檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關(guān)應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關(guān)應(yīng)用，試劑盒中包含一組檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的探針，探針包括如SEQ ID No.1~SEQ ID No.136所示序列的任意一個(gè)或多個(gè)，所述基因?yàn)閞poB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因；本發(fā)明應(yīng)用多重實(shí)施熒光PCR技術(shù)，利用小溝結(jié)合物（MGB）和鎖核酸（LNA）雙重標(biāo)記的熒光探針，實(shí)現(xiàn)了短時(shí)高效結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥檢測效率，為結(jié)核病防治提供了強(qiáng)有力的檢測方法和工具。
【專利說明】
檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及相關(guān)應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒及 相關(guān)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WK)估計(jì)，全球有約20億人感染結(jié)核分 枝桿菌，每年有約200萬人死于結(jié)核。雪上加霜的是，近今年全球耐藥結(jié)核流行情況非常嚴(yán) 峻，W冊(cè)在"2013年全球結(jié)核報(bào)告"指出每年多耐藥結(jié)核(MDR-TB)新發(fā)病例約450000例并且 有170000例將死于MDR-TB感染。最新的WHCVIUATLD統(tǒng)計(jì):所有新發(fā)病例，10.2%的患者至少 耐受一種抗結(jié)核藥物，而MDR-TB為1.1 %。
[0003] 我國是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，同時(shí)也是MDR/XDR-TB高負(fù)擔(dān)國家之 一;每年新增100萬結(jié)核病例，其中10萬為MDR-TB，占了全球的四分之一?！?010年中國結(jié)核 分歧桿菌流行病抽樣調(diào)查統(tǒng)計(jì)》報(bào)道：我國結(jié)核分歧桿菌耐藥率高達(dá)42.1%，多耐藥率 (MDR-TB)6.8%，更恐怖的是泛耐藥率達(dá)到2.1%。結(jié)核分歧桿菌在我國肆虐，跟我國的實(shí)際 國情:抗生素亂用、結(jié)核耐藥的監(jiān)控失衡和醫(yī)療水平息息相關(guān)。
[0004] 隨著對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥的研究，盡管其耐藥機(jī)制比較復(fù)雜。相關(guān)基因突變成為 化療失敗的主要原因。利福平耐藥發(fā)生主要與rpoB基因81個(gè)堿基范圍內(nèi)突變相關(guān)，其中W 511、513、516、526、531基因突變最為常見。約90%^上異煙阱耐藥與1?116、1油4和址口(：基因 突變有關(guān)，其中的katG S315N/T、inhA-15C-T和ahpC-lOC-T和-9G-A為主要耐藥位點(diǎn)。embB 基因306位密碼子突變是乙胺下醇產(chǎn)生耐藥的主要分子機(jī)制。鏈霉素耐藥產(chǎn)生主要是由于 結(jié)核分枝桿菌核糖體S12蛋白編碼基因 rpsl突變所致，rpsl常見位點(diǎn)為43和88位密碼子突 變。哇諾酬類藥物耐藥突變位點(diǎn)主要為gyrA基因90和94位密碼產(chǎn)生突變。耐卷曲霉素、阿米 卡星和卡那霉素突變主要為16s rRNA基因突變，W1401和1402位點(diǎn)突變最為常見。
[0005] 結(jié)核分枝桿菌的臨床檢測一直W來主要依靠藥物藥敏試驗(yàn)，但傳統(tǒng)的在固體培養(yǎng) 基上進(jìn)行的藥物敏感試驗(yàn)周期長、敏感性低，嚴(yán)重影響了患者的早期診斷和治療。因此，研 發(fā)一種能夠快速檢測耐藥基因多點(diǎn)突變的方法及相關(guān)的試劑盒對(duì)促進(jìn)結(jié)核病的防治具有 重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題提出的一種能夠快速檢測耐藥基因多點(diǎn)突 變的方法及相關(guān)的探針和試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供了一組檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的探針，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個(gè)或多個(gè)，所述基因?yàn)榍蒾B基因、katG基因、inM基因、ahpC基 因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。采用DNA小溝結(jié)合物MGB(CDPI3)和鎖核酸 同時(shí)標(biāo)記探針。探針包括W下幾部分：1)報(bào)告基團(tuán)：位于DNA序列的5'-端，巧光基團(tuán)可W是 FAM、肥乂、￥10、1?0乂^(^的等報(bào)告基團(tuán)中任何一種；2)探針0魁序列，與基因突變和基因多態(tài) 性結(jié)合的序列，序列長度為8~18個(gè)bp; 3)鎖核酸化ΝΑ)修飾:探針DNA序列上1~4個(gè)堿基采 用鎖核酸修飾，其目的是提高探針于模板的雜交溫度;4)探針DNA序列3'-末端連接粹滅基 團(tuán)(NFQ)和小溝結(jié)合物MGB，運(yùn)些基團(tuán)可W為冊(cè)Q、DABCTL和MGB等。該探針組為如下表1中（1) ~（136)中的所示序列探針中的至少一個(gè)(其中大寫字母標(biāo)記的表示為"LNA修飾：
[000引表1探針序列表
[0009]




[0018] 為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0019] 優(yōu)選地，每個(gè)探針序列均有若干堿基采用鎖核酸修飾，探針3'-端還標(biāo)記有小溝結(jié) 合物MGB。
[0020] 優(yōu)選地，每個(gè)探針序列上有1-4個(gè)堿基采用鎖核酸修飾。
[0021] 優(yōu)選地，每個(gè)探針3'-端標(biāo)記有3個(gè)CDPI小溝結(jié)合物MGB。
[0022] 上述任一所述的探針中，所述的巧oB基因?yàn)槟屠Ｆ侥退幓?；所述katG基因、 inhA基因和ahpC基因?yàn)槟彤悷熩迥退幓颍籸psl基因?yàn)槟玩溍顾鼗?；embB基因?yàn)槟鸵野?下醇基因；gyrA基因?yàn)槟屯壑Z酬類的基因；rrs為耐卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素基因。
[0023] 巧 oB 基因突變?yōu)?531TCG-TTG、5 26CAC-AAC、5 26CAC-TAC、526CAC-GAC、516GAC-AAC、 516GAC-TAC和511CTG-CCG。
[0024] katG基因突變?yōu)椋簁atG 315AGC-ACC和315AGC-AAC; inhA突變?yōu)?15C-T; ahpC突變 為-10C-T和-9G-A突變。
[0025] 巧 si 基因突變?yōu)椋?3AAG-AGG 和 88AAG-AGGeRrs 突變?yōu)榈?1401 位 A-G、第 1402位 C-T 和1484位G-T突變。
[00%] embB 基因突變?yōu)椋旱?306 密碼子 4了6-4了4、4了6-41'1'、4了6-41'(：、4了6-6了6、4了6-(：了6和 ATG-TTG。
[0027] gyr A基因突變：位90GCG-GTG、94GAC-GGC、94GAC-CAC、94GAC-TAC和 94GAC-GCC。
[002引探針（1)~(42)位檢測rpoB基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探針。
[0029] 探針（2)~（9)中任一探針為檢測巧oB基因531TCG-TTG突變巧光探針，（1)野生型 探針。
[0030] 探針（11)~（15)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-AAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0031] 探針（16)~(22)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-TAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0032] 探針(23)~(28)中任一探針為檢測巧oB基因 526CAC-GAC突變巧光探針，（10)野生 型探針。
[0033] 探針(30)~(32)中任一探針為檢測巧oB基因516GAC-AAC突變巧光探針，（29)野生 型探針。
[0034] 探針(33)~(36)中任一探針為檢測巧oB基因 516GAC-AAC突變巧光探針，（29)野生 型探針。
[00巧]探針(38)~(42)中任一探針為檢測巧oB基因511CTG-CCG突變巧光探針，（37)野生 型探針。
[0036] 探針（43)~（49)位檢測katG基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0037] 探針(44)~(45)中任一探針為檢測katG基因315AGC-ACC突變巧光探針，（43)野生 型探針。
[003引探針(46)~(47)中任一探針為檢測katG基因315AGC-AAC突變巧光探針，（43)野生 型探針。
[0039] 探針（50)~（56)位檢測inhA基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。探針(51)~(56)中任一探針為檢inM基因-15C-T突變巧光探針，（50)野生型探針。
[0040] 探針（57)~（65)位檢測ahpC基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0041 ] 探針(58)~(61)中任一探針為檢測ahpC基因-10C-T突變巧光探針，（57)野生型探 針。
[0042] 探針(62)~（65)中任一探針為檢測ahpC基因-9G-A突變巧光探針，（57)野生型探 針。
[0043] 探針（66)~（87)位檢測embB基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0044] 探針(67)~(71)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATA突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0045] 探針(72)~(77)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATT突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0046] 探針(78)~(83)中任一探針為檢iiembB基因306ATG-ATC突變巧光探針，（66)野生 型探針。
[0047] 探針(86)為檢測embB基因 306ATG-GTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[004引探針(87)為檢測embB基因306ATG-CTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[0049] 探針(88)為檢測embB基因306ATG-TTG突變巧光探針，（66)野生型探針。
[0050] 探針（88)~（97)位檢測rps 1基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0051 ] 探針(89)~（92)中任一探針為檢測rpsl基因43AAG-AGG突變巧光探針，（88)野生 型探針。
[0化2] 探針(94)~（97)中任一探針為檢測rpsl基因88AAG-AGG突變巧光探針，（93)野生 型探針。
[0053] 探針（98)~（114)位檢測rrs基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0054] 探針(99)~（104)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（98)野生型 探針。
[0055] 探針（105)~（109)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（98)野生型 探針。
[0056] 探針（111)~（114)中任一探針為檢測rrs基因1401A-G突變巧光探針，（110)野生 型探針。
[0化7] 探針（115)~（136)位檢測gyrA基因突變探針，探針為MGB和LNA雙重標(biāo)記的巧光探 針。
[0化引探針（116)~（120)中任一探針為檢測gyrA基因90GCG-GTG突變巧光探針，（115)野 生型探針。
[0059] 探針（122)~（126)中任一探針為檢測gyrA基因94GAC-GGC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0060] 探針（127)~（129)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-CAC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0061 ] 探針（130)~（132)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-TAC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0062] 探針（133)~（136)中任一探針為檢測gyrA基因90GAC-GCC突變巧光探針，（121)野 生型探針。
[0063] 另一方面，本發(fā)明還提供一種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒，試劑盒包括 上述的探針，所述基因?yàn)?φοΒ基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基因、embB基因、 gyrA基因和/或rrs基因。
[0064] 試劑盒還包括如下所示的引物對(duì)：
[0065] 如SEQ ID No. 137和SEQ ID No. 138所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增rpoB基因片段 的引物對(duì)；
[0066] 如SEQ ID No. 139和SEQ ID No. 140所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增katG基因片段 的引物對(duì)；
[0067] 如SEQ ID No. 141和SEQ ID No. 142所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增inhA基因片段 的引物對(duì)；
[006引如SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增ahpC基因片段 的引物對(duì)；
[0069] 如SEQ ID No. 145和SEQ ID No. 146所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增embB基因片段 的引物對(duì)；
[0070] 如沈Q ID No. 147和SEQ ID No. 148所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增巧si基因片段 的引物對(duì)；
[0071] 如SEQ ID No. 149和SEQ ID No. 150所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增rrs基因片段 的引物對(duì)；
[0072] 如SEQ ID No. 151和SEQ ID No. 152所示序列組成的引物對(duì)，為擴(kuò)增gyrA基因片段 的引物對(duì)。
[0073] 具體序列如下表2所示：
[0074] 表2引物序列表
[0075]
[0076] 本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中結(jié)核分枝桿菌耐藥突變的方法，包括如下步驟：
[0077] 步驟一，巧光PCR體系的建立：
[007引1)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系l:w樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（137-138)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌rpoB片段;探針（1)或探針(29)為野生型探針;探針(2)~(9)中 選擇任一條檢測rpob 531;探針（11)~（15)、探針（16)~（22)和探針(22)~（28)中分別任 選一條檢測rpoB 516突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3 個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0079] 2)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系2: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（137-138)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌rpoB片段;探針（10)或探針（37)為野生型探針；探針（38)~ (42)中選擇任一條檢測rpob 511突變;探針(30)~(32)和探針(33)~（36)中分別任選一條 檢測rpoB 526突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基 采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0080] 3)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系3: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（139-140)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌katG片段;探針(43)為野生型探針;探針(44)~(45)中選擇任 一條檢測katG 315 AGC-ACC突變;探針(46)~(49)任選一條檢測katG 315AGC-AAC突變。檢 測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí) 3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0081 ] 4)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系4: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（141-144)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌inhA和ahpC基因片段;探針(50)或探針(57)為野生型探針;探 針巧1)~巧6)中選擇任一條檢測inhA-15C-T突變;探針巧8)~(61)和探針(62)~(65)中分 別任選一條檢測ahpC-lOC-T和-9G-A突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針 序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA 和MGB修飾。
[0082] 5)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系5: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（145-146)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌embB片段;探針(66)為野生型探針;探針(67)~(71)中選擇任 一條檢測embB 306ATG-ATA突變;探針(72)~（77)和探針(78)~(83)中分別任選一條檢測 embB 306ATG-ATT和ATG-ATC突變；探針（85)、（86)和（87)分別檢測embB 306ATG-GTG、ATG- CTG和ATG-TTG。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用 鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0083] 6)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系6: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（147-148)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌rpsl片段;探針（88)或探針（93)為野生型探針；探針（89)~ (92)中選擇任一條檢測rpsl 43AAG-AGG突變；探針（94)~（97)任選一條檢測檢測rpsl 88AAG-AGG突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用 鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0084] 7)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系7: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（149-150)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌rrs片段;探針(98)、或探針（105)、或探針（110)為野生型探針； 探針(99)~（105)中選擇任一條檢測rrs 1401A-G突變;探針（106)~（109)中任選一條檢測 rrs基因1402C-T突變;探針（110)~（114)中任選一條檢測rrsl484G-T突變。檢測突變的探 針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修 飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0085] 8)實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系8: W樣本中DNA為模板，W寡核巧酸序列（151-152)為引 物擴(kuò)增樣本中結(jié)核分枝桿菌gyrA片段;探針（115)或探針（121)為野生型探針;探針（116)~ (120)中選擇任一條檢測gyrA90 GCG-GTG突變;探針（122)~（126)、探針（127)~（129)、探 針（130)~（132)和探針（133)~（136)中分別任選一條用于分別檢測gyrA94 GAC-GGC、GAC- CAC、GAC-TAC和GAC-GCC突變。檢測突變的探針采用5'-端巧光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~ 3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾。野生型探針采用巧光基因 B、LNA和MGB修飾。
[0086] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系1檢測巧oB基因531和516突變；
[0087] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系2檢測巧oB基因526和511突變；
[008引上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系3檢測katG基因315AGC-ACC和315AGC-AAC突變；
[0089] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系4檢測inM基因-15C-T，址pC基因-10C-T和-9G-A突變；
[0090] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系5檢測embB基因306突變；
[0091] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系6檢測巧si基因88和43突變；
[0092] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系7檢測rrs基因1401、1402和1484突變；
[0093] 上述實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系8檢測gyrA基因90和94突變；
[0094] 步驟二，將實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系1~8分別進(jìn)行實(shí)施巧光PCR定量擴(kuò)增，得到各個(gè) 體系的擴(kuò)增曲線，分別記為曲線1~曲線8。
[00巧]步驟Ξ，結(jié)果分析：
[0096] 1)如果曲線1中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpoB 基因531和/或516突變；
[0097] 2)如果曲線2中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpoB 基因526和/或511突變；
[009引 3)如果曲線3中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在katG 基因315突變；
[0099] 4)如果曲線4中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在inhA- 15C-T或/和址pC-1 OC-T'和/或基址PC-9G/A突變。
[0100] 5)如果曲線5中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在embB 306突變；
[0101] 6)如果曲線6中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rpsl 基因43和/或88基因突變；
[0102] 7)如果曲線7中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在 rrsHOl或/和rrsl402或/和1484基因突變；
[0103] 8)如果曲線8中有A巧光基團(tuán)的巧光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值<42,則樣品中存在gyrA 90或/和94基因突變；
[0104] 上述探針5 ' -端巧光基團(tuán)A和B為常見染料FAM、J0E、VIC和皿X中的一種;3 ' -端為帶 有粹滅基團(tuán)及小溝結(jié)合物(MGB);所述探針序列上有1~3個(gè)堿基被鎖核酸修飾。
[0105] 巧光基團(tuán)：
[0106] 1)所述探針5'-端巧光基團(tuán)A為常見巧光基團(tuán)，具體為FAM;
[0107] 2)所述探針3'-端帶有粹滅基團(tuán)及小溝結(jié)合物，具體可W為MGB基團(tuán)；
[0108] 3)所述探針序列中含有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾；
[0109] 巧光PCT體系：上述巧光PCR體系中，還包含實(shí)時(shí)巧光PCR緩沖液、dUTP、dTTP、dATP、 dCTP、dGTP、Mg化、Hots^d Taq DM聚合酶、尿喀晚DM糖基酶。
[0110] 巧光PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0度2分鐘；95度10分鐘；95度25秒，58度60秒，共42循環(huán)；58 度60秒為巧光采集步驟。
[0111] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果:本發(fā)明應(yīng)用多重 實(shí)施巧光PCR技術(shù)，利用小溝結(jié)合物(MGB)和鎖核酸(LNA)雙重標(biāo)記的巧光探針，實(shí)現(xiàn)了短時(shí) 高效結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥檢測效率，為結(jié)核病防治提 供了強(qiáng)有力的檢測方法和工具。
【附圖說明】
[0112] 圖1為實(shí)施例一中體系1中加入巧oB 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC- TAC突變DNA的FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線。
[0113] 圖2為實(shí)施例一中體系2中加入巧oB 526 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/ 或511 CTG-CCG突變DNA的FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線。
[0114] 圖3為實(shí)施例一中體系3中加入katG 315突變模板，F(xiàn)AM巧光基團(tuán)的"S"擴(kuò)增曲線。
[0115] 圖4為實(shí)施例一中體系4中加入inhA-15C-T或/和ahpC-lOC-T和/或基ahpC-9G/A突 變DNA的FAM巧光基團(tuán)的"S"擴(kuò)增曲線。
[0116] 圖5為實(shí)施例一中體系5中加入embB 306突變DNA的FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線。
[0117] 圖6為實(shí)施例一中體系6中加入rpsl基因43和/或88基因突變DNA，有FAM巧光基團(tuán) 的"S"擴(kuò)增曲線。
[0118] 圖7為實(shí)施例一中體系7中加入rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變DNA，有 FAM巧光基團(tuán)的"S"擴(kuò)增曲線。
[0119] 圖8為實(shí)施例一中體系8中，gyrA 90或/和94基因突變，有FAM巧光基團(tuán)的"S"擴(kuò)增 曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0120] 本發(fā)明提供了一組檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的探針，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個(gè)或多個(gè)，所述基因?yàn)榍蒾B基因、katG基因、inM基因、ahpC基 因、rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。同時(shí)提供了相應(yīng)的試劑盒，并提供了利用 上述探針檢測結(jié)核分枝桿菌是否發(fā)生耐藥性突變的方法。
[0121] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，W使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0122] 實(shí)施例一
[0123] 1、材料：
[0124]
[0125] ~~2、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備: '
'
[0126] 樣本制備
[0127] 接受來自臨床的疲液樣本，按照臨床處理規(guī)范處理。加入疲液10倍體積的Imol/L 氨氧化鋼(v/v=l: 10)振搖液化30-60min，12 OOOr/min離屯、2min，富集沉淀（可多富集幾 次），待用；向菌體沉淀中加入20化1緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮，100°C煮lOmin;瞬時(shí)離 屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠；向管中加入20μ1 Proteinase K溶液，混勻。加入22化1緩沖液 GB，振蕩15sec，70°C放置lOmin，溶液應(yīng)變清亮，簡短離屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠;注意：加 入緩沖液GB時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，一般70°C放置時(shí)會(huì)消失，不會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如溶液未 變清亮，說明細(xì)胞裂解不徹底，可能導(dǎo)致提取DNA量少和提取出的DNA不純。加220μ1無水乙 醇，充分振蕩混勻15sec，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離屯、W去除管蓋內(nèi)壁的水珠;將上 一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收管中），12，OOOrpm(~13， 400Xg)離屯、30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入50化1緩沖 液GD(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm(~13,400Xg)離屯、30sec，倒掉廢 液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中加入60化1漂洗液PW(使用前請(qǐng)先檢查是否 已加入無水乙醇），12,000巧m(~13,400Xg)離屯、30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管 中。將吸附柱CB3放回收集管中，12，00化pm(~13，400 X g)離屯、2min，倒掉廢液。將吸附柱 CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸附材料中殘余的漂洗液。注意:運(yùn)一步的目的是將 吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí) 驗(yàn)。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離屯、管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μ1洗脫緩 沖液ΤΕ，室溫放置2-5min，12，OOOrpm(~13，400 X g)離屯、2min，將溶液收集到離屯、管中。注 意:洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μ1，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有 很大影響。若用ddH20做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效 率;且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20°C，W防DNA降解。
[0128] 標(biāo)準(zhǔn)品制備:上述突變標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒由上海生工合成，將質(zhì)粒梯度稀釋備用。
[0129] 探針和引物的設(shè)計(jì)和合成，探針設(shè)計(jì)參見下表3,引物設(shè)計(jì)參見表2。
[0130] 表3探針設(shè)計(jì)
[0131]
[0132]
[0133] 備注:換針序列中，大與堿基為LNA修飾的堿基。
[0134] 探針合成和標(biāo)記；針對(duì)巧〇8、4曰16、;[]1114、曰119〔、61]1613、巧31、祥3和旨7'4基因突變的 探針，5'-端采用FAM標(biāo)記，序列中有1~2個(gè)堿基采用鎖核酸(LNA)修飾，3'-端采用帶有非巧 光粹滅基團(tuán)的小溝結(jié)合物MGB標(biāo)記。
[0135] 3、巧光PCR檢測結(jié)核分枝桿菌多耐藥位點(diǎn)
[0136] 1)擴(kuò)增模板:含有上述基因突變的質(zhì)粒，稀釋至lOOOOcopies/ml備用。
[0137] 2)各個(gè)巧光PCR檢測體系：
[0138] 巧光PCR檢測體系1:探針（1)為野生型探針，5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列第4、第六和 第八個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -MGB;探針(9)、（ 32)和(36)分別檢測巧oB 531 TCG〉TTG、516GAC-AAC 和GAC-TAC，探針序列都選用5 ' -FAM，序列中1~2個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體 系為(137)和(138)。
[0139] 體系中加入模板含有巧oB 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突變 DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/ml。
[0140] 巧光PCR檢測體系2:探針（10)為野生型探針，探針（15)、（22)、（26)和（40)檢測 巧 oB基因 526CAC-AAC、CAC-TAC、CAC-GAC和511 CTG-CCG 突變。探針（10) 5 ' -3 ' 端分別標(biāo)記有 5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;探針（15)、（ 22)、（ 26)和(40)都選用5 ' - FAM，序列中1~2個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾;引物體系為(137)和(138)。
[0141] 體系中加入模板含有巧〇8 516 04044巧日/或〔40了4巧日/或〔4(：-64巧日/或511 CTG-CCG 突變 DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/ml。
[0142] 巧光PCR檢測體系3:探針(43)為野生型探針，探針(44)和(49)檢測katG AGC-ACC 和AGC-AAC突變。探針(43) 5 ' -3 '端分別標(biāo)記有5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾， 3 ' -MGB;探針(44)和(49)都選用5 ' -FAM，序列中1個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體 系為(139)和(40)。
[0143] 體系中加入模板含有katG AGC-ACC和/或AGC-AAC突變DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/mlo
[0144] 巧光PCR檢測體系4:探針(57)為野生型探針，探針(52)檢測inM-15C-T突變，探針 (60)和(65)檢測ahpC-lOC-T和-9G-A。野生型探針5'-3'端分別標(biāo)記有5'-端標(biāo)記VIC，探針 序列中有堿基LNA修飾，3'-MGB;探針（52)、（65)和(60)都選用5'斗41，序列中1~2個(gè)堿基 LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體系為(141)~（144)。
[0145] 體系中加入模板含有inhA-15C-T和/或ahpC-lOC-T和/或-9G-A突變DNA。模板的濃 度為 lOOOOcopies/ml。
[0146] 巧光PCR檢測體系5:探針(84)為野生型探針，探針(69)、（77)、（78)、（87)、（85)和 (86)檢測embB306突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標(biāo)記有5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列中有堿基 LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有1個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修 飾；引物體系為（145)和（146)。
[0147] 體系中加入模板含有embB306突變DNA。模板的濃度為lOOOOcopies/ml。
[014引巧光PCR檢測體系6:探針(88)為野生型探針，探針(89)和(98)檢測rpsl43AAG-AGG 和88AAG-AGG突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標(biāo)記有5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列中有堿基LNA修 飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 '-FAM，序列中有1個(gè)堿基LNA修飾，3 '-末端MGB修飾；引物 體系為（147)和（148)。
[0149] 體系中加入模板含有巧S143AAG-AGG和/或88AAG-AGG突變DNA。模板的濃度為 lOOOOcopies/mlo
[0150] 巧光PCR檢測體系7:探針（98)為野生型探針，探針（99)、（107)和（11)檢測 rrsl401A-G、1402C-T和1484G-T突變。野生型探針5 '-3 '端分別標(biāo)記有5 ' -端標(biāo)記VIC，探針 序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有1個(gè)堿基LNA修飾， 3 ' -末端MGB修飾；引物體系為（149)和（150)。
[0151] 體系中加入模板含有rrsl401A-G和/或1402C-T和/或1484G-T突變DNA。模板的濃 度為 lOOOOcopies/ml。
[0152] 巧光PCR檢測體系8:探針（121)為野生型探針，探針（118)、（124)、（129)、（132)和 (135)檢測gyrA90GCG-GTG、94GAC-GGC、CAC、TAC和GCC突變。野生型探針5 ' -3 '端分別標(biāo)記有 5 ' -端標(biāo)記VIC，探針序列中有堿基LNA修飾，3 ' -MGB;檢測突變探針都選用5 ' -FAM，序列中有 1個(gè)堿基LNA修飾，3 ' -末端MGB修飾；引物體系為(145)和(146)。
[0153] 體系中加入模板含有g(shù)yrA90GCG-GTG和/或94GAC-GGC和/或CAC和/或TAC和/或GCC 突變DNA。模板的濃度為lOOOOcopies/ml。
[0154] 3)各反應(yīng)體系中，引物和探針濃度為0.15mM。
[01 巧]4)PCR體系：10 XMOLE Hots^d Taq DNA聚合酶Buffer 3μ1，5 XEnhance Buffer 化 1，加 TP/dNTP mix終濃度為0.2mM，M0LE Hotstad Taq DNA聚合酶終濃度為0.05υ/μ1， UNG酶為0.00?υ/μ1，模板化1，剩余部分加水補(bǔ)足至30μ1。
[0156] 5)反應(yīng)程序，與ΑΒΙ 7500巧光PCR儀器上進(jìn)行;程序?yàn)?0度2分鐘;95度10分鐘;95 度25秒，58度60秒，共42循環(huán);58度60秒為巧光采集步驟。
[0157] 6)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：
[015引體系1中加入巧οΒ 531 TCG〉TTG和/或516GAC-AAC和/或516GAC-TAC突變DNA，觀察 到FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在rpoB基因531和/或516突變;見圖 10
[0159] 體系2中，加入巧oB 516 CAC-AAC和/或CAC-TAC和/或CAC-GAC和/或511 CTG-CCG 突變DNA，觀察到FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在rpoB基因526和/或 511突變;見圖2。
[0160] 體系3中加入katG 315突變模板，有FAM巧光基團(tuán)的"S"擴(kuò)增曲線，且Ct值<42,則樣 品中存在katG基因315突變;見圖3。
[0161] 體系4中加入inM-15C-T或/和址pC-lOC-T和/或基址PC-9G/A突變DNA，有FAM巧光 基團(tuán)的擴(kuò)增曲線，且Ct值<42，則樣品中存在inhA-15C-T或/和ahpC-lOC-T和/或基ahpC- 9G/A突變。見圖4。
[0162] 體系5中加入embB 306突變DNA，F(xiàn)AM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線，且Ct值<42，則樣品 中存在embB 306突變;見圖5。
[0163] 體系6中，加入rpsl基因43和/或88基因突變DNA，有FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線， 且Ct值<42,則樣品中存在巧si基因43和/或88基因突變;見圖6。
[0164] 體系7中，加入rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變DNA，有FAM巧光基團(tuán)的 "夢'擴(kuò)增曲線，且Ct值<42,則樣品中存在rrsl401或/和rrsl402或/和1484基因突變;見圖7。 [01化]體系8中，gyrA 90或/和94基因突變，有FAM巧光基團(tuán)的擴(kuò)增曲線，且Ct值<42， 則樣品中存在gyrA 90或/和94基因突變。見圖8。
[0166] 上述實(shí)施例表明，應(yīng)用本發(fā)明的方法可W快速檢測結(jié)核分枝桿菌多個(gè)耐藥位點(diǎn)。 由此可見，本發(fā)明應(yīng)用多重實(shí)施巧光PCR技術(shù)，利用小溝結(jié)合物(MGB)和鎖核酸(LNA)雙重標(biāo) 記的巧光探針，實(shí)現(xiàn)了短時(shí)高效結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測的目的，大大提高了臨床耐藥 檢測效率，為結(jié)核病防治提供了強(qiáng)有力的檢測方法和工具。
[0167] W上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于W上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的探針，其特征在于，包括如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序列的任意一個(gè)或多個(gè)，所述基因?yàn)閞poB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、 rpsl基因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于，每個(gè)探針序列均有若干堿基采用鎖核酸修 飾，探針3 ' -端還標(biāo)記有小溝結(jié)合物MGB。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于，由如SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 136所示序 列的探針組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，每個(gè)探針序列上有1-4個(gè)堿基采用鎖核酸 修飾。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，每個(gè)探針3 端標(biāo)記有3個(gè)CDPI小溝結(jié)合物 MGB〇6. -種檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要 求1-5任意一項(xiàng)所述的探針，所述基因?yàn)閞poB基因、katG基因、inhA基因、ahpC基因、rpsl基 因、embB基因、gyrA基因和/或rrs基因。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括如下所示的引物對(duì)： 如SEQ ID No. 137和SEQ ID No. 138所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 139和SEQ ID No. 140所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 141和SEQ ID No. 142所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 145和SEQ ID No. 146所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 147和SEQ ID No. 148所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 149和SEQ ID No. 150所示序列組成的引物對(duì)； 如SEQ ID No. 151和SEQ ID No. 152所示序列組成的引物對(duì)。8. -種檢測結(jié)核分枝桿菌是否發(fā)生耐藥性突變的方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一，熒光PCR體系的建立 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系l:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l37和SEQIDNo.l38 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌rpoB片段；以SEQ ID No. 1序 列所示的探針或SEQ ID No. 29序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No. 2~SEQ ID No.9序列所示的探針中選擇任一條檢測rpoB 531;在如SEQ ID No. 11~SEQ ID No. 15、SEQ ID No. 16~SEQ ID No. 22以及SEQ ID No.23~SEQ ID No.28序列所示的探針中分別任選一 條檢測rpoB 516突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基 采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系2:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l37和SEQIDNo.l38 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌rpoB片段；以SEQ ID No. 10序 列所示的探針或SEQ ID No. 37序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No.38~SEQ ID No.42序列所示的探針中選擇任一條檢測rpoB 511突變;在如SEQ ID No.30~SEQ ID No.32 和SEQ ID No.33~SEQ ID No.36序列所示的探針中分別任選一條檢測rpoB 526突變;檢測 突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系3:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l39和SEQIDNo.l40 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌katG片段；以SEQ ID No. 43序 列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.44~SEQ ID No.45序列所示的探針中選擇任 一條檢測katG 315 AGC-ACC突變；在如SEQ ID No.46~SEQ ID No.49序列所示的探針中任 選一條檢測katG 315 AGC-AAC突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序列 中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB 修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系4:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l41和SEQIDNo.l42 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌inhA基因片段；以檢測樣本中 DNA為模板，以SEQ ID No. 143和SEQ ID No. 144所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣 本中結(jié)核分枝桿菌ahpC基因片段；以SEQ ID No.50或SEQ ID No.57序列所示的探針為野生 型探針;在如SEQ ID No.51~SEQ ID No.56序列所示的探針中選擇任一條檢測inhA -15 C-T突變；在如SEQ ID No.58~SEQ ID No.61和SEQ ID No.62~SEQ ID No.65序列所示的探針 中分別任選一條檢測ahpC -10C-T和-9G-A突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo) 記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基 因 B、LNA和MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系5:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l45和SEQIDNo.l46 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌embB基因片段；以SEQ ID No.66序列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.67~SEQ ID No.71序列所示的探針中 選擇任一條檢測embB 306 ATG-ATA突變；在如SEQ ID No .72~SEQ ID No .77和SEQ ID No.78~SEQIDNo.83序列所示的探針中分別任選一條檢測embB 306 ATG-ATT和ATG-ATC 突變；利用如SEQ ID No.85、SEQ ID No.86和SEQ ID No.87序列所示的探針中分別檢測 embB 306 ATG-GTG、ATG-CTG和ATG-TTG;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序 列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3 團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和 MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系6:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l47和SEQIDNo.l48 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌rpsl片段；以SEQ ID No.88或 SEQ ID No.93序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No.89~SEQ ID No.92序列所示 的探針中任選一條檢測rpsl43AAG-AGG突變；在如SEQIDNo.94~SEQIDNo.97序列所示 的探針中任選一條檢測rpsl 88AAG-AGG突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記， 探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、 LNA和MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系7:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l49和SEQIDNo.l50 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌rrs基因片段；以SEQ ID No.98、SEQ ID No. 105或SEQ ID No. 110序列所示的探針為野生型探針;在如SEQ ID No.99 ~SEQ ID No.105序列所示的探針中任選一條檢測rrs 1401A-G突變;在如SEQ ID No.106~ SEQ ID No. 109序列所示的探針中任選一條檢測rrs基因1402C-T突變;在如SEQ ID No. 110 ~SEQ ID No. 114序列所示的探針中任選一條檢測rrs基因1484G-T突變;檢測突變的探針采 用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸修飾，同時(shí)3'-團(tuán)MGB修飾;野 生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系8:以檢測樣本中DNA為模板，以SEQIDNo.l51和SEQIDNo.l52 所示序列組成的引物對(duì)為引物擴(kuò)增檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌gyrA基因片段；以SEQ ID No. 115或SEQ ID No. 121序列所示的探針為野生型探針；在如SEQ ID No. 116~SEQ ID No.l20序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因90GCG-GTG突變;在如SEQIDNo.l22~ SEQIDNo.l26序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-GGC突變；在如SEQID No.l27~SEQIDNo.l29序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-CAC突變 ；在如 SEQIDNo.l30~SEQIDNo.l32序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-TAC突 變;在如SEQIDNo.l33~SEQIDNo.l36序列所示的探針中任選一條檢測gyrA基因94GAC-GCC突變;檢測突變的探針采用5'-端熒光基因 A標(biāo)記，探針序列中有1~3個(gè)堿基采用鎖核酸 修飾，同時(shí)3 ' -團(tuán)MGB修飾;野生型探針采用熒光基因 B、LNA和MGB修飾； 步驟二，獲得實(shí)時(shí)熒光PCR定量擴(kuò)增曲線 將所述步驟一實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系1~8分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR定量擴(kuò)增，得到各個(gè)體 系的擴(kuò)增曲線，分別為曲線1~曲線8; 步驟三，結(jié)果分析 如果曲線1中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpoB基因531 和/或516突變； 如果曲線2中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpoB基因526 和/或511突變； 如果曲線3中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在katG基因315 突變； 如果曲線4中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在inhA-15C-T 或 / 和ahpC-10C-T 和/或基ahpC-9G/A 突變； 如果曲線5中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在embB 306突 變； 如果曲線6中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rpsl基因43 和/或88基因突變； 如果曲線7中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在rrsHOl或/ 和rrsl402或/和1484基因突變； 如果曲線8中有A熒光基團(tuán)的熒光擴(kuò)增"S"曲線，且Ct值〈42,則樣品中存在gyrA 90或/ 和94基因突變。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述探針5'-端熒光基團(tuán)A和B為FAM、J0E、 VIC和HEX中的一種。10. 利用如權(quán)利要求8或9所述的方法檢測結(jié)核分枝桿菌是否發(fā)生耐藥性突變?cè)诜窃\斷 和治療目領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106011306SQ201610657425
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月11日
【發(fā)明人】齊飛虎, 張翼飛, 董鳳媛
【申請(qǐng)人】上海默禮生物醫(yī)藥科技有限公司