蛋白質。通過離心收集沉淀的蛋白質，在50％v/v丙酮中洗滌，真空中干燥，并溶解于PBS中。
檢測牝牛分枝桿菌培養(yǎng)上清(S/N)，殺死的牝牛分枝桿菌和去脂牝牛分枝桿菌在小鼠中產(chǎn)生對卵白蛋白(一種結構上無關的蛋白質)的細胞毒T細胞免疫反應的佐劑活性。這種抗卵白蛋白特異的細胞毒反應被檢測如下通過與下述檢測佐劑一起腹膜腔注射100微克卵白蛋白而免疫C57BL/6小鼠(每組2只)，所述佐劑是高壓消毒的牝牛分枝桿菌；去脂牝牛分枝桿菌；糖脂亦被提取并用SDS提取出蛋白質的去脂牝牛分枝桿菌；用鏈酶蛋白酶(一種降解蛋白質的酶)處理的SDS蛋白質提取物；全牝牛分枝桿菌培養(yǎng)過濾物；和加熱殺死的結核分枝桿菌或加熱殺死的牛分枝桿菌BCG，草分枝桿菌或恥垢分枝桿菌或牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物。10天后，用E.G7細胞體外刺激脾細胞另6天，所述E.G7細胞是用卵白蛋白基因轉染并因此而表達卵白蛋白的EL4細胞(一種C57BL/6衍生T細胞淋巴瘤)。然后測試脾細胞的非特異性殺傷EL4靶細胞或特異性殺傷E.G7卵白蛋白表達細胞的能力。在所述殺傷測試前，通過EL4和E.G7細胞被標記(每2×106個細胞100微居)的51鉻的釋放來檢測殺傷細胞的能力。用如下公式將殺傷或細胞毒活性表示為特異性裂解％

一般知道卵白蛋白特異的細胞毒細胞只有在被卵白蛋白與佐劑一起免疫的小鼠中產(chǎn)生，而不在只用卵白蛋白免疫的小鼠中產(chǎn)生。
圖4所做的圖解表示各種牝牛分枝桿菌來源的佐劑制劑對C57BL/6小鼠中產(chǎn)生對卵白蛋白的細胞毒T細胞的作用。如圖4A所示，細胞毒性細胞在用(ⅰ)10微克，(ⅱ)100微克或(ⅲ)1毫克高壓消毒的牝牛分枝桿菌或(ⅳ)75微克牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物免疫的小鼠中產(chǎn)生。圖4B表示細胞毒性細胞在用(ⅰ)1毫克高壓消毒的全牝牛分枝桿菌或(ⅱ)1毫克去脂牝牛分枝桿菌免疫的小鼠中產(chǎn)生。如圖4C(ⅰ)所示，在用1毫克高壓消毒的全牝牛分枝桿菌免疫的小鼠中產(chǎn)生細胞毒細胞；圖4C(ⅱ)表示在100微克去脂，然后除去糖脂并用SDS提取了蛋白質的牝牛分枝桿菌中的活性物質。圖4C(ⅲ)顯示在圖4C(ⅱ)中的佐劑制劑中的活性物質用蛋白酶鏈酶蛋白酶處理而被破壞。通過比較，100微克SDS提取的蛋白質比1毫克高壓消毒的全牝牛分枝桿菌(圖4C(ⅰ))有明顯更強的免疫增強能力。
用1毫克加熱殺死的牝牛分枝桿菌(圖4D(ⅰ))免疫的小鼠產(chǎn)生對卵白蛋白的細胞毒細胞，但用1毫克加熱殺死的結核分枝桿菌(圖4D(ⅱ)),1毫克牛分枝桿菌BCG(圖4D(ⅲ)),1毫克草分枝桿菌(圖4D(ⅳ))，或1毫克恥垢分枝桿菌(圖4D(ⅴ))分別免疫的小鼠不產(chǎn)生細胞毒細胞。
通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了從去脂和去糖脂的牝牛分枝桿菌獲得的SDS提取的蛋白質。如圖5所示，在用銀染色后觀察到三條主要的帶。
在隨后的研究中，通過在BioRed Prep Cell(Hercules,CA)上的預制SDS-PAGE制備出更多的上述SDS提取的蛋白質。通過三氯乙酸沉淀與分子量范圍對應的片段以在如上述測試C57BL/6小鼠中抗卵白蛋白特異的細胞毒反應試驗中的佐劑活性前除去SDS。如圖6所見，在60-70kDa片段中佐劑活性最高。通過將SDS-PAGE印跡在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上純化這個大小范圍內(nèi)最豐富的蛋白質，然后測序。頭10個氨基酸殘基序列在SEQ ID NO:76中給出。將此序列與如上所述的基因庫中的序列進行比較揭示了與結核分枝桿菌的熱休克蛋白質65(GroEL)基的同源性，這表明此蛋白質是GroEL家族的一個牝牛分枝桿菌成員。
使用經(jīng)過如上述制備的牝牛分枝桿菌分泌性蛋白質免疫的cynomolgous猴血清篩選BamHⅠ-λZAP Express(Stratagene)中的牝牛分枝桿菌基因組DNA表達庫。用比色系統(tǒng)鑒定陽性空斑。按照標準方法再篩選這些空斑直到空斑純凈。按照廠商的方法，在ExAssist輔助噬菌體存在下從λZAP Express(Stragene)載體切下含插入片段的pBV-CMV噬菌粒2-1。使用Perkin Elmer/Applied BiosystemsDvision自動測序儀上的熒光引物進行Sanger法測序來測定該克隆(本文稱為GV-27)插入片段的5’端堿基序列。部分牝牛分枝桿菌GroEL-同源克隆GV-27的被測定核苷酸序列在SEQ ID NO:27中給出并且預期的氨基酸序列在SEQ ID NO:78中給出。發(fā)現(xiàn)該克隆有與結核分枝桿菌GroEL的同源性。牝牛分枝桿菌的65kDa熱休克蛋白的部分序列由Kapur等發(fā)表。(Arch.Pathol.Lab.Med.119:131-138,1995)。Kapur等片段的核苷酸序列在SEQ ID NO:79中給出而預期的氨基酸序列在SEQ ID NO:80中給出。
在隨后的研究中，得到GV-27的全長DNA序列(除預期的51個末端核苷酸外)(SEQ ID NO:113)。相應的預期氨基酸序列在SEQ IDNO:114中給出。GV-27被發(fā)現(xiàn)與結核分枝桿菌GroEL在氨基酸水平上有93.7％的一致性。
使用本領域眾所周知的技術制備了含GV-27的N末端序列(下文稱為GV-27A)和GV-27的羧基末端(此后稱為GV-27B)的兩個多肽片段。GV-27A和GV-27B的核苷酸序列分別在SEQ ID NO:115和116中給出，同時相應的氨基酸序列在SEQ ID NO:117和118中給出。GV-27A的序列與結核分枝桿菌GroEL序列有95.8％的一致性并含上述討論的Kapur等的短牝牛分枝桿菌序列。GV-27B的序列顯示與結核分枝桿菌HSP65相應區(qū)域有92.2％的一致性。
通過等電聚焦還可分級分離上述的牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物并且測試所述分級分離組分在如上述C57BL/6小鼠中抗卵白蛋白特異性細胞毒反應測試中的佐劑活性。如圖7所示，在組分中測定的峰值佐劑活性對應于等電點4.2-4.32(組分號7-9),4.49-4.57(組分號13-17)和4.81-5.98(組分號23-27)。
實施例7高壓消毒的牝牛分枝桿菌產(chǎn)生抗結核分枝桿菌感染的巨噬細胞的細胞毒CD8 T細胞本實施例闡明殺死的牝牛分枝桿菌刺激細胞毒CD8 T細胞的能力，所述CD8 T細胞優(yōu)先殺死被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞。
通過腹膜腔注射500微克如實施例1中描述制備的殺死的牝牛分枝桿菌免疫小鼠。免疫兩周后，使免疫小鼠的脾細胞通過一個CD8 T細胞富集柱(R&D系統(tǒng)，St.Paul,MN,USA)。從所述柱回收的脾細胞已顯示出被富集到90％CD8 T細胞。檢測這些T細胞(以及未免疫小鼠的脾CD8 T細胞)對未受感染的巨噬細胞或已被結核分枝桿菌感染的巨噬細胞的殺傷能力。
在1毫升的3％硫甘油腹膜內(nèi)注射后5天內(nèi)從小鼠腹膜腔獲得巨噬細胞。用每巨噬細胞2個分枝桿菌比例的結核分枝桿菌感染所述巨噬細胞過夜。用51鉻以每104巨噬細胞2微居標記全部巨噬細胞制劑。然后，所述巨噬細胞與CD8 T細胞一起培養(yǎng)過夜(16小時)，殺傷細胞對靶細胞的比例是30∶1。通過51鉻的釋放檢測特異殺傷作用并表示為特異裂解％(如實施例5所計算的)。
使用酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)檢測在CD8 T細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)3天后IFN-γ的產(chǎn)生以及其釋放到培養(yǎng)基中的情況。用抗小鼠IFN-γ(Pharmigen,San Diego,CA,USA)的大鼠單克隆抗體在PBS中4℃ 4小時來包被ELISA平板。用含0.2％吐溫20的PBS在室溫封閉板孔1小時。然后將所述平板在含0.2％吐溫20的PBS中洗4次，并將1∶2稀釋于所述ELISA平板培養(yǎng)基中的樣品在室溫培養(yǎng)過夜。再次洗滌所述平板，并將生物素標記的單克隆大鼠抗小鼠IFN-γ抗體(Pharmigen)(被稀釋成1微克/毫升PBS)加入到每個孔中。然后在室溫培養(yǎng)所述平板1小時，洗滌，并將辣根過氧化物酶偶聯(lián)的生物素蛋白D(Sigma A-3151)以1∶4,000稀釋度加入到PBS中。在室溫進一步培養(yǎng)1小時后，洗滌所述平板并加入OPD底物。10分鐘后用10％(v/v)HCl終止所述反應。在490納米測定光密度。在兩個副本中均顯示出高于單獨在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞之平均OD兩倍的組分被認為是陽性。
如表5所示，牝牛分枝桿菌免疫之小鼠脾的CD8 T細胞對結核分枝桿菌感染的巨噬細胞是細胞毒性的，而對未感染的巨噬細胞則無裂解。未免疫的小鼠之CE8 T細胞不裂解巨噬細胞。當與感染的巨噬細胞共培養(yǎng)時，新生或未免疫的小鼠之CD8 T細胞會產(chǎn)生IFN-γ。在共培養(yǎng)中產(chǎn)生的IFN-γ的量比來自牝牛分枝桿菌免疫小鼠的CD8 T細胞獲得的量高。
表5結核分枝桿菌感染和未感染的巨噬細胞的作用<

實施例8牝牛分枝桿菌抗原GV-23,GV-24,GV-25,GV-26,GV-38A和GV-38B的DNA克隆策略在無菌培養(yǎng)基90中，37℃培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)4天并通過離心收獲。將細胞重懸浮于1毫升Trizol(Gibco BRL,LifeTechnologies,Guithersburg,Maryland)并按照標準的廠商方法提取RNA。結核分枝桿菌菌株H37Rv(ATCC號27294)被培養(yǎng)在37℃含吐溫80TM和油酸/白蛋白/葡萄糖/過氧化氫酶添加劑的無菌Middlebrooke 7H9培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,Michigan)中并在適合實驗室安全的條件下收獲。將細胞重懸浮于1毫升Trizol(Gibco BRL)中并按照所述廠商的標準方法提取RNA。
通過將所述總RNA部分與互補于結核分枝桿菌rRNA的寡核苷酸AD10和AD11(SEQ ID NO:81和82)雜交而消耗掉總結核分枝桿菌和牝牛分枝桿菌RNA中的16S和23S核糖體RNA(rRNA)。這些寡核苷酸是根據(jù)Bottger(FEMS Microbiol.Lett.65:171-176,1989)發(fā)表的分枝桿菌16SrRNA序列和根據(jù)存放于所述數(shù)據(jù)庫中的序列設計的。通過將總RNA與固定化在尼龍膜(Hybond N,AmershamInternational,United Kingdom)上的寡核苷酸AD10和AD11雜交進行消耗反應。雜交被反復進行直到rRNA帶在溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上不可見。用RNA連接酶將20個dATP殘基組成的寡核苷酸AD12(SEQ ID NO:83)連接到富集mRNA片段的3’端。按照標準方法，用含多(dT)序列的寡核苷酸AD7(SEQ ID NO:84)進行第一條cDNA鏈的合成。
用結核分枝桿菌和牝牛分枝桿菌cDNA作為單側特異性(singlesided-specific)PCR(3S-PCR)的模板。在這種方法中，根據(jù)保守前導序列和膜蛋白序列設計出一條簡并寡核苷酸AD1(SEQ ID NO:85)。使用引物AD1作為5’引物和AD7作為3’引物擴增30個循環(huán)后，在尿素/聚丙烯酰胺凝膠上分離產(chǎn)物。切下牝牛分枝桿菌特有的DNA帶并用引物AD1和AD7再擴增。凝膠純化之后，將條帶克隆到pGEM-T(Promega)并測定所述堿基序列。
用條帶12B21被測定的核苷酸和預期的氨基酸序列(分別為SEQ IDNOS:86和87)檢索顯示出與E.coli pota基因序列的同源性，該基因編碼由Furuchi等(Jnl.Biol.Chem.266:20928-20933,1991)發(fā)表的亞精胺/腐胺ABC轉運復合物的ATP結合蛋白。E.coli的亞精胺/腐胺轉運復合物包括四個基因并且是ABC轉運蛋白家族的一個成員。ABC(ATP-結合盒)轉運蛋白一般由四個基因組成一個ATP結合基因，一個周質，或底物結合基因和兩個跨膜基因。跨膜基因編碼每個特征上有六個跨膜區(qū)的蛋白質。在嗜血流感病毒(Haemophilus infuenza)基因組(Fleischmann等Science 269:496-512,1995)和Mycoplasmagenitalium基因組中(Fraser等Science,270:397-403,1995)已鑒定出這種ABC轉運蛋白的同系物(以類似性為根據(jù))。
按照標準方法用放射標記的238bp條帶12B21探察構建在BamHⅠ消化的λZAP Express(Stratagene)中的牝牛分枝桿菌基因組DNA文庫。通過反復篩選純化空斑直到純凈并通過Southern印記和雜交鑒定含4.5kb插入片段的噬菌粒。通過亞克隆4.5kb片段和堿基測序鑒定pota(ATP結合蛋白)的全長牝牛分枝桿菌同系物的核苷酸序列。所述基因由1449bp組成，包括了含推測的-10和-35啟動子元件的320bp之5’非翻譯區(qū)。牝牛分枝桿菌pota類似物的核苷酸序列和推測的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS:88和89中給出。
牝牛分枝桿菌pota基因的核苷酸序列被用于設計表達克隆用的引物EV24和EV25(SEQ ID NO:90和91)。所述擴增的DNA片段被克隆到pProEX HT原核表達系統(tǒng)(Gibco BRL)并且通過加入0.6毫摩爾異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)誘導在適當?shù)腅.coli宿主中的表達。重組子蛋白質被命名為GV-23并按照廠商的方法從包含體中純化。在隨后的研究中，GV-23(SEQ ID NO:88)被再克隆到另選的載體pET16中(Novagen)。
上述4.5kb插入片段3’端的322bp Sall-BamHⅠ亞克隆表現(xiàn)出與E,coli的亞精胺/腐胺ABC轉運蛋白復合物potd基因(周質蛋白質)的同源性。此亞克隆的核苷酸序列在SEQ ID NO:92中給出。為鑒別該基因，按照標準方法，使用該亞克隆的標記片段探察構建于λZapExpress(Stratagene)Sall-位點的牝牛分枝桿菌基因組DNA文庫。鑒定出一只克隆，其中的1342bp表現(xiàn)出與E.coli的potd基因的同源性。通過亞克隆和堿基測序鑒定出牝牛分枝桿菌的potd同系物。被測定的核苷酸和預期的氨基酸序列在SEQ ID NO:93和94中給出。
為表達克隆，根據(jù)測定的牝牛分枝桿菌potd同系物設計引物EV26和EV27(SEQ ID NO:95-96)。擴增的片段被克隆到pProEX HT原核表達系統(tǒng)中(Gibco BRL)。通過加入0.6毫摩爾IPTG誘導在適當E.coli宿主中的表達并將重組蛋白質命名為GV24。按照供應商的方法從包含體純化所述重組抗原。在隨后的研究中，GV-24(SEQ ID NO:93)被再次克隆到另選的載體pET16中(Novagen)。
如實施例2中的描述測定純化的重組蛋白質GV-23和GV-24刺激T細胞擴增和在人PBL中產(chǎn)生干擾素的能力。這些測試結果在表6中給出，其中(-)表明無活性，(+/-)表明多肽有比對照培養(yǎng)基背景活性高不到兩倍的結果，(+)表明多肽高出背景兩到四倍的活性，(++)表明多肽有高出背景四倍以上的活性，而ND表明沒有被測定。
表6

與牝牛分枝桿菌potd基因同系物鄰近的堿基序列被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出與E.coli的亞精胺/腐胺ABC轉運蛋白復合物之potb基因的同源性，該轉運蛋白復合物是ABC轉運蛋白復合物中的兩個跨膜蛋白之一。牝牛分枝桿菌potb同系物(稱為GV-25)通過進一步克隆和堿基測序而被鑒定。GV-25測定的核苷酸和預期的氨基酸序列分別在SEQ ID NOS:97和98中給出。
鄰近的509bp的進一步亞克隆和堿基測序未能顯示出與PotC(E.coli的第二個跨膜蛋白)的同源性，從而表明第二個跨膜蛋白不存在ABC轉運蛋白的牝牛分枝桿菌同系物。然而，一個與結核分枝桿菌乙酰CoA乙酰轉移酶有同源性的開放閱讀框被鑒定開始于跨膜蛋白下游530bp，而被翻譯的蛋白質被命名為GV-26。測定的GV-26的部分核苷酸序列和預期的其氨基酸序列在SEQ ID NO:99和100中給出。
使用類似于上面為分離GV-23而描述的方法，將3S-PCR條帶12B28(SEQ ID NO:119)用于篩選構建于λZAP Express(Stratagene)BamHⅠ位點的牝牛分枝桿菌基因組庫。從該庫分離的克隆含一個新的開放閱讀框并且由此基因編碼的抗原被命名為GV-38A。GA-38A的被測定核苷酸序列和推測的氨基酸序列分別在SEQ ID NO:120和121中給出。將這些序列與所述基因庫中的序列比較顯示出與先前在粘粒MTCY428.12.(SPTREMBL:P71915)中鑒定的未知結核分枝桿菌蛋白質有些同源性。
GV-38A基因上游，鑒定出第二個新開放閱讀框并將由此基因編碼的抗原命名為GV-38B。GV-38B的被測定的5’核苷酸序列和3’核苷酸序列分別在SEQ ID NO:122和123中給出，同時相應的預期氨基酸序列分別在SEQ ID NO:124和125中給出。該蛋白質被發(fā)現(xiàn)與在粘粒MTCT428.11(SPTREMEL:P71914)中鑒定的未知結核分枝桿菌有同源性。
擴增GV-38A和GV-38B抗原用于表達克隆進入pET16(Novagen)。用引物KR11和KR12(SEQ ID NO:126和127)擴增GV-38A，并用引物KR-13和KR14(SEQ ID NO:128和129)擴增GV-38B。用1毫摩爾IPTG誘導宿主細胞BL21(DE3)中蛋白質的表達，然而從這些構建體中沒有蛋白質表達。疏水區(qū)被鑒定在抗原GV-38A和GV-38B的N末端，它們可抑制這些構建體的表達。GV-38A中的疏水區(qū)被鑒定為一種有6個跨膜區(qū)的可能的跨膜基序。為表達無疏水區(qū)的抗原，設計出GV-38A的引物KR20,(SEQ ID NO:130)和GV-38B的KR21(SEQ DINO:131)。用引物KR20和KR12擴增截短的GV-38A基因，而用KR21和KR14擴增截短的GV-38B基因。截短的GV38-A和GV-38B的被測定核苷酸序列分別在SEQ ID NO:132和133中給出，同時相應的預期氨基酸序列分別在SEQ ID NO:134和135中給出。
實施例9通過預制等電聚焦和預制聚丙烯酰胺凝膠電泳純化和鑒定源于牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物的多肽用如下述的預制等電聚焦和預制聚丙烯酰胺凝膠電泳從培養(yǎng)濾出物分離牝牛分枝桿菌可溶性蛋白質。除非另有注釋，下面實施例中的百分率均是每體積重量。
將牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)培養(yǎng)在250升無菌培養(yǎng)基90中，該培養(yǎng)基已通過超濾被分級分離以除去分子量大于10kDa的所有蛋白質。離心所述培養(yǎng)基以除去細菌，并通過0.45米濾器過濾除菌。無菌濾出物通過在10kDa分子量截留值膜上被超濾濃縮。
通過用10％三氯乙酸沉淀從濃縮的培養(yǎng)濾出物分離的蛋白質。所述沉淀的蛋白質被重新溶解于100毫摩爾Tris.HCl pH8.0并通過加入等體積的丙酮再次沉淀。將丙酮沉淀溶解于水中，并通過加入等體積氯仿∶甲醇2∶1(v/v)再次沉淀蛋白質。將氯仿/甲醇沉淀物溶解于水，并冷凍干燥所述溶液。
將凍干的蛋白質溶解于含8摩爾去離子尿素，2％Triton X-100,10毫摩爾二硫蘇糖醇和2％兩性電解質(pH2.5-5.0)的等電聚焦緩沖液中。在一個Ultrodex凝膠8瓦恒功率的水平電泳床上，通過預制等電聚焦16小時分級分離所述樣品。用水從所述凝膠床分離組分洗脫蛋白質并通過10％三氯乙酸沉淀濃縮蛋白質。
通過分析型聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定含目的蛋白質的組分收集物并通過預制聚丙烯酰胺凝膠電泳分級分離之。在12.5％SDS-PAGE凝膠上分級分離樣品，并將其電印跡在硝酸纖維素膜上。通過用麗春紅染色，在膜上定位蛋白質，用水脫色并用40％乙腈/0.1碳酸氫銨pH8.9從膜上洗脫蛋白質，然后通過冷凍干燥濃縮之。
測試被洗脫蛋白質誘導增殖的能力和從如實施例2免疫供體的外周血淋巴細胞分泌干擾素γ的能力。在這些測試中選出誘導強反應的蛋白質供進一步研究用。
使用三氟乙酸-乙腈系統(tǒng)，通過在Vydac Protein C4柱上反相層析進一步純化選出的蛋白質。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳制備純化的蛋白質以供蛋白質序列測定之用，并電印跡到PVDF膜上。蛋白質序列測定如實施例3。所述蛋白質被命名為GV-40,GV-41,GV-42,GV-43和GV-44。測定出的這些多肽的N末端序列分別在SEQ ID NOS:101-105中給出。隨后的研究導致分離出GV-42的5’，中間片段和3’DNA序列(分別為SEQ ID NO:136,137和138)。相應的預期氨基酸序列分別在SEQ ID NO:139,140和141中給出)。
使用TFASTA將全部這些氨基酸序列與EMBL數(shù)據(jù)庫中的已知氨基酸序列比較。沒有得到與GV-40,GV-42,GV-44的明顯同源性。GV-41與推測的結核分枝桿菌核糖體再循環(huán)因子有類似性，該蛋白質與蛋白質合成終止時從mRNA釋放核糖體有關。GV-43顯示出與先前鑒定的未知結核分技桿菌和麻風分枝桿菌蛋白質有同源性(根據(jù)類似性)。
實施例10去脂并去糖基化的牝牛分枝桿菌和源于牝牛分枝桿菌的重組蛋白質的免疫調(diào)節(jié)性質本實施例闡明牝牛分枝桿菌不同成分的加工及其免疫調(diào)節(jié)性質。加熱殺死的牝牛分枝桿菌和牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)被培養(yǎng)在37℃，無菌培養(yǎng)基90(酵母提取物，2.5克/升；蛋白胨，5克/升；葡萄糖1克/升)中。通過離心收集細胞，并將其轉移到含葡萄糖的無菌Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)中，37℃培養(yǎng)一天。然后離心所述培養(yǎng)基以沉淀細菌，并除去培養(yǎng)濾出物。將細菌沉淀物重懸浮于濃度為10毫克/毫升(相當于每毫升1010個牝牛分枝桿菌細菌)的磷酸緩沖生理鹽水中。然后將細胞懸液在120℃高壓消毒15分鐘。使所述培養(yǎng)濾出物通過0.45微米的濾器進入無菌瓶中。冷凍干燥，去脂和去糖基化的牝牛分枝桿菌為制備去脂的牝牛分枝桿菌，通過離心沉淀所述高壓消毒的牝牛分枝桿菌，用水洗該沉淀并通過離心重新收集，然后凍干。將此凍干的牝牛分枝桿菌的一個等價試樣置于一旁并稱為冷凍干燥的牝牛分枝桿菌。當在實驗中使用時，將其重懸浮于PBS中到合適的濃度。用氯仿/甲醇(2∶1)在室溫提取凍干的牝牛分枝桿菌60分鐘，并重復提取一次。用50％乙醇，通過回流2小時進一步提取從所述氯仿/甲醇提取得到的殘余物。50％乙醇重復提取兩次。匯集的50％乙醇提取物被用做牝牛分枝桿菌糖脂的來源(見下)。從50％乙醇提取得到的殘留物被凍干并稱重。制備的去脂牝牛分枝桿菌的量相當于所使用的牝牛分枝桿菌初始濕重的11.1％。為生物測試，通過超聲處理和高壓滅菌，將所述去脂和去糖基化的牝牛分枝桿菌(DD-牝牛分枝桿菌；在圖8和圖9中稱為去脂牝牛分枝桿菌)重懸浮于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中。牝牛分枝桿菌糖脂通過旋轉蒸發(fā)干燥上述匯集的50％乙醇提取物，重溶解于水中，并凍干。回收的糖脂的量是所用的牝牛分枝桿菌初始濕重的1.2％。為生物測試，將所述糖脂溶解于磷酸鹽緩沖的生理鹽水中。從巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素-12如下面詳述，加熱殺死的全牝牛分枝桿菌和牝牛分枝桿菌成分顯示出能刺激從巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素-12(IL-12),IL-12是一種重要的Th1反應成分。用DIFCO巰基乙酸鹽腹膜內(nèi)注射一組C57BL/6J小鼠并在三天后收集腹膜巨噬細胞并放置于含干擾素-γ的細胞培養(yǎng)基中3小時。替換所述培養(yǎng)基并加入各種濃度的加熱殺死的全牝牛分枝桿菌，冷凍干燥的牝牛分枝桿菌，DD-牝牛分枝桿菌(在圖8中稱為去脂牝牛分枝桿菌)和牝牛分枝桿菌糖脂。在37℃進一步培養(yǎng)3天后，測試培養(yǎng)上清中存在的巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12。如圖8所示，牝牛分枝桿菌制劑刺激從巨噬細胞產(chǎn)生IL-12。
圖9A,B和C顯示來自幾個實驗的資料，其中C57B1/6小鼠(圖9A),BALB/C小鼠(圖9B)或C3H/HeJ小鼠(圖9C)組被腹膜內(nèi)給予DIFCO巰基乙酸鹽并于3天后收集腹膜巨噬細胞并放置于含γ干擾素的培養(yǎng)基中3小時。替換培養(yǎng)基并加入各種濃度的牝牛分枝桿菌重組蛋白質GVc-3(GV-3),GVc-4P(GV4P),GVc-7(GV-7),GV-23,GV-27，加熱殺死的牝牛分枝桿菌.DD-牝牛分枝桿菌(在圖9A,B和C中稱為去脂牝牛分枝桿菌)，牝牛分枝桿菌糖脂或脂多糖。在37℃ 3天后，測試所述培養(yǎng)上清中存在由巨噬細胞產(chǎn)生的IL-12。如圖9A,B和C中所示，所述重組蛋白質和牝牛分枝桿菌制劑刺激從巨噬細胞產(chǎn)生IL-12。
實施例11用牝牛分枝桿菌經(jīng)皮內(nèi)途徑免疫對CYNOMOLGOUS猴結核病的作用本實施例闡明在用活結核分枝桿菌攻擊之前用牝牛分枝桿菌或牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物經(jīng)皮內(nèi)免疫在cynomolgous猴中的作用。
在37℃，無菌培養(yǎng)基90(酵母提取物2.5克/升；蛋白胨5克/升；葡萄糖1克/升)培養(yǎng)牝牛分枝桿菌(ATCC號15483)。離心收獲細胞并轉移到含葡萄糖的無菌Middlebrook 7H9培養(yǎng)基(Difco Laboratories,Detroit,MI,USA)中，37℃培養(yǎng)一天。然后離心所述培養(yǎng)基以沉淀所述細菌，并除去培養(yǎng)濾出物，重懸浮細菌沉淀于濃度為10毫克/毫升(相當于每毫升1010個牝牛分枝桿菌細菌)的磷酸鹽緩沖生理鹽水中。然后將所述細胞懸浮液在120℃高壓消毒15分鐘。使所述培養(yǎng)濾出物通過0.45微米的濾器進入無菌瓶中。
在此研究中包括3組cynomolgous猴，每組兩只。一組猴用加熱殺死的全牝牛分枝桿菌免疫，一組用牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物免疫，而對照組不接受免疫。用于免疫的組合物，免疫原的量和每組猴的施用途徑在表7中給出。
表7皮內(nèi)途徑免疫的比較組號 猴鑒別號 抗原量免疫途徑1 S3101-E 0 -(對照) 3144-B 0 -2 4080-B 500微克 皮內(nèi)(加熱殺死的牝牛分枝桿菌免疫的)3586-B 500微克 皮內(nèi)3 3564-B 100微克 皮內(nèi)(培養(yǎng)濾出物免疫的) 3815-B 100微克 皮內(nèi)免疫前，全部猴被稱重(重量公斤)，測體溫(溫度)，和取血樣用于測定紅細胞沉降速率(ESR毫米/小時)和牛分枝桿菌制備的純化蛋白質(PPD)體外攻擊時淋巴細胞的增殖(LPA)。在免疫后33天重復這些檢測。在第34天，用同量的牝牛分枝桿菌使全部猴接受第二次免疫。在第62天，測體重，溫度，ESR和對PPD的LPA，然后用103菌落形成單位的結核分枝桿菌的Erdman株感染全部猴子。感染后28天，測全部猴的體重，溫度，ESR和對PPD的LPA并給肺拍X光片以確定是否活結核分枝桿菌感染已經(jīng)導致肺炎發(fā)作。
如表8A,B和C所示，對照組的猴到結核分枝桿菌感染后28天表現(xiàn)出肺結核的放射學證據(jù)。在用兩個劑量的500微克牝牛分枝桿菌皮內(nèi)免疫的猴中，感染后84天無明顯臨床病癥。用100微克牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物皮內(nèi)免疫的猴均延遲了臨床病癥的發(fā)作。
表8A對照組猴


ND=Not
表8B用加熱殺死的全牝牛分枝桿菌(500微克)經(jīng)皮內(nèi)免疫的猴


ND=未做表8C用培養(yǎng)濾出物(100微克)經(jīng)皮內(nèi)免疫的猴


ND=未做雖然本發(fā)明為理解之目的已通過說明和舉例的方式做了某些詳述，可能發(fā)生的變更和修飾并不偏離本發(fā)明的范圍，該范圍僅通過所附權利要求的范圍而被限定。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(ⅱ)發(fā)明題目治療和診斷分枝桿菌感染的化合物和方法(ⅲ)序列數(shù)141(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Russel McVeagn West-Walker(B)街The Todd Building,Cnr Brandon Street&amp;LambtonQuay(C)城市Wellington(D)州(E)國家新西蘭(F)郵政編碼(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM兼容(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件Wordperfect 5.2(ⅵ)現(xiàn)申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(ⅶ)先前申請資料(A)申請?zhí)?B)提交日期(ⅷ)代理人/代理資料(A)姓名Bennett,Michael Roy(B)注冊號
(C)參考/摘要號22238/MRB(ⅸ)電信資料(A)電話+64 4 499 9058(B)傳真+64 4 499 9306(C)電報(2)SEQ ID NO:1資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ala Pro Val Gly Pro Gly Xaa Ala Ala Tyr Val Gln Gln Val Pro Asp1 5 10 15Gly Pro Gly Ser Val Gln Gly Met Ala20 25(2)SEQ ID NO:2資料(ⅰ)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Xaa Asp Gln Leu Lys Val Asn Asp Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:3資料(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(E)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Xaa Pro Val Pro Val Ala Thr Ala Ala Tyr1 510(2)SEQ ID NO:4資料(ⅱ)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Thr Pro Ala Pro Ala Pro Pro Pro Tyr Val Asp His Val Glu Gln Ala15 10 15Lys Phe Gly Asp Leu20(2)SEQ ID NO:5資料(ⅰ)序列特征(A)長度29個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Met Gln Ala Phe Asn Ala Asp Ala Tyr Ala Phe Ala Lys Arg Glu Lys15 10 15Val Ser Leu Ala Pro Gly Val Pro Xaa Val Phe Glu Thr20 25(2)SEQ ID NO:6資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Met Ala Asp Pro Asn Xaa Ala Ile Leu Gln Val Ser Lys Thr Thr Arg15 10 15Gly Gly Gln Ala Ala20(2)SEQ ID NO:7資料(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Pro Ile Leu Gln Val Ser Gln Thr Gly Arg15 10(2)SEQ ID NO:8資料(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Met Xaa Asp Pro Ile Xaa Leu Gln Leu Gln Val Ser Ser Thr1 5 10(2)SEQ ID NO:9資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Lys Ala Thr Tyr Val Gln Gly Gly Leu Gly Arg Ile Glu Ala Arg Val1 5 10 15(2)SEQ ID NO:10資料(ⅰ)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Lys Xaa Gly Leu Ala Asp Leu Ala Pro1 5(2)SEQ ID NO:11資料(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置12…12(C)其他資料殘基可以是Glu或者Ile(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Lys Xaa Tyr Ala Leu Ala Leu Met Ser Ala Val Xaa Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:12資料(ⅰ)序列特征(A)長度11個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Lys Asn Pro Gln Val Ser Asp Glu Leu Xaa Thr1 510(2)SEQ ID NO:13資料(ⅰ)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Xaa Gly Asp Pro Ala Ala Val Val15 10 15Ala Ala Asn Ser Thr20(2)SEQ ID NO:14資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Glu Ala Glu Val Xaa Tyr Leu Gly Gln Pro Gly Glu Leu Val Asn15 10 15(2)SEQ ID NO:15資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置2…2(C)其他資料殘基可以是Gly或者Ala(A)名稱/關鍵字其他(B)位置15…15(C)其他資料殘基可是Pro或Ala(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Ala Xaa Val Val Pro Pro Xaa Gly Pro Pro Ala Pro Gly Ala Xaa15 10 15(2)SEQ ID NO:16資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Ala Pro Ala Pro Asp Leu Gln Gly Pro Leu Val Ser Thr Leu Ser15 10 15(2)SEQ ID NO:17資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Ala Thr Pro Asp Trp Ser Gly Arg Tyr Thr Val Val Thr Phe Ala Ser15 10 15Asp Lys Leu Gly Thr Ser Val Ala Ala20 25(2)SEQ ID NO:18資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質
(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置15…15(C)其他資料殘基可以是Ala或Arg(A)名稱/關鍵字其他(B)位置23…23(C)其他資料殘基可是Val或Leu(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Ala Pro Pro Tyr Asp Asp Arg Gly Tyr Val Asp Ser Thr Ala Xaa Xaa1 5 10 15Ala Ser Pro Pro Thr Leu Xaa Val Val20 25(2)SEQ ID NO:19資料(ⅰ)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Glu Pro Glu Gly Val Ala Pro Pro1 5(2)SEQ ID NO:20資料(ⅰ)序列特征(A)長度25個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Glu Pro Ala Gly Ile Pro Ala Gly Phe Pro Asp Val Ser Ala Tyr Ala5 10 15Ala Val Asp Pro Xaa Xaa Tyr Val Val20 25(2)SEQ ID NO:21資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Ala Pro Val Gly Pro Gly Xaa Ala Ala Tyr Val Gln Gln Val Pro15 10 15(2)SEQ ID NO:22資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Asp Val Phe Ser15 10 15(2)SEQ ID NO:23資料(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Met Val Pro Ser Pro15 10 15Ser Met Gly(2)SEQ ID NO:24資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Met Val Pro Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO:25資料(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Xaa Xaa Thr Gly Leu His Arg Leu Arg Met Met Val Pro Asn1 5 10
(2)SEQ ID NO:26資料(ⅰ)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置16…16(C)其他資料殘基可是Ser或Val(A)名稱/關鍵字其他(B)位置17…17(C)其他資料殘基可是Gln或Val(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Val Pro Ala Asp Pro Val Gly Ala Ala Ala Gln Ala Glu Pro Ala Xaa15 10 15Xaa Arg Ile Asp20(2)SEQ ID NO:27資料(ⅰ)序列特征(A)長度14個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置4…4(C)其他資料殘基可以是Tyr或Pro(A)名稱/關鍵字其他(B)位置8…8(C)其他資料殘基可以是Val或Gly(A)名稱/關鍵字其他(B)位置9…9(C)其他資料殘基可以是Ile或Tyr(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:
Asp Pro Xaa Xaa Asp Ile Glu Xaa Xaa Phe Ala Arg Gly Thr15 10(2)SEQ ID NO:28資料(ⅰ)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Ala Pro Ser Leu Ser Val Ser Asp Tyr Ala Arg Asp Ala Gly Phe1 5 10 15(2)SEQ ID NO:29資料(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅸ)特點(A)名稱/關鍵字其他(B)位置2…2(C)其他資料殘基可以是Leu或者Pro(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ala Xaa Leu Gly Xaa Thr Val Asp Ala Asp Gln15 10 15(2)SEQ ID NO:30資料(ⅰ)序列特征(A)長度330個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Met Lys Phe Val Asp Arg Phe Arg Gly Ala Val Ala Gly Met Leu Arg1 5 10 15Arg Leu Val Val Glu Ala Met Gly Val Ala Leu Leu Ser Ala Leu Ile20 25 30Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Glu Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu35 40 45Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile50 55 60Lys Val Gln Phe Gln Asn Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu65 70 75 80Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn85 90 95Thr Thr Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Ile Ser Val Val Met
100 105 110Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala115 120 125Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr130 135 140Ser Glu Leu Pro Glu Tyr Leu Gln Ser Asn Lys Gln Ile Lys Pro Thr145 150 155 160Gly Ser Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Leu Ser Ala Leu Thr165 170 175Leu Ala Ile Tyr His Pro Asp Gln Phe Ile Tyr Val Gly Ser Met Ser180 185 190Gly Leu Leu Asp Pro Ser Asn Ala Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu195 200 205Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro210 215 220Ser Thr Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Thr Val Asn Val Gly225 230 235 240Thr Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Met Tyr Cys Gly Asn Gly245 250 255Lys Pro Thr Glu Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys Leu Leu Glu260 265 270Gly Leu Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Gly Tyr Asn Ala275 280 285Gly Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Asp Ser Gly Thr His290 295 300Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Glu Gln Leu Asn Asp Met Lys Pro Asp Leu305 310 315 320Gln Gln Tyr Leu Gly Ala Thr Pro Gly Ala325 330(2)SEQ ID NO:31資料(ⅰ)序列特征(A)長度327個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:Met Ile Asp Val Ser Gly Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Trp Leu Leu1 5 10 15Val Gly Ala Ala Ala Thr Leu Pro Ser Leu Ile Ser Leu Ala Gly Gly20 25 30Ala Ala Thr Ala Ser Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr35 40 45Leu Gln Val Pro Ser Glu Ala Met Gly Arg Thr Ile Lys Val Gln Phe50 55 60Gln Asn Gly Gly Asn Gly Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu65 70 75 80Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Ser Ala Phe85 90 95Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly100 105 110Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala115 120 125Gly Cys Thr Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro130 135 140Lys Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ser Val Lys Ser Thr Gly Ser Ala Val145 150 155 160Val Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Ala Tyr165 170 175His Pro Asp Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Met Asp180 185 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Leu Asp Asp Ser Gly Asn Arg Val Asp85 90 95Val Arg Ala Leu Ile Pro Lys Ser Asn Pro Gln Arg Tyr Leu Gln Ala100 105 110Leu Tyr Thr Pro Pro Phe Gln Asn Trp Glu Lys Ala Ile Ala Phe Asp115 120 125Asp Ala Arg Asp Gly Ser Ala Trp Ser Ala Ala Asn Ala Arg Phe Asn130 135 140Glu Phe Phe Arg Glu Ile Val His Arg Phe Asn Phe Glu Asp Leu Met145 150 155 160Leu Leu Asp Leu Glu Gly Asn Val Val Tyr Ser Ala Tyr Lys Gly Pro165 170 175Asp Leu Gly Thr Asn Ile Val Asn Gly Pro Tyr Arg Asn Arg Glu Leu180 185 190Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ala Val Ala Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Val195 200 205Gly Val Thr Asp Phe Gly Trp Tyr Leu Pro Ala Glu Glu Pro Thr Ala210 215 220Trp Phe Leu Ser Pro Val Gly Leu Lys Asp Arg Val Asp Gly Val Met225 230 235 240Ala Val Gln Phe Pro Gly Ile245(2)SEQ ID NO:136資料(ⅰ)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:136:ATGAGCGAAA TCGCCCGNCC CTGGCGGGTT CTGGCATGTG GCATC 45(2)SEQ ID NO:137資料(ⅰ)序列特征(A)長度340個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:137:GCCACCGGCG 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Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Gly Val Ser Ala Pro Ala1 5 10 15Val Ala Pro Ala Pro Ala Met Pro Ala Arg Pro Val Ser Thr Ile Ala20 25 30Pro Ala Thr Ser Gly Thr Leu Ser Glu Phe Phe Ala Ala Lys Gly Val35 40 45Thr Met Glu Pro Gln Ser Ser Arg Asp Phe Arg Ala Leu Asn Ile Val50 55 60Leu Pro Lys Pro Arg Gly Trp Glu His Ile Pro Asp Pro Asn Val Pro65 70 75 80Asp Ala Phe Ala Val Leu Ala Asp Arg Val Gly Gly Lys Gly Gln Xaa85 90 95Ser Thr Asn Ala His Val Val Val Asp Lys His Val Gly Glu Phe Asp100 105 110Gly(2)SEQ ID NO:141資料(ⅰ)序列特征(A)長度73個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線型(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:141:Val Thr Thr Ser Val Glu Gln Val Val Ala Ala Ala Asp Ala Thr Glu1 5 10 15Ala Ile Val Asn Gly Phe Lys Val Ser Val Pro Gly Pro Gly Pro Ala20 25 30Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Gly Val Pro Pro Ala Pro Gly35 40 45Ala Pro Ala Leu Pro Leu Ala Val Ala Pro Pro Pro Ala Pro Ala Val50 55 60Pro Ala Val Ala Pro Ala Pro Gln Leu65 70
權利要求
1．含可溶性牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分之多肽，或其變體，其中所述抗原誘導先前接觸過分枝桿菌的患者的免疫反應。
2．含牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包含的序列選自(a)在SEQ ID NOS:1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列；以及(b)當通過計算機算法BLASTP測定時，與SEQ ID NOS:1-4,9-16,18-21,23,25,26,28,29,44,45,47,52-55,63,64,70,75,89,94,98,100-105,109,110,112,121,124,125,134,135,140和141中描述的序列有至少約99％概率相同的序列。
3．含牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包含的氨基酸序列由選自如下DNA分子編碼(a)在SEQ ID NOS:40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,120,122,123,132,133和136-138中列舉的序列；(b)在SEQ ID NOS:40-42,46,48-51,74,88,93,97,99,106-108,111,120,122,123,132,133和136-138中列舉的序列的互補體；以及(c)當通過計算機算法FASTA測定時，與(a)和(b)的序列有至少約99％概率是相同的序列。
4．含編碼權利要求1-3任何之一的多肽之核苷酸序列的DNA分子。
5．含權利要求4的DNA分子的表達載體。
6．用權利要求5的一種表達載體轉化的宿主細胞。
7．權利要求6的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自大腸桿菌，分枝桿菌，昆蟲，酵母和哺乳動物細胞。
8．含權利要求1-3任何之一的兩個或兩個以上多肽之融合蛋白。
9．含權利要求1-3任何之一的一個或多個多肽和一種生理可接受載體之藥物組合物。
10．含權利要求4的DNA分子和一種生理可接受載體之藥物組合物。
11．含培養(yǎng)中牝牛分枝桿菌細胞分泌的一個或多個成分和一種生理上可接受載體之藥物組合物。
12．含權利要求8的融合蛋白和一種生理可接受載體之藥物組合物。
13．含權利要求1-3任何之一的一個或多個多肽和一種非特異性免疫反應放大劑之疫苗。
14．含權利要求4的DNA分子和一種非特異性免疫反應放大劑之疫苗。
15．含培養(yǎng)中牝牛分枝桿菌分泌的一個或多個成分和一種非特異性的免疫反應放大劑之疫苗。
16．含權利要求8的融合蛋白和一種非特異性免疫反應放大劑之疫苗。
17．權利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特異性免疫反應放大劑是佐劑。
18．權利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特異性免疫反應放大劑包括去脂的牝牛分枝桿菌細胞。
19．權利要求13-16任何之一的疫苗，其中非特異性免疫反應放大劑包括牝牛分枝桿菌的培養(yǎng)濾出物。
20．一種誘導患者保護性免疫力的方法，包括給患者施用權利要求9-12任何之一的藥物組合物。
21．一種誘導患者保護性免疫力的方法，包括給患者施用權利要求13-19任何之一的疫苗。
22．一種檢測患者的分枝桿菌感染的方法，包括(a)用權利要求1-3任意一項的一種或多種多肽接觸患者皮膚細胞；和(b)檢測患者皮膚的免疫反應。
23．權利要求22的方法，其中所述免疫反應是硬結。
24．一種診斷試劑盒，包括(a)權利要求1-3任意一項的多肽；和(b)足以使所述多肽與患者皮膚細胞接觸的裝置。
25．一種檢測生物學樣品中分枝桿菌感染的方法，包括(a)用權利要求1-3任何之一的一種或多種多肽接觸所述生物學樣品；和(b)檢測所述樣品中存在的與至少所述多肽之一結合的抗體。
26．權利要求25的方法，其中步驟(a)另外包括用38kD結核分枝桿菌抗原接觸所述生物學樣品和步驟(b)另外包括檢測所述樣品中存在的與所述38kD結核分枝桿菌抗原結合的抗體。
27．權利要求25的方法，其中所述多肽被結合到固體支持物上。
28．權利要求25的方法，其中所述生物學樣品選自全血，血清，血漿，唾液，腦脊液和尿。
29．檢測生物學樣品中分枝桿菌感染的方法，包括(a)用能結合到權利要求1-3中任意一項的多肽的結合試劑接觸所述生物學樣品；和(b)檢測所述樣品中結合所述結合試劑的蛋白質或多肽。
30．權利要求29的方法，其中所述結合試劑是單克隆抗體。
31．權利要求29的方法，其中所述結合試劑是多克隆抗體。
32．一種診斷試劑盒，包括(a)權利要求1-3中任意一項的至少一種多肽；和(b)檢測試劑。
33．權利要求32的試劑盒，其中所述多肽被固定化在固體支持物上。
34．權利要求32的試劑盒，其中所述檢測試劑包括一種偶聯(lián)到結合試劑的報道基團。
35．權利要求34的試劑盒，其中所述結合試劑選自抗-免疫球蛋白，G蛋白，A蛋白和植物凝集素。
36．權利要求34的試劑盒，其中所述報道基團選自放射性同位素，熒光基團，發(fā)光基團，酶，生物素和染料顆粒。
37．與權利要求1-3任何之一的多肽結合的單克隆抗體。
38．與權利要求1-3任何之一的多肽結合的多克隆抗體。
39．增強對抗原的非特異性免疫反應的一種方法，包括施用選自如下的成分(a)去脂牝牛分枝桿菌細胞；(b)去糖基化牝牛分枝桿菌細胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞
40．促進對抗原的非特異性免疫反應的一種方法，包括施用牝牛分枝桿菌細胞的培養(yǎng)濾出物。
41．包含選自如下成分的組合物(a)去脂牝牛分枝桿菌細胞；(b)去糖基化牝牛分枝桿菌細胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞
42．在患者中誘導保護性免疫力的方法，包括施用權利要求41的組合物。
43．含非特異性免疫反應放大劑和一種選自如下成分的疫苗(a)去脂牝牛分枝桿菌細胞；(b)去糖基化牝牛分枝桿菌細胞；和(c)去脂并去糖基化的牝牛分枝桿菌細胞。
44．在患者中誘導保護性免疫力的方法，包括給患者施用權利要求43的疫苗
45．促進對抗原的非特異性免疫反應的方法，包括施用一種多肽，所述多肽含一種抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列選自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)與SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少約97％一致性的序列。
46．含一種多肽的疫苗，所述多肽含一種抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列選自(a)在SEQ ID NOS:114,117和118中描述的序列；和(b)與SEQ ID NOS:114,117和118的序列有至少約97％一致性的序列。
47．牝牛分枝桿菌抗原的免疫學反應片段，其中基本由選自如下的氨基酸序列組成(a)在SEQ ID NOS:114和118中描述的序列；和(b)與SEQ ID NO:114和118中描述的序列有至少約97％一致性的序列。
48．促進抗分枝桿菌感染的保護性免疫力的方法，包括施用一種多肽，所述多肽含一種抗原的致免疫部分，其中所述抗原包括的序列選自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)與SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少約97％一致性的序列。
49．一種含牝牛分枝桿菌抗原的致免疫部分之多肽，其中所述抗原包括的序列選自(a)在SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列；和(b)與SEQ ID NO:114,117和118中描述的序列有至少約97％一致性的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供含牝牛分枝桿菌蛋白質的致免疫部分之多肽和編碼此類多肽之DNA分子,以及將其用于診斷和治療分枝桿菌感染的方法。還提供促進對抗原的免疫反應的方法,包括施用牝牛分枝桿菌培養(yǎng)濾出物或去脂牝牛分枝桿菌細胞。
文檔編號A61K39/04GK1235555SQ97199228
公開日1999年11月17日 申請日期1997年8月28日 優(yōu)先權日1996年8月29日
發(fā)明者P·譚, J·海葉馬, E·S·維斯埃爾, M·A·斯金納, L·M·斯科特, R·L·普雷斯蒂德格 申請人:吉尼西斯研究及發(fā)展有限公司