本發(fā)明涉及細(xì)菌培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種分枝桿菌快速分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

分枝桿菌屬(Mycobacterium)是一類細(xì)長(zhǎng)略彎曲的微生物，有時(shí)有分枝或出現(xiàn)絲狀體。目前在分類學(xué)上已將分枝桿菌屬歸納于放線菌中。對(duì)人致病的放線菌可分含和不含分枝菌酸兩類。分枝桿菌可通過(guò)呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機(jī)體，引起多種組織器官的結(jié)核病，其中以通過(guò)呼吸道引起肺結(jié)核為最多。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，分枝桿菌每年引起全球約300萬(wàn)人死亡。20世紀(jì)80年代后結(jié)核病的發(fā)病率曾有所降低，但近年其全球疫情又呈上升趨勢(shì)，而且由于分枝桿菌耐藥性和多重耐藥菌株的出現(xiàn)，結(jié)核病對(duì)某些國(guó)家已構(gòu)成嚴(yán)重的健康威脅。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，我國(guó)三分之一左右的人口已感染了結(jié)核分枝桿菌，受感染人數(shù)超過(guò)4億。我國(guó)現(xiàn)有肺結(jié)核病人約500萬(wàn)，主要集中在25歲及以上人群；其中涂陽(yáng)肺結(jié)核病人150萬(wàn)；每年約有25萬(wàn)人死于結(jié)核病，死亡平均年齡為55.2歲。據(jù)研究，受結(jié)核菌感染的人群中，10％的人會(huì)發(fā)展為結(jié)核病。在臨床上，只有快速分離培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)藥敏測(cè)試，才能進(jìn)一步找到對(duì)結(jié)核分枝桿菌有效的藥物，因此要求提高結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)的速度，并且要求盡量避免培養(yǎng)過(guò)程中存在的雜菌污染問(wèn)題。

目前結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷已經(jīng)發(fā)展到基因研究的水平，國(guó)際上也有許多先進(jìn)的技術(shù)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室，但固體培養(yǎng)法及表型藥敏仍然是目前結(jié)核病診斷領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。長(zhǎng)期以來(lái)我國(guó)大部分的各級(jí)實(shí)驗(yàn)室一直采用羅氏固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，但其培養(yǎng)時(shí)間需要一個(gè)月以上。進(jìn)行表型藥敏檢測(cè)前需要獲得分枝桿菌的分離培養(yǎng)菌落，而羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出分枝桿菌陽(yáng)性培養(yǎng)物均為成團(tuán)結(jié)塊生長(zhǎng)，在做藥敏之前必須磨菌，將成團(tuán)的分枝桿菌打磨分散均勻才能進(jìn)行下一步藥敏實(shí)驗(yàn)，存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)高、勞動(dòng)強(qiáng)度大、耗時(shí)耗力的難題。因此迫切需要一種快速培養(yǎng)分枝桿菌以及簡(jiǎn)單的操作方法用于對(duì)接后期的分枝桿菌藥敏檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種步驟簡(jiǎn)單、培養(yǎng)時(shí)間短、無(wú)需磨菌的分枝桿菌快速分離培養(yǎng)方法。

本發(fā)明方法所采用的技術(shù)方案是，該方法是在分支桿菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述分支桿菌培養(yǎng)基包括液體培養(yǎng)基、無(wú)菌稀釋液和雜菌抑制劑，所述液體培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑、抑菌劑和分散劑，在所述分枝桿菌培養(yǎng)基內(nèi)加入有磁力攪拌子，該方法包括以下步驟：

（1）通過(guò)堿處理中和離心沉淀法對(duì)分支桿菌待檢標(biāo)本進(jìn)行抗污染液化處理；

（2）取出凍干雜菌抑制劑，加入無(wú)菌稀釋液后充分搖勻；

（3）取出液體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，吸取混合均勻的雜菌抑制劑加入液體培養(yǎng)基，充分混合均勻；

（4）取所述步驟（2）處理后的標(biāo)本溶液，在無(wú)菌條件下接種于所述步驟（3）中的培養(yǎng)基里，并置于多通道磁力攪拌機(jī)上，恒溫37℃全程進(jìn)行混懸培養(yǎng)；

（5）用實(shí)時(shí)濁度分析儀檢測(cè)，實(shí)時(shí)記錄液體培養(yǎng)基的濁度值變化，經(jīng)過(guò)7-14天時(shí)間培養(yǎng)，當(dāng)檢測(cè)到的麥?zhǔn)蠞岫戎颠_(dá)到1.0或以上并呈現(xiàn)特殊的生長(zhǎng)曲線，此培養(yǎng)可判斷為陽(yáng)性，結(jié)束培養(yǎng)。

進(jìn)一步地，所述無(wú)菌稀釋液為鉀鹽或鈉鹽的無(wú)菌溶液。

另進(jìn)一步地，所述雜菌抑制劑和所述抑菌劑為含有至少一種抗生素的凍干制劑，所述抗生素包括但不限于多粘菌素B、兩性霉素B、林可霉素、甲氧芐啶和萘啶酸。

再進(jìn)一步地，所述分散劑為吐溫20或吐溫80或曲拉通X-100。

又再進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括但不限于7H9干粉、甘油和純化水。

再又進(jìn)一步地，所述促生長(zhǎng)劑包括但不限于葡萄糖、氯化鈉和過(guò)氧化氫酶。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中，分枝桿菌培養(yǎng)基由磁力攪拌子和液體培養(yǎng)基兩部分組成，液體部分由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑、抑菌劑和分散劑組成。該培養(yǎng)基既能選擇性地促進(jìn)分枝桿菌的快速生長(zhǎng)，又能抑制其它雜菌生長(zhǎng)，分枝桿菌在液體培養(yǎng)基里經(jīng)磁力攪拌子的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)基中形成一定的濁度，麥?zhǔn)蠞岫戎颠_(dá)到1.0或以上之后的分枝桿菌液體培養(yǎng)基，可以直接進(jìn)行下一步的藥敏測(cè)試。本發(fā)明采用的液體培養(yǎng)基提供分枝桿菌快速生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)縮短培養(yǎng)耗時(shí)，利用培養(yǎng)基內(nèi)特殊的分散劑及混懸培養(yǎng)的方式避免分枝桿菌成團(tuán)生長(zhǎng)，陽(yáng)性培養(yǎng)物無(wú)需磨菌即可對(duì)接藥敏實(shí)驗(yàn)；分枝桿菌液體培養(yǎng)基7-14天即可獲得陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果，比傳統(tǒng)的固體羅氏培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間大大縮短，陽(yáng)性培養(yǎng)物無(wú)需磨菌直接對(duì)接藥敏實(shí)驗(yàn)，具有耗時(shí)短、生物安全性高、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的推廣應(yīng)用前景，適合在我國(guó)各級(jí)結(jié)核病專業(yè)收治機(jī)構(gòu)推廣使用。

附圖說(shuō)明

圖1是結(jié)核分枝桿菌濁度變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明方法是在分支桿菌培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，所述分支桿菌培養(yǎng)基包括液體培養(yǎng)基、無(wú)菌稀釋液和雜菌抑制劑，所述液體培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑、抑菌劑和分散劑，在所述分枝桿菌培養(yǎng)基內(nèi)加入有磁力攪拌子。其中，所述雜菌抑制劑或抑菌劑為含有至少一種抗生素的凍干制劑，所述抗生素為多粘菌素B、兩性霉素B、林可霉素、甲氧芐啶和萘啶酸，或其它。所述分散劑選自吐溫20或吐溫80或曲拉通X-100。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括7H9干粉、甘油和純化水。所述促生長(zhǎng)劑包括葡萄糖、氯化鈉和過(guò)氧化氫酶，也可選擇其它促生長(zhǎng)劑。在本實(shí)施例中，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、促生長(zhǎng)劑、抑菌劑按照900：100：1的比例混合均勻后，用玻璃螺口瓶（內(nèi)含磁力攪拌子1個(gè)）灌裝為6ml/支，共20支/盒。無(wú)菌稀釋液為3ml/支的鉀鹽、鈉鹽無(wú)菌溶液，用防盜滴瓶灌裝，1支/盒。雜菌抑制劑為多粘菌素B、兩性霉素B等抗生素的凍干制劑，將多粘菌素B、兩性霉素B等抗生素的混合藥液通過(guò)真空冷凍干燥工藝制得，1支/盒。

本發(fā)明方法包括以下步驟：

（1）參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》中的堿處理中和離心沉淀法對(duì)分支桿菌待檢標(biāo)本進(jìn)行抗污染液化處理。

（2）取出凍干雜菌抑制劑，旋開(kāi)瓶蓋，加入無(wú)菌稀釋液后充分搖勻。

（3）取出液體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，吸取混合均勻的雜菌抑制劑加入液體培養(yǎng)基，充分混合均勻。

（4）取所述步驟（2）處理后的標(biāo)本溶液0.1ml，在無(wú)菌條件下接種于所述步驟（3）中的培養(yǎng)基里，并置于多通道磁力攪拌機(jī)上，設(shè)置好轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速范圍為80轉(zhuǎn)/分鐘～100轉(zhuǎn)/分鐘，恒溫37℃全程進(jìn)行混懸培養(yǎng)。其中的多通道磁力攪拌機(jī)選自由賽洛捷克提供的型號(hào)為MS-H-S10的磁力攪拌機(jī)。

（5）如圖1所示的是結(jié)核分枝桿菌濁度變化曲線圖。用實(shí)時(shí)濁度分析儀檢測(cè)，實(shí)時(shí)記錄液體培養(yǎng)基的濁度值變化，經(jīng)過(guò)7-14天時(shí)間培養(yǎng)，當(dāng)檢測(cè)到的麥?zhǔn)蠞岫戎颠_(dá)到1.0或以上并呈現(xiàn)特殊的生長(zhǎng)曲線，此培養(yǎng)可判斷為陽(yáng)性，結(jié)束培養(yǎng)。進(jìn)行下一步的微孔板的藥敏測(cè)試結(jié)果。

采用分枝桿菌液體培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后的菌液進(jìn)行藥敏測(cè)試按以下步驟進(jìn)行：

（a）將混懸液體培養(yǎng)后陽(yáng)性菌稀釋至1.0麥?zhǔn)蠞岫?，直接接種于藥敏羅氏培養(yǎng)基或分枝桿菌藥敏液體培養(yǎng)基中，按各自的說(shuō)明書要求進(jìn)行操作。

（b）剩余的混懸液體培養(yǎng)后陽(yáng)性菌，可繼續(xù)保留培養(yǎng)7天左右的時(shí)間作為菌種保存等其他用處，或者直接高壓滅菌處理。

本發(fā)明用于解決當(dāng)前分枝桿菌固體分離培養(yǎng)及傳統(tǒng)羅氏藥敏檢測(cè)報(bào)陽(yáng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，并且解決分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)前的繁瑣的磨菌問(wèn)題，解決磨菌過(guò)程中存在的生物安全風(fēng)險(xiǎn)高、勞動(dòng)強(qiáng)度大以及耗時(shí)耗力的問(wèn)題。

本發(fā)明可應(yīng)用于細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。