專利名稱：：診斷由分枝桿菌引起的感染的方法和針對(duì)其的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的針對(duì)由結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)造成的動(dòng)物受試者(如人)的感染和與該感染相關(guān)的病狀(如，例如，結(jié)核病)的診斷性、預(yù)后性和治療性試劑。更具體而言，本發(fā)明提供了第一個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)的對(duì)如下內(nèi)容的公開(kāi)，即在受感染的受試者中表達(dá)適用于制備免疫性(immune-logical)試劑，如，例如，抗原性蛋白/肽和/或抗體的結(jié)核分枝桿菌的乙酮醇酸還原異構(gòu)酶(Ketol-acidreductoisomerase，KARI)蛋白(SEQIDNO:1)及其免疫原性表位以供感染的診斷、預(yù)后和治療，以及疫苗開(kāi)發(fā)。
背景技術(shù)：
：相關(guān)技術(shù)的描述結(jié)核病是慢性的傳染性疾病，其通常由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組(complex)中的一種或多種生物的感染而導(dǎo)致。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組”指一種或多種選自下組的生物結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌(M.bovis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、M.canetti和田鼠分枝桿菌(M.microti)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還知道所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組與所謂的鳥(niǎo)分枝桿菌(Mavium)復(fù)合菌組(包括鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulaire))不同，后者為稱作類結(jié)核病的不相關(guān)疾病(例如，在農(nóng)用動(dòng)物中)的病原體。結(jié)核病是發(fā)展中國(guó)家中的主要疾病，并在世界上發(fā)達(dá)區(qū)域也日漸稱為問(wèn)題，每年有8百萬(wàn)新病例以及3百萬(wàn)死亡。雖然感染可在相當(dāng)時(shí)間內(nèi)無(wú)癥狀，該疾病最常見(jiàn)地表現(xiàn)為肺的急性炎癥，導(dǎo)致發(fā)燒和排痰性咳嗽。如果放置不予治療，結(jié)核分枝桿菌可進(jìn)展至肺中的原發(fā)感染位點(diǎn)以外的身體中的其他器官，并通常導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。醫(yī)療工業(yè)的許多從業(yè)人員常常描述全球結(jié)核病發(fā)病率和微生物抗性正在快速增長(zhǎng)的問(wèn)題，所述問(wèn)題對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。具體而言，越來(lái)越認(rèn)識(shí)到迫切需要新的診斷方法、藥物和疫苗。對(duì)結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)維持并繁殖的免疫學(xué)機(jī)理所知不多。因此，關(guān)于肺結(jié)核和宿主之間的免疫性關(guān)系的任何新信息顯然可以以許多不同的方式用于促進(jìn)該疾病的診斷、治療和處理。結(jié)核病在晚期AIDS患者中的發(fā)病特別常見(jiàn)，大部分患者罹患該病。事實(shí)上，HIV感染是在純化的蛋白衍生物(PPD)-結(jié)核菌素-陽(yáng)性受試者中形成活性結(jié)核病(activetuberculosis)的最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素(riskfactor)，且在經(jīng)HIV感染的免疫抑制個(gè)體中與未經(jīng)HIV感染的個(gè)體相比較可顯著地增強(qiáng)遭受結(jié)核病感染的風(fēng)險(xiǎn)。還可能HIV-I和結(jié)核分枝桿菌的共感染介導(dǎo)了縮短的無(wú)HIV癥狀期，并縮短了受試者的存活時(shí)間，這可能是通過(guò)觸發(fā)病毒復(fù)制和病毒載量的增加，其導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞耗盡和免疫缺陷或免疫抑制(Corbett11等，2003；Ho,Mem.Inst.OswaldoCruz，91，385-387，1996)。結(jié)核分枝桿菌基因組的測(cè)序促進(jìn)了大量鑒定可由結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的潛在的結(jié)核分枝桿菌蛋白的研究努力。然而，序列數(shù)據(jù)本身并不足以得出該生物在體內(nèi)表達(dá)任何具體蛋白的結(jié)論，更遑論得出在對(duì)人或其他動(dòng)物受試者的感染過(guò)程中表達(dá)所述蛋白的結(jié)論了。同樣，闡明結(jié)核分枝桿菌基因組的開(kāi)放閱讀框也不表明由該細(xì)菌編碼或?qū)嶋H表達(dá)的任何特定蛋白包含任何免疫顯性(immunedominant)B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位，其為制備診斷性、預(yù)后性和治療性免疫試劑所需。舉例而言，要得出結(jié)核分枝桿菌的具體蛋白或來(lái)源于該蛋白的肽片段在免疫測(cè)定法形式下具有作為診斷試劑的效力，或適用于疫苗制備物中的結(jié)論，必需顯示該蛋白在所述細(xì)菌的感染循環(huán)中表達(dá)，且宿主生物對(duì)該蛋白和/或包含B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位的肽片段(例如，CDS+-限制性CTL表位)進(jìn)行免疫應(yīng)答。結(jié)核分枝桿菌在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的能力提供了方便的模型以供在體外鑒定表達(dá)的結(jié)核病蛋白。然而，培養(yǎng)環(huán)境與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的人巨噬細(xì)胞、肺或肺外位點(diǎn)的環(huán)境迥然有異。近來(lái)證據(jù)表明胞內(nèi)寄生物(如，例如結(jié)核分枝桿菌)的蛋白表達(dá)概貌根據(jù)環(huán)境信號(hào)顯著變動(dòng)，從而使得所述生物體外的表達(dá)概貌可能并不準(zhǔn)確地反映其在自然位置(insitu)的表達(dá)概貌。結(jié)核分枝桿菌感染，或潛在性感染的重激活，誘導(dǎo)宿主反應(yīng)，其包括將單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞募集(recruitment)至感染位點(diǎn)。隨著更多免疫細(xì)胞的積聚，形成肉芽腫(granulomata)的結(jié)，其包含免疫細(xì)胞和由巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性產(chǎn)物摧毀的宿主組織。隨著疾病的進(jìn)展，巨噬細(xì)胞的酶造成蛋白、脂質(zhì)和核酸的水解，導(dǎo)致周圍組織的液化和肉芽腫的形成。最終，該損傷(lesion)破裂，而桿菌釋放至周圍的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中。在該感染循環(huán)中，桿菌暴露于四種不同的宿主環(huán)境，即肺泡巨噬細(xì)胞(alveolimacrophage)、干酪樣肉芽腫(caseousgranuloma)、胞外的肺部和肺外位點(diǎn)，例如腎或腹膜腔、淋巴、骨或脊柱。認(rèn)為桿菌可在所有這些環(huán)境中復(fù)制至不同的程度，然而，對(duì)于在每個(gè)位點(diǎn)的環(huán)境條件所知甚少。所有四種宿主環(huán)境迥然有別，表明在每種環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌的表達(dá)概貌并不相同。相應(yīng)地，從對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)物中鑒定結(jié)核分枝桿菌蛋白并不一定表明在體內(nèi)的各種環(huán)境中何種蛋白被表達(dá)或具高免疫原性。類似地，在體外生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞中鑒定結(jié)核分枝桿菌蛋白并不一定表明其類似于結(jié)核分枝桿菌在干酪樣肉芽腫、高度充氣的肺部或具有低氧氣含量的肺外位置處的蛋白表達(dá)概貌。此外，結(jié)核分枝桿菌在宿主內(nèi)的感染可視為動(dòng)態(tài)過(guò)程，其中宿主免疫系統(tǒng)持續(xù)地嘗試包裹(encapsulate)桿菌并通過(guò)破壞受感染的巨噬細(xì)胞來(lái)摧毀桿菌。因此，結(jié)核分枝桿菌經(jīng)歷胞內(nèi)生長(zhǎng)、破壞(此時(shí)胞內(nèi)和分泌的細(xì)菌蛋白遭暴露和摧毀)和快速胞外繁殖的循環(huán)。宿主和病原體的相互作用是多種因素的結(jié)果，其無(wú)法在體外復(fù)制。相應(yīng)地，在本發(fā)明之前，并不清楚何種結(jié)核分枝桿菌蛋白在體內(nèi)任何具體環(huán)境中為最高度表達(dá)的和/或最具免疫活性或免疫原性的結(jié)核分枝桿菌蛋白。顯然，仍有對(duì)快速并劃算地用于確定由結(jié)核分枝桿菌造成的感染和/或與之相關(guān)的疾病狀況的診斷和預(yù)后試劑的需要。分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白組學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA技術(shù)、溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)描述于，例如下述文獻(xiàn)1.Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork，第二版(1989)，第I，II和III卷全文；2.DNACloning:APracticalApproach,Vols.IandII(D.N.Glover,ed.，1985)，IRLPress,Oxford，全文；3.OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(M.J.GaitIS,1984)IRLPress,Oxford,全文，且特別是其中Gait，ppl-22；Atkinson等，pp35_81；Sproat等，pp83-115；和Wu等，pp135-151的論文；4.NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(B.D.Hames&S.J.Higgins編，1985)IRLPress,Oxford,全文；5.ImmobilizedCellsandEnzymes:APracticalApproach(1986)IRLPress,Oxford，全文；6.Perbal,B.,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)；7.MethodsInEnzymology(S.ColowickandN.Kaplan,編，AcademicPress,hc.)，全系列；8.J.F.RamalhoOrtigao,"TheChemistryofPeptideSynthesis"InknowledgedatabaseofAccesstoVirtualLaboratorywebsite(Interactiva,Germany)；9.Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.LandFenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336—34210.Merrifield,R.B.(1963)·J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154.11.Barany,G.andMerrifield,R.B.(1979)inThePeptides(Gross,E.andMeienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,AcademicPress,NewYork.12.ffunsch,E.編(1974)SynthesevonPeptideninHouben-ffeylsMetodenderOrganischenChemie(Miller,Ε.,ed.),vol.15,4thedn.,Parts1and2,Thieme,Stuttgart.13.Bodanszky,M.(1984)PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelberg.14.Bodanszky，M.&Bodanszky，A.(1984)ThePracticeofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelberg.15.Bodanszky,M.(1985)Int.J.PeptideProteinRes.25，449-474.16.HandbookofDiagnostictestalImmune-logy,Vols.I-IV(D.M.WeirandC.C.Blackwel1,1!),1986,BlackwellScientificPublications).17.WilkinsM.R.,WilliamsK.L.,AppelR.D.andHochstrasser(編)1997ProteomeResearch:NewFrontiersinFunctionalGenomicsSpringer,Berlin.
發(fā)明內(nèi)容1.背景介紹在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，發(fā)明人尋求闡明在體內(nèi)多種環(huán)境下由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組生物表達(dá)的蛋白的范圍，并由此鑒定高度表達(dá)的和/或高度免疫原性的結(jié)核分枝桿菌及其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組生物的蛋白。本發(fā)明人使用蛋白組學(xué)方法來(lái)鑒定在體內(nèi)表達(dá)并存在于一群患病的患者體液中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組蛋白，所述體液包括痰、胸膜液、血漿和血清。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組蛋白在體內(nèi)通過(guò)對(duì)含免疫球蛋白(特別是IgG)的樣品進(jìn)行二維電泳來(lái)鑒定，所述樣品為之前從一群診斷為罹患結(jié)核病的患者獲得，例如，被結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物感染的患者。鑒定出肽片段，且通過(guò)對(duì)胰蛋白酶消化片段的質(zhì)譜法確定肽片段的氨基酸序列，顯示其與乙酮醇酸-還原異構(gòu)酶(Setol-AcidReductoIsomerase,KARI)蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO=D對(duì)齊。具體而言，匹配的肽與KARI蛋白序列中的區(qū)域?qū)R。在一個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明人制備了超過(guò)10個(gè)不同的與重組全長(zhǎng)KARI蛋白和所述全長(zhǎng)KARI蛋白中的肽區(qū)結(jié)合的抗體的制備物，以供開(kāi)發(fā)基于抗原的診斷和預(yù)后測(cè)定法，其包括命名為“Ch34/35”的多克隆抗體制備物，其在雞中針對(duì)偶合于六組氨酸標(biāo)記的全長(zhǎng)重組KARI蛋白(SEQIDNO1)制備；三個(gè)命名為“Mol283F”、“Mo2Bl”和“MolF6”的單克隆抗體，其針對(duì)偶合于六組氨酸標(biāo)記的全長(zhǎng)重組KARI蛋白(SEQIDNO=D；兩個(gè)命名為“Mo4F7”和“Mo4C10”的單克隆抗體，其針對(duì)SEQIDNO1的殘基40-56制備；一個(gè)命名為“Mo2D6”的單克隆抗體，其針對(duì)SEQIDNO1的殘基290-300制備；以及兩個(gè)針對(duì)SEQIDNO1的殘基四8-310制備的單克隆抗體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，抗體也可針對(duì)全長(zhǎng)KARI蛋白的其他免疫原性肽片段制備，而無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試。如本文中例示，抗體是針對(duì)臨床樣品中重組蛋白和結(jié)合于重組KARI蛋白的肽以及結(jié)合于內(nèi)源KARI蛋白的肽培育的，所述樣品來(lái)自之前通過(guò)培養(yǎng)和涂片(smear)測(cè)試診斷為具有結(jié)核病的患者，例如，被結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物感染的患者。所述抗體還檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的臨床和實(shí)驗(yàn)室菌株表達(dá)的內(nèi)源KARI蛋白，并與其他微生物(包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌或銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))具有低交叉反應(yīng)性。針對(duì)KARI制備的抗體也能夠在夾心(sandwich)ELISA和定制的(point-of-need)測(cè)定法中檢測(cè)出低水平的KARI蛋白，所述測(cè)定法描述于例如美國(guó)專利號(hào)7205159和歐洲專利號(hào)1461615，在本文中以提述的方式并入。亦考慮到選擇能夠在亞皮克/ml水平在患者體液(如痰、唾液、胸膜液、血清、血漿等)中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌KARI的高親和性抗體而獲得抗體。同樣，考慮到選擇能夠依賴于由結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的KARI蛋白與由選自牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、M.canetti和田鼠分枝桿菌的生物表達(dá)的KARI蛋白的高度序列同一性，以及其間B細(xì)胞表位的保守性使得一種或多種所述生物之間的交叉反應(yīng)性成為可能，來(lái)檢測(cè)來(lái)自一種或多種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種其他生物的KARI的高親和性抗體，從而獲得抗體。這些發(fā)現(xiàn)提供了手段用于產(chǎn)生新的基于抗原的診斷以供診斷結(jié)核病，例如，依賴在受試者中對(duì)結(jié)核分枝桿菌或其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組生物的檢測(cè)，和產(chǎn)生新的基于抗原的預(yù)后指示劑用于感染或與其相關(guān)的疾病狀態(tài)的進(jìn)展。優(yōu)選地，一種或多種結(jié)合于KARI蛋白或其B細(xì)胞表位的抗體可用于早期診斷感染或疾病。上述診斷和預(yù)后測(cè)試可與針對(duì)結(jié)核病或與其相關(guān)的感染的治療性處理一同使用，例如，用于確定治療介入的效力，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見(jiàn)的。在本文中所述的另一個(gè)實(shí)施例中，多分析物測(cè)定法(multianalyteassay)提供了高敏感性和特異性，所述多分析物測(cè)定法例如，使用結(jié)合于KARI蛋白的一種或多種抗體，和結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的其他蛋白的一種或多種抗體，所述蛋白例如選自下組的蛋白BSX蛋白、S9蛋白、Rvl265蛋白、EF-Tu蛋白、P5CR蛋白、TetR樣蛋白、谷氨酰胺合成酶蛋白及其組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，上述基于抗原的診斷和預(yù)后測(cè)定法與供診斷結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)測(cè)試(例如依賴于在臨床樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的存在)相組合，以例如確證起初的診斷和/或表明涉及的具體病原體。在一個(gè)實(shí)例中，培養(yǎng)測(cè)試確證了結(jié)核分枝桿菌，而非另一種分枝桿菌病原體在臨床樣品中的存在。在另一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)測(cè)試確證了結(jié)核分枝桿菌或其他分枝桿菌病原體菌株在從受試者獲得的臨床樣本中的存在。盡管涂片測(cè)試不如培養(yǎng)測(cè)試準(zhǔn)確，應(yīng)理解該測(cè)試，正如任何其他本領(lǐng)域已知的供診斷結(jié)核病或在來(lái)自懷疑受感染，或具有受感染的風(fēng)險(xiǎn)的受試者的樣本中確定或檢測(cè)結(jié)核病致病因子(例如，結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物)的存在的手段一樣，可方便地與本發(fā)明的基于抗原的測(cè)定法相組合，而無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試。在另一個(gè)實(shí)施例中，結(jié)合于SEQIDNO1所述氨基酸序列或其來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的生物的變體，并在罹患肺外結(jié)核病的受試者中存在的抗體提供了供診斷由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的分枝桿菌造成的活動(dòng)的(active)及過(guò)去的感染的其他手段。為了測(cè)定上述抗體在受試者中的存在，在基于抗體的測(cè)定法中使用包含SEQIDNO:1所示的序列的重組KARI蛋白或其變體，或源自所述全長(zhǎng)蛋白序列的免疫原性肽作為檢測(cè)試劑以供鑒定抗體在從所述受試者獲取的含抗體的樣品中的存在，所述樣品例如血、血清、血清級(jí)分等。正如基于抗原的測(cè)定法，將在受試者中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的抗-KARI抗體方便地與對(duì)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他免疫原性蛋白的抗體的檢測(cè)相結(jié)合，例如，通過(guò)還檢測(cè)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的一種或多種蛋白或結(jié)核病的其他致病因子，或其一種或多種B細(xì)胞表位的抗體，其中所述蛋白選自下組BSX蛋白、S9蛋白、Rvl265蛋白、EF-Tu蛋白、P5CR蛋白、TetR樣蛋白、谷氨酰胺合成酶蛋白及其組合；其通過(guò)使用源自上述免疫原性蛋白全長(zhǎng)蛋白序列的免疫原性肽作為檢測(cè)試劑以供篩選含抗體的樣品。上述多分析物的基于抗體的測(cè)定法提供了高敏感性和特異性?；诳贵w的單分析物和多分析物診斷和預(yù)后測(cè)定法還可方便地與任何本領(lǐng)域已知的手段相結(jié)合，例如，供確定或診斷結(jié)核病的培養(yǎng)測(cè)試，例如，其通過(guò)在來(lái)自疑似受感染或具有受感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者的樣本中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的存在，例如，以確證初始診斷和/或指示涉及的具體病原體。在一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)測(cè)試確證在臨床樣品中結(jié)核分枝桿菌而非另一種并非引起結(jié)核病的病原體的分枝桿菌的存在。在另一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)測(cè)試確證在從受試者獲得的臨床樣本中存在結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核病的其他分枝桿菌因素的菌株。優(yōu)選的基于抗體的測(cè)試，當(dāng)與供結(jié)核病或與其相關(guān)的感染的治療性處理一同使用時(shí)，提供了對(duì)感染或疾病的早期檢測(cè)和/或?qū)χ委煼桨感ЯΦ谋O(jiān)測(cè)。2.具體實(shí)例本發(fā)明的范圍就在實(shí)施例之后本申請(qǐng)中提交的權(quán)利要求來(lái)看是顯而易見(jiàn)的。在本申請(qǐng)中提交的權(quán)利要求在此以提述的方式并入本說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明的范圍就下述對(duì)具體實(shí)例的描述來(lái)看是顯而易見(jiàn)的。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了分離的或重組的結(jié)核分枝桿菌免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI蛋白片段或其表位。優(yōu)選地，所述分離的或重組的結(jié)核分枝桿菌免疫原性KARI蛋白包含SEQIDNO=I所述的氨基酸序列，或包含與SEQIDNO:1至少約95%相同的氨基酸序列，包括來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的生物的同源序列。優(yōu)選地，所述免疫原性KARI肽是合成肽。優(yōu)選地，所述KARI肽、片段或表位包含SEQIDNO:1所述的序列中至少約5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，更優(yōu)選SEQIDNO:1所述的序列中至少約10個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選SEQIDNO1所述的序列中至少約15個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，并仍更優(yōu)選SEQIDNO:1所述的序列中至少約5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基在N-端和/或C-端融合約1-5個(gè)其他氨基酸殘基。這明確地包括分離自或源自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的任何生物的KARI蛋白的任何合成肽、片段或表位。在另一個(gè)實(shí)例中，所述免疫原性KARI肽是包含單獨(dú)地或共同地選自下組的氨基酸殘基或由所述氨基酸殘基組成的合成肽a)SEQIDNO1的殘基1-23；b)SEQIDNO1的殘基40-71，并優(yōu)選SEQIDNO1的殘基57-71；c)SEQIDNO1的殘基97-111；d)SEQIDNO1的殘基169-199；e)SEQIDNO1的殘基265-279；f)SEQIDNO1的殘基290-300，優(yōu)選SEQIDNO1的殘基298-300；禾口g)SEQIDNO1的殘基313-333。還在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了由SEQIDNO1的殘基40-71，或SEQIDNO1的殘基57-71或SEQIDNO1的殘基290-300或SEQIDNO1的殘基298-300組成的合成肽，或包含SEQIDNO1的殘基40-71，或SEQIDNO1的殘基57-71或SEQIDNO1的殘基290-300或SEQIDNO1的殘基四8_300的合成肽，例如，以供產(chǎn)生適于免疫測(cè)定法的抗體，或作為陽(yáng)性對(duì)照肽用于免疫測(cè)定法(如為了表明抗體結(jié)合)的抗體。包含一種或多種標(biāo)簽或可檢測(cè)的部分(例如，為了便于檢測(cè)或分離或固定化)的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位明確地落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。優(yōu)選的標(biāo)簽包括，例如生物素、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、FLAG表位、六組氨酸、β-半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶、鏈霉抗生物素蛋白或金。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文中任何實(shí)施例，包含一種或多種免疫原性KARI肽、片段或表位的融合蛋白。舉例而言，KARI蛋白的N-端或C-端部分可融合。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，優(yōu)選在上述物質(zhì)的組成中包含內(nèi)部的連接殘基，例如，半胱氨酸?；蛘撸瑑?yōu)選的融合蛋白包含將免疫原性KARI肽與一種或多種其他肽部分分開(kāi)的接頭，例如，單一氨基酸殘基(例如，甘氨酸、半胱氨酸、賴氨酸)，肽接頭(例如，非免疫原性肽，如多賴氨酸或多甘氨酸)，包含高至約6或8或10或12個(gè)碳?xì)埢亩嗵冀宇^(poly-carbonlinker)，或化學(xué)接頭。上述接頭通過(guò)例如使得與脂質(zhì)或半抗原的結(jié)合成為可能，或使得與配體的交聯(lián)或結(jié)合成為可能，可便于抗體產(chǎn)生或疫苗配制。蛋白作為融合物表達(dá)還可增強(qiáng)其可溶性。優(yōu)選的融合蛋白包含融合于載體蛋白、可檢測(cè)的標(biāo)簽或報(bào)道分子(例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、FLAG表位、六組氨酸、β-半乳糖苷酶、硫氧還蛋白(TRX)(LaVallie等，Bio/Technology11，187-193，1993)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、大腸桿菌NusA蛋白(Fayard,Ε.M.S.,論文，UniversityofOklahoma,USA,1999；Harrison,inNovations11,4-7,2000),大腸桿MBFR(Harrison,inNovations11,4-7,2000)或大腸桿菌GrpE(Harrison,inNovations11，4-7，2000))的所述KARI蛋白、肽、片段或表位。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文中的任何實(shí)施例包含一種或多種免疫原性KARI肽、片段或表位的分離的蛋白聚集體。優(yōu)選的蛋白聚集體包括與免疫球蛋白，例如IgA、IgM或IgG復(fù)合的蛋白、肽、片段或表位，例如，作為循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)。示例性的蛋白聚集體可源自，例如，受試者的含抗體生物樣品。本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本文中的任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物用于在受試者中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌造成的過(guò)去的或現(xiàn)在的感染或潛在的感染中的用途，其中所述感染由抗體在從受試者獲得的樣品中與所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性片段或表位的結(jié)合來(lái)確定。本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本文中的任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物用于引發(fā)(elicit)結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體的產(chǎn)生的用途。本發(fā)明還涵蓋根據(jù)本文中的任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物在制備使受試者針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染免疫的藥物中的用途。本發(fā)明還提供藥物組合物，所述藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的稀釋劑(例如，佐劑)組合的根據(jù)本文中的任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物。編碼SEQIDNO1的KARI蛋白或本發(fā)明范圍內(nèi)的其任何變體的核酸，由結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因或同源物、類似物或其其他序列變體來(lái)編碼。本發(fā)明還提供分離的核酸，其編碼根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或編碼所述肽或表位或片段的組合或混合物(例如作為融合蛋白)，所述分離的核酸例如用于制備基于核酸的疫苗或是為了以其他方式表達(dá)所述免疫原性多肽、蛋白、肽、片段或表位。舉例而言，所述分離的核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列或其來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的生物的同源物。本發(fā)明還提供細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)根據(jù)本文任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，或表達(dá)其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或表達(dá)所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物。所述細(xì)胞可優(yōu)選地由抗原呈遞細(xì)胞(APC)組成，所述抗原呈遞細(xì)胞(例如在其表面上)表達(dá)所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或其免疫原性片段或表位。本發(fā)明還提供分離的配體，例如，小分子、肽、抗體或抗體的免疫反應(yīng)性片段，所述配體特異性結(jié)合于根據(jù)本文任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的其他生物的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述蛋白、肽或表位或片段的組合或混合物，或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體。優(yōu)選的配體為肽或抗體。優(yōu)選的抗體包括，例如，單克隆或多克隆抗體制備物。這延及任何分離的抗體產(chǎn)生細(xì)胞或抗體產(chǎn)生細(xì)胞群，例如，產(chǎn)生抗體的雜交瘤或漿細(xì)胞瘤，其中所述抗體結(jié)合KARI蛋白或KARI蛋白的免疫原性片段或其他包含源自KARI蛋白序列的序列的免疫原性肽。舉例而言，本發(fā)明提供了由分離的抗體組成或包含分離的抗體的分離的配體，所述分離的抗體結(jié)合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位。在一個(gè)實(shí)例中，所述抗體是多克隆抗體(例如，通過(guò)對(duì)雞進(jìn)行免疫而獲得的)，如具有在本文中命名為ChM或Ch35的多克隆抗體制備物或命名為Ch34/35的兩者的匯集的結(jié)合特征(例如，特異性)的抗體。在另一個(gè)實(shí)例中，所述抗體是單克隆抗體，例如，通過(guò)用SEQIDNO:1的全長(zhǎng)KARI蛋白進(jìn)行免疫，或通過(guò)用添加了任選的C-端半胱氨酸殘基的SEQIDNO:1的殘基40-56進(jìn)行免疫，或通過(guò)用添加了任選的C-端半胱氨酸殘基的SEQIDN0:1的殘基四0-300進(jìn)行免疫，或通過(guò)用添加了任選的C-端半胱氨酸殘基的SEQIDN0:1的殘基298-310進(jìn)行免疫而制備的單克隆抗體，例如，具有單獨(dú)地或共同地選自下組的抗體的結(jié)合特征(例如特異性)的單克隆抗體:Mol283F、MolE7、Mo2C7、Mo3A2、Mo2Bl、Mo4F7、Mo3C3、MolC10、Mo4C10、MolF6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4Dll及其混合物，且優(yōu)選具有單獨(dú)地或共同地選自下組的抗體的結(jié)合特征(例如特異性)的單克隆抗體Mol283F、Mo2Bl、Mo4F7、Mo4C10、MolF6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4Dll及其混合物。在另一實(shí)例中，本發(fā)明提供了由分離的單克隆抗體組成的或包含分離的單克隆抗體的分離的配體，所述單克隆抗體結(jié)合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或其免疫原性KARI片段或表位，其中所述單克隆抗體具有單獨(dú)地或共同地選自下組的抗體的結(jié)合特征(例如特異性)Mol283F、Mo2Bl、MolF6和Mo2D6及其混合物。還在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一對(duì)選自下組的抗體(a)具有本文中命名為Ch34/35的多克隆抗體制備物的結(jié)合特征(例如特異性)的多克隆抗體和具有選自Mol823F和Μο2Β1及其混合物的抗體的結(jié)合特征(例如特異性)的單克隆抗體；和(b)一對(duì)單獨(dú)地或共同地選自具有選自下組的抗體的結(jié)合特征(例如特異性)的單克隆抗體的單克隆抗體Mol283F、Mo2Bl、MolF6和Mo2D6。在另一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了如根據(jù)本文任何實(shí)施例所述由雜交瘤2B1C11產(chǎn)生的抗體，所述雜交瘤在2009年5月21日保藏于ATCC。本發(fā)明明確地延及根據(jù)本文任何實(shí)施例所述的分離的雜交瘤，以及任何組的產(chǎn)生上述抗體的雜交瘤，只要至少一個(gè)上述雜交瘤表達(dá)結(jié)合于KARI蛋白的抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一組抗體，其包含至少一個(gè)根據(jù)本文任何實(shí)施例所述結(jié)合于KARI蛋白的抗體，特別是結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體，例如，與根據(jù)本文任何實(shí)施例所述結(jié)合于一種或多種其他結(jié)核分枝桿菌抗原的一種或多種抗體組合，如結(jié)合于BSX和/或S9和/或Ef-Tu和/或Rv1265的抗體組合。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的配體，特別是任何肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段在醫(yī)藥中的用途。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的配體或所述配體的組合，特別是任何肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段用于在受試者中檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的生物(例如，結(jié)核分枝桿菌)造成的過(guò)去或現(xiàn)在(即，活動(dòng)的)感染或潛在的感染中的用途，其中所述感染通過(guò)將所述配體結(jié)合于在從所述受試者獲取的生物樣品中存在的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位來(lái)確定。本發(fā)明還提供了根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的配體或所述配體的組合，特別是任何肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段用于鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的細(xì)菌或受結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的細(xì)菌感染的細(xì)胞或用于對(duì)所述細(xì)菌或所述細(xì)胞進(jìn)行分選或計(jì)數(shù)的用途。該實(shí)施例明確地包括鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的多種細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌。根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的配體，特別是任何肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段或其組合，也可用于治療、診斷和研究應(yīng)用，以供通過(guò)在來(lái)自受試者的生物樣品中根據(jù)本文任何實(shí)施例將所述配體結(jié)合于本發(fā)明的KARI蛋白或免疫原性片段或表位來(lái)檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的過(guò)去或現(xiàn)在的感染，或潛在的感染(即，基于抗原的免疫測(cè)定法)。主題配體的其他應(yīng)用包括純化和研究診斷性/預(yù)后性KARI蛋白，鑒定受結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌(例如，結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌)造成的細(xì)胞感染，或?qū)ι鲜黾?xì)胞進(jìn)行分選或計(jì)數(shù)。所述配體還可用于治療，包括結(jié)核病的預(yù)防、診斷或預(yù)后，和上述配體在制備用于治療結(jié)核病的藥物中的使用。舉例而言，產(chǎn)生結(jié)合并中和本發(fā)明的KARI蛋白(特別是在體內(nèi))的特異性人源化抗體或其他配體。所述人源化抗體或其他配體用于制備供治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌在人受試者中造成的TB特異性疾病或感染(例如，治療由結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌造成的活性或慢性感染)的藥物。本發(fā)明還提供組合物，所述組合物包含根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的配體或包含所述配體，特別是任何肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的組合。本發(fā)明還提供在受試者中診斷由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的結(jié)核病或感染的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)合于免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的抗體，所述抗體在所述樣品中的存在指示感染。所述感染可為過(guò)去的或活動(dòng)的感染，或潛在的感染；然而該測(cè)定法形式對(duì)檢測(cè)活動(dòng)的感染和/或最近的感染是特別有用的。19舉例而言，所述方法可為免疫測(cè)定法，例如，包括將源自受試者的生物樣品與根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的組合或混合物在足以使抗原-抗體復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間，并然后檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。所述樣品為從所述受試者獲得的含抗體的樣品，例如，包含血或血清或血漿或免疫球蛋白級(jí)分的樣品。所述樣品可包含以與KARI抗原性片段的復(fù)合物的形式存在的循環(huán)抗體。一般而言，在這類測(cè)定形式中使用能夠結(jié)合于患者的免疫球蛋白的抗體(例如，抗人Ig抗體)檢測(cè)所述抗原-抗體復(fù)合物。在本發(fā)明的測(cè)定法中，KARI蛋白，及任選地一種或多種其他結(jié)核分枝桿菌蛋白的檢測(cè)指示活性TB。任選地，上述測(cè)試結(jié)果通過(guò)測(cè)試一種或多種其他TB特異性分析物(例如，本文中描述的蛋白標(biāo)志物)來(lái)確證。確證對(duì)于TB的涂片測(cè)試數(shù)據(jù)或培養(yǎng)測(cè)試數(shù)據(jù)的測(cè)定法發(fā)明也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述免疫測(cè)定法可為使用多個(gè)抗體(例如，捕捉抗體和檢測(cè)抗體)的雙位測(cè)定法或夾心測(cè)定法。在一個(gè)實(shí)施例中，將具有源自小鼠的單克隆抗體Mol283F的特異性的抗體或抗體Mol283F自身用作捕捉抗體，而將具有源自雞的多克隆抗體Ch34/35的特異性的抗體，或所述Ch34/35抗體制備物自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有源自小鼠的單克隆抗體Μο2Β1(或簡(jiǎn)稱“2B1”)的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作捕捉抗體，而將具有源自雞的抗體Ch34/35的特異性的抗體，或所述Ch34/35抗體制備物自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有源自小鼠的單克隆抗體MolF6(或簡(jiǎn)稱“1F6”)的特異性的抗體或抗體MolF6自身用作捕捉抗體，而將具有源自小鼠的單克隆抗體Μο2Β1的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有源自小鼠的單克隆抗體Mo2D6(或簡(jiǎn)稱“2D6”)的特異性的抗體或抗體Mo2D6自身用作捕捉抗體，而將具有源自小鼠的單克隆抗體Μο2Β1的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有源自雞的抗體Ch34/35的特異性的抗體，或所述Ch34/35抗體制備物自身用作捕捉抗體，而將具有單克隆抗體Μο2Β1的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有單克隆抗體2B1的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作捕捉抗體，而將具有單克隆抗體1F6的特異性的抗體或抗體MolF6自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有單克隆抗體2B1的特異性的抗體或抗體Μο2Β1自身用作捕捉抗體，而將具有單克隆抗體2D6的特異性的抗體或抗體Mo2D6自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有單克隆抗體2D6的特異性的抗體或抗體Mo2D6自身用作捕捉抗體，而將具有單克隆抗體1F6的特異性的抗體或抗體MolF6自身用作檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，將具有單克隆抗體1F6的特異性的抗體或抗體MolF6自身用作捕捉抗體，而將具有單克隆抗體2D6的特異性的抗體或抗體Mo2D6自身用作檢測(cè)抗體。應(yīng)理解這些實(shí)施例延及抗體片段及與本文例示的那些抗體的等價(jià)抗體的用途，且數(shù)據(jù)明確地表明其無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試或?qū)嵤﹦?chuàng)造性勞動(dòng)即可產(chǎn)生。并不排除其他的排列和抗體組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述受試者疑似罹患由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病和/或所述受試者有受所述一種或多種分枝桿菌(例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌)感染的風(fēng)險(xiǎn)。懷疑罹患由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者顯示一種或多種結(jié)核病或上述感染的癥狀，例如發(fā)燒、排痰性咳嗽、咯血(痰中有血)、胸疼、盜汗、體重減輕、不適(malaise)、肺的空洞形成和/或結(jié)鈣化。懷疑罹患結(jié)核病或上述感染的受試者可能暴露于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種細(xì)菌(例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌)，例如由于與罹患結(jié)核病的人相接觸。有形成結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)的受試者為暴露于如下環(huán)境或遭受如下環(huán)境的受試者，所述環(huán)境增加形成結(jié)核病或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，上述受試者包括與罹患結(jié)核病的人接觸的受試者，旅行至結(jié)核病常見(jiàn)并為流行致病因子的國(guó)家或地區(qū)(例如，南非)的受試者，在醫(yī)院或護(hù)理機(jī)構(gòu)工作的受試者，受HIV-I或HIV-2感染的受試者，使用皮質(zhì)類固醇的受試者，免疫妥協(xié)或免疫受抑制的受試者，罹患硅肺病(silicosis)的受試者或罹患由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的潛在感染的受試者，所述分枝桿菌例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌。在該測(cè)定法形式中包含多分析物測(cè)試，其中將源自由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌表達(dá)的多抗原表位用于確證使用KARI或由其衍生的肽獲得的診斷，這落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。舉例而言，所述源自其他結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的蛋白選自下組BSX蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)Α57Κ2;SEQIDNO2)、核糖體蛋白S9(UniftOtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)、蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789;SEQIDNO:21)、延伸因子-iTu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO丨8-29)、P5CR蛋白卬111卩1~討1/5￥188-卩1~(^登錄號(hào)011141；SEQIDN0:36)JetR樣蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92；SEQIDNO44)谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rvl265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽、源自所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其組合。應(yīng)理解在此語(yǔ)境下，所述的蛋白包括由序列表的方式例示的示例蛋白的同源物，其中所述同源物由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組中一種或多種細(xì)菌(例如結(jié)核分枝桿菌和/或牛分枝桿菌和/或非洲分枝桿菌和/或M.canetti和/或田鼠分枝桿菌)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，使用針對(duì)KARI蛋白的抗體的免疫測(cè)定法與對(duì)TB的涂片測(cè)試和/或?qū)B的培養(yǎng)測(cè)試和/或檢測(cè)另一種TB蛋白(例如，BSX和/或Rvl265和/或Ef-Tu和/或S9蛋白)的免疫測(cè)定法同時(shí)或順序進(jìn)行，如為了減少測(cè)試KARI蛋白和測(cè)試S9蛋白的陽(yáng)性組合以減少假陽(yáng)性檢測(cè)，或?yàn)榱肆硗獾卦鰪?qiáng)測(cè)定的特異性和/或敏感度，其中對(duì)一種或兩種或三種或四種除KARI蛋白之外的蛋白的陰性結(jié)果表明或確證陰性涂片結(jié)果和/或指示在受試者中無(wú)具活性的TB。在一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)試KARI蛋白和測(cè)試BSX蛋白的組合減少假陽(yáng)性檢測(cè)，其中對(duì)BSX的陰性結(jié)果或BSX及KARI蛋白的陰性結(jié)果表明或確證陰性涂片結(jié)果和/或指示在受試者中無(wú)具活性的TB。在另一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)試KARI蛋白和測(cè)試Rv1265蛋白的組合減少假陽(yáng)性檢測(cè)，其中對(duì)Rv1265的陰性結(jié)果或Rv1265及KARI蛋白的陰性結(jié)果表明或確證陰性涂片結(jié)果和/或指示在受試者中無(wú)具活性的TB。在另一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)試KARI蛋白和測(cè)試S9蛋白和測(cè)試BSX蛋白的組合減少假陽(yáng)性檢測(cè)，其中對(duì)BSX和S9蛋白的陰性結(jié)果或BSX和S9和KARI蛋白的陰性結(jié)果表明或確證陰性涂片結(jié)果和/或指示在受試者中無(wú)具活性的TB。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白UniProtKB/SwiSS-Prot為SwissInstituteofBioinformatics的治療性(curated)的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，提供關(guān)于蛋白功能、域結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾和變體的數(shù)據(jù)；且UniProtKB/TrEMBL為經(jīng)計(jì)算機(jī)注釋的Swiss-Prot的增補(bǔ)，其包含尚未整合入Swiss-Prot的EMBL核苷酸序列條目的翻譯。對(duì)UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)的訪問(wèn)權(quán)(access)可方便地例如通過(guò)SwissInstituteofBioinformatics的ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)蛋白組學(xué)服務(wù)器獲得。舉例而言，患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白(例如UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2;SEQIDNO:2)或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于BSX蛋白的肽，或包含選自SEQIDNO:3-13的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。供檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌BSX和肽衍生物還詳細(xì)描述于本發(fā)明人于2005年8月19日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/0012M(W02006/01792)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9(例如UnitfrotKB/Swiss-Plot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)，或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于S9蛋白的肽，或包含選自SEQIDNO:15-20的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌S9和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年1月31日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000093(W02007/087679)，其全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265(例如UnitfrotKB/Swiss-Plot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于Rvl265蛋白的肽，或包含選自SEQIDNO:22-27的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌Rvl265蛋白和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年5月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000662(W02007/131291)，其全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌延伸因子Tu(EF-Tu)蛋白(例如UnitfrotKB/Swiss-Plot登錄號(hào)A5U071;SEQIDNOJ8-29)或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于EF-Tu蛋白的肽，或包含選自SEQIDNO:30-35的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌EF-Tu蛋白和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年6月8日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000810(W02007/140545)，其全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌二氫吡咯-5-羧酸還原酶(P5CR)蛋白(例如UnitfrotKB/Swiss-Plot登錄號(hào)Ql1141；SEQIDNO36)或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如來(lái)源于P5CR蛋白的肽，或包含選自SEQIDNO:37-43的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年5月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000664(W02007/140545)，其全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌推定的TetR樣蛋白家族的調(diào)節(jié)蛋白(TetR樣蛋白)(例如UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92；SEQIDNO44)或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于TetR樣蛋白的肽，或包含選SEQIDNO:45-56的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年5月16日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000663(W02007/131292)，其全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)核分枝桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白(例如UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，或由其來(lái)源的免疫原性肽，例如，來(lái)源于GS蛋白表面暴露區(qū)域的肽，或包含選自SEQIDNO:57-60的序列的肽，及其混合物/組合相接觸。用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的免疫原性結(jié)核分枝桿菌GS和肽衍生物還詳細(xì)描述于2007年6月24日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/000930(W02006/000045)，其全文提述的方式并入本文。其他在這種測(cè)定法形式中的多分析物測(cè)試的具體實(shí)施例包括來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9和/或結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265的抗原表位的使用，或者可供選擇地，來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265的抗原表位的使用。對(duì)于一種或多種第二分析物(例如結(jié)合于BSX和/或谷氨酰胺合成酶)的測(cè)定法以與供檢測(cè)在血清或血漿或其他體液中結(jié)合于KARI蛋白的抗體相同的方式方便地進(jìn)行。所述測(cè)定法可同時(shí)進(jìn)行或在不同時(shí)間進(jìn)行，并使用相同或不同的患者樣品。所述測(cè)定法還可在相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，只要不同的檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)不同的抗體，例如，使用不同報(bào)道分子(如不同顏色的染料、熒光團(tuán)、放射性核苷酸或酶)標(biāo)記的抗人Ig。另外進(jìn)行一種或多種本領(lǐng)域已知的測(cè)試以供確定由一種或多種分枝桿菌病原菌(例如，結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌)造成的感染也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，如為了確證使用本發(fā)明的方法獲得的初始或預(yù)先診斷，和/或確定在臨床樣品中的具體傳染因子(infectiousagent)。與本發(fā)明基于抗體的測(cè)定法一起使用的示例性的替代測(cè)試(surrogatetest)包括培養(yǎng)測(cè)試和/或涂片測(cè)試，然而除了那些具體描述之外的基于抗體的測(cè)試也明確地由本發(fā)明涵蓋，唯一的要求是檢測(cè)出結(jié)合于分枝桿菌KARI蛋白和/或其一種或多種免疫原性片段的一種或多種抗體。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“感染”應(yīng)理解為意指在受體呼吸道中微生物和/或多種微生物(特別是細(xì)菌或病毒)的侵襲和/或定殖(colonisation)。上述感染可為不顯著的或?qū)е戮植考?xì)胞損傷。所述感染可為局限性的(localised)、亞臨床的(subclinical)和暫時(shí)的，或者可通過(guò)延伸成為急性或慢性的臨床感染而擴(kuò)散。所述感染還可為過(guò)去的感染，其中殘余的KARI抗原，或者與分離的KARI蛋白或肽結(jié)合的反應(yīng)性宿主抗體，遺留在宿主中。所述感染還可為潛在的感染，其中所述微生物存在于受試者中，然而所述受試者并不顯示與所述生物相關(guān)疾病的癥狀。優(yōu)選地，所述感染是結(jié)核分枝桿菌造成的肺部或肺外感染，并更優(yōu)選肺外感染?！胺尾俊备腥局阜沃袣獾赖母腥荆?，肺組織、支氣管、細(xì)支氣管、呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊或肺泡的感染。“肺外”指肺以外，涵蓋例如腎、淋巴、尿道、骨、皮膚、脊髓液、腸、腹膜、胸膜和心包腔。本發(fā)明的多肽還可用于診斷結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病。舉例而言，本發(fā)明還提供在受試者中診斷由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或其免疫原性KARI片段或表位，其中所述蛋白或免疫原性片段或表位在樣品中的存在指明疾病、疾病進(jìn)展或感染。在相關(guān)的實(shí)施例中，所述蛋白或免疫原性片段或表位在所述樣品中的存在指明感染。優(yōu)選地，懷疑所述受試者罹患由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，和/或所述受試者有形成結(jié)核病或被感染的風(fēng)險(xiǎn)。舉例而言，所述方法可為免疫測(cè)定法，例如，包括將來(lái)源于受試者的生物樣品與根據(jù)本文任何實(shí)施例的結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌內(nèi)源KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的組合或混合物的抗體，在足以使抗原-抗體復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。根據(jù)該實(shí)施例的優(yōu)選樣品為其中很可能發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌或來(lái)自細(xì)菌碎片的肽片段的樣品，或包含免疫球蛋白的級(jí)分，例如，來(lái)自腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物；體液如痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物，例如痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液衍生物等。所述樣品可包含與KARI抗原性片段復(fù)合的循環(huán)抗體。在該測(cè)定法形式中包含多分析物測(cè)試，其中使用多種抗體以確證使用結(jié)合于KARI蛋白或表位的抗體獲得的診斷，這落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。舉例而言，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合另一種結(jié)核分枝桿菌蛋白的抗體相接觸，所述蛋白例如選自下組的蛋白結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2;SEQIDNO:2)、結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)、結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)、結(jié)核分枝桿菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO丨8_29)、結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141;SEQIDNO:36)、結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)結(jié)核分枝桿菌谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)、源自所述BSX蛋白的免疫原性肽、源自所述S9的免疫原性肽、源自所述Rvl265的免疫原性肽、源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽、源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽和源自所述TetR樣蛋白的免疫原性肽、源自所述GS蛋白的免疫原性肽及其組合。舉例而言，所述患者樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白(例如UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于BSX蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDNO:3-13)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2005年8月19日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/001254號(hào)(W02006/01792)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9(例如toiProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8;SEQIDNO14)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于S9蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDN0:15-20)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2007年1月31日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000093號(hào)(W02007/087679)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265(例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789;SEQIDNO:21)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于Rvl265蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDNO22-27)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2007年5月16日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AUAU2007/000662號(hào)(W02007/131291)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌蛋白EF-Tu(例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO28-29)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于EF-Tu蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDNO30-35)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2007年6月8日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AUAU2007/000810號(hào)(W02007/140545)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌蛋白P5CR(例如UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141;SEQIDNO:36)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于P5CR蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDN0:37-43)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2007年5月16日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000664號(hào)(W02007/131293)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白(例如UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于TetR樣蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDNO:45-56)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2007年5月16日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2007/000663號(hào)(W02007/131292)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述患者的樣品可與結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性KARI肽或片段或表位相接觸，并與結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌GS蛋白(例如UniProtKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)的抗體和/或結(jié)合于來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽的抗體(例如與包含選自下組的序列的肽結(jié)合的抗體SEQIDNO:57-60)相接觸。示例性的抗體描述于本文，和申請(qǐng)人提交于2005年6月M日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/000930號(hào)(W02006/000045)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。其他在該測(cè)定法形式中的多分析物測(cè)試的具體實(shí)施例包括使用結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白或其免疫原性片段或表位和/或結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9或其免疫原性片段或表位和/或結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265或其免疫原性片段或表位的抗體，或者，使用結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白或其免疫原性片段或表位和/或結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265或其免疫原性片段或表位的抗體。對(duì)于一種或多種第二分析物(例如BSX和/或谷氨酰胺合成酶和/或S9)的測(cè)定法以與在樣品中檢測(cè)KARI蛋白相同的方式方便地進(jìn)行。所述測(cè)定法可同時(shí)進(jìn)行或在不同時(shí)間進(jìn)行，并使用相同或不同的患者樣品。所述測(cè)定法還可在相同的反應(yīng)容器中進(jìn)行，只要不同的檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)結(jié)合的抗體，例如，結(jié)合于抗KARI抗體的第二抗體和結(jié)合于所述第二分析物的抗體。與基于抗體的測(cè)定法類似，基于抗原的測(cè)定系統(tǒng)可包括免疫測(cè)定法，例如，將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與根據(jù)本文任何實(shí)施例的一種或多種分離的配體，特別是任何能夠結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的肽配體、抗體或其免疫反應(yīng)性片段相接觸，并檢測(cè)復(fù)合物，例如抗原-抗體復(fù)合物的形成。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述配體是抗體，優(yōu)選特異性結(jié)合于根據(jù)本文任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或結(jié)合于所述肽或表位或片段的組合或混合物，或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體的多克隆或單克隆抗體或抗體片段。雖然所述測(cè)定法可用于非免疫妥協(xié)的受試者(例如HIV陰性受試者)，其對(duì)于在免疫妥協(xié)或免疫缺陷的受試者(例如，被人免疫缺陷病毒感染(即，“HIV+”)的受試者)中檢測(cè)TB也是特別有用的。用于進(jìn)行上述測(cè)定法的樣品包括，例如，⑴來(lái)自選自下組的組織的提取物腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)選自下組的體液痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物；和(iii)來(lái)源于選自下組體液的樣品痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。本發(fā)明還提供用于確定具有由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)于用治療性化合物治療所述結(jié)核病或感染的應(yīng)答的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平與該蛋白或片段或表位在正?；蚪】凳茉囌咧锌蓹z測(cè)到的水平相比較增加，或尚未減少或未在減少表明所述受試者并未對(duì)所述治療有應(yīng)答，或并未擺脫疾病或感染。舉例而言，所述方法可包括免疫測(cè)定法，例如將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種能夠結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體接觸，并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體為根據(jù)本文任何實(shí)施例特異性結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或結(jié)合于所述肽或表位或片段的組合或混合物，或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體的分離的或重組的抗體或抗體的免疫反應(yīng)性片段。雖然本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于非免疫妥協(xié)的受試者(例如HIV陰性受試者)，其對(duì)于在免疫妥協(xié)或免疫缺陷的受試者(例如，HIV+的受試者)中檢測(cè)TB是特別有用的。用于進(jìn)行上述測(cè)定法的樣品包括，例如，(i)來(lái)自選自下組的組織的提取物腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)選自下組的體液痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)來(lái)源于選自下組體液的樣品痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。本發(fā)明還提供用于確定具有由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造26成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)于用治療性化合物治療所述結(jié)核病或感染的應(yīng)答的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平與該蛋白或片段或表位在罹患結(jié)核病或上述感染的受試者中可檢測(cè)到的水平相比較低表明所述受試者對(duì)所述治療有所應(yīng)答，或擺脫了疾病或感染。舉例而言，所述方法可包括免疫測(cè)定法，例如將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種能夠結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體接觸，并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體為根據(jù)本文任何實(shí)施例特異性結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體的分離的或重組的抗體或抗體的免疫反應(yīng)性片段。雖然本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于非免疫妥協(xié)的受試者(例如HIV陰性受試者)，其對(duì)于在免疫妥協(xié)或免疫缺陷的受試者(例如，HIV+的受試者)中檢測(cè)TB是特別有用的。用于進(jìn)行上述測(cè)定法的樣品包括，例如，(i)來(lái)自選自下組的組織的提取物腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)選自下組的體液痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)來(lái)源于選自下組體液的樣品痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。本發(fā)明還提供在受試者中監(jiān)測(cè)由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的疾病進(jìn)展、對(duì)療法的應(yīng)答或感染狀態(tài)的方法，其包括在不同時(shí)間在來(lái)自所述受試者的生物樣品中確定KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的水平，其中所述KARI蛋白、片段或表位的水平的變化表明受試者疾病進(jìn)展、對(duì)療法的應(yīng)答或感染狀態(tài)的變化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法還包括當(dāng)KARI蛋白、片段或表位水平隨時(shí)間提高時(shí)，施用供治療結(jié)核病或結(jié)核分枝桿菌感染的化合物。舉例而言，所述方法可包括免疫測(cè)定法，例如將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種能夠結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體接觸，并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，抗體為根據(jù)本文任何實(shí)施例特異性結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或結(jié)合于所述肽或表位或片段的組合或混合物，或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體的分離的或重組的抗體或抗體的免疫反應(yīng)性片段。雖然本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于非免疫妥協(xié)的受試者(例如HIV陰性受試者)，其對(duì)于在免疫妥協(xié)或免疫缺陷的受試者(例如，HIV+的受試者)中檢測(cè)TB是特別有用的。用于進(jìn)行上述測(cè)定法的樣品包括，例如，(i)來(lái)自選自下組的組織的提取物腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨，和其混合物；(ii)選自下組的體液痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物；和(iii)來(lái)源于選自下組體液的樣品痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液和其混合物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，在基于抗原的測(cè)定平臺(tái)(assayplatform)或基于抗體的測(cè)定平臺(tái)中檢測(cè)循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)。對(duì)于基于抗原的測(cè)定平臺(tái)，CIC的檢測(cè)可依賴于檢測(cè)所述CIC的免疫球蛋白部分來(lái)針對(duì)循環(huán)中分離的抗原的檢測(cè)提供信號(hào)擴(kuò)增。根據(jù)該實(shí)施例，使用捕捉試劑(例如，捕捉抗體)從而除了捕捉在受試者循環(huán)中的分離的抗原之外，還捕捉與受試者的免疫球蛋白復(fù)合的KARI抗原(KARI多肽或其免疫反應(yīng)性片段或表位)。使用任選地與可檢測(cè)的標(biāo)記偶合的抗Ig抗體以特異性結(jié)合受捕捉的CIC，由此檢測(cè)CIC患者樣品。在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，抗Ig抗體優(yōu)先結(jié)合樣品中的IgM、IgA或IgG。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述抗Ig抗體結(jié)合于人Ig，例如人IgA、人IgG或人IgM。所述抗Ig抗體可偶合于任何本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)可檢測(cè)標(biāo)記。這對(duì)于檢測(cè)由致病體(pathogenicagent)(例如，細(xì)菌或病毒)造成的感染，或?qū)τ谠\斷任何與CIC相關(guān)的疾病或病癥是特別有用的。相應(yīng)地，可對(duì)根據(jù)本文任何實(shí)施例所述的診斷方法進(jìn)行修飾，其中來(lái)源于受試者的樣品包含一種或多種循環(huán)的免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物包含結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的KARI蛋白或一種或多種免疫原性KARI肽或其片段或表位的免疫球蛋白(Ig)，且其中檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成包括將抗Ig抗體與循環(huán)免疫復(fù)合物的免疫球蛋白部分在足以使復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)結(jié)合的抗Ig抗體。供監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和/或療法效力的基于抗原的多分析物測(cè)試明確地落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，且其基本上如本文上面對(duì)于對(duì)感染診斷的描述進(jìn)行，只不過(guò)使用來(lái)自已知受感染(例如，由于之前使用一種或多種前述基于抗原的測(cè)定法形式診斷出來(lái))的患者的樣品進(jìn)行。與其他多分析物測(cè)試一樣，在為了監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和/或?qū)τ诟腥镜闹委煹男ЯΦ谋尘跋率褂镁哂胁煌禺愋缘亩鄠€(gè)抗體，例如，使用選自下組的抗體結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白(UnitProtKB/trEMBL登錄號(hào)A5TZK2;SEQIDNO2)和/或結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或結(jié)核分枝桿菌延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO28-29)和/或結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Ql1141；SEQIDNO36)和/或結(jié)核分枝桿菌iTetR樣蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92；SEQIDNO44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)03334和/或源自所述BSX蛋白的免疫原性肽和/或源自所述S9的免疫原性肽和/或源自所述Rvl265的免疫原性肽和/或源自所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽和/或源自所述PC5R蛋白的免疫原性肽和/或源自所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和/或源自GS蛋白的免疫原性肽及其組合的抗體，或所述抗體的任意組合，以確證使用針對(duì)KARI培育的抗體和/或針對(duì)KARI肽培育的抗體獲得的診斷，由此增強(qiáng)特異性和/或選擇性。同樣，使用結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組一種或多種分枝桿菌的同源物的交叉反應(yīng)性抗體可用于進(jìn)行本發(fā)明。然后使用能夠結(jié)合于每種蛋白分析物的抗體，或者，在CIC檢測(cè)的情況下，使用能夠結(jié)合于人免疫球蛋白的抗體來(lái)檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物。所述測(cè)定法可同時(shí)進(jìn)行或在不同時(shí)間進(jìn)行，并使用相同或不同的患者樣品。所述測(cè)定法還可在同一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，只要使用不同的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)不同的抗原或包含不同抗原的CIC，例如，使用不同報(bào)道分子(如不同顏色的染料、熒光團(tuán)、放射性核苷酸、酶或膠體金顆粒)標(biāo)記的抗人Ig，或差異標(biāo)記的(differentially-labelled)抗KARI抗體、抗BSX抗體和抗GS抗體。與其他本文中所述的免疫測(cè)定法一樣，所述二抗任選地偶合于合適的可檢測(cè)標(biāo)記，例如，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或半乳糖苷酶或葡糖苷酶，膠體金顆粒等。使用這樣的標(biāo)記檢測(cè)形成的復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。還進(jìn)行一種或多種本領(lǐng)域已知測(cè)試以確定由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌或其他病原菌(例如，鳥(niǎo)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌)造成的感染，所述測(cè)試如為了確證使用本發(fā)明的方法獲得的初始或預(yù)先診斷和/或在臨床樣品中確定具體的傳染原，這也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。用于本發(fā)明的基于抗原的測(cè)定法的示例性的替代性測(cè)試包括培養(yǎng)測(cè)試和/或涂片測(cè)試，然而除了那些具體描述的測(cè)試之外的基于抗原的測(cè)試也明確地由本發(fā)明所涵蓋，只要其滿足檢測(cè)分枝桿菌KARI蛋白和/或其一種或多種免疫原性片段的要求即可。上述實(shí)施例在本文末尾的實(shí)施例部分中詳細(xì)描述。本發(fā)明還提供了治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括(i)根據(jù)本文任何實(shí)施例進(jìn)行診斷方法，由此檢測(cè)來(lái)自受試者的生物樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的存在；和(ii)施用治療上有效量的藥物組合物以在受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中減少病原性桿菌數(shù)。本發(fā)明還提供了治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括(i)根據(jù)本文任何實(shí)施例進(jìn)行診斷方法，由此檢測(cè)來(lái)自經(jīng)第一藥物組合物治療的受試者的生物樣品中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的存在；和(ii)施用治療上有效量的第二藥物組合物以在受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中減少病原性桿菌數(shù)。本發(fā)明還提供了在受試者中治療結(jié)核病的方法，其包括進(jìn)行如本文所述的診斷方法或預(yù)后方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了預(yù)防方法，包括(i)在來(lái)自受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌感染的存在；和(ii)施用治療上有效量的藥物組合物以在受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中減少病原性桿菌數(shù)。更具體而言，免疫原性KARI蛋白或一種或多種免疫原性KARI肽、或其片段或表位當(dāng)施用于動(dòng)物受試者時(shí)，誘導(dǎo)高效價(jià)抗體的特異性產(chǎn)生。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了引發(fā)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的抗體產(chǎn)生的方法，包括在足以引發(fā)抗體產(chǎn)生的條件下將免疫原性KARI蛋白或一種或多種其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位施與所述受試者一段時(shí)間，所述抗體例如結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的中和抗體。本發(fā)明明確地涵蓋免疫原性KARI蛋白或一種或多種其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在中制備針對(duì)在人或其他動(dòng)物受試者中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的治療性或預(yù)防性亞單位疫苗的用途。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了包含免疫原性KARI蛋白或一種或多種其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位與藥學(xué)上可接受的稀釋劑組合的疫苗。優(yōu)選地，所述蛋白或肽或片段或表位與合適的佐劑一起配制。或者，所述肽或衍生物或變體通過(guò)施用在體外經(jīng)處理從而在其表面呈遞所述肽的自體的或同種異體的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)配制為細(xì)胞疫苗。還涵蓋了包含克隆入合適載體(例如，牛痘、金絲雀痘(canarypox)、腺病毒或其他真核病毒載體)的編碼免疫原性KARI蛋白或一種或多種其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的核酸(例如，DNA或RNA)的基于核酸的疫苗。優(yōu)選地，將編碼免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的DNA配制入DNA疫苗，例如，與現(xiàn)存的卡介苗(BCG)或免疫佐劑(如牛痘病毒、弗氏佐劑或其他免疫刺激劑(immunestimulant))結(jié)合配制。本發(fā)明還提供了免疫原性KARI蛋白或其一種或多種免疫原性KARI肽或一種或多種免疫原性KARI片段或一種或多種表位在制備組合物中的用途，所述組合物供在受試者(例如，受HIV-I和/或HIV-2感染的受試者，或具有形成結(jié)核病或受結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)的受試者)中預(yù)防或治療或診斷由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，包括在人受試者中治療潛在的感染。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了免疫原性KARI蛋白或一種或多種免疫原性KARI肽或其一種或多種免疫原性KARI片段或一種或多種表位在制備組合物中的用途，所述組合物供在受試者中預(yù)防或治療或診斷由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，其中所述受試者之前接受過(guò)針對(duì)HIV-I和/或HIV-2的抗病毒療法。本發(fā)明還提供了供在生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包含(i)根據(jù)本文任何實(shí)施例特異性結(jié)合結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組中的于一種或多種分枝桿菌的分離或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI片段或表位或片段或結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體的一種或多種分離的抗體或其免疫反應(yīng)性片段；和(ii)供檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成的工具，任選地，所述試劑盒與使用說(shuō)明一同包裝。本發(fā)明還提供了用于在生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包含(i)根據(jù)本文任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或所述肽或表位或片段的組合；和(ii)供檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物形成的工具，任選地，所述試劑盒與使用說(shuō)明一同包裝?？蓪⒈疚闹兴龅臏y(cè)定法修改用于任何測(cè)定法形式，且特別地用于固相ELISA、流通免疫測(cè)定法(flowthroughimmune-assay)形式、側(cè)流(lateralflow)形式、毛細(xì)管(capillary)形式，以供純化或分離免疫原性蛋白、肽、片段(例如，使用偶合于抗體、蛋白G或蛋白A的固相基質(zhì))。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了具有根據(jù)本文中所述任何實(shí)施例的分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體吸附其上的固相基質(zhì)。舉例而言，所述固相基質(zhì)可包括膜，例如尼龍膜或硝酸纖維素膜?；蛘撸龉滔嗷|(zhì)可包括聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部分(例如，微滴定板的一個(gè)或多個(gè)孔)、浸漬片、玻璃支持物或?qū)游鰳?shù)脂。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了具有根據(jù)本文任何實(shí)施例的分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位或所述肽或表位或片段的組合或混合物或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體吸附其上的固相基質(zhì)。舉例而言，所述固相基質(zhì)可包括膜，例如尼龍膜或硝酸纖維素膜?；蛘?，所述固相基質(zhì)可包括聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板或其部分(例如，微滴定板的一個(gè)或多個(gè)孔)、浸漬片、玻璃支持物或?qū)游鰳?shù)脂。包含需用于進(jìn)行本文中所述的測(cè)定法(特別是用于使用多個(gè)抗原或多個(gè)抗體的多分析物測(cè)試)的其他抗原和/或抗體的上述固相基質(zhì)也明確地落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。3.定義本文中使用的術(shù)語(yǔ)“乙酮醇酸還原異構(gòu)酶”或“KARI”是指包含或具有與SEQIDNO:1至少約80%同一性或與本申請(qǐng)SEQIDNO:1所述的序列實(shí)質(zhì)上相同的序列，和/或包含或具有與結(jié)核分枝桿菌ilvC基因編碼的序列至少約80%相同的序列的蛋白組合物，所述組合物適用于產(chǎn)生免疫原性肽或制備抗體的目的，其與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌或來(lái)自收到所述一種或多種分支桿菌感染的受試者的臨床基質(zhì)(clinicalmatrix)交叉反應(yīng)，且無(wú)需其他任何功能(例如，在蛋白翻譯中起作用)。在本發(fā)明之前，并未顯示SEQIDNO:1所述的結(jié)核分枝桿菌蛋白在體內(nèi)表達(dá)，或具有免疫原性，或免疫上與其他生物并不交叉反應(yīng)，且涉及所述KARI蛋白的信息來(lái)源于對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組中編碼SEQIDNO1的多肽的開(kāi)放閱讀框的生物信息學(xué)分析。本文中使用的的術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”是為了表明可從特定的來(lái)源獲取特定的整體，但并不需要直接來(lái)自該來(lái)源。除非上下文另有指示，或明確表示相反含意，本文中記載為單數(shù)的整體、步驟或要素的本發(fā)明的整體、步驟或要素明確地涵蓋所記載的整體、步驟或要素的單數(shù)和復(fù)數(shù)形式。本文中所述的針對(duì)任何單一實(shí)施例的本發(fā)明的實(shí)施例，具體而言，針對(duì)任何蛋白或其在診斷、預(yù)后或治療結(jié)核分枝桿菌中的用途應(yīng)理解為可根據(jù)情況適當(dāng)變動(dòng)以適用于(mutatismutandis)本文中所述的任何其他實(shí)施例。本文描述的用于個(gè)體受試者的診斷實(shí)施例明確地可可根據(jù)情況適當(dāng)變動(dòng)以適用于群體、種族集團(tuán)或亞集團(tuán)的流行病學(xué)或針對(duì)具有特定MHC限制(restriction)的個(gè)體的診斷或預(yù)后。所有上述本發(fā)明的變化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文中所述的主題容易地推出ο本文中所提及的檢測(cè)或鑒定結(jié)核分枝桿菌和/或所提及的診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病明確地延及對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組中任何一種或多種生物的檢測(cè)，但不延及對(duì)類結(jié)核病和/或一種或多種鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合菌組的生物的診斷，除非上下文另行表明。舉例而言，如本文所述，本發(fā)明涵蓋使用與結(jié)核分枝桿菌KARI和片段以及一種或多種鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌交叉反應(yīng)的抗體作為對(duì)分支桿菌屬的篩選，其與使用一種或多種替代性測(cè)定法以供檢測(cè)結(jié)核病和/或檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌相偶聯(lián)(但并不與任何供診斷類結(jié)核病和/或檢測(cè)一種或多種鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合菌組的分枝桿菌的替代性測(cè)定法相偶聯(lián))。在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中，除非上下文另行表明，單詞“包括/包含(comprise)”或其變化形式如“comprises”或“comprising”，應(yīng)理解為暗示包括所述步驟或要素或整體或者一組步驟或要素或整體，但并不排除任何其他步驟或要素或整體或者一組要素或整體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可對(duì)本文中所述的本發(fā)明進(jìn)行除了那些經(jīng)具體描述的變化和修飾之外的變化和修飾。應(yīng)理解本發(fā)明包含所有上述變化和修飾。本發(fā)明還包括在本說(shuō)明書(shū)中個(gè)別地或整體地所提及或表明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個(gè)或更多個(gè)所述步驟或特征的任何和全部組合。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受本文中所述的具體實(shí)施例的限制。如本文中所述，功能上等同的產(chǎn)物、組合物和方法明確地落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的實(shí)施無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試，除非另行指明，使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、蛋白組學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA技術(shù)、溶液中肽合成、固相肽合成和免疫學(xué)的常規(guī)方法。教導(dǎo)上述常規(guī)技術(shù)的下文中的文獻(xiàn)1-17以全文提述的方式并入本文。附圖簡(jiǎn)述圖1是顯示供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌乙酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)的擴(kuò)增的夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示。標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用供在緩沖液中如實(shí)施例中所述檢測(cè)KARI的優(yōu)化ELISA條件生成的。重組KARI蛋白的濃度(pg/ml)以對(duì)數(shù)尺度標(biāo)于X軸[ilvC]，而平均OD示于Y軸。分別使用5和2.5μg/mL的捕捉和檢測(cè)抗體(分別為Mol283F和Ch34/35)。使用4-參數(shù)對(duì)數(shù)方程將代表性ELISA(n=2)的數(shù)據(jù)擬合于標(biāo)準(zhǔn)曲線(#1217；LOD=1690pg/mL)。圖2是顯示在結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室菌株(H37Rv)和兩個(gè)臨床菌株(CSU93和HN878)中KARI蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其由夾心ELISA確定。通過(guò)夾心ELISA分析來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左)、結(jié)核分枝桿菌菌株CSU93(中)和HN878(右)的全細(xì)胞裂解液(WCL)。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就添加水平(spikinglevel)加以校正。從每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)。將內(nèi)源蛋白的水平(表示為Pg/μg總細(xì)胞蛋白)就三個(gè)培養(yǎng)菌株中每一個(gè)的平均值士SD進(jìn)行作圖。結(jié)核分枝桿菌菌株承蒙ColoradoStateUniversity的好意而獲得。圖3是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中KARI蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv(左邊)，和鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為pg/yg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖4是顯示從結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌的全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物中KARI蛋白的表達(dá)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將從結(jié)核分枝桿菌菌株H35Rv(左邊)、鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子(如果存在)加以校正。表示為pg/μL濾過(guò)物的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖5是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體與來(lái)自非分枝桿菌病原菌大腸桿菌(柱1和2)、枯草芽孢桿菌(柱3和4)和銅綠假單胞菌(柱5和6)的0.1μg/ml(柱2、4、6)或10(^8/!111(柱1、3、5)全細(xì)胞裂解液缺乏顯著交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。全細(xì)胞裂解液在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。作為對(duì)照，使用分別為Ong/ml(柱7)、0.12ng/ml(柱8)、0.49ng/ml(柱9)、1·95ng/ml(柱10)、7·8ng/ml(柱11)>31.3ng/ml(柱12)或125ng/ml(柱13)的純化的重組KARI蛋白，其通過(guò)將重組蛋白在封閉緩沖液中系列稀釋制備。對(duì)樣品和對(duì)照就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖6是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中KARI蛋白的表達(dá)的圖示。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的KARI蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋:60yg/ml，柱1；20μg/ml，柱2;6.67μg/ml，柱3;2·22yg/ml，柱4；0.74yg/ml，柱5；0.25yg/ml，柱6；0.08yg/ml，柱7；0μg/ml，柱8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如伴隨的實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的KARI蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值(方法34.5mL痰-Cl，17x150μL替代擴(kuò)增(!^placementamplification)ELISA)?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，KARI蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。圖7是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgKARI蛋白/ml樣品體積。將示于圖6的數(shù)據(jù)基于其中的KARI蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlKARI蛋白內(nèi)插為pg/mLrKARI蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，KARI蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=900pg/mL。圖8是顯示未稀釋的痰在本文中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中對(duì)內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白檢測(cè)的掩蔽和/或淬滅作用，以及通過(guò)稀釋痰回收失去的信號(hào)的圖示。將足以提供1.2ng/mlKARI蛋白的結(jié)核分枝桿菌H37Rv全細(xì)胞裂解液摻入未稀釋的封閉溶液或痰中，并在測(cè)定之前溫育16小時(shí)，或者直接測(cè)定。還將該樣品在測(cè)定之前用封閉溶液進(jìn)行系列稀釋，其中稀釋的范圍為從13(v/v)封閉“純粹的(neat)”樣品至127(ν/ν)封閉“純粹的”樣品，如χ-軸所示。對(duì)于測(cè)定法，用捕捉抗體Mol283F將ELISA板包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將每一個(gè)未稀釋的樣品(“純粹的”)或13(ν/ν)稀釋(“13”)、19(ν/ν)稀釋(“19“)或127(ν/ν)稀釋(“127”)的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示痰對(duì)信號(hào)有顯著的減弱/抑制，無(wú)論樣品是立刻進(jìn)行測(cè)定或在測(cè)定之前溫育了較長(zhǎng)時(shí)間，如前兩個(gè)柱的“純粹的”樣品的信號(hào)與封閉緩沖液中的信號(hào)相比無(wú)法檢測(cè)到所示。通過(guò)將樣品在封閉緩沖液中稀釋恢復(fù)了高至約50-75%的信號(hào)，且該恢復(fù)甚至可在測(cè)定之前樣品在痰中溫育了16小時(shí)的情況下仍然發(fā)生，表明在痰中信號(hào)的喪失大部分可歸結(jié)于痰對(duì)信號(hào)的遮掩和淬滅。圖9是顯示未稀釋的痰在本文中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中對(duì)重組結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白檢測(cè)的掩蔽和/或淬滅作用，以及通過(guò)稀釋痰回收失去的信號(hào)的圖示。將KARI蛋白以終濃度lOng/ml摻入未稀釋的封閉緩沖液或痰，并將樣品在測(cè)定之前溫育16小時(shí)，或者直接測(cè)定。還將該樣品在測(cè)定之前用封閉溶液進(jìn)行系列稀釋，其中稀釋范圍為從13(v/v)封閉“純粹的”樣品至127(ν/ν)封閉“純粹的”樣品，如χ-軸所示。對(duì)于測(cè)定法，用捕捉抗體Mol283F將ELISA板包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將每一個(gè)未稀釋的樣品(“純粹的”)或13(ν/ν)稀釋(“13”)、19(ν/ν)稀釋(“19“)或127(ν/ν)稀釋(“127”)的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示痰對(duì)信號(hào)有顯著的減弱/抑制，無(wú)論樣品是立刻進(jìn)行測(cè)定或在測(cè)定之前溫育了較長(zhǎng)時(shí)間，如前兩個(gè)柱的“純粹的”樣品的信號(hào)與封閉緩沖液中的信號(hào)相比無(wú)法檢測(cè)到所示。通過(guò)將樣品在封閉緩沖液中稀釋恢復(fù)了信號(hào)，盡管所述樣品在痰中已溫育了長(zhǎng)時(shí)間，表明在痰中信號(hào)的喪失大部分可歸結(jié)于痰對(duì)信號(hào)的遮掩和淬滅。圖10是使用KARI作為靶抗原，抗體Mol283F作為捕捉抗體而Ch34/35作為檢測(cè)抗體對(duì)臨床涂片陽(yáng)性的痰樣品進(jìn)行篩選的結(jié)果的圖示。從左至右為下述樣品(i)包含具有標(biāo)出的蛋白濃度(μg蛋白/ml)的結(jié)核分枝桿菌H37RV全細(xì)胞裂解液系列稀釋的陽(yáng)性對(duì)照樣品；(ii)兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品(MPC306和MPC315)，每個(gè)均用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋、或13(ν/ν)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子；(iii)陰性對(duì)照(BD_1)，用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋、或13(ν/ν)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子；和(iv)另一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，其包含摻入30μg/ml重組KARI蛋白的樣品BD_1，然后用封閉緩沖液系列稀釋為11(ν/ν)稀釋、或13(ν/ν)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子。ELISA信號(hào)示于y軸。數(shù)據(jù)顯示陰性對(duì)照具有背景信號(hào)，而兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品具有超過(guò)背景的可檢測(cè)信號(hào)。圖11是使用KARI作為靶抗原，抗體Mol283F作為捕捉抗體而Ch34/35作為檢測(cè)抗體對(duì)臨床涂片陽(yáng)性的痰樣品進(jìn)行篩選的結(jié)果的圖示。其為數(shù)據(jù)示于圖10的實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)。從左至右為下述樣品(i)包含具有標(biāo)出的蛋白濃度(μg蛋白/ml)的結(jié)核分枝桿菌H37RV全細(xì)胞裂解液系列稀釋的陽(yáng)性對(duì)照樣品；(ii)兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品(MPC305和MPC316)，每個(gè)均用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋、13(ν/ν)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子；(iii)涂片陰性樣品(MPC313)，用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋、13(ν/ν)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子；和(iv)陰性對(duì)照樣品(BD_1)，用封閉緩沖液配為1l(v/v)稀釋、13(v/v)稀釋或19(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子。ELISA信號(hào)示于y軸。數(shù)據(jù)顯示陰性對(duì)照具有背景信號(hào)，而兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品和一個(gè)涂片陰性樣品具有超過(guò)背景的可檢測(cè)信號(hào)。圖12是使用KARI作為靶抗原，抗體Mol283F作為捕捉抗體而Ch34/35作為檢測(cè)抗體對(duì)臨床涂片陽(yáng)性的痰樣品進(jìn)行篩選的結(jié)果的圖示，其為數(shù)據(jù)示于圖10的實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)。從左至右為下述樣品(i)包含具有標(biāo)出的蛋白濃度(μg蛋白/ml)的結(jié)核分枝桿菌H37RV全細(xì)胞裂解液系列稀釋的陽(yáng)性對(duì)照樣品；和()兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品(MPC309和MPC307)，每個(gè)均用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋或101(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子；和(iii)涂片陰性對(duì)照(MPC311)，用封閉緩沖液配為11(ν/ν)稀釋、31(ν/ν)稀釋或91(ν/ν)稀釋，即標(biāo)于χ軸的稀釋因子。ELISA信號(hào)示于y軸。數(shù)據(jù)顯示陰性對(duì)照具有背景信號(hào)，而兩個(gè)涂片陽(yáng)性樣品和一個(gè)涂片陰性樣品具有超過(guò)背景的可檢測(cè)信號(hào)。圖13提供了顯示使用多克隆Ch34/35抗體(左邊小圖)和單克隆Mol283F抗體(右邊小圖)通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)重組KARI蛋白和內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的圖示。將重組KARI蛋白(rilvC，10ng)和來(lái)自經(jīng)培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌菌株H35Rv、CSU93或HN878的10μg全細(xì)胞裂解液(WCL)通過(guò)SDS-PAGE分辨，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并用Ch34/35多克隆一抗繼以抗雞二抗(標(biāo)題為“雞34/35”的左邊小圖)或用單克隆Mol283F抗體繼以抗小鼠二抗(標(biāo)題為“小鼠1283F”的左邊小圖)進(jìn)行探測(cè)。還將重復(fù)的印跡用Ch34/35在1μg/ml未標(biāo)記的重組KARI蛋白存在下(標(biāo)題為“雞34/35”的中間小圖)，或者，僅用二抗(標(biāo)題為雞“34/35”的右邊小圖和標(biāo)記為“小鼠1283F”的右邊小圖)進(jìn)行探測(cè)。方框標(biāo)記的區(qū)域標(biāo)明KARI蛋白條帶。蛋白的分子量標(biāo)于每組小圖的左側(cè)。數(shù)據(jù)顯示兩種抗體均能夠在全部三個(gè)測(cè)試的菌株中結(jié)合重組KARI蛋白，且所述多克隆抗體能夠在Western印跡中檢測(cè)測(cè)試濃度的內(nèi)源蛋白。數(shù)據(jù)還顯示過(guò)量未標(biāo)記的蛋白能夠阻止抗體結(jié)合ο圖14是使用不同的抗體制備物通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)重組KARI蛋白和內(nèi)源KARI蛋白的照片表示。分子量標(biāo)記蛋白(泳道1)、lng重組KARI蛋白(泳道2)和5mg經(jīng)培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞裂解液(MCL)(泳道幻通過(guò)SDS-PAGE分辨。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并使用標(biāo)于每個(gè)小圖上的一抗進(jìn)行探測(cè)。數(shù)據(jù)顯示，使用Ch35抗體制備物、匯集的Ch34/35抗體制備物、單克隆抗體2B1和單克隆抗體3A2可檢測(cè)出對(duì)重組和內(nèi)源KARI蛋白的結(jié)合，而使用單克隆抗體制備物MolE7和Mo2C7可檢測(cè)出對(duì)內(nèi)源KARI蛋白的結(jié)合。圖15是顯示KARI蛋白對(duì)不同結(jié)核分枝桿菌菌株的交叉反應(yīng)性的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將從ColoradoUniversity或在TyrianDiagnostics內(nèi)部(in-house)獲得的結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的全細(xì)胞裂解液和結(jié)核分枝桿菌菌株HN878和⑶C1551的細(xì)胞裂解液系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示使用該抗體組合在菌株之間有顯著的交叉反應(yīng)性。圖16是顯示在來(lái)自不同結(jié)核分枝桿菌菌株的細(xì)胞裂解液胞質(zhì)溶膠級(jí)分的KARI蛋白的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv、HN878和⑶C1551的胞質(zhì)溶膠蛋白的系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物35相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示使用該抗體組合，在所有三種測(cè)試的菌株的胞質(zhì)溶膠中可檢測(cè)出KARI蛋白，在H37Rv中其水平較高，而在⑶C1551中其水平較低。圖17是顯示在來(lái)自不同結(jié)核分枝桿菌菌株的細(xì)胞裂解液的細(xì)胞膜級(jí)分中的KARI蛋白的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv、HN878和⑶C1551的溶解的細(xì)胞膜蛋白的系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示使用該抗體組合，在所有三種測(cè)試的菌株的細(xì)胞膜中可檢測(cè)出KARI蛋白，在H37Rv中其水平較高，而在⑶C1551和HN878中其水平較低。圖18是顯示在來(lái)自不同結(jié)核分枝桿菌菌株的細(xì)胞裂解液的細(xì)胞壁級(jí)分中的KARI蛋白的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv、HN878和⑶C1551的溶解的細(xì)胞壁蛋白的系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示使用該抗體組合，在所有三種測(cè)試的菌株的細(xì)胞壁中可檢測(cè)出KARI蛋白，在H37Rv中其水平較高，而在CDC1551中其水平較低。圖19是顯示結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液(右邊曲線)和重組KARI蛋白(左邊曲線)的ELISA信號(hào)的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自TyrianDiagnostics內(nèi)部的結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞裂解液的系列稀釋的50μ1等分試樣和重組KARI蛋白系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示內(nèi)源和重組KARI蛋白的效價(jià)值(titrationvalue)0數(shù)據(jù)還顯示可明確地檢出內(nèi)源蛋白，盡管在全細(xì)胞裂解液中內(nèi)源蛋白可受遮掩和/或淬滅。圖20是顯示內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白與大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母細(xì)胞裂解液中的蛋白缺乏可檢測(cè)出的交叉反應(yīng)性的圖示。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的全細(xì)胞裂解液的系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示對(duì)于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白生成了可檢測(cè)出的信號(hào)，而對(duì)于其他生物的全細(xì)胞裂解液中的蛋白缺乏顯著的信號(hào)，這表明使用該抗體對(duì)的該測(cè)定法的特異性。圖21是顯示內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白與大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母細(xì)胞裂解液中的蛋白缺乏可檢測(cè)出的交叉反應(yīng)性，以及結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白和胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌KARI蛋白之間具有弱交叉反應(yīng)性的圖示。將ELISA板用由漿細(xì)胞瘤2B1C11產(chǎn)生的捕捉抗體Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(M.tb裂解液)、大腸桿菌(E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseud)、枯草芽孢桿菌(B.sub)和釀酒酵母(酵母)、胞內(nèi)分枝桿菌(Intrce.Lys)和鳥(niǎo)分枝桿菌(AviumLys)的全細(xì)胞裂解液的系列稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ1經(jīng)150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗進(jìn)行溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增的ELISA)添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述進(jìn)行洗滌，并最終與TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示對(duì)于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白生成了可檢測(cè)出的信號(hào)，對(duì)于胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌蛋白生成了弱得多的信號(hào)(敏感度大約為1/100)，而對(duì)于其他生物的全細(xì)胞裂解液中的蛋白缺乏顯著的信號(hào)，這表明使用該抗體對(duì)的該測(cè)定法的特異性。圖22故意忽略。圖23a_e提供了顯示使用KARI作為靶抗原、抗體Μο2Β1作為捕捉抗體而C34/35作為檢測(cè)抗體對(duì)臨床涂片陽(yáng)性的痰樣品進(jìn)行篩選的結(jié)果的圖示。在圖23a_e中，左邊系列的柱提供了用具有標(biāo)示的蛋白濃度(Pg蛋白/ml)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv全細(xì)胞裂解液的系列稀釋對(duì)KARI蛋白的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)，和包含封閉緩沖液的空白陰性對(duì)照；而最右邊的柱提供了對(duì)于陰性對(duì)照痰或?qū)τ诎?0μg/ml重組KARI蛋白，然后用封閉緩沖液系列稀釋至1l(v/v)稀釋或13(ν/ν)稀釋的該陰性對(duì)照痰的信號(hào)。每個(gè)圖中的樣品包括如下所述的涂片陰性和涂片陽(yáng)性樣品圖23a中涂片陰性:BD1229；BD1288；MPC364；BD1287；BDl187；MPC363；圖23a中涂片陽(yáng)性:MPC360；MPC374；MPC366；MPC357；MPC356；圖23b中涂片陰性CGS123；MPC375；Phru0905；CGSl19；和MPC388；圖23b中涂片陽(yáng)性MPC381；MPC380；MPC379；MPC378；圖23c中涂片陰性:BD505；MPC339；圖23c中涂片陽(yáng)性:MPC370；MPC365；MPC335；MPC372；MPC342；MPC377；MPC324；MPC367；MPC359；MPC368；圖23d中涂片陰性所有列舉的樣品圖23d中涂片陽(yáng)性所有列舉的樣品均不是圖23e中涂片陰性:3_D；3-E；3-H；3-J；3-L；禾口圖23e中涂片陽(yáng)性:3_A；3-B；3-C；3-E；3-F；3-G；3-1；3-K。對(duì)所述樣品在標(biāo)示的稀釋如前述附例所述使用單克隆抗體Μο2Β1作為捕捉抗體而多克隆Ch34/35血清作為檢測(cè)抗體進(jìn)行擴(kuò)增的ELISA測(cè)定法。樣品編碼和涂片測(cè)試的值示于χ軸。ELISA信號(hào)在y軸上標(biāo)為平均值士SD(n=2)。數(shù)據(jù)顯示對(duì)于陰性對(duì)照的背景信號(hào)，以及包含全細(xì)胞裂解液或重組KARI蛋白的陽(yáng)性對(duì)照超過(guò)背景的可檢測(cè)出的信號(hào)。對(duì)于臨床樣品，對(duì)于所有涂片陽(yáng)性的樣品數(shù)據(jù)顯示可檢出顯著高于背景的信號(hào)，而對(duì)于絕大多數(shù)涂片陰性的樣品顯示低于背景的信號(hào)。一些涂片陽(yáng)性的樣品也提供了高于背景的信號(hào)，例如MPC364、MPC363、MPC375、MPC388和MPC339，然而所有這些假陽(yáng)性檢測(cè)可通過(guò)使用一種或多種基于抗原的測(cè)定法使用針對(duì)Rvl265和/或BSX和/或S9蛋白的替代性測(cè)定法來(lái)分辨(數(shù)據(jù)未顯示)。圖M提供了顯示使用單克隆抗體MolF6作為捕捉抗體而生物素化的單克隆抗體Μο2Β1(2Β1-Β)作為檢測(cè)抗體使用擴(kuò)增的夾心ELISA對(duì)內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白進(jìn)行檢測(cè)的圖示。擴(kuò)增的ELISA基本上如本文中所述在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。數(shù)據(jù)表明該測(cè)定法檢測(cè)KARI蛋白。圖25提供了使用針對(duì)包含KARI蛋白區(qū)域的肽(Mo4F7、Mo3C3、Mo4C10、MolClO)或重組KARI蛋白(Μο2Β1)培育的單克隆抗體進(jìn)行擴(kuò)增的夾心ELISA以結(jié)合結(jié)核分枝桿菌全細(xì)胞裂解液中內(nèi)源KARI蛋白的圖示。每種單克隆抗體測(cè)試了兩批。數(shù)據(jù)顯示針對(duì)全長(zhǎng)重組蛋白制備的單克隆抗體Μο2Β1對(duì)內(nèi)源KARI蛋白的結(jié)合最強(qiáng)，且可檢測(cè)出針對(duì)包含SEQIDNO1的殘基40-56的合成肽產(chǎn)生的單克隆抗體Mo4F7和Mo4C10對(duì)內(nèi)源KARI蛋白的結(jié)口O圖洸提供了顯示對(duì)單克隆抗體MolA4、MolH2、Mo2D6、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4Dll進(jìn)行抗體滴定(antibodytitration)的圖示?？贵w以標(biāo)于χ軸的稀釋程度進(jìn)行滴定，其中在每個(gè)測(cè)試的抗體稀釋，生成的信號(hào)從左向右對(duì)應(yīng)于下述抗體1Α4、1Η2、2D6、2E5、2G2、3H3、4C3、4D2和4D11。數(shù)據(jù)顯示抗體2D6、3H3和4D11具有最高效價(jià)，其順序?yàn)?D63>>H3>4D11。圖27提供了顯示單克隆抗體MolA4、MolH2、Mo2D6、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4Dll檢測(cè)重組KARI蛋白的能力的圖示。將抗體針對(duì)相同體積的具有標(biāo)于χ軸的濃度的重組KARI蛋白進(jìn)行滴定，其中在每個(gè)測(cè)試的濃度，生成的信號(hào)從左向右對(duì)應(yīng)于下述抗體1A4、1H2、2D6、2E5、2G2、3H3、4C3、4D2和4D11。數(shù)據(jù)顯示抗體2D6、3H3和4D11在微克至納克濃度的范圍內(nèi)檢測(cè)KARI蛋白。圖28提供了顯示使用單克隆抗體MolF6或Mo2D6作為捕捉抗體而生物素化的單克隆抗體Μο2Β1(2Β1-Β)作為檢測(cè)抗體使用擴(kuò)增的夾心ELISA檢測(cè)重組KARI蛋白的圖示。對(duì)于每個(gè)抗體對(duì)擴(kuò)增的ELISA基本上如本文中所述在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行。數(shù)據(jù)顯示兩種測(cè)定法均檢測(cè)KARI蛋白。圖四提供了顯示在定點(diǎn)的測(cè)定法形式(Diagnostic，TyrianDiagnostics,Australia)中在菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液中內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線的照片表示(上面)和圖示(下面)。對(duì)于每個(gè)測(cè)定法，測(cè)試了500μL包含7.5-120yg/mL范圍的蛋白的結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液(WCL)。使用命名為Ch34/35的雞抗KARI多克隆抗體匯集來(lái)捕捉內(nèi)源KARI，并使用與金偶合的單克隆抗體Μο2Β1進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)測(cè)定點(diǎn)(assaypoint)重復(fù)兩次進(jìn)行。數(shù)據(jù)表明所述ELISA測(cè)定法可簡(jiǎn)化(reducible)為定點(diǎn)形式。圖30是顯示使用經(jīng)與重組BSX預(yù)溫育的雞抗BSX多克隆抗體(實(shí)心菱形)；未經(jīng)預(yù)溫育的雞抗BSX抗體(灰色正方形)；兔抗BSX多克隆抗體(實(shí)心三角形)和小鼠抗BSX單克隆抗體(實(shí)心正方形)檢測(cè)出的重組BSX濃度的圖示。重組蛋白的濃度標(biāo)于X軸，而吸光度標(biāo)于Y軸。圖31是顯示使用夾心ELISA檢測(cè)重組BSX的圖示，其中使用單克隆抗體Mo40;3B作為捕捉試劑而多克隆抗體C44作為檢測(cè)試劑。篩選從50ng/ml低至0.39ng/ml滴定量的重組BSX。標(biāo)出了檢測(cè)和捕捉試劑的濃度。BSX濃度示于X軸，而平均OD示于Y軸。圖32是顯示使用夾心ELISA在TB和對(duì)照受試者的痰中檢測(cè)BSX的圖示。吸光度標(biāo)于Y軸，而樣品類型和編號(hào)標(biāo)于X軸。圖33是顯示使用擴(kuò)增的夾心ELISA檢測(cè)重組BSX的圖示，其中使用單克隆抗體Mo403B作為捕捉試劑或檢測(cè)試劑(如標(biāo)示)，而多克隆抗體C44作為檢測(cè)試劑或捕捉試劑(如標(biāo)示)。篩選從50ng/ml低至0.39ng/ml的滴定量的重組BSX。標(biāo)出檢測(cè)和捕捉試劑的濃度。BSX的濃度示于X軸，而平均OD示于Y軸。圖34是顯示使用擴(kuò)增ELISA檢測(cè)重組BSX的圖示，其中C44用作捕捉試劑。將純化的雞抗BSXpAbC44作為捕捉抗體以20μg/ml的濃度使用每孔50μ1固定在ELISA板上。通過(guò)順序添加濃度為5μg/ml的純化的兔抗BSX(肽28)pAb，然后添加130000(ν/ν)或160000(ν/ν)稀釋的山羊抗兔IgG作為第二檢測(cè)劑(detector)篩選從lOng/ml低至0.078ng/ml的滴定量的重組BSX。使用稀釋為15000(ν/ν)的驢抗山羊IgGHRP和TMB進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。圖35是顯示標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA與基于生物素的擴(kuò)增系統(tǒng)的檢出限比較測(cè)定的圖示。將純化的兔抗BSXpAbR16以20μg/ml的濃度固定于ELISA平板上。以從50ng/ml低至0.39ng/ml的濃度添加滴定量的重組BSX1小時(shí)，除非另行指明(即2小時(shí))。抗原檢測(cè)使用標(biāo)準(zhǔn)的夾心系統(tǒng)進(jìn)行，其中以5μg/ml的濃度添加雞抗BSXpAbC44，然后以15000(ν/ν)的稀釋程度添加偶合于HRP的綿羊抗雞IgG，或使用擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行，其中首先以5μg/ml添加雞抗BSX，然后以上述指明的多種稀釋程度添加偶合于生物素的驢抗雞IgG，最后以15000(ν/ν)的稀釋程度添加鏈霉抗生物素蛋白-HRP。將背景(即BSX不存在時(shí)的信號(hào))從上述曲線中減去。圖36是顯示使用基于生物素的擴(kuò)增ELISA檢測(cè)重組BSX滴定量的圖示。將純化的兔抗BSX(抗肽^)pAbR16作為捕捉抗體以20或40μg/ml的濃度固定于ELISA板上。然后通過(guò)順序添加濃度為5μg/ml的純化的雞抗BSXpAbC44，然后添加以120000(ν/ν)稀釋程度添加偶合于生物素的驢抗雞IgG作為第二檢測(cè)劑來(lái)篩選從lOng/ml低至4.9pg/ml的重組BSX的滴定量。使用稀釋為15000(ν/ν)的偶合于HRP的鏈霉抗生物素蛋白和TMB進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。通過(guò)不添加重組BSX來(lái)獲得對(duì)于兩個(gè)兔抗BSX捕捉濃度的背景OD強(qiáng)度。圖37是顯示使用夾心ELISA用生物素?cái)U(kuò)增系統(tǒng)篩選痰中的內(nèi)源BSX的圖示。將來(lái)自南非的TB患者和分別來(lái)自南非(前綴“Μ”)和澳大利亞(前綴“CGS”)的罹患非TB呼吸道疾病的患者痰樣品(50μ1+50μ1封閉緩沖液)通過(guò)夾心ELISA篩選BSX抗原的存在。將純化的兔抗BSX(肽28)pAb作為捕捉抗體以20μg/ml的濃度固定于ELISA板上，使用濃度為Syg/ml的純化的雞抗BSXpAb，C44作為檢測(cè)抗體。使用稀釋為120000(ν/ν)的生物素化的驢抗雞IgG作為第二檢測(cè)劑。使用稀釋為15000(ν/ν)的鏈霉抗生物素蛋白HRP和TMB進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。向來(lái)自對(duì)照患者CGS25的痰摻入5ng/ml和lng/ml重組BSX作為陽(yáng)性對(duì)照。圖38是顯示多重樣品上樣對(duì)通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA檢測(cè)BSX蛋白的作用的圖示。將兔抗BSXpAbR16作為捕捉抗體以20μg/ml的濃度使用每孔50μ1固定于ELISA板上。將來(lái)自TB患者和非TB呼吸道疾病對(duì)照患者的痰樣品以11(ν/ν)比例用封閉溶液加以稀釋。陽(yáng)性對(duì)照為摻入lng/ml重組BSX的CGS23痰樣品。將痰樣品(i)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)ELISA溫育1小時(shí)；(ii)溫育2小時(shí)；或(iii)溫育2小時(shí)，移除并添加新鮮痰再溫育1小時(shí)。內(nèi)源BSX使用純化的雞抗BSXpAbC44以Syg/ml繼以稀釋為120000(ν/ν)的偶合于生物素的驢抗雞IgG并最后用稀釋為15000(ν/ν)的偶合于HRP的鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。圖39是顯示供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)增的夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示。如實(shí)施例中所述，使用供檢測(cè)緩沖液中的BSX的優(yōu)化ELISA條件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。重組BSX蛋白的濃度(pg/ml)以對(duì)數(shù)尺度標(biāo)于X軸，而平均OD示于Y軸。分別以2μg/mL和5μg/mL使用捕捉和檢測(cè)抗體(分別為Mo639F和Chl2/13)。將數(shù)據(jù)就平均OD+SD(n=3)針對(duì)rBSX的logpg/mL制作X-Y圖，并使用曲線擬合確定所述測(cè)定法的LOD(#733標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)增的ELISA，LOD分別=522和89pg/mL)。圖40是顯示BSX蛋白在結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室菌株(H37Rv)和兩個(gè)臨床菌株WSU93和HN878)中的表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)、結(jié)核分枝桿菌菌株CSU93(中間)和HN878(右邊)的全細(xì)胞裂解液(WCL)通過(guò)夾心ELISA來(lái)進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插并就添加水平進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)從重復(fù)實(shí)驗(yàn)中獲得，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。將內(nèi)源蛋白的水平(表示為Pg/μg總細(xì)胞蛋白)對(duì)于三個(gè)培養(yǎng)菌株中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。結(jié)核分枝桿菌菌株承蒙厚意由CaloradoStateUniversity提供。圖41a是顯示BSX蛋白在結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中的表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)，和來(lái)自鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)及胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)測(cè)定兩次。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插并就稀釋因子進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行計(jì)算。表達(dá)為pg/μg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖41b是顯示BSX蛋白在從結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物中的表達(dá)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將從結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)，鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)及胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物重復(fù)測(cè)定兩次。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插并就稀釋因子(如存在)進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行計(jì)算。表達(dá)為pg/μg濾過(guò)物的內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于三個(gè)分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖42是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的抗體與來(lái)自非分枝桿菌病原菌大腸桿菌(柱1和2)、枯草芽孢桿菌(柱3和4)和銅綠假單胞菌(柱5和6)的0.1μg/ml(柱2、4、6)或lOOyg/ml(柱1、3、5)全細(xì)胞裂解液缺乏顯著交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。全細(xì)胞裂解液在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。作為對(duì)照，分別使用Ong/ml(柱7)和3ng/ml(柱8)的純化的重組BSX蛋白，其通過(guò)將重組蛋白在封閉緩沖液中系列稀釋制備。對(duì)樣品和對(duì)照就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖43是顯示通過(guò)免疫磁珠測(cè)定法(immunemagneticbeadassay)在來(lái)自臨床樣品的痰中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的圖示。將用1.8yg抗BSXChSpAb包被的總共LhlO7個(gè)磁珠，用500μLTB陽(yáng)性或陰性痰(痰-Ml處理)溫育過(guò)夜，之前對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理向各個(gè)樣品添加IOmMEDTA和IX蛋白酶抑制劑混合物，然后在冰上用IOmMDTT還原1小時(shí)，在冰上用30mMIAA烷化1小時(shí)，在室溫用0.25%SDS旋轉(zhuǎn)溫育30分鐘。將樣品用樣品稀釋緩沖液(BNTT-1%BSAUOOmMNaClUOmMTris和0.05%Tween20)稀釋為110(ν/ν)。將重組BSX蛋白(IOOpg)添加至500μL進(jìn)行了相同預(yù)處理方法的Mitha對(duì)照匯集中，以制成供本測(cè)定法的陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)合的內(nèi)源抗原使用ImL的5μg/mL用BNTT稀釋的抗BSX抗體(Mo639F)作為檢測(cè)抗體，繼以添加100μL用偶合稀釋緩沖液稀釋為15000(ν/ν)的抗小鼠HRP偶合抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)表示為OD45ch62ci，并對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)一起進(jìn)行作圖。圖44是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中BSX蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集至Cameroon中，并如實(shí)施例中所述(方法3:9.OmL痰-Cl，4x150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，將痰-Cl進(jìn)行大小分級(jí)(size-fractionate)以去除小于IOOkDa分子量的污染物，用50mMTris,pH7.8、5mMMgCl2平衡，濃縮并以^150μL等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的BSX蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋:60μg/ml，柱1；20μg/ml，柱2；6.67μg/ml，柱3;2·22μg/ml，柱4;0.74μg/ml，柱5；0.25yg/ml，柱6;0.08yg/ml，柱7;0yg/ml，柱8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的BSX蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，BSX蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。圖45是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgBSX蛋白/ml樣品體積。將示于圖22的數(shù)據(jù)基于其中的BSX蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的Ug/mlBSX蛋白內(nèi)插為pg/mLrBSX蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，BSX蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=67pg/mL。圖46是一張顯示使用二維凝膠電泳將從分離自TB受試者的免疫球蛋白的級(jí)分分離的蛋白分開(kāi)的聚丙烯酰胺凝膠的照片表示。標(biāo)出了結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的位置。圖47是顯示多克隆抗體R9滴定的圖示，其相應(yīng)的生物素化肽以3μg/ml包被于5μg/ml鏈霉抗生物素蛋白板上。圖48是顯示將包含氨基酸序列MTETTPAPQTPAAPAGPAQS!7GSGL-生物素的肽以20480pg/ml至10pg/ml相對(duì)于針對(duì)連接于KHL的該肽培育的兔血清進(jìn)行滴定的圖示。實(shí)心菱形代表40μg/ml抗體。實(shí)心正方形代表20μg/ml抗體。灰色三角形代表10μg/ml抗體。灰色正方形代表Oμg/ml抗體。圖49是一張顯示在來(lái)自罹患TB的受試者的樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的Western印跡的照片表示。對(duì)應(yīng)于S9的條帶位置通過(guò)附圖右側(cè)的箭頭標(biāo)示。樣品編號(hào)標(biāo)在附圖頂部，而每個(gè)患者的HIV狀態(tài)標(biāo)在附圖的底部。分子量標(biāo)在附圖的左側(cè)。圖50是一張顯示在來(lái)自對(duì)照受試者(即，未罹患TB的受試者)的樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的Western印跡的照片表示。對(duì)應(yīng)于S9的條帶位置通過(guò)附圖右側(cè)的箭頭標(biāo)示。樣品編號(hào)標(biāo)在附圖頂部，而分子量標(biāo)在附圖的左側(cè)。圖51是顯示針對(duì)重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9制備的不同抗體對(duì)免疫接種抗原的結(jié)合親和性的圖示，其通過(guò)ELISA確定。將重組S9蛋白從500ng/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至7.8ng/ml，并使用50μ1每個(gè)稀釋的等分試樣包被ELISA板的孔(χ軸)。在洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將通過(guò)對(duì)雞(即，命名為Ch27的多克隆抗體)或?qū)π∈?即，命名為Mol025F的抗體)用重組全長(zhǎng)S9蛋白進(jìn)行免疫接種制備的不同抗體分別與濃度為5μg/ml的吸附的抗原相接觸。在室溫下溫育1小時(shí)后，洗滌板，用50μ1稀釋為15000(ν/ν)的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，對(duì)于檢測(cè)結(jié)合的Ch27抗體，綿羊抗雞IgG；而對(duì)于檢測(cè)結(jié)合的Mol205F抗體，驢抗小鼠IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示兩種抗體均通過(guò)ELISA檢測(cè)重組S9蛋白。圖52是顯示使用抗體Ch27作為捕捉抗體而抗體Mol025F作為檢測(cè)抗體測(cè)定重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Ch27以5μg/ml和2.5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組S9蛋白從500ng/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至7.8ng/ml，并將50μ1每個(gè)稀釋的等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Mol025F以1.25μg/ml至5μg/ml的濃度范圍與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫下溫育1小時(shí)后，洗滌板，用50μ1稀釋為15000(ν/ν)的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，驢抗小鼠IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示該抗體組合并無(wú)背景信號(hào)。最優(yōu)的信號(hào)是使用濃度為5μg/ml的捕捉抗體與濃度范圍為1.25μg/ml至5μg/ml的檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)的，該條件對(duì)于結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9提供了約Mng/ml的半最大值檢測(cè)(half-maximumdetection)。圖53是顯示使用抗體Mol025F作為捕捉抗體而抗體Ch27作為檢測(cè)抗體測(cè)定重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Mol025F以5μg/ml和2.5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組S9蛋白從500ng/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至7.8ng/ml，并將50μ1每個(gè)稀釋的等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch27與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物以1.25μg/ml至5μg/ml的濃度范圍相接觸。在室溫下溫育1小時(shí)后，洗滌板，用50μ1稀釋為15000(ν/ν)的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，綿羊抗雞IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示使用該抗體組合在不存在添加的抗原時(shí)，具有顯著的背景交叉反應(yīng)性。最優(yōu)的信號(hào)是使用濃度為2.5μg/ml或5μg/ml的捕捉抗體與濃度為5μg/ml的檢測(cè)抗體在測(cè)試的條件下進(jìn)行檢測(cè)的。圖M是顯示使用抗體Ch27作為捕捉抗體而抗體Mol025F作為檢測(cè)抗體，以及偶合于HRP的二抗測(cè)定低濃度重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Ch27以5μg/ml的濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組S9蛋白從150ng/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至18.31pg/ml，并將50μ1每個(gè)稀釋的等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Mol025F以2.5μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫下溫育1小時(shí)后，洗滌板，用50μ1稀釋為15000(ν/ν)的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，驢抗小鼠IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示該抗體組合并無(wú)背景信號(hào)，在測(cè)試的條件下對(duì)于結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9，檢出限為996pg/ml，而半最大值檢測(cè)為約^ng/ml。誤差棒顯示平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖55是顯示使用抗體Ch27作為捕捉抗體而抗體Mol025F作為檢測(cè)抗體，以及生物素化的二抗測(cè)定低濃度的重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果的圖示。ELISA基本上如圖32的圖例所述進(jìn)行，只不過(guò)重組S9蛋白以20ng/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至4.77pg/ml(x軸)；與二抗的溫育為用生物素化的驢抗小鼠IgG進(jìn)行一小時(shí)，然后用稀釋為15000(v/v)的修飾的鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物(poly-40)溫育；然后通過(guò)洗滌板，用TMB溫育10分鐘，并在450-620nm測(cè)定吸光度(y軸)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗體-抗原-抗體復(fù)合物。數(shù)據(jù)顯示使用生物素化的二抗具有低背景信號(hào)，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9，檢出限為約150pg/ml，而半最大值檢驗(yàn)為約6ng/ml。誤差棒顯示平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖56是顯示使用抗體Ch27作為捕捉抗體而抗體Mol025F作為檢測(cè)抗體，生物素化的二抗以及反復(fù)的(iterative)抗原結(jié)合(本文中也稱作“替代擴(kuò)增”)測(cè)定低濃度的重組結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果的圖示。ELISA基本上如圖33的圖例所述進(jìn)行，只不過(guò)重組S9蛋白以1.0μg/ml的起始濃度12(ν/ν)系列稀釋至0.238fg/ml(χ軸)；且抗原結(jié)合重復(fù)5此，S卩，將封閉緩沖液中的抗原等分試樣與固定的捕捉抗體溫育1小時(shí)，去除，添加另一個(gè)等分試樣，并重復(fù)該過(guò)程直至添加了5次等分試樣。在450-620nm處的吸光度標(biāo)于y軸。數(shù)據(jù)顯示使用生物素化的二抗與反復(fù)的抗原結(jié)合具有低背景信號(hào)，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9，檢出限為約84pg/ml。誤差棒顯示平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖57是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的抗體與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌缺乏顯著交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖33圖例中所述，只不過(guò)用如標(biāo)于χ軸的500ng/ml或50μg/ml的細(xì)胞提取物替代純化的重組S9蛋白。作為陽(yáng)性對(duì)照，使用來(lái)自結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv的細(xì)胞提取物。作為每個(gè)測(cè)定法的陽(yáng)性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。數(shù)據(jù)顯示在450-620nm吸光度的變化，即對(duì)于每個(gè)樣品減去背景吸光度之后的值。誤差棒顯示平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。圖58是顯示在臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白S9的夾心ELISA結(jié)果，以及血漿中缺乏信號(hào)抑制的圖示。測(cè)定條件基本上如圖58圖例所述，只不過(guò)細(xì)胞提取物為來(lái)自結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv和CSU93，如標(biāo)示于χ軸。為了確定血漿造成的信號(hào)抑制，將在所標(biāo)示濃度的細(xì)胞提取物用血漿稀釋，如標(biāo)示于χ軸。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液或血漿。在y軸顯示在450-620nm吸光度的變化，即對(duì)于每個(gè)樣品減去背景吸光度之后的值。誤差棒顯示平均值的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=幻。數(shù)據(jù)顯示血漿并不在該測(cè)定法中抑制信號(hào)，且該測(cè)定法能夠檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的臨床和實(shí)驗(yàn)室分離株兩者。圖59是顯示供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌S9蛋白的標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)增的夾心ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖示。標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用供檢測(cè)緩沖液中的S9而優(yōu)化的ELISA條件如實(shí)施例所述生成的。重組S9蛋白的濃度(logpg/ml)標(biāo)于X軸，即，以對(duì)數(shù)尺度，而平均OD標(biāo)于Y軸。使用捕捉抗體(5yg/mLCh27)和檢測(cè)抗體(對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)ELISA，2μg/mLMol025F，而對(duì)于擴(kuò)增的ELISA，2μg/mL生物素化的Mol025F(S卩“Mol025F_bio”))。數(shù)據(jù)就平均0D+SD(η=2或3)針對(duì)rS9的logpg/mL作為X-Y圖進(jìn)行作圖，并使用曲線擬合以確定該測(cè)定法的LOD(#733標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)增的ELISA，LOD分別=552和89pg/mL)。圖60是顯示S9蛋白在結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室菌株(H37Rv)和兩個(gè)臨床菌株(CSU93和HN878)中的表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)、結(jié)核分枝桿菌菌株CSU93(中間)和HN878(右邊)的全細(xì)胞裂解液(WCL)通過(guò)夾心ELISA來(lái)進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插并就添加水平進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行計(jì)算。數(shù)據(jù)從重復(fù)實(shí)驗(yàn)中獲得，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。將內(nèi)源蛋白的水平(表示為pg/yg總細(xì)胞蛋白)對(duì)于三個(gè)培養(yǎng)菌株中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。結(jié)核分枝桿菌菌株承蒙厚意由CaloradoStateUniversity提供。圖61是顯示S9蛋白在結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中的表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)、和來(lái)自鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液(WCL)在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插并就稀釋因子進(jìn)行校正來(lái)進(jìn)行計(jì)算。將表示為pg/μg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試菌株中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖62是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中S9蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法3:9.OmL痰-Cl，虹150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，將樣品進(jìn)行大小分級(jí)以去除小于IOOkDa分子量的污染物，用50mMTris、pH7.8、5mM1%(12平衡，濃縮并以4x150μL等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋AOyg/ml，柱1；20μg/ml，柱2;6.67yg/ml,tt3；2.22μg/ml，柱4;0.74μg/ml，柱5;0.25yg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7;0μg/ml，柱8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值。“MPC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，S9蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。圖63是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgS9蛋白/ml樣品體積。將示于圖40的數(shù)據(jù)基于其中的S9蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlS9蛋白內(nèi)插為pg/mLrS9蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，S9蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=55pg/mL。圖64是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中S9蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法21.SmL痰-Cl，17x150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，使用丙酮沉淀樣品，將其重新溶解并作為17x150μL等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋90μg/ml，柱1；45μg/ml，柱2；22.50μg/ml，柱3；11.25μg/ml，柱4；5.63μg/ml，柱5；2.81μg/ml，柱6；1.41口8/1111，柱7;(^8/1111，柱8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。圖65是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgS9蛋白/ml樣品體積。將示于圖42的數(shù)據(jù)基于其中的S9蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlS9蛋白內(nèi)插為pg/mLrS9蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。測(cè)定法的LOD=100pg/mL。圖66是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中S9蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法39.OmL痰-ClJxl50yL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，將樣品進(jìn)行大小分級(jí)以去除小于IOOkDa分子量的污染物，用50mMTris、pH7.8、5mM1%(12平衡，濃縮并以4x150μL等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋AOyg/ml，柱1；20μg/ml，柱2;6.67yg/ml,tt3；2.22μg/ml，柱4;0.74μg/ml，柱5;0.25yg/ml，柱6；0.08μg/ml，柱7;0μg/ml，柱8。附圖左側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的S9蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，S9蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。圖67是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgS9蛋白/ml樣品體積。將示于圖44的數(shù)據(jù)基于其中的S9蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlS9蛋白內(nèi)插為pg/mLrS9蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，S9蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=55pg/mL。圖68是顯示在雞中針對(duì)SEQIDNO:6制備的多克隆抗體的滴定的圖示。將重組蛋白R(shí)vl265/MT1303(SEQIDNO:21)以5μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將標(biāo)于χ軸上的命名為“粉紅10”(■)和“粉紅11”(X)的抗血清稀釋液和標(biāo)于χ軸上的來(lái)自相同動(dòng)物的免疫前血清稀釋液(對(duì)于粉紅10，；對(duì)于粉紅11，▲)與固定的重組蛋白R(shí)vl265/ΜΤ1303在足以形成抗原抗體復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，并通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(ν/ν)的綿羊抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB來(lái)檢測(cè)結(jié)合的HRP活性。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。數(shù)據(jù)表明對(duì)于粉紅10，抗體效價(jià)為至少約164000，而對(duì)于粉紅11，抗體效價(jià)至少為約11沘000。圖69是顯示在兔中針對(duì)SEQIDNO26制備的多克隆抗體的滴定的圖示。將鏈霉抗生物素蛋白以5yg/ml濃度固定于ELISA板上。將偶合于由SEQIDNOJ6所示的序列組成的肽的生物素(3yg/ml)與所述板在足以將所述肽通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用固定的條件下接觸一段時(shí)間。在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下添加一段時(shí)間的兔抗血清或免疫前血清的稀釋液，然后如圖46圖例所述檢測(cè)結(jié)合的抗體，只不過(guò)二抗為綿羊抗兔IgGHRP偶合物。兔血清命名為RCP25(對(duì)于免疫前血清，■；對(duì)于免疫血清，)和RCP26(對(duì)于免疫前血清，X；對(duì)于免疫血清，▲)。血清稀釋程度標(biāo)于χ軸。吸光度(OD)標(biāo)于y軸。數(shù)據(jù)表明對(duì)于兩種制備物，抗體效價(jià)為至少約164000(v/v)。圖70是顯示純化的兔抗蛋白R(shí)vl265/MT1303抗體制備物檢出限的圖示。將包含SEQIDNO21所述的序列的重組Rvl265/MT1303蛋白基本上如圖47的圖例所述結(jié)合于ELISA板，只不過(guò)蛋白濃度從19.6ng/ml變?yōu)?00pg/ml(χ軸)。然后將純化的兔抗體以1.25μg/ml,2.5μg/ml或5μg/ml的濃度結(jié)合于重組蛋白，并使用偶合于HRP的綿羊抗兔IgG如圖47的圖例所述進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)表明所述兔抗體的檢出限在所有測(cè)試的濃度約為2.5ng/ml。圖71是使用針對(duì)全長(zhǎng)重組結(jié)核分枝桿菌RV1265蛋白(SEQIDNO21)制備的命名為Chl0(=本文中提及的抗體“粉紅10”)和Chll(=本文中提及的抗體“粉紅11”)的多克隆抗體的ChlO/11匯集和命名為M0788C的單克隆抗體進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的圖示。該圖顯示以不同排列(即，作為捕捉和檢測(cè)抗體)在夾心ELISA中使用這兩個(gè)抗體的作用。用50μ15μg/ml濃度的ChlO/11或Mo788C抗體將ELISA板的孔包被過(guò)夜。在封閉并洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組Rvl265蛋白從500ng/ml起始濃度13(ν/ν)系列稀釋為22.86pg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將交叉使用的檢測(cè)抗體(即，用ChlO/11檢測(cè)Rvl265-Mo788C復(fù)合物和用Mo788C檢測(cè)Rvl265_ChlO/ll復(fù)合物)以2μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，對(duì)于檢測(cè)ChlO/11，綿羊抗雞IgG，或?qū)τ跈z測(cè)Mo788C，綿羊抗小鼠IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并在減去背景之后確定450-620nm處的吸光度(y軸)。雖不欲限定本發(fā)明，但數(shù)據(jù)表明當(dāng)在夾心ELISA中使用單克隆抗體Mo788C作為捕捉抗體并用多克隆抗體匯集Chl0/11作為檢測(cè)試劑時(shí)，觀察到較低的背景作用。圖72是將擴(kuò)增的夾心ELISA與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA就檢測(cè)重組結(jié)核分枝桿菌RV1265蛋白作比較的圖示。將ELISA板用濃度為5μg/ml的捕捉抗體Mo788C包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組Rvl265蛋白從約10yg/ml起始濃度110(v/v)系列稀釋至約1.Opg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體ChlO/11以2.Oμg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ115000(ν/ν)稀釋的由HRP偶合的綿羊抗雞IgG(標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA)或50μ1150000(ν/ν)稀釋的生物素化的驢抗雞IgG(擴(kuò)增的夾心ELISA)組成的二抗溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。對(duì)于進(jìn)行擴(kuò)增ELISA的樣品，然后將HRP-鏈霉抗生物素蛋白添加至板，并在室溫再溫育1小時(shí)，并如前所述洗滌板。最后，將所有樣品用TMB溫育5分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)表明在這樣的條件下使用擴(kuò)增的夾心ELISA顯著地增強(qiáng)檢測(cè)該擴(kuò)增的夾心ELISA的檢出限為約60pg/mlRvl265蛋白，而半最大值檢測(cè)為約5ng/mlRvl265蛋白。這與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的檢出限(約2.6ng/mlRvl265蛋白)和半最大值檢測(cè)(約100ng/mlRvl265蛋白)相比是有利的。圖73是顯示在臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93和HN878，以及在實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv的全細(xì)胞提取物中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌Rvl265蛋白的夾心ELISA結(jié)果的圖示。擴(kuò)增的夾心ELISA條件基本上如圖50的圖例所述，只不過(guò)下述方面有所不同(i)細(xì)胞提取物如χ軸所示進(jìn)行測(cè)定；(ii)向全細(xì)胞提取物摻入重組Rvl265蛋白至終濃度為50、16.7、5.6和1.8μg總細(xì)胞蛋白/ml；和(iii)內(nèi)源Rvl265蛋白的濃度通過(guò)從Rvl265濃度相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)確定，并就樣品中摻入的重組Rvl265蛋白的水平進(jìn)行校正(例如，就稀釋因子進(jìn)行校正)。數(shù)據(jù)表示為對(duì)于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的每微克細(xì)胞提取物總蛋白的內(nèi)源Rvl265蛋白的皮克數(shù)(y軸)。還標(biāo)出了平均蛋白水平。圖74是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rvl265蛋白的抗體與來(lái)自酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液缺乏顯著的交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖51圖例中所述，只不過(guò)測(cè)定的是0-20ng/ml純化的重組Rvl265蛋白或lOOng/ml或100μg/ml細(xì)胞提取物，如標(biāo)于χ軸。不含蛋白或細(xì)胞提取物的緩沖液用作陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示在450-620nm的吸光度的變化，即，在對(duì)于每個(gè)樣品減去背景吸光度之后。圖75是顯示未稀釋的血漿對(duì)在前述圖5中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組Rvl265蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋痰恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Mo788C以5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以標(biāo)于圖例的濃度將重組Rvl265蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉”或“封閉液”)，未稀釋的血漿(“純粹的血漿”)，或用封閉溶液以從11(ν/ν)封閉液血漿至81(ν/ν)封閉液血漿的范圍的稀釋的血漿，并將50μ1每個(gè)樣品等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體ChlO/11以2.Oμg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ1150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗溫育。在室溫再溫育1小時(shí)后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增ELISA)添加至板，將其在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述洗滌，并最后用TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示血漿對(duì)信號(hào)具有30%的減弱/抑制。圖76是顯示未稀釋的痰對(duì)在前述圖5中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組Rvl265蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋痰恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Mo788C以5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以標(biāo)于圖例的濃度將重組Rvl265蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉”或“封閉液”)，未稀釋的痰(“純粹的痰”)，或用封閉溶液以從1l(v/v)封閉液痰至81(ν/ν)封閉液痰的范圍稀釋的痰，并將50μ1每個(gè)樣品的等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體ChlO/11以2.0yg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ1150000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成的二抗溫育。在室溫再溫育1小時(shí)后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增ELISA)添加至板，將其在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述洗滌，并最后用TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示痰對(duì)信號(hào)無(wú)顯著的減弱/抑制。圖77是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中Rvl265蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv(左邊)，和鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為Pg/μg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖78是顯示從結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌的全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物中Rvl265蛋白的表達(dá)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將從結(jié)核分枝桿菌H35Rv(左邊)、鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子(如果存在)加以校正。表示為pg/μL濾過(guò)物的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖79是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中Rvl265蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法1:2.5mL痰-Μ1，17Χ150μ替代擴(kuò)增ELISA)處理的。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋20μg/ml，柱1；10μg/ml,柱2；5μg/ml,柱3；2.5μg/ml,柱4；1.25μg/ml，柱5；0.625μg/ml,柱6；0.313μg/ml,柱7；0.156μg/ml,柱8；0.078μg/ml,柱9；0.039μg/ml,柱10；0.02μg/ml，柱11;0.01μg/ml,柱12；0.005μg/ml,柱13；0.002μg/ml,柱14；0.001μg/ml,柱15；0μg/ml，柱16。附圖右側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，Rvl265蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。圖80是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgRV1265蛋白/ml樣品體積。將示于圖57的數(shù)據(jù)基于其中的Rvl265蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlRvl265蛋白內(nèi)插為pg/mLrRvl265蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，Rvl265蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=11.2pg/mL。圖81是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中Rvl265蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法2:1.8mL痰-Cl，150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，使用丙酮沉淀樣品，將其重新溶解并以4x150μL等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋90μg/ml，柱1；45μg/ml，柱2；22.50μg/ml，柱3；11.25μg/ml，柱4；5.63μg/ml，柱5；2.81μg/ml，柱6;1.41口8/1111，柱7;(^8/1111，柱8。附圖右側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值。“MPC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。圖82是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgRV1265蛋白/ml樣品體積。將示于圖59的數(shù)據(jù)基于其中的Rvl265蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlRvl265蛋白內(nèi)插為pg/mLrRvl265蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，Rvl265蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=67pg/mL。圖83是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中Rvl265蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法39.OmL痰-Cl，4x150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，將樣品進(jìn)行大小分級(jí)以去除小于IOOkDa分子量的污染物，用50mMTris,pH7.8、5mMMgCl2平衡，濃縮并等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋60μg/ml，柱1;20μg/ml，柱2；6.67μg/ml,柱3；2.22μg/ml,柱4；0.74μg/ml,柱5；0.25μg/ml,柱6；0.08μg/ml,柱7；Oyg/ml，柱8。附圖右側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)。空心柱表明涂片陰性/培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。圖84是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgRV1265蛋白/ml樣品體積。將示于圖61的數(shù)據(jù)基于其中的Rvl265蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlRvl265蛋白內(nèi)插為pg/mLrRvl265蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。數(shù)據(jù)顯示在涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品中，無(wú)論受試者的HIV狀態(tài)，Rvl265蛋白交叉反應(yīng)性的水平顯著更高。測(cè)定法的LOD=^pg/mL。圖85是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中Rvl265蛋白的表達(dá)的圖示。痰是從4個(gè)TB陽(yáng)性和TB陰性受試者中的每一個(gè)收集并如實(shí)施例中所述(方法4:18.0mL痰-M2，150μL替代擴(kuò)增ELISA)處理的。簡(jiǎn)言之，將樣品進(jìn)行大小分級(jí)以去除小于IOOkDa分子量的污染物，用50mMTris,pH7.8、5mMMgCl2平衡，濃縮并等分試樣通過(guò)替代擴(kuò)增ELISA進(jìn)行分析。附圖左側(cè)系列的直方圖顯示校準(zhǔn)標(biāo)樣中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法的平均OD值，所述標(biāo)樣包括結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液的下述系列稀釋30μg/ml，柱1;10μg/ml，柱2；3.33μg/ml,柱3；1.11μg/ml,柱4；0.37μg/ml,柱5；0.12μg/ml,柱6；0.04μg/ml,柱7；Oyg/ml，柱8。附圖右側(cè)的系列直方圖顯示如實(shí)施例中所述制備的患者樣品中存在的Rvl265蛋白進(jìn)行ELISA測(cè)定法所得的平均OD值。“MPC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。圖86是顯示從根據(jù)其TB涂片測(cè)試結(jié)果、TB培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果和HIV狀態(tài)分類的患者獲得的臨床痰中的表達(dá)的圖示，表示為PgRV1265蛋白/ml樣品體積。將示于圖63的數(shù)據(jù)基于其中的Rvl265蛋白校準(zhǔn)值轉(zhuǎn)換為pg抗原，這使得將結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞提取物的μg/mlRvl265蛋白內(nèi)插為pg/mLrRvl265蛋白成為可能?！癕PC”表明樣品的識(shí)別碼；“涂片”表明涂片測(cè)試結(jié)果；“培養(yǎng)”表明培養(yǎng)測(cè)試結(jié)果；而“HIV”表明HIV狀態(tài)?？招闹砻魍科幮?培養(yǎng)測(cè)試陰性樣品。實(shí)心柱表明涂片陽(yáng)性/培養(yǎng)陽(yáng)性樣品。測(cè)定法的LOD=65pg/mL。圖87是顯示在來(lái)自罹患結(jié)核病的受試者或?qū)φ帐茉囌叩难搴脱獫{中檢測(cè)抗EF-Tu抗體的圖示。將重組EF-Tu以2μg/ml的濃度每孔50μ1固定在ELISA板上。然后將用封閉緩沖液稀釋100倍的血漿或血清樣品與固定的蛋白在足以使得抗體抗原復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，然后通過(guò)結(jié)合稀釋為150000的綿羊抗人IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。黑柱形條表明來(lái)自罹患結(jié)核病的受試者的樣品?；抑螚l表明來(lái)自對(duì)照受試者的樣品。圖88是顯示針對(duì)融合于NUS的全長(zhǎng)EF-Tu或針對(duì)SEQIDNO:35的由漿細(xì)胞瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的滴定的圖示。將重組EF-Tu以17μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將如標(biāo)于χ軸的命名為681E(O)、683B(■)、682A(□),685B(+),684A(·),524D(X)和521F()的抗體稀釋液與固定的重組EF-Tu在足以使得抗原抗體復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，然后通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(v/v)的綿羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。圖89是顯示針對(duì)融合于NUS的全長(zhǎng)EF-Tu或針對(duì)于SEQIDN0:35的由漿細(xì)胞瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的滴定的圖示。將如標(biāo)于χ軸的重組EF-Tu的稀釋液固定于ELISA板上。將命名為681E(),683B(■)、682A(□)、680A(〇)、685B(X)、684A(·)和521F(A)的抗體以2.5μg/ml的濃度與固定的重組EF-Tu蛋白在足以使得抗原抗體復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，然后通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(ν/ν)的綿羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。圖90是顯示使用雞多克隆抗EF-Tu抗體作為捕捉抗體而單克隆抗體68作為檢測(cè)試劑使用夾心ELISA檢測(cè)重組EF-Tu的圖示。如該例所示使用每個(gè)抗體的多種濃度。將來(lái)自A280=0.235的儲(chǔ)液溶液的12000至122753稀釋的重組EF-Tu的滴定量如標(biāo)于X軸進(jìn)行篩選。洗滌ELISA板，然后通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(ν/ν)的綿羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。圖91是顯示使用雞多克隆抗EF-Tu抗體作為捕捉抗體而單克隆抗體68(■)或524D(^)或521F(A)作為檢測(cè)試劑使用夾心ELISA檢測(cè)重組EF-Tu的圖示。將多克隆抗體以5μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將如標(biāo)于χ軸的滴定量的重組EF-Tu與固定的抗體在足以使得抗體抗原復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。然后將每個(gè)單克隆抗體以5μg/ml的濃度與所述固定的重組EF-Tu在足以使得抗體抗原復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，然后通過(guò)稀釋為15000(ν/ν)的綿羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。圖92是顯示使用來(lái)自雞(hen)49()或雞50(■)的雞多克隆抗EF-Tu抗體作為捕捉抗體和命名為68的單克隆抗體使用夾心ELISA檢測(cè)重組EF-Tu的圖示。就命名而言，來(lái)自雞49的多克隆抗體在本文中也命名為“Ch49”，而來(lái)自雞50的多克隆抗體在本文中也命名為“Ch50”。將多克隆抗體以2.5μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將如標(biāo)于χ軸的滴定量的重組EF-Tu與固定的抗體在足以使得抗體抗原復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。然后將單克隆抗體以2.5μg/ml的濃度與所述固定的重組EF-Tu在足以使得抗體抗原復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，然后通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(v/ν)的綿羊抗小鼠IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。圖93是將擴(kuò)增的夾心ELISA與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA就檢測(cè)重組結(jié)核分枝桿菌EF-Tu蛋白作比較的圖示。將ELISA板用濃度為2μg/ml的捕捉抗體Ch49包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組EF-Tu蛋白從lOOng/ml的起始濃度稀釋至約1.Opg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)之后，洗滌板去除未結(jié)合的抗原。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)增ELISA，將單克隆抗體68生物素化，然后將經(jīng)生物素化的單克隆抗體(命名為“Mo68;3B-bi”)以2.Oμg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ115000(ν/ν)稀釋的由HRP偶合的綿羊抗小鼠IgG(標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA)或50μ112500(ν/ν)稀釋的HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(也稱作“多聚80-HRP-鏈霉抗生物素蛋白”)組成的二抗溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。最后，將所有樣品用TMB溫育30分鐘(標(biāo)準(zhǔn)ELISA)或10分鐘(擴(kuò)增ELISA)。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)表明在這樣的條件下使用擴(kuò)增的夾心ELISA顯著地增強(qiáng)檢測(cè)該擴(kuò)增的夾心ELISA的檢出限為約154pg/mlEF-Tu蛋白。這與觀察到的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的檢出限(約2.172ng/mlEF-Tu蛋白)相比是有利的。圖94是顯示在臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93和HN878，以及在實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv的全細(xì)胞提取物中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌EF-Tu蛋白的夾心ELISA結(jié)果的圖示。擴(kuò)增的夾心ELISA條件基本上如圖73的圖例所述，只不過(guò)下述方面有所不同(i)細(xì)胞提取物如χ軸所示進(jìn)行測(cè)定；(ii)向全細(xì)胞提取物摻入重組EF-Tu蛋白至終濃度為50、16.7,5.6和1.8μg/ml；和(iii)內(nèi)源EF-Tu蛋白的濃度通過(guò)從EF-Tu濃度相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)確定，并就樣品中摻入的重組EF-Tu蛋白的水平進(jìn)行校正。數(shù)據(jù)表示為對(duì)于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的每微克細(xì)胞提取物中的總蛋白的內(nèi)源EF-Tu蛋白的皮克數(shù)(y軸)。還標(biāo)出了平均蛋白水平。圖95是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌EF-Tu蛋白的抗體與來(lái)自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液缺乏顯著的交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖74圖例中所述。作為標(biāo)樣，還制備了從39.lpg/ml至2.5μg/ml范圍的純化的重組EF-Tu蛋白的系列稀釋液以供與細(xì)胞提取物的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行比較，如標(biāo)于χ軸。還使用由封閉緩沖液組成的陰性對(duì)照，如標(biāo)于χ軸的“空白”。數(shù)據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌與來(lái)自大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液之間的低交叉反應(yīng)性或無(wú)交叉反應(yīng)性。圖96是顯示未稀釋的痰對(duì)在前述圖7中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組EF-Tu蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋痰恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Ch49以2.Oμg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以3.3ng/ml的濃度將重組EF-Tu蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉液”)，未稀釋的痰(“痰”)，或用封閉溶液以從1l(v/v)封閉液痰至81(ν/ν)封閉液痰的范圍稀釋的痰，如標(biāo)于χ軸。然后將50μ1每個(gè)樣品等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將生物素化的單克隆抗體Mo68;3B-bi以2.0μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ112500(ν/ν)稀釋的HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(也稱作“多聚80-HRP-鏈霉抗生物素蛋白”)溫育，溫育并然后如前所述進(jìn)行洗滌，最后用TMB溫育10分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示未稀釋的痰對(duì)信號(hào)有淬滅作用，然而通過(guò)稀釋痰實(shí)現(xiàn)了顯著的信號(hào)恢復(fù)，即超過(guò)70%的信號(hào)恢復(fù)。圖97是顯示未稀釋的血漿對(duì)在前述圖7中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組EF-Tu蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋血漿恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Ch49以2.0μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以3.3ng/ml的濃度將重組EF-Tu蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉液”)，未稀釋的血漿(“血漿”)，或用封閉溶液以從11(ν/ν)封閉液血漿至81(ν/ν)封閉液血漿的范圍稀釋的血菜，如標(biāo)于χ軸。然后將50μ1每個(gè)樣品等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將生物素化的單克隆抗體Mo68;3B-bi以2.0μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ112500(ν/ν)稀釋的HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(也稱作“多聚80-HRP-鏈霉抗生物素蛋白”)溫育，溫育并然后如前所述進(jìn)行洗滌，最后用TMB溫育10分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示未稀釋的血漿對(duì)信號(hào)有淬滅作用，然而通過(guò)稀釋血漿實(shí)現(xiàn)了顯著的信號(hào)恢復(fù)，即超過(guò)70%的信號(hào)恢復(fù)。圖98是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中EF-Tu蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H35Rv(左邊)，和鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為pg/yg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖99是顯示在雞中針對(duì)SEQIDNO:36制備的多克隆抗體的滴定的圖示。將重組P5CR(rP5CR)蛋白(SEQIDNO36)以5μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將標(biāo)于χ軸上的命名為“粉紅6”(■)和“粉紅7”(X)的抗血清稀釋液和標(biāo)于χ軸上的來(lái)自相同動(dòng)物的免疫前血清(對(duì)于粉紅6，；對(duì)于粉紅7，▲)與固定的rP5CR蛋白在足以形成抗原抗體復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，并通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(v/v)的綿羊抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。數(shù)據(jù)表明對(duì)于兩個(gè)抗體制備物，抗體效價(jià)均為至少約132000(ν/ν)0命名為“粉紅6”的抗體在本文中也稱作“Ch6”，而命名為“粉紅7”的抗體在本文中也稱作“Ch7”。圖100是顯示在兔中針對(duì)SEQIDNO:43制備的多克隆抗體的滴定的圖示。將鏈霉抗生物素蛋白以5μg/ml固定于ELISA板上。將偶合于由SEQIDNO:43所示的序列組成的肽的生物素(3yg/ml)與所述板在足以將所述肽通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用固定的條件下接觸一段時(shí)間。在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下添加一段時(shí)間的兔抗血清或免疫前血清的稀釋液，然后如圖79圖例所述檢測(cè)結(jié)合的抗體，只不過(guò)二抗為綿羊抗兔IgGHRP偶合物。兔血清命名為Rb33(=RCP33)(對(duì)于免疫血清，■；對(duì)于免疫前血清，)和Rb34(=RCP34)(對(duì)于免疫血清，X；對(duì)于免疫前血清，▲)。血清稀釋程度標(biāo)于χ軸。吸光度(OD)標(biāo)于y軸。圖101是顯示兔抗P5CR抗體Rb37(=RCP37)和Rb38(=RCP38)檢出限的圖示。將包含SEQIDNO42所述的序列的生物素化的肽如圖80的圖例所述結(jié)合于ELISA板，只不過(guò)肽濃度從204.8ng/ml變?yōu)?00pg/ml(χ軸)。將抗體詘37(，■)*詘38(▲，X)以及1500(ν/ν)(，▲)和12000(ν/ν)(·，Χ)的稀釋結(jié)合于肽，并使用綿羊抗兔IgGHRP偶合物如圖80圖例所述進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)表明Rb37的檢出限在1500(ν/ν)稀釋為約0.8ng/ml，而在12000(ν/ν)稀釋為約l_3ng/ml；且Rb38的檢出限在至少高至約12000(ν/ν)稀釋為約l_5ng/ml。圖102是顯示不同的抗體結(jié)合于重組結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白(SEQIDNO36)的圖示，如通過(guò)ELISA確定。將重組P5CR蛋白從55.555ng/ml的起始濃度13(ν/ν)系列稀釋至228.62pg/ml，并使用每個(gè)稀釋液的50μ1等分試樣包被ELISA板的孔(χ軸)。在洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將通過(guò)對(duì)雞(即，命名為Ch6/7的多克隆抗體匯集，通過(guò)結(jié)合本文中提及的多克隆抗體“粉紅6”和“粉紅7”產(chǎn)生)或小鼠(S卩，稱為Mol027D的單克隆抗體)進(jìn)行免疫接種或通過(guò)用抗原的噬菌體展示(Ph4550.2)而制備的不同的抗體分別以5μg/ml的濃度與吸附的重組P5CR蛋白相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(例如，對(duì)于檢測(cè)結(jié)合的Ch6/7抗體，綿羊抗雞IgG；而對(duì)于檢測(cè)結(jié)合的Mol027D抗體，驢抗小鼠IgG)，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示Ch6/7多克隆抗體和重組噬菌體展示抗體Wi4550.2顯著結(jié)合于重組P5CR。圖103是顯示使用抗體Wi4550.2作為捕捉抗體而多克隆抗體匯集Ch6/7作為檢測(cè)抗體以測(cè)定重組結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白的夾心ELISA結(jié)果的優(yōu)化的圖示。將ELISA板用捕捉抗體以2μg/ml,5μg/ml和10μg/ml的濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組P5CR蛋白從50ng/ml的起始濃度13(ν/ν)系列稀釋至22.86pg/ml，并將每個(gè)稀釋液的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch6/7以5μg/ml或10μg/ml范圍的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，與50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，綿羊抗雞IgG)溫育，洗滌，與TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。雖不愿限定本發(fā)明，數(shù)據(jù)顯示最優(yōu)的信號(hào)是使用濃度為5μg/ml或10μg/ml的捕捉抗體與濃度為5μg/ml的檢測(cè)抗體檢測(cè)出的。圖104是將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-偶合的二抗的檢測(cè)與使用鏈霉抗生物素蛋白-HRP或鏈霉抗生物素蛋白多聚-40HRP進(jìn)行的對(duì)生物素化二抗的檢測(cè)進(jìn)行比較的圖示。將ELISA板用l-8pg/ml重組P5CR蛋白包被過(guò)夜，封閉，然后用生物素化的Wi4550.2或未標(biāo)記的Ch6/7抗體在5μg/ml濃度進(jìn)行溫育。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將偶合于HRP的綿羊抗雞IgG二抗或偶合于鏈霉抗生物素蛋白多聚-40HRP的驢抗雞抗體添加至含有所述Ch6/7抗體的孔中。在平行反應(yīng)中，將能夠結(jié)合于生物素化的Wi4550.2的二抗和用鏈霉抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白多聚-40HRP的二抗添加至含有拖4550.2抗體的孔。在溫育之后，洗滌板，用TMB溫育30分鐘，并確定450-620nm的吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示與HRP比較使用鏈霉抗生物素蛋白多聚-40HRP作為檢測(cè)試劑用于Ch6/7抗體顯著的增強(qiáng)了信號(hào)。圖105是顯示就捕捉和檢測(cè)抗體的量和鏈霉抗生物素蛋白多聚80HRP偶合物二抗的稀釋對(duì)擴(kuò)增的夾心ELISA進(jìn)行優(yōu)化以供測(cè)定低濃度的重組結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Wi4550.2以5μg/ml或10μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組P5CR蛋白從500ng/ml的起始濃度13(ν/ν)系列稀釋至22.86pg/ml,并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch6/7以2.5μg/ml或5μg/ml范圍的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，與50μ11200000(ν/ν)稀釋的二抗(即，生物素化的驢抗雞IgG)溫育，如前所述洗滌，然后與HRP80-鏈霉抗生物素蛋白偶合物的50μ1110000(ν/ν)稀釋液或120000(ν/ν)稀釋液溫育。再次洗滌板，并與TMB溫育30分鐘，并確定在450-620nm的吸光度(y軸)。雖不愿限定本發(fā)明，數(shù)據(jù)顯示在本文所使用的二抗?jié)舛?，夾心ELISA中P5CR蛋白的最優(yōu)檢出限是使用10μg/mlPh4550.2捕捉抗體和2.5μg/mlCh6/7檢測(cè)抗體，以及110000稀釋(ν/ν)的擴(kuò)增的鏈霉抗生物素蛋白多聚-80HRP。圖106是將擴(kuò)增的夾心ELISA與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA就檢測(cè)重組結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白作比較的圖示。將ELISA板用濃度為5μg/ml的捕捉抗體Wi4550.2包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組P5CR蛋白從lOOng/ml起始濃度110(v/v)系列稀釋至1.Opg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch6/7以2.Oμg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ1120000(ν/ν)稀釋的由未標(biāo)記的綿羊抗雞IgG(標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA)或生物素化的驢抗雞IgG(擴(kuò)增的夾心ELISA)組成的二抗溫育。在室溫再溫育1小時(shí)之后，如前所述洗滌板。然后將HRP(標(biāo)準(zhǔn)ELISA)或HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增ELISA)添加至板，并將其在室溫再溫育1小時(shí)，并如前所述洗滌板，最后，用TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)表明在這樣的條件下使用擴(kuò)增的夾心ELISA顯著地增強(qiáng)檢測(cè)該擴(kuò)增的夾心ELISA的檢出限為約48pg/mlP5CR蛋白，而半最大值檢測(cè)為約lng/mlP5CR蛋白。圖107是顯示未稀釋的血漿對(duì)在前述圖8中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組P5CR蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋血漿恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體拖4550.2以5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以標(biāo)于χ軸的濃度將重組P5CR蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉”)，未稀釋的血漿(“純粹的血漿”)，或用封閉溶液以從11(ν/ν)封閉液血漿至81(ν/ν)封閉液血漿的范圍的稀釋的血漿，并將50μ1每個(gè)樣品等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch6/7以2.Oμg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ1120000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成二抗(擴(kuò)增的夾心ELISA)溫育。在室溫再溫育1小時(shí)后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增ELISA)添加至板，將其在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述洗滌，并最后用TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示，盡管血漿對(duì)信號(hào)有一些減弱/抑制，稀釋臨床樣品基質(zhì)確實(shí)使得信號(hào)強(qiáng)度的恢復(fù)超過(guò)約70%，并高至約88%。圖108是顯示未稀釋的痰對(duì)在前述圖8中所述的擴(kuò)增的夾心ELISA測(cè)定法中檢測(cè)重組P5CR蛋白的淬滅作用，以及通過(guò)稀釋臨床樣品基質(zhì)完全恢復(fù)喪失的信號(hào)的圖示。將ELISA板用捕捉抗體Wi4550.2以5μg/ml濃度包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，以標(biāo)于χ軸的濃度將重組P5CR蛋白摻入未稀釋的封閉溶液(“封閉”)，未稀釋的痰(“純粹的痰”)，或用封閉溶液以從1l(v/v)封閉液痰至81(ν/ν)封閉液痰的范圍稀釋的痰，并將50μ1每個(gè)樣品等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將抗體Ch6/7以2.0μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并與50μ1120000(ν/ν)稀釋的由生物素化的驢抗雞IgG組成二抗(擴(kuò)增的夾心ELISA)溫育。在室溫再溫育1小時(shí)后，如前所述洗滌板。然后將HRP80-鏈霉抗生物素蛋白(擴(kuò)增ELISA)添加至板，將其在室溫再溫育1小時(shí)，如前所述洗滌，并最后用TMB溫育30分鐘。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)顯示，盡管痰對(duì)信號(hào)有一些減弱/抑制，稀釋臨床樣品基質(zhì)使得信號(hào)強(qiáng)度完全恢復(fù)，甚至有所增強(qiáng)。圖109是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白的抗體與來(lái)自酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液缺乏顯著的交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖86圖例中所述，只不過(guò)測(cè)定的是O-lOng/ml純化的重組P5CR蛋白或100ng/ml或100μg/ml細(xì)胞提取物，如標(biāo)于χ軸。不含蛋白或細(xì)胞提取物的緩沖液用作陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示在450-620nm吸光度變化，即，在對(duì)于每個(gè)樣品減去背景吸光度之后。圖110是顯示在臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93和HN878，以及在實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv的全細(xì)胞提取物中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌P5CR蛋白的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖89的圖例所述，只不過(guò)下述方面有所不同(i)細(xì)胞提取物的來(lái)源如χ軸所示；(ii)向全細(xì)胞提取物摻入重組P5CR蛋白至終濃度為50、16.7、5.6和1.8μg/ml；和(iii)內(nèi)源P5CR蛋白的濃度通過(guò)從PC5R濃度相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)確定，并就樣品中摻入的重組PC5R蛋白的水平進(jìn)行校正。數(shù)據(jù)表示為對(duì)于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的每微克細(xì)胞提取物總蛋白的內(nèi)源PC5R蛋白的水平(y軸)。還標(biāo)出了平均蛋白水平。圖111是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中P5CR蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)，和鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為Pg/μg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖112是顯示在雞中針對(duì)包含SEQIDNO44的重組蛋白制備的多克隆抗體的滴定的圖示。將重組TetR(SEQIDNO44)以5μg/ml的濃度固定于ELISA板上。將標(biāo)于χ軸上的命名為“粉紅4”(■)和“粉紅5”(X)的抗血清稀釋液和標(biāo)于χ軸上的來(lái)自相同動(dòng)物的免疫前血清的稀釋液(對(duì)于粉紅4，；對(duì)于粉紅5，▲)與固定的TetR在足以形成抗原抗體復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間。洗滌ELISA板，并通過(guò)結(jié)合稀釋為15000(ν/ν)的綿羊抗雞IgG辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶合物使用TMB來(lái)檢測(cè)結(jié)合的HRP活性來(lái)檢測(cè)復(fù)合物。對(duì)每個(gè)樣品確定吸光度(OD)(y軸)。數(shù)據(jù)表明對(duì)于兩個(gè)抗體制備物，對(duì)于粉紅4，抗體效價(jià)為至少約164000，而對(duì)于粉紅5，抗體效價(jià)至少為約11觀000。抗體“粉紅4”也稱作“Ch4”；而抗體“粉紅5”也稱作“Ch5”。圖113是顯示在兔中針對(duì)SEQIDNO:55制備的多克隆抗體的檢出限的圖示。將鏈霉抗生物素蛋白以5μg/ml固定于ELISA板上。將濃度如χ軸所示為204.8μg/ml至IOOpg/ml范圍的偶合于由SEQIDNO:55所示的序列組成的肽的生物素與所述板在足以將所述肽通過(guò)生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用固定的條件下接觸一段時(shí)間。在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下添加一段時(shí)間的兔抗血清或免疫前血清的稀釋液(1500(ν/ν)或12000(ν/ν))，然后如圖92圖例所述檢測(cè)結(jié)合的抗體，只不過(guò)二抗為綿羊抗兔IgGHRP偶合物。兔血清命名為RCP18(對(duì)于1500(ν/ν)稀釋的免疫前血清，■；對(duì)于1500(ν/ν)稀釋的免疫血清，；對(duì)于12000(ν/ν)稀釋的免疫前血清，X；對(duì)于12000(ν/ν)稀釋的免疫血清，▲)。吸光度(OD)標(biāo)于y軸。數(shù)據(jù)表明RPC18的檢出限為約0.1-0.5ng/mlο圖114是使用多克隆抗血清RCP18(在圖中=RblS)作為捕捉抗體，而包含多克隆抗體Ch4(=本文中提及的抗體“粉紅4”)和Ch5(=本文中提及的抗體“粉紅5”)的命名為“Ch4/5”的多克隆抗體匯集作為檢測(cè)抗體進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的圖示。該圖顯示在夾心ELISA中使用這兩個(gè)抗體制備物的作用。用50μ1RCP18抗體(Rbl8)以5μg/ml或10μg/ml的濃度將ELISA板的孔包被過(guò)夜。在封閉并洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組TetR樣蛋白從50ng/ml起始濃度稀釋為80pg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體(即，用于檢測(cè)TetR-RCP18復(fù)合物的Ch4/5)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，對(duì)于檢測(cè)Ch4/5，綿羊抗雞IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并在減去背景之后確定450-620nm處的吸光度(y軸)。雖不欲限定本發(fā)明，但數(shù)據(jù)表明在這種夾心ELISA格式中優(yōu)選5μg/mlRCP18作為捕捉抗體而用5μg/mlCh4/5作為檢測(cè)抗體的組合，其檢測(cè)TetR至至少5ng/ml蛋白。圖115是使用包含多克隆抗體Ch4(=本文中提及的抗體“粉紅4”)和Ch5(=本文中提及的抗體“粉紅5”)的命名為“Ch4/5”的多克隆抗體匯集作為捕捉抗體，而多克隆抗血清RCP18(在圖中=Rb18)作為檢測(cè)抗體進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的圖示。該圖顯示在夾心ELISA中使用這兩個(gè)抗體制備物的作用。用50μ1Ch4/5抗體以5μg/ml或10μg/ml的濃度將ELISA板的孔包被過(guò)夜。在封閉并洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組TetR樣蛋白從50ng/ml起始濃度稀釋為80pg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體(即，用于檢測(cè)TetR-Ch4/5復(fù)合物的RCP19)以5μg/ml或10μg/ml或20μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，對(duì)于檢測(cè)Ch4/5，綿羊抗兔IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并在減去背景之后確定450-620nm處的吸光度(y軸)。雖不欲限定本發(fā)明，但數(shù)據(jù)表明在這種夾心ELISA格式中優(yōu)選5μg/mlCh4/5作為捕捉抗體而用5μg/mlRCP18作為檢測(cè)抗體，其與示于圖3的相反順序的抗體相比，僅有略微改善。圖116是使用包含多克隆抗體Ch4(=本文中提及的抗體“粉紅4”)和Ch5(=本文中提及的抗體“粉紅5”)的命名為“Ch4/5”的多克隆抗體匯集作為檢測(cè)抗體，而命名為784F和Mo785E的單克隆抗體制備物作為作為檢測(cè)抗體進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的圖示。該圖顯示在夾心ELISA中使用這些抗體制備物的作用。用50μ1Ch4/5抗體以500ng/ml或1μg/ml或2μg/ml或4μg/ml或8μg/ml的濃度將ELISA板的孔包被過(guò)夜。在封閉并洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組TetR樣蛋白從5ng/ml起始濃度稀釋為2.^pg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體(即，用M784F或MΜο785Ε檢測(cè)TetR_Ch4/5復(fù)合物)以2μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ115000(ν/ν)稀釋的偶合于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的二抗(即，對(duì)于檢測(cè)所述小鼠單克隆抗體，綿羊抗小鼠IgG)溫育，洗滌，用TMB溫育30分鐘，并在減去背景之后確定450-620nm處的吸光度(y軸)。雖不欲限定本發(fā)明，但數(shù)據(jù)表明Mo785E單克隆抗體提供了最低的背景信號(hào)，并當(dāng)與Ch4/5捕捉抗體組合時(shí)，提供了比兔多克隆RCP18更高的信號(hào)。500ng/mlCh4/5作為捕捉抗體而2μg/mlMo785E作為檢測(cè)抗體的組合提供了最低的背景信號(hào)，然而2μg/mlCh4/5作為捕捉抗體而2μg/mlMo785E作為檢測(cè)抗體的組合在該夾心ELISA形式中提供了最高的信號(hào)噪音比例。圖117是將擴(kuò)增的夾心ELISA與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA就檢測(cè)重組結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白作比較的圖示。將ELISA板用濃度為2μg/ml的捕捉抗體Ch4/5包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將重組TetR樣蛋白從lOOng/ml的起始濃度稀釋至490fg/ml，并將每個(gè)稀釋的50μ1等分試樣添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中(χ軸)。在溫育1小時(shí)之后，洗滌板去除未結(jié)合的抗原。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA，將未標(biāo)記的單克隆抗體Μο785Ε以2.5μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。對(duì)于擴(kuò)增的夾心ELISA，將單克隆抗體Mo785E生物素化，并將生物素化的抗體以2.5μg/ml的濃度與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，并用50μ115000(ν/ν)稀釋的由HRP-偶合的綿羊抗小鼠IgG(標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA)組成的二抗或50μ112500(ν/ν)稀釋的HRP80-鏈霉抗生物素蛋白溫浴。然后將板在室溫再溫育1小時(shí)，并如前所述洗滌板。最后，將所有樣品用TMB溫育30分鐘(標(biāo)準(zhǔn)ELISA)或10分鐘(擴(kuò)增ELISA)。在450-620nm確定吸光度(y軸)。數(shù)據(jù)表明在這樣的條件下使用擴(kuò)增的夾心ELISA顯著地增強(qiáng)檢測(cè)該擴(kuò)增的夾心ELISA的檢出限為約18pg/mlTetR樣蛋白，而半最大值檢測(cè)為約lng/mlTetR樣蛋白。這與標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA的觀察到的檢出限(約176pg/mlTetR樣蛋白)相比是有利的。圖118是顯示在臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93和HN878，以及在實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv的全細(xì)胞提取物中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白的夾心ELISA結(jié)果的圖示。擴(kuò)增的夾心ELISA條件基本上如圖97的圖例所述，只不過(guò)下述方面有所不同(i)細(xì)胞提取物如χ軸所示進(jìn)行測(cè)定；(ii)向全細(xì)胞提取物摻入重組7討1樣蛋白至終濃度為50、16.7、5.6和1.8μg/ml；和(iii)內(nèi)源TetR樣蛋白的濃度通過(guò)從TetR濃度相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)確定，并就樣品中摻入的重組TetR樣蛋白的水平進(jìn)行校正。數(shù)據(jù)表示為對(duì)于兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的每微克細(xì)胞提取物總蛋白的內(nèi)源TetR樣蛋白的皮克數(shù)(y軸)。還標(biāo)出了平均蛋白水平。圖119是顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌TetR樣蛋白的抗體與來(lái)自酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液缺乏顯著的交叉反應(yīng)性的夾心ELISA結(jié)果的圖示。測(cè)定條件基本上如圖98圖例中所述，只不過(guò)以12500(ν/ν)稀釋使用HRP40-鏈霉抗生物素蛋白而非HRP80-鏈霉抗生物素蛋白，使用TMB進(jìn)行15分鐘的信號(hào)檢測(cè)，并如標(biāo)于χ軸測(cè)定450fg/ml至lng/ml純化的重組TetR樣蛋白或細(xì)胞提取物的13(ν/ν)系列稀釋(即11.lyg/ml或33.348/1111或10(^8/1111)。不含蛋白或細(xì)胞提取物的緩沖液充當(dāng)陰性對(duì)照。數(shù)據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌與來(lái)自酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的全細(xì)胞裂解液之間并無(wú)交叉反應(yīng)性。圖120是顯示結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中TetR樣蛋白表達(dá)(相對(duì)于總細(xì)胞蛋白)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)兩次測(cè)定來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)，和鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)的全細(xì)胞裂解液。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子加以校正。表示為pg/yg總細(xì)胞蛋白的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)測(cè)試的分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖121是顯示從結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌的全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物中TetR蛋白的表達(dá)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA確定。將從結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(左邊)、鳥(niǎo)分枝桿菌(中間)和胞內(nèi)分枝桿菌(右邊)全細(xì)胞裂解液獲得的濾過(guò)物重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子(如果存在)加以校正。表示為pg/μL濾過(guò)物的內(nèi)源蛋白水平對(duì)于三個(gè)分枝桿菌中的每一個(gè)就平均值士SD進(jìn)行作圖。圖122提供了顯示痰對(duì)抗體與重組BSX(上左)、Rvl265(上右)、S9(下左)和KARI(下右)蛋白的結(jié)合的抑制的圖示。使用擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)分析在TB陰性痰中抗體與重組蛋白結(jié)合的抑制程度。用lOng/mL每種重組蛋白(每個(gè)小圖的1_2列)、用封閉緩沖液13(ν/ν)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的4-5列)、用封閉緩沖液19(ν/ν)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的7-8列)、和用封閉緩沖液127(ν/ν)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的10-11列)摻入痰。將樣品在測(cè)定前在4°C溫育過(guò)夜(每個(gè)小圖的1、4、7、10列)或立即測(cè)定(每個(gè)小圖的2、5、8、11)。陽(yáng)性對(duì)照缺乏痰，并在測(cè)定之前溫育過(guò)夜(每個(gè)小圖的3、6、9、12列)。樣品在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)在一式兩份的孔中進(jìn)行測(cè)定。在每個(gè)稀釋中在痰中檢測(cè)出的重組蛋白濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并表示為重組蛋白摻入濃度的％信號(hào)恢復(fù))。對(duì)于三種處理的四個(gè)稀釋因子中的每一個(gè)將恢復(fù)的水平作為平均％信號(hào)恢復(fù)士SD進(jìn)行作圖。對(duì)每個(gè)示于χ軸的稀釋，數(shù)據(jù)表示為信號(hào)恢復(fù)百分比(Y軸)。圖123提供了顯示痰對(duì)抗體與內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌BSX(上左)、RvU65(上右)、S9(下左)和KARI(下右)蛋白的結(jié)合的抑制的圖示，其通過(guò)擴(kuò)增的夾心ELISA確定。使用擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)分析在摻入TB陰性痰的結(jié)核分枝桿菌H37Rv全細(xì)胞裂解液中抗體與內(nèi)源BSX、S9、Rvl265和KARI蛋白的結(jié)合的淬滅和遮掩的水平。用全細(xì)胞裂解液摻入痰以取得下述痰中的目標(biāo)濃度BSX=9ng/mL、Rvl265=2.8ng/mL、S9=1.2ng/mL而KARI=31ng/mL(每個(gè)小圖的1-2列)、并用封閉緩沖液13(v/v)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的4-5列)、用封閉緩沖液19(ν/ν)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的7-8列)、和用封閉緩沖液127(ν/ν)稀釋的混合物(每個(gè)小圖的10-11列)摻入痰。將樣品在測(cè)定前在4°C溫育過(guò)夜(每個(gè)小圖的1、4、7、10列)或立即測(cè)定(每個(gè)小圖的2、5、8、11)。陽(yáng)性對(duì)照樣品缺乏痰，并在測(cè)定之前溫育過(guò)夜(每個(gè)小圖的3、6、9、12列)。樣品在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)在一式兩份的孔中進(jìn)行測(cè)定。在每個(gè)稀釋中在痰中檢測(cè)出的內(nèi)源蛋白濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線(用封閉緩沖液系列稀釋的H37RV-WCL)內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并表示為摻入濃度的％信號(hào)恢復(fù))。對(duì)于三種處理的四個(gè)稀釋因子中的每一個(gè)將恢復(fù)的水平作為平均％信號(hào)恢復(fù)士SD進(jìn)行作圖。圖124是顯示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rvl265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱觀-30)和抗原E(柱31-33)基于在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(每3列一組的第一列)、CSU939(每3列一組的第二列)和HN878(每3列一組的第三列)中總細(xì)胞蛋白表達(dá)的相對(duì)表達(dá)的圖示，其通過(guò)夾心ELISA來(lái)確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子來(lái)加以校正。數(shù)據(jù)通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平(表示為Pg/μg總細(xì)胞蛋白)對(duì)于分析的11個(gè)TB抗原作為平均值士SD進(jìn)行作圖。圖125是圖IM所述的圖示的擴(kuò)展表示，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。圖126是顯示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rvl265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱觀-30)和抗原E(柱31-33)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每IxlO6CFU結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(每3列一組的第一列)、鳥(niǎo)分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)的蛋白ng數(shù)，通過(guò)夾心ELISA來(lái)確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子來(lái)加以校正。數(shù)據(jù)通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于分析的11個(gè)TB抗原的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)表示結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu,KARI、Rvl265和S9的特異性表達(dá)。圖127是圖1所述的圖示的擴(kuò)展表示，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表明在結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu、P5CR、Rvl265和S9的特異性表達(dá)，以及KARI在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中在這些低檢出限具有可檢測(cè)出的表達(dá)。圖128是顯示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rvl265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱觀-30)和抗原E(柱31-33)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每μg結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(每3列一組的第一列)、鳥(niǎo)分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)總細(xì)胞蛋白的抗原pg數(shù)，通過(guò)夾心ELISA來(lái)確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子來(lái)加以校正。數(shù)據(jù)通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于分析的11個(gè)TB抗原中的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)表示結(jié)核分枝桿菌中BSX、EF-Tu、Rvl265和S9的特異性表達(dá)。在這些條件下在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中明顯可檢出KARI。圖1是圖1所述的圖示的擴(kuò)展表示，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表明Rvl265在結(jié)核分枝桿菌中的特定性表達(dá)，而大部分在胞內(nèi)分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌中的其他抗原在這些低檢出限可檢測(cè)出表達(dá)。圖130是顯示BSX(柱1-3)、EF-Tu(柱4-6)、KARI(柱7-9)、P5CR(柱10-12)、抗原A(柱13-15)、Rvl265(柱16-18)、抗原B(柱19-21)、抗原C(柱22-24)、S9(柱25-27)、抗原D(柱觀-30)和抗原E(柱31-33)的相對(duì)表達(dá)的圖示，所述表達(dá)表示為每μL結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(每3列一組的第一列)、鳥(niǎo)分枝桿菌(每3列一組的第二列)和胞內(nèi)分枝桿菌(每3列一組的第三列)全細(xì)胞裂解液的濾過(guò)物的抗原pg數(shù)，通過(guò)夾心ELISA來(lái)確定。內(nèi)源蛋白的濃度通過(guò)從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插來(lái)計(jì)算，并就稀釋因子來(lái)加以校正。數(shù)據(jù)通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)來(lái)獲取，其中每個(gè)樣品重復(fù)兩次進(jìn)行分析。內(nèi)源蛋白的水平對(duì)于分析的11個(gè)TB抗原中的每一個(gè)作為平均值士SD進(jìn)行作圖。圖131是圖130所述的圖示的擴(kuò)展表示，顯示一些低表達(dá)抗原的表達(dá)水平。圖132提供了顯示測(cè)定法工作范圍和對(duì)重組結(jié)核分枝桿菌KARI、(IlvC)、BSX、Rvl265和S9蛋白(左邊小圖)和結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv全細(xì)胞裂解液(WCL)中的內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌KARI、(IlvC)、BSX、Rvl265和S9蛋白(右邊小圖)檢出限的圖示。重組蛋白和全細(xì)胞裂解液蛋白濃度示于χ軸(yg/ml)而在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用本文中所述的抗體對(duì)進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA所得的吸光度示于y軸。數(shù)據(jù)表明所有四種抗原均能夠在納克濃度被顯著地檢測(cè)出來(lái)，而對(duì)于全細(xì)胞裂解液為微克濃度。優(yōu)詵實(shí)施例的詳細(xì)描述分離的或重組的KARI蛋白及其免疫原性片段和表位本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位。本發(fā)明的該方面涵蓋了任何來(lái)源于本文中提及的KARI蛋白的合成或重組的肽，包括全長(zhǎng)KARI蛋白、和/或KARI蛋白的衍生物或同源物，或其免疫原性片段或表位。優(yōu)選的KARI蛋白是與SEQIDNO1所述的氨基酸序列具有至少約80%氨基酸序列同一性的肽、多肽或蛋白。優(yōu)選地，KARI蛋白與SEQIDNO:1的同一性百分比為至少約85%，更優(yōu)選至少約90%，甚至更優(yōu)選至少約95%而還更優(yōu)選至少約99%。本發(fā)明并不限定于使用例示的結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道，無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試即可界定與例示的結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白具有序列同一性和免疫學(xué)等同性的蛋白片段。在確定兩個(gè)氨基酸序列是否落在上文界定的百分比同一性限制范圍內(nèi)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白可以對(duì)氨基酸序列進(jìn)行并排(side-by-side)比較。在上述比較或比對(duì)中，會(huì)根據(jù)用于進(jìn)行所述比對(duì)的算法，在非相同殘基的位置方面產(chǎn)生差異。在本文的語(yǔ)境中，提及兩個(gè)或更多氨基酸序列的百分比同一性和相似性應(yīng)認(rèn)為是提及所述序列之間使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)算法確定的各自相同和相似的殘基數(shù)。具體而言，氨基酸同一性禾口相似性是使用ComputerGeneticsGroup,Inc.,UniversityResearchPark,Madison,Wisconsin,UnitedStatesofAmerica的軟件進(jìn)行計(jì)算的，例如，使用Devereaux等，Nucl.AcidsRes.12，387-395，1984的GAP程序，其使用Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48，443-453,1970的算法?；蛘撸褂肨hompson等，Nucl.AcidsRes.22，4673-4680的CLUSTALW算法以獲得多重序列的比對(duì)，其中必需或需要最大化相同/相似殘基的數(shù)量，而最小化比對(duì)中序列缺口的數(shù)量和/或長(zhǎng)度。氨基酸序列比對(duì)還可使用多種其他商業(yè)上可得到的序列分析程序進(jìn)行，例如，在NCBI可獲得的BLAST程序。特別優(yōu)選的片段包括那些包含表位，特別是B細(xì)胞表位或T細(xì)胞表位的。B細(xì)胞表位方便地來(lái)源于免疫原性KARI蛋白的氨基酸序列。本發(fā)明具體涵蓋了需要針對(duì)其進(jìn)行免疫應(yīng)答的獨(dú)特型(idiotypic)和反獨(dú)特型B細(xì)胞表位，以及經(jīng)脂質(zhì)修飾的B細(xì)胞表位或組B(GroupB)蛋白。優(yōu)選的B細(xì)胞表位當(dāng)施用于哺乳動(dòng)物時(shí)，能夠引發(fā)抗體的產(chǎn)生，所述抗體優(yōu)選針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的中和抗體，且更優(yōu)選地，高效價(jià)中和抗體。優(yōu)選較短的B細(xì)胞表位，以便于肽合成。優(yōu)選地，B細(xì)胞表位的長(zhǎng)度不應(yīng)超過(guò)30氨基酸的長(zhǎng)度。更優(yōu)選地，所述B細(xì)胞表位由約25或更少的氨基酸殘基組成，且更優(yōu)選少于20個(gè)氨基酸殘基，且甚至更優(yōu)選約5-20個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度，其來(lái)源于全長(zhǎng)蛋白的序列。CTL表位也方便地來(lái)源于KARI蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列，且通常會(huì)由所述KARI蛋白至少9個(gè)連續(xù)的氨基酸組成，并具有使用供確定I類MHC結(jié)合表位的預(yù)測(cè)性算法確定的與I類MHC等位基因以顯著的水平相互作用的氨基酸序列，所述算法例如UniversityofTuebingen,Germany^SYFPEITHItheNationalInstitutesofHealthoftheGovernmentoftheUnitedStatesofAmerica的BioInformaticsandMolecularAnalysisSection(BIMAS)的HLAP印tideBindingPredictions程序的算法。更優(yōu)選地，CTL表位會(huì)具有在抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面結(jié)合于和/或穩(wěn)定I類MHC分子的氨基酸序列。甚至更優(yōu)選地，所述CTL表位具有誘導(dǎo)記憶CTL應(yīng)答或引發(fā)IFNy的T細(xì)胞表達(dá)的序列(例如⑶8+T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL))。還甚至更優(yōu)選地，所述CTL具有在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性測(cè)定法中激發(fā)CTL活性的序列。KARI蛋白特別優(yōu)選的CTL表位能夠在人細(xì)胞或組織中引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，例如，通過(guò)識(shí)別并裂解結(jié)核分枝桿菌感染的人細(xì)胞，由此提供或增強(qiáng)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞免疫。合適的片段為至少約5，例如10、12、15或20個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。其還可以為少于200、100或50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的氨基酸序列可就具體的目的根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行修飾，而不負(fù)面影響其免疫功能。舉例而言，特定的肽殘基可經(jīng)衍生化或化學(xué)修飾以增強(qiáng)所述免疫應(yīng)答或允許所述肽偶聯(lián)于其他試劑，特別是脂質(zhì)。還可能改變肽內(nèi)的特定氨基酸而不擾亂所述肽的整體結(jié)構(gòu)或免疫原性。因此，上述變化稱作“保守性”變化，并傾向于依賴于所述殘基的親水性或極性。側(cè)鏈的大小和/或電荷在確定哪個(gè)取代是保守性的時(shí)候也是相關(guān)的因素。本發(fā)明明確地涵蓋一種或多種免疫原性KARI肽之間的共價(jià)融合，包括肽的同二聚體、同三聚體、同四聚體或更高級(jí)的同多聚體，或包含兩種或更多種不同免疫原性肽的異二聚體、異三聚體、異四聚體或更高級(jí)的異多聚體。本發(fā)明還涵蓋一種或多種免疫原性KARI肽之間的非共價(jià)聚集體，例如，其通過(guò)離子的(ionic)、流體靜力的(hydrostatic)或其他本領(lǐng)域已知的或本文中所述的相互作用保持在一起。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分地知道，在定義生物學(xué)功能等同蛋白時(shí)，隱含著下述概念對(duì)于在所述分子界定的部分內(nèi)進(jìn)行變化，但仍然得到具有可接受水平的等同生物學(xué)活性的分子所能進(jìn)行的變化數(shù)是有限的。因此，本文中生物學(xué)功能等同蛋白界定為其中取代了特定氨基酸的蛋白。具體的實(shí)施例涵蓋在所述肽的氨基酸序列中具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)變化的變體。當(dāng)然，可方便地制備多種具有不同取代的不同蛋白/肽，并依據(jù)本發(fā)明加以使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員充分明白下述取代是可容許的保守取代(i)涉及精氨酸、賴氨酸和組氨酸的取代；(ii)涉及丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的取代；和(iii)涉及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的取代。并入上述保守取代的衍生物在本文中界定為生物學(xué)或免疫性的功能等同物。憎水性氨基酸指數(shù)(hydropathicaminoacidindex)對(duì)賦予蛋白相互作用的生物學(xué)功能的重要性在本領(lǐng)域通常是理解的(Kyte&Doolittle,J.Mol.Biol.157,105-132,1982)。已知一些氨基酸可取代另一些具有相似憎水性指數(shù)(hydropathicindex)或得分(score)的氨基酸而仍舊保留類似的生物學(xué)活性。還可在確定產(chǎn)生功能性等同分子的保守取代中考慮氨基酸的憎水性指數(shù)。對(duì)每個(gè)氨基酸基于其疏水性和電荷特征指定如下所述的憎水性指數(shù)異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在基于憎水性指數(shù)進(jìn)行變化時(shí)，優(yōu)選對(duì)憎水性指數(shù)在+/-0.2之內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。更優(yōu)選地，取代涉及憎水性指數(shù)在+/-0.1之內(nèi)的氨基酸，且甚至更優(yōu)選在約+/-0.05之內(nèi)。在本領(lǐng)域還理解相似氨基酸的取代可基于親水性來(lái)有效進(jìn)行，特別是當(dāng)所述生物學(xué)功能等同物蛋白或由此產(chǎn)生的肽意欲用于免疫學(xué)實(shí)施例，如本案中(例如，美國(guó)專利4554101號(hào))。事實(shí)上，蛋白的最大局部平均親水性(greatestlocalaveragehydrophilicity)，其由其鄰接的氨基酸的親水性決定，與其免疫原性和抗原性相關(guān)。如美國(guó)專利45M101號(hào)所詳述，對(duì)氨基酸殘基指定了下述親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+/-0.1)；谷氨酸(+3.0+/-0.1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+/-0.1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于相似的親水性值進(jìn)行變化時(shí)，優(yōu)選對(duì)彼此親水性值在約+/-0.2之內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代，更優(yōu)選在約+/-0.1之內(nèi)，且甚至更優(yōu)選在約+/-0.05之內(nèi)。包含表位的KARI多肽或其肽片段可方便地使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Merrifield的合成方法(Merrifield，JAmChemSoc,85,:2149-2154,1963)和對(duì)該技術(shù)無(wú)數(shù)可用的改進(jìn)(參見(jiàn)，例如SyntheticPeptides:AUser'sGuide,Grant,編(1992)W.H.Freeman&Co.,NewYork,pp.382；Jones(1994)TheChemicalSynthesisofPeptides,ClarendonPress,Oxford,pp.230.)；Barany,G.禾口Merrifield,R.B.(1979)inThePeptides(Gross,E.andMeienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,AcademicPress,NewYork；ffiinsch,Ε.,編(1974)SynthesevonPeptideninHouben-ffeylsMetodenderOrganischenChemie(Miller,E.,IS),vol.15,4thedn.,Parts1and2,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,Μ.(1984)PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,Μ·&Bodanszky,A.(1984)ThePracticeofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int.J.PeptideProteinRes.25，449—474.d如本領(lǐng)域所知，合成肽可產(chǎn)生為具有附加的親水性N-端和/或C-端氨基酸添加至來(lái)源于全長(zhǎng)KARI蛋白的片段或B細(xì)胞表位的序列，例如，為了便于合成或改善肽可溶性。就此目的，特別優(yōu)選甘氨酸和/或絲氨酸殘基。上述肽可經(jīng)修飾以包括位于所述KARI片段兩側(cè)的附加的間隔物序列，所述間隔物包含雜聚物(hetero-polymer)(三聚體或四聚體)，所述雜聚物包含甘氨酸和絲氨酸。本發(fā)明的肽可方便地經(jīng)修飾以供診斷目的，例如，通過(guò)添加天然或合成的半抗原、抗生素、激素、類固醇、核苷、核苷酸、核酸、酶、酶底物、酶抑制劑、生物素、親和素、鏈霉抗生物素蛋白、多組氨酸標(biāo)記、谷胱甘肽、GST、聚乙二醇、肽性多肽部分(ρ印tidicpolypeptidemoiety)(例如，促吞噬肽(tuftsin)，多賴氨酸)、熒光標(biāo)志物(例如，F(xiàn)ITC、RITC、丹?；?、魯米諾或香豆素)、生物發(fā)光標(biāo)志物、自旋標(biāo)記、生物堿、生物胺、維生素、毒素(例如，地高辛、鬼筆環(huán)肽、鵝膏菌素(amanitin)、河豚毒素(tetrodotoxin))或形成復(fù)合物的試劑。特別優(yōu)選生物素化的肽。在另一個(gè)實(shí)施例中，將KARI蛋白或其免疫原性片段或表位作為重組蛋白產(chǎn)生。對(duì)于通過(guò)重組手段表達(dá)蛋白，將編碼蛋白的核苷酸序列置于與啟動(dòng)子或其他能夠在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)或細(xì)胞系統(tǒng)中調(diào)節(jié)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可操作的連接位置。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包含KARI蛋白(例如，如SEQIDNO=I所述)或其表位的編碼序列可操作地連接于合適啟動(dòng)子序列的核酸，在足以發(fā)生表達(dá)的條件下在合適的細(xì)胞中表達(dá)一段時(shí)間。編碼所述KARI蛋白的核酸，包括結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因及其任何如本文中所述編碼KARI蛋白的變體，可方便地從公眾可以得到的氨基酸序列衍生。在另一個(gè)實(shí)施例中，將KARI蛋白作為重組融合蛋白產(chǎn)生，例如，以協(xié)助提取和純化。為了產(chǎn)生融合多肽，將其開(kāi)放閱讀框以相同的閱讀框共價(jià)連接，例如，使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法，如由Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyInterscience,ISBN047150338,1992)描述的方法，并在啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。融合蛋白配偶體的實(shí)施例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、FLAG(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、六組氨酸、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活域)和β-半乳糖苷酶。還可方便地將蛋白水解剪切位點(diǎn)包含于融合蛋白配偶體和目標(biāo)蛋白序列之間以使得去除融合蛋白序列成為可能。優(yōu)選地，所述融合蛋白不會(huì)妨礙所述KARI蛋白的免疫功能。本文中提及的“啟動(dòng)子”應(yīng)考慮其最廣泛的含意，并包括經(jīng)典基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其包括精確轉(zhuǎn)錄起始(accuratetranscriptioninitiation)所需的TATA盒，其包含或不包含響應(yīng)發(fā)育和/或外源刺激，或以組織特異性的形式改變基因表達(dá)的CCAAT盒序列和其他調(diào)節(jié)元件(即，上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子(silencer)。在本文語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”也用于描述下述的重組、合成或融合分子，或衍生物，所述分子或衍生物對(duì)其可操作地連接的下述核酸賦予、激活或增強(qiáng)其表達(dá)，所述核酸編碼所述多肽或肽片段。優(yōu)選的啟動(dòng)子可包含一種或多種特定調(diào)節(jié)元件的附加拷貝以進(jìn)一步加強(qiáng)表達(dá)和/或改變?cè)摵怂岱肿拥目臻g表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。將核酸置于啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下，即“可操作地連接于”該啟動(dòng)子，意指將所述核酸置于使得所述啟動(dòng)子序列控制其表達(dá)的位置。啟動(dòng)子通常位于其調(diào)控的編碼序列的5，(上游)。在細(xì)菌(如大腸桿菌)中產(chǎn)生完整的多肽和肽的先決條件是使用具有有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)的強(qiáng)啟動(dòng)子。通常適于在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)中表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不僅限于，IacZ啟動(dòng)子、溫度敏感的λ^或λκ啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子或可由IPTG誘導(dǎo)的tac啟動(dòng)子。多種其他供在大腸桿菌中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的載體系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的，并描述于，例如，Ausubel等(In:CurrentProtocolsinMolecularBiology.WileyInterscience,ISBN047150338，1987)或Sambrook等(In:Molecularcloning,Alaboratorymanual，第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)。已描述了多種具有適于在細(xì)菌中表達(dá)的啟動(dòng)子和有效核糖體結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒，例如，PKC30(λL=ShimakateandRosenberg,Nature292,128,1981)；pKK173_3(tac:AmannandBrosius,Gene40,183,1985)、pET-3(T7:Studier和Moffat,J.Mol.Biol.189，113，1986)；pBAD/TOPO或pBAD/ο-ΤΟΡΟ系列的載體，其包含可由阿拉伯糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(Invitrogen，Carlsbad,CA)，后者設(shè)計(jì)為還產(chǎn)生與硫氧還蛋白的融合蛋白以增強(qiáng)所表達(dá)的蛋白的可溶性；PFLEX系列的表達(dá)載體(PfizerInc.，CT,USA)；或pQE系列的表達(dá)載體(Qiagen,CA)，等等。通常適于在真核細(xì)胞的病毒和真核細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子包括SV40晚期啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、CMVIE(巨細(xì)胞病毒立即早期)啟動(dòng)子等。供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，293、COS、CHO、IOT細(xì)胞、293T細(xì)胞)中表達(dá)的優(yōu)選的載體包括但不僅限于，由hvitrogen提供的pcDNA載體組(vectorsuite)，特別是包含CMV啟動(dòng)子并編碼C端6xHis和MYC標(biāo)記的pcDNA3.1myc-His-標(biāo)記；以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSRatkneo(Muller等，Mol.Cell.Biol.，11，1785，1991)。對(duì)于在細(xì)胞中表達(dá)KARI蛋白或其衍生物的分泌形式，特別優(yōu)選載體pcDNA3.1myc-His(Invitrogen)，其中表達(dá)的肽或蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)的利用鎳柱以通過(guò)His標(biāo)記結(jié)合所述蛋白的親和技術(shù)純化為不含同種蛋白。廣泛范圍的適于表達(dá)本發(fā)明的診斷蛋白或其免疫學(xué)衍生物(例如，表位或其他片段)的其他宿主/載體系統(tǒng)可公開(kāi)獲得，并描述于，例如，Sambrook等(In=Molecularcloning,Alaboratorymanual,第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)。將分離的核酸分子或包含該分子的基因構(gòu)建體引入細(xì)胞以供表達(dá)的手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。用于給定生物的技術(shù)依賴于已知的成功技術(shù)。將重組DNA引入動(dòng)物細(xì)胞的手段包括微注射、通過(guò)DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(如通過(guò)使用lipofectamine(Gibco，MD,USA)和/或cellfectin(Gibco，MD,USA))、PEG介導(dǎo)的DNA攝入、電穿孔和微粒轟擊(microparticlebombardment)(如通過(guò)使用包被DNA的鎢或金微粒(AgracetusInc.，WI，USA))等。本發(fā)明的蛋白可以以分離的形式產(chǎn)生，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含同種的蛋白。特別優(yōu)選抗體和其他親和配體以供產(chǎn)生分離的蛋白。優(yōu)選地，在所述蛋白所在的制備物中，超過(guò)約90%(例如，95%，98%或99%)的制備物中的蛋白是KARI蛋白或其表位。分離或重組的次級(jí)分析物蛋白、肽及其表位。應(yīng)理解本文中上述供產(chǎn)生分離和重組的KARI蛋白或其免疫原性片段的方法可根據(jù)情況作適當(dāng)應(yīng)用于產(chǎn)生次級(jí)分析物蛋白、肽和片段，其可用于免疫測(cè)定法形式，例如，為了對(duì)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的診斷或預(yù)后、抗體產(chǎn)生、分析物純化、疫苗配制等的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，上述外推取決于用所述KARI蛋白免疫原取代所述次級(jí)分析物，例如，根據(jù)本文中的任何實(shí)施例結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白或S9蛋白或GS蛋白或其免疫原性片段，或所述肽或表位或片段的組合或混合物。上述取代可根據(jù)本文的公開(kāi)無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試即可方便地進(jìn)行。為方便起見(jiàn)，優(yōu)選的次級(jí)分析物(例如，供用于多分析物的基于抗原的測(cè)試的)，會(huì)包含選自SEQIDNO:3-60所述的氨基酸序列，及其組合/混合物。舉例而言，結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)手段進(jìn)行表達(dá)，并自其獲得片段，或者，合成肽可基于全長(zhǎng)蛋白(例如，包含SwissProtDatabase登錄號(hào)053759所述的序列)的序列合成。來(lái)自全長(zhǎng)BSX蛋白的示例性的免疫原性肽會(huì)包含選自下組的序列MRQLAERSGVSNPYL(SEQIDNO3),ERGLRKPSADVLSQI(SEQIDNO4),LRKPSADVLSQIAKA(SEQIDNO:5)、PSADVLSQIAKALRV(SEQIDNO:6)、SQIAKALRVSAEVLY(SEQIDNO:7)、AKALRVSAEVLYVRA(SEQIDNO8),VRAGILEPSETSQVR(SEQIDNO9)、TAITERQKQILLDIY(SEQIDNO10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQIDNO:11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQIDNO:12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQIDNO:13)。供產(chǎn)生上述片段的方法詳細(xì)描述于本申請(qǐng)人于2005年8月19日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/0012M號(hào)(W02006/01792)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。作為替換或附加手段，結(jié)核分枝桿菌谷氨酰胺合成酶(GQ蛋白可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)手段進(jìn)行表達(dá)，并自其獲得片段，或者，合成肽可基于全長(zhǎng)蛋白(例如，包含SwissProtDatabase登錄號(hào)033342所述的序列的)的序列合成。來(lái)自GS蛋白的示例性的免疫原性肽來(lái)源于GS蛋白的表面暴露區(qū)域，或包含序列RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQIDNO57)或WASGYRGLTPASDYNIDYAI(SEQIDNO:58)。供產(chǎn)生上述片段的方法詳細(xì)描述于本申請(qǐng)人于2005年6月M日提交的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/000930號(hào)(W02006/000045)，其公開(kāi)以全文提述的方式并入本文。結(jié)合于KARI蛋白或其表位的抗體本發(fā)明的第二方面提供了特異性結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體，例如，適用于本文中所述的測(cè)定法的單克隆或多克隆抗體制備物。本文中提及的抗體包含完整多克隆和單克隆抗體及其部分，其本身或與其他部分偶合。抗體部分包括Fab和F(ab)2片段和單鏈抗體。所述抗體可在合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)制備，或，在工程改造的抗體(單鏈抗體或SCABS等)的情況下，使用重組DNA技術(shù)在體外制備。按照本發(fā)明的該方面，可為了對(duì)受試者進(jìn)行免疫接種的目的產(chǎn)生抗體，在此情況下，特別優(yōu)選結(jié)合于B細(xì)胞表位的高效價(jià)或中和抗體。適用于免疫接種的受試者無(wú)疑取決于用于免疫接種的抗原或抗原性B細(xì)胞表位。考慮到本發(fā)明會(huì)廣泛的應(yīng)用于廣泛范圍的動(dòng)物免疫接種，所述動(dòng)物例如農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(farmanimal)(例如，馬、牛、綿羊、豬、山羊、雞、鴨、火雞等)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔)、家養(yǎng)動(dòng)物(domesticanimal)(貓、狗、鳥(niǎo)等)，野化(feral)或野生的外來(lái)動(dòng)物(exoticanimal)(例如，負(fù)鼠、貓、豬、水牛、野狗等)和人。或者，所述抗體可用于商業(yè)或診斷目的，在此情況下被施用KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的受試者極有可能為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物。廣泛范圍的動(dòng)物用于產(chǎn)生抗血清。通常，用于產(chǎn)生抗血清的動(dòng)物是兔、小鼠、兔、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、山羊、綿羊、豬、狗、馬或雞。由于兔和綿羊的相對(duì)較大的血量，其為產(chǎn)生多克隆抗體的優(yōu)選選擇。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，與較小的動(dòng)物(如小鼠)相比，需要更大量的免疫原以從大型動(dòng)物獲得抗體。在上述情況下，需要從經(jīng)免疫接種的動(dòng)物分離所述抗體。優(yōu)選地，所述抗體是高效價(jià)抗體?！案咝r(jià)”意指適用于診斷或治療應(yīng)用的足夠高的效價(jià)。如本領(lǐng)域所知，對(duì)于何者可被視為“高效價(jià)”有所不同。對(duì)于大部分應(yīng)用優(yōu)選至少66約IO3-IO4的效價(jià)。更優(yōu)選地，所述抗體效價(jià)會(huì)在IO4至IO5的范圍，甚至更優(yōu)選在約IO5至約IO6的范圍。更優(yōu)選地，在來(lái)自病原體、病毒或細(xì)菌的B細(xì)胞的情況下，所述抗體是中和抗體(即，其能夠中和所述B細(xì)胞表位來(lái)源于的生物的感染性)。為了產(chǎn)生抗體，所述KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，任選地與任何合適的或需要的載體、佐劑、BRM或藥學(xué)上可接受的賦形劑一同配制，可方便地以可注射的組合物的形式給藥。注射可為鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他已知途徑。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，需要包含一種或多種液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑(nutrientreplenisher)0制備和表征抗體的手段在本領(lǐng)域是眾所周知的(參見(jiàn)，例如，ANTIBODIES:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory，1988，以提述的方式并入本文)。將供生成多克隆抗體或單克隆抗體的優(yōu)選的免疫原性肽使用幾種本領(lǐng)域已知的偶合化學(xué)之一共價(jià)性偶聯(lián)于免疫原性載體蛋白，如白喉類毒素(DT)、匙孔血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin，KLH)、破傷風(fēng)類毒素(TT)或流感病毒的核蛋白(NP)。其增強(qiáng)否則在動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、雞等)中不具有高免疫原性的肽的免疫原性。制備供上述偶聯(lián)的載體蛋白的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。舉例而言，DT優(yōu)選通過(guò)從白喉棒桿菌(Corynebacteriumdiphtheriae)培養(yǎng)物純化所述毒素并然后通過(guò)或化學(xué)去毒來(lái)產(chǎn)生，但也可通過(guò)純化重組的或遺傳上去毒的毒素類似物(例如，CRM197或如其他描述于美國(guó)專利4，709，017,5,843，711,5,601，827、和5，917，017號(hào)的突變體)來(lái)制備。優(yōu)選地，所述類毒素(toxoid)是使用至多6個(gè)碳的橋聯(lián)作為間隔物衍生的，如通過(guò)使用白喉類毒素(D-AH)的己二酸酰胼衍生物所提供的。對(duì)于偶聯(lián)，可將來(lái)源于全長(zhǎng)KARI蛋白的肽通過(guò)化學(xué)方法合成或通過(guò)重組表達(dá)手段產(chǎn)生，用羥胺處理以形成自由的巰基基團(tuán)，并通過(guò)所述自由巰基基團(tuán)交聯(lián)于經(jīng)馬來(lái)酰亞胺修飾的白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素或流感NP蛋白或其他載體分子。一種最具特異性并可靠的偶合化學(xué)使用肽中的半胱氨酸殘基并將馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)添加至所述載體蛋白，以形成穩(wěn)定的硫醚鍵(Lee，A.C.等，Mol.Immune-1.17，749-7561980)。舉例而言，如果肽中不存在巰基基團(tuán)，可先將所述KARI蛋白衍生肽通過(guò)添加C-端半胱氨酸殘基進(jìn)行修飾以輔助此方法。免疫原性KARI肽優(yōu)選在非變性條件下用羥胺、硫醇還原劑或者通過(guò)酸或堿水解處理生成自由巰基基團(tuán)，并將所述含巰基的肽通過(guò)藉由所述自由巰基基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)鍵合偶合于載體來(lái)產(chǎn)生。上述偶合可為通過(guò)使用合適的二馬來(lái)酰亞胺(bis-maleimide)化合物?；蛘撸鯤A蛋白可偶合于經(jīng)馬來(lái)酰亞胺修飾的載體蛋白，如白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素或流感(NP)蛋白或偶合于糖類，如藻酸(alginicacid)、右旋糖酐或聚乙二醇。上述經(jīng)馬來(lái)酰亞胺修飾的載體分子可通過(guò)將所述載體分子與馬來(lái)酰亞胺-N-羥基琥珀酸酯類的異雙功能(hetero-bifunctional)交聯(lián)劑反應(yīng)來(lái)形成。上述雙功能酯的實(shí)施例包括馬來(lái)酰亞胺-己酸一N-輕基玻拍酸酉旨(maleimido-caproic-N-hydroxysuccinimideester,MCS)、馬來(lái)酷亞胺-苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(maleimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimideester,MBS)、馬來(lái)酰亞胺-苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(maleimido-benzoylsul-fosuccinimideester,sulfo-MBS)、琥珀酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate,SMCC)、琥珀酰亞胺_4_(對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸(succinimidyl-4-(p-maleimido-phenyl)butyrate，SMPP)、硫代琥拍酰亞胺-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸(sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethy1)cyclohexane-l-carboxylate,sulfo-SMCC)和硫代琥珀酰亞胺_4_(對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸(sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate,sulfo—SMPP)。N—輕基白酰亞胺酯部分與載體蛋白的氨基基團(tuán)反應(yīng)，從而使得馬來(lái)酰亞胺部分可以自由的與抗原上的巰基基團(tuán)反應(yīng)以形成交聯(lián)的物質(zhì)。這樣產(chǎn)生的偶合分子可經(jīng)純化，并用于免疫原性組合物以在施用于宿主時(shí)，引發(fā)對(duì)KARI肽的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答比KARI肽單獨(dú)引發(fā)的免疫應(yīng)答更加強(qiáng)烈。白喉類毒素可商業(yè)獲得，或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從在浸沒(méi)培養(yǎng)(submergedculture)中生長(zhǎng)的白喉棒桿菌制備。白喉類毒素的產(chǎn)生分為五個(gè)階段，即維持可用的種培養(yǎng)物(maintenanceofworkingseed)、生長(zhǎng)白喉棒桿菌、收獲白喉毒素、將白喉毒素去毒以及濃縮白喉類毒素。在制備物中用作載體的純化的白喉類毒素(DT)優(yōu)選為通過(guò)使用水溶性碳二亞胺縮合方法附加間隔物分子(如己二酸酰胼(ADH))而修飾(衍生)的商業(yè)性的類毒素。然后從未反應(yīng)的ADH分離經(jīng)修飾的類毒素，其通常為己二酸酰胼衍生物D-AH。KARI蛋白或其免疫原性片段或表位產(chǎn)生抗體的效力通過(guò)向動(dòng)物(例如，小鼠、雞、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬、牛、山羊或豬)注射包含KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的配制劑，然后監(jiān)測(cè)其針對(duì)B細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答來(lái)確立，如描述于實(shí)施例。初次和再次免疫應(yīng)答均受監(jiān)測(cè)。抗體效價(jià)使用任何常規(guī)免疫測(cè)定法確定，例如，ELISA或放射性免疫測(cè)定法。多克隆抗體的產(chǎn)生可通過(guò)對(duì)經(jīng)免疫接種的動(dòng)物在免疫接種后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血樣來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如果要取得所需的抗體效價(jià)，可給予其二次的加強(qiáng)(booster)注射。反復(fù)進(jìn)行加強(qiáng)和測(cè)定效價(jià)(tittering)的過(guò)程，直至取得合適的效價(jià)。當(dāng)獲得所需水平的免疫原性時(shí)，將經(jīng)免疫接種的動(dòng)物放血，分離其血清并儲(chǔ)藏，和/或使用所述動(dòng)物產(chǎn)生單克隆抗體(Mab)。特別優(yōu)選單克隆抗體。對(duì)于產(chǎn)生單克隆抗體(Mab)，可使用多種眾所周知的技術(shù)中任何一種，例如，例示于美國(guó)專利4，196，265號(hào)中的方法，其以提述的方式并入本文。舉例而言，用有效量的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞的條件下對(duì)合適的動(dòng)物進(jìn)行免疫接種。優(yōu)選的動(dòng)物是嚙齒類如兔、小鼠和大鼠，然而亦可使用綿羊或蛙的細(xì)胞。使用大鼠可提供某些益處，但是優(yōu)選小鼠或兔，其中BALB/c小鼠是最優(yōu)選的，因?yàn)槠錇樽畛Ｓ玫膭?dòng)物，且通常給出較高百分比的穩(wěn)定融合物。已知兔提供高親和性的單克隆抗體。在免疫接種后，將具有產(chǎn)生抗體潛力的體細(xì)胞，特別是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，選用于Mab生成方法。這些細(xì)胞可通過(guò)脾臟、扁桃體或淋巴結(jié)的活檢獲得，或可自外周血樣獲得。優(yōu)選脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞，前者是因?yàn)槠錇榉至阎械臐{母細(xì)胞階段的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的豐富來(lái)源，而后者是因?yàn)橥庵苎煞奖愕氐玫?。通常，?duì)一組動(dòng)物進(jìn)行免疫接種，并移除具有最高抗體效價(jià)的動(dòng)物的脾。脾淋巴細(xì)胞是通過(guò)用注射器對(duì)脾進(jìn)行勻漿來(lái)獲得的。通常，來(lái)自經(jīng)免疫接種的小鼠的脾包含大約5xl07至hlO8個(gè)淋巴細(xì)胞。然后將來(lái)自經(jīng)免疫接種的動(dòng)物的B細(xì)胞與不死的骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，其通常來(lái)源于經(jīng)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位免疫接種的動(dòng)物的相同物種。適用于雜交瘤-產(chǎn)生融合方法的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選為非抗體產(chǎn)生的，具有高融合效率，并具有使其不能夠在一些選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酶缺陷，所述選擇性培養(yǎng)基僅支持所需的融合細(xì)胞，或雜交瘤的生長(zhǎng)?？墒褂枚喾N骨髓瘤細(xì)胞中的任一種，且其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的(例如，鼠P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210_Agl4、F0、NSO/U、MPC-IUMPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0；或大鼠R210.RCY3、Y3_Ag1.2.3、IR983F和4B210；以及Uj66、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2和UC7^_6)。優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞是NS-I骨髓瘤細(xì)胞系(也稱作P3-NS-l-Ag4-l)，其可容易地從NIGMHumanGeneticMutantCellRepository以登錄號(hào)GM3573獲得。或者，使用鼠骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)者細(xì)胞(non-producercell)，其具有8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤抗性。為了生成抗體產(chǎn)生脾或淋巴結(jié)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雜合體，將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的試劑(化學(xué)的或電的)存在下分別以約201至約11的比例(ν/ν)混合。使用仙臺(tái)病毒的融合方法已經(jīng)由Kohler和Milstein，Nature256,495-497,1975；以及Kohler和Milstein,Eur.J.Immune-1.6，511-519，1976所描述。使用聚乙二醇(PEG)(如37%(v/v))PEG)的方法已經(jīng)由Gefter等，SomaticCellGenet.3，231-236，1977詳細(xì)描述。使用電誘導(dǎo)的融合方法也是合適的。雜合體在包含阻斷組織培養(yǎng)基中核苷酸的從頭合成的試劑的選擇性培養(yǎng)基中通過(guò)培養(yǎng)來(lái)增殖。示例性和優(yōu)選的試劑是氨基蝶呤、氨甲喋呤和偶氮絲氨酸(azaserine)。氨基蝶呤和氨甲喋呤阻斷嘌呤和嘧啶的從頭合成，而偶氮絲氨酸僅阻斷嘌呤合成。當(dāng)使用氨基蝶呤和氨甲喋呤時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃嘌呤和胸腺嘧啶作為核苷酸的來(lái)源(HAT培養(yǎng)基)。當(dāng)使用偶氮絲氨酸時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃嘌呤。優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT，因?yàn)閮H那些能夠運(yùn)行核苷酸補(bǔ)救途徑的雜交瘤能夠在HAT培養(yǎng)基中生存，而骨髓瘤細(xì)胞具有補(bǔ)救途徑關(guān)鍵酶缺陷(例如，次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)(hypoxanthinephosphoribosyltransferase)^^HPRT),/AM^fe^^oBMM^i運(yùn)行該補(bǔ)救途徑，但其在培養(yǎng)物中具有有限的壽命，并通常在約兩周內(nèi)死亡。相應(yīng)地，唯一能夠在選擇性培養(yǎng)基中生存的細(xì)胞是那些從骨髓瘤和B細(xì)胞形成的雜合體。對(duì)擴(kuò)增的雜交瘤就抗體特異性和/或效價(jià)例如通過(guò)免疫測(cè)定法(例如，放射性免疫測(cè)定法、酶免疫測(cè)定法、細(xì)胞毒性測(cè)定法、噬菌斑測(cè)定法、斑點(diǎn)免疫測(cè)定法等)進(jìn)行功能性選擇。將選中的雜交瘤系列稀釋并克隆入單獨(dú)的抗體產(chǎn)生細(xì)胞系，然后可無(wú)限繁殖該克隆以提供MAb。可用兩種基本方法利用所述細(xì)胞系以供MAb產(chǎn)生。將雜交瘤樣品注射入用于提供初始融合體的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的類型的組織相容性動(dòng)物(通常為其腹膜腔)。受注射的動(dòng)物形成腫瘤，所述腫瘤分泌由所述融合細(xì)胞雜合體產(chǎn)生的特異性單克隆抗體。然后可將所述動(dòng)物的體液(如血清或腹水)引流，以提供高濃度的MAb。也可將單獨(dú)的細(xì)胞系在體外培養(yǎng)，其中MAb自然地分泌至培養(yǎng)基中，其可以以高濃度從所述培養(yǎng)基方便地獲得?？蛇M(jìn)一步使用過(guò)濾、離心和多種層析方法(如HPLC或親和層析)純化(如需要)由任一手段產(chǎn)生的MAb。或者，使用ABL-MYC技術(shù)(NeoClone，MadisonWI53713，USA)產(chǎn)生分泌針對(duì)免疫原性KARI肽抗原的單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞系。在此過(guò)程中，用一定量的該肽抗原對(duì)BALB/cByJ雌性小鼠進(jìn)行免疫接種約2至約3個(gè)月。在此期間，以有規(guī)律性的間隔從經(jīng)免疫接種的小鼠取測(cè)試血樣以在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中評(píng)價(jià)抗體應(yīng)答。使用具有至少約1000抗體效價(jià)的小鼠脾以供后續(xù)使用包含癌基因v-abl和c-myc的無(wú)法復(fù)制(implication-incompetent)的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行ABL-MYC感染。將脾細(xì)胞移植入首次接受測(cè)試的小鼠(naivemouse)，其便產(chǎn)生腹水，所述腹水包含產(chǎn)生針對(duì)KARI肽抗原的單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞系。將mAb從腹水根據(jù)該mAb的同種型使用蛋白G或蛋白A純化(例如，結(jié)合于固體基質(zhì))。由于不涉及雜交瘤融合，ABL-MYC方法具有更快、更劃算，且比常規(guī)mAb產(chǎn)生方法產(chǎn)量更高的優(yōu)點(diǎn)。此外，通過(guò)該方法產(chǎn)生的二倍體漿細(xì)胞瘤本質(zhì)上比多倍體雜交瘤更加穩(wěn)定，因?yàn)锳BL-MYC逆轉(zhuǎn)錄病毒僅感染脾中被免疫接種的抗原刺激的細(xì)胞。然后ABL-MYC將這些激活的B-細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不死的mAb產(chǎn)生漿細(xì)胞，稱作漿細(xì)胞瘤?！皾{細(xì)胞瘤”為能夠進(jìn)行不受控制的細(xì)胞分裂的永生化的漿細(xì)胞。由于漿細(xì)胞瘤起初僅為一個(gè)細(xì)胞，所有從其產(chǎn)生的漿細(xì)胞瘤因此是同一的，而且，產(chǎn)生相同的所需“單克隆”抗體。其結(jié)果，無(wú)需分選不需要的細(xì)胞系。ABL-MYC技術(shù)一般地詳細(xì)描述于下述公開(kāi)1.Largaespada等，Curr.Top.Microbiol.Immune-1.,166,91-96.1990；2.Weissinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88，8735-8739，1991；3.Largaespada等，Oncogene，7，811-819，1992；4.Weissinger等，J.Immune-1.Methods168，123—130，1994;5.Largaespada等，J.Immune-1.Methods.197(1-2)，85-95，1996；禾口6.Kumar等，Immune-.Letters65，153-159，1999，其以提述的方式并入本文。本發(fā)明的單克隆抗體還包括由本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體。根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體還可為單克隆雜偶合體(heteroconjugate)，(即，兩種或更多種抗體分子的雜合體)。在另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體是嵌合的單克隆抗體。在一個(gè)方法中，所述嵌合的單克隆抗體通過(guò)從小鼠抗KARI產(chǎn)生細(xì)胞克隆包含啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列(leader)和可變區(qū)序列的重組DNA并從人抗體基因克隆恒定區(qū)外顯子來(lái)進(jìn)行工程改造。由上述重組基因編碼的抗體是小鼠-人嵌合體。其抗體特異性由來(lái)源于小鼠序列的可變區(qū)確定。其同種型由恒定區(qū)確定，來(lái)源于人DNA。在另一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體是“人源化的”單克隆抗體，其通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的多種方法之任一而產(chǎn)生。即，將小鼠互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)從小鼠Ig的重V鏈和輕V鏈轉(zhuǎn)移至人的V域，然后用一些人殘基在框架區(qū)替換其小鼠中對(duì)應(yīng)殘基。根據(jù)本發(fā)明的“人源化的”單克隆抗體特別適用于體內(nèi)診斷和治療方法。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體及其片段根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的體外和體內(nèi)方法進(jìn)行增殖。體外增殖在合適的培養(yǎng)基(如Dulbecco氏改良fegle培養(yǎng)基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)或RPMI1640培養(yǎng)基)中進(jìn)行，任選地補(bǔ)充以哺乳動(dòng)物血清(如胎牛血清)或痕量元素和維持生長(zhǎng)的附加劑(supplement)(例如，飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercell),如正常小鼠腹膜滲出物細(xì)胞，脾細(xì)胞，骨髓巨噬細(xì)胞等)。體外產(chǎn)生提供相對(duì)較純的抗體制備物，并使得給出大量所需抗體的規(guī)模放大(scale-up)成為可能。供在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，且包括均一懸液培養(yǎng)(homogenoussuspensionculture)(例如,在氣升式反應(yīng)器或在持續(xù)攪拌反應(yīng)器(continuousstirrerreactor)中或固定或截留的(entrapped)細(xì)胞培養(yǎng))。大量本發(fā)明的單克隆抗體亦可通過(guò)在體內(nèi)增殖雜交瘤細(xì)胞來(lái)獲得。將細(xì)胞克隆注射入與親細(xì)胞組織相容的哺乳動(dòng)物(例如，同基因小鼠)，以引起抗體產(chǎn)生腫瘤的生長(zhǎng)。任選地，在注射之前，用烴類，特別是油(如Pristane(四甲基十五烷))使所述動(dòng)物預(yù)備(primed)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的單克隆抗體的片段從上述產(chǎn)生的單克隆抗體獲得，其方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通過(guò)化學(xué)還原來(lái)剪切二硫鍵?；蛘?，本發(fā)明涵蓋的單克隆抗體片段是使用自動(dòng)肽合成儀合成的，或其可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)手動(dòng)產(chǎn)生。本發(fā)明的單克隆偶合物通過(guò)本領(lǐng)域已知方法制備，例如，通過(guò)將如上所述制備的單克隆抗體與例如酶，在偶聯(lián)劑(如戊二醛或高碘酸)的存在下反應(yīng)。與熒光素標(biāo)志物的偶合物是在這些偶聯(lián)劑的存在下，或通過(guò)與異硫氰酸酯反應(yīng)制備的。與金屬螯合物的偶合物是類似地產(chǎn)生的。其他抗體可偶合的部分包括放射性核素，例如，3H、125I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe、75Se和152Eu。本發(fā)明明確地包括偶聯(lián)于任何可檢測(cè)的配體或試劑的抗體，所述配體或試劑包括例如，酶(如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酯酶)、或熒光團(tuán)、放射性核素、有色染料、金微粒、膠體金等。本發(fā)明的放射性標(biāo)記的單克隆抗體通過(guò)本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生。例如，將單克隆抗體通過(guò)與碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑(如次氯酸鹽)，或酶氧化劑(如乳過(guò)氧化物酶)相接觸來(lái)碘化。根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體可用锝“通過(guò)配體交換方法來(lái)標(biāo)記，例如，通過(guò)用亞錫溶液還原高锝酸鹽(pertechnate)，將還原的锝螯合在S印hadex柱上，并將抗體施于該柱，或者，通過(guò)直接標(biāo)記技術(shù)來(lái)標(biāo)記(例如，通過(guò)將高锝酸鹽，還原劑如SNCl2,緩沖溶液如酞酸鈉_鉀溶液和所述抗體一同溫育)。可使用任何免疫測(cè)定法以監(jiān)測(cè)由KARI蛋白或其免疫原性片段或表位引起的抗體產(chǎn)生。免疫測(cè)定法就其最簡(jiǎn)單和直接的方面而言，是結(jié)合測(cè)定法。一些優(yōu)選的免疫測(cè)定法是多種類型的本領(lǐng)域已知的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和放射性免疫測(cè)定法(RIA)。使用組織切片的免疫-組織化學(xué)檢測(cè)也是特別有用的。然而，應(yīng)容易地理解，檢測(cè)方法并不僅限于上述技術(shù)，且還可使用Western印跡、斑點(diǎn)印跡、FACS分析等。更優(yōu)選地，所述測(cè)定法能夠產(chǎn)生定量結(jié)果。舉例而言，在簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)試。將結(jié)合于B細(xì)胞表位的已知抗體制備物和測(cè)試抗體與包含該B細(xì)胞表位(在此背景下其優(yōu)選為天然抗原)的抗原組合物一同溫育。本文中使用的“抗原組合物”指任何包含某些可接近的(accessible)形式的B細(xì)胞表位形式的任何組合物。特別優(yōu)選抗原包被的ELISA板孔。在一個(gè)實(shí)施例中，將已知抗體在施于抗原組合物之前與多種量的測(cè)試抗體(例如，1l(v/v)U10(v/v)和1100(v/v))預(yù)混合一段時(shí)間。如果已知抗體中的一種經(jīng)標(biāo)記，可直接檢測(cè)結(jié)合于所述抗原的標(biāo)記；將其與未混合的樣品測(cè)定相比較將確定測(cè)試抗體的競(jìng)爭(zhēng)程度，并因此確定相互反應(yīng)性。或者，能夠使用對(duì)已知或測(cè)試抗體具特異性的二抗確定競(jìng)爭(zhēng)程度。結(jié)合于所述抗原組合物的抗體能夠有效的與已知抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，因此會(huì)顯著地減少后者的結(jié)合。用已知抗體在不存在任何測(cè)試抗體時(shí)的反應(yīng)性作為對(duì)照。在測(cè)試抗體存在下反應(yīng)性的顯著減少表明測(cè)試抗體結(jié)合于B細(xì)胞表位(即，其與已知抗體交叉反應(yīng))。在一個(gè)示例性ELISA中，將結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性片段或B細(xì)胞表位的抗體固定于顯示蛋白親和性的受選表面，如聚苯乙烯微滴定板中的孔。然后，將包含含B細(xì)胞表位的肽的組合物添加至孔。在結(jié)合并洗滌去除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物之后，可檢測(cè)出結(jié)合的表位。檢測(cè)通常通過(guò)添加已知結(jié)合于所述B細(xì)胞表位并連接于可檢測(cè)的標(biāo)記的第二抗體來(lái)達(dá)成。該類型的ELISA是簡(jiǎn)單的“夾心ELISA”。檢測(cè)也可通過(guò)添加所述第二抗體，然后添加對(duì)第二抗體具有結(jié)合親和性的第三抗體來(lái)達(dá)成，其中所述第三抗體連接于可檢測(cè)的標(biāo)記。在一個(gè)替代性實(shí)施例(即，擴(kuò)增ELISA)中，將結(jié)合于KARI蛋白或免疫原性片段或B細(xì)胞表位的抗體固定于顯示蛋白親和性的受選表面，如聚苯乙烯微滴定板中的孔。然后，將包含含B細(xì)胞表位的肽的組合物添加至孔。在結(jié)合并洗滌去除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物之后，將結(jié)合于B細(xì)胞表位的抗體與結(jié)合的肽在足以形成復(fù)合物的條件下接觸一段時(shí)間。然后使用二抗，和優(yōu)選三抗進(jìn)行擴(kuò)增，所述抗體結(jié)合于識(shí)別B細(xì)胞表位的抗體。然后通過(guò)添加已知結(jié)合于所述二抗或三抗并連接于可檢測(cè)標(biāo)記的抗體來(lái)達(dá)成檢測(cè)。在另一個(gè)示例性的，適用于流通(flow-through)和固相ELISA的免疫測(cè)定法形式，將結(jié)合于免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或B細(xì)胞表位的抗體固定于顯示蛋白親和性的受選表面，如聚苯乙烯微滴定板的孔或者柱。將所述抗體結(jié)合的包含含所述B細(xì)胞表位的免疫原性KARI蛋白或免疫原性肽或免疫原性片段的樣品在足以形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下添加一段時(shí)間。在此情況下，添加的KARI蛋白、肽或片段與人Ig復(fù)合。舉例而言，在患者血清的情況下，所述肽優(yōu)選與人Ig依賴于患者針對(duì)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的免疫應(yīng)答而復(fù)合。在結(jié)合并洗滌去除非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物之后，通過(guò)添加已知在所述免疫復(fù)合物中結(jié)合于人Ig并連接于可檢測(cè)標(biāo)記的第二抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合的表位。此為修飾的“夾心ELISA”。還可通過(guò)添加所述第二抗體，然后添加對(duì)于所述第二抗體具有結(jié)合親和性的第三抗體來(lái)達(dá)成檢測(cè)，其中所述第三抗體連接于可檢測(cè)的標(biāo)記。本發(fā)明的抗體可結(jié)合于固體支持物和/或在合適的容器中與合適的試劑、對(duì)照、說(shuō)明書(shū)等一同包裝于試劑盒。結(jié)合于次級(jí)分析物的抗體應(yīng)理解本文中上述供產(chǎn)生針對(duì)KARI蛋白或其免疫原性片段產(chǎn)生抗體的方法可根據(jù)情況適當(dāng)變動(dòng)以適用于產(chǎn)生針對(duì)次級(jí)分析物的抗體，其用于免疫測(cè)定法形式，例如，為了對(duì)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病進(jìn)行診斷或預(yù)后的目的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，上述外推依賴于用KARI蛋白免疫原取代所述次級(jí)分析物，例如根據(jù)本文中任何實(shí)施例的結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白或GS蛋白或S9蛋白或其免疫原性片段，或所述肽或表位或片段的組合或混合物。上述取代可根據(jù)本文的公開(kāi)方便地?zé)o需任何不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試而進(jìn)行。為方便起見(jiàn)，優(yōu)選的供產(chǎn)生針對(duì)次級(jí)分析物(例如，用于多分析物基于抗原的測(cè)試)的抗體的免疫接種肽，包含選自下組的氨基酸序列SEQIDN0:3-60所述的氨基酸序列和其組合或混合物。舉例而言，結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的抗體可根據(jù)其全長(zhǎng)蛋白(例如，包含SwissProtDatabase登錄號(hào)053759中所述的序列)或其肽片段來(lái)制備，所述肽片段包括例如選自下組的序列MRQLAERSGVSNPYL(SEQIDNO3)、ERGLRKPSADVLSQI(SEQIDNO:4)、LRKPSADVLSQIAKA(SEQIDNO5)、PSADVLSQIAKALRV(SEQIDNO:6)、SQIAKALRVSAEVLY(SEQIDNO7),AKALRVSAEVLYVRA(SEQIDNO:8)、VRAGILEPSETSQVR(SEQIDNO:9)、TAITERQKQILLDIY(SEQIDNO10)、SQIAKALRVSAEVLYVRAC(SEQIDNO:11)、MSSEEKLCDPTPTDD(SEQIDNO:12)和VRAGILEPSETSQVRC(SEQIDNO13)及其組合。結(jié)合于免疫原性結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白或肽以供檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的抗體也詳細(xì)描述于本申請(qǐng)人提交于2005年4月19日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/001254(W02006/01792)，其公開(kāi)以提述的方式并入本文。作為替代或附加手段，所述抗體結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白(例如，包含SwissProtDatabase登錄號(hào)033342中所述的序列)或來(lái)源于該蛋白的免疫原性肽，所述免疫原性肽例如包含GS蛋白表面暴露區(qū)，或包含序列RGTDGSAVFADSNGPHGMSSMFRSF(SEQIDNO:57)或WASGYRGLTPASDYNIDYAI(SEQIDNO58)或其組合。結(jié)合于免疫原性結(jié)核分枝桿菌GS或肽以供檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的抗體也詳細(xì)描述于本申請(qǐng)人提交于2005年6月24日的國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/AU2005/000930(W02006/000045)，其公開(kāi)以提述的方式并入本文。本發(fā)明明確地考慮了針對(duì)除了BSX或GS或S9或其免疫原性片段之外的次級(jí)分析物的抗體，對(duì)其描述僅就例示的目的而提供。供檢測(cè)結(jié)核病或結(jié)核分枝桿菌感染的診斷/預(yù)后方法1.基于抗原的測(cè)定法本發(fā)明提供了在受試者中診斷由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中樣品中所述蛋白或免疫原性片段或表位的存在指示感染。檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗原，而非基于抗體的測(cè)定法的一個(gè)好處是，嚴(yán)重免疫妥協(xié)的患者可能并不產(chǎn)生可檢測(cè)水平的抗體，且在任何患者中抗體的水平并不反應(yīng)桿菌負(fù)載(bacilliburden)。在另一方面，抗原水平應(yīng)反應(yīng)桿菌負(fù)載，且作為所述桿菌的產(chǎn)物，為直接檢測(cè)其存在的方法。在本發(fā)明的診斷測(cè)定法的一個(gè)實(shí)施例中，提供了在受試者中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，所述方法包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與能夠結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體相接觸，并檢測(cè)抗原_抗體復(fù)合物的形成。優(yōu)選地，懷疑所述受試者罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，和/或有形成結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)，或有受結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于在受試者中確定由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的進(jìn)展。依照本發(fā)明的這些預(yù)后性應(yīng)用，KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在生物樣品中的水平與感染狀態(tài)正相關(guān)。舉例而言，KARI蛋白或其免疫原性片段的水平低于罹患結(jié)核病或感染的癥狀的受試者中可檢測(cè)出的KARI蛋白或片段的水平表明受試者正從感染恢復(fù)。類似地，所述蛋白或片段在來(lái)自受試者的樣品中的水平比健康個(gè)體較高表明所述受試者并未完全擺脫所述疾病或感染。相應(yīng)地，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例提供了確定具有由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)使用治療化合物對(duì)所述結(jié)核病或感染進(jìn)行治療的反應(yīng)的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中相比在正常或健康的受試者中可檢測(cè)出的所述蛋白或片段或表位增強(qiáng)水平的所述蛋白或片段或表位表明所述受試者并未響應(yīng)所述治療，或尚未完全擺脫疾病或感染。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了確定具有由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)使用治療化合物對(duì)所述結(jié)核病或感染進(jìn)行治療的反應(yīng)的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中所述蛋白或片段或表位的水平低于在罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病中可檢測(cè)出的蛋白或片段或表位的水平表明所述受試者響應(yīng)所述治療，或已經(jīng)完全擺脫了疾病或感染。明確而言，如果KARI蛋白或其片段或表位的水平在受試者中無(wú)法檢測(cè)出，則所述受試者對(duì)治療有反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，將來(lái)源于患者的生物樣品中的KARI蛋白的量與在之前來(lái)源于相同患者的生物樣品中檢測(cè)的相同蛋白的量進(jìn)行比較。如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，該方法可用于持續(xù)地監(jiān)測(cè)具有潛在感染的患者或形成結(jié)核病的患者。以此方法，可就感染或疾病的發(fā)作或進(jìn)展對(duì)患者進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其目標(biāo)為在感染確立之前就開(kāi)始治療，特別是對(duì)于HIV+的個(gè)體。作為替代或附加手段，可將在來(lái)源于罹患結(jié)核病的受試者的生物樣品中檢測(cè)的蛋白的量與參照樣品比較，其中所述參照樣品來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)不再罹患感染或疾病的結(jié)核病患者，或一個(gè)或多個(gè)最近接受了成功的對(duì)感染治療的結(jié)核病患者，和/或一個(gè)或多個(gè)不再具有結(jié)核病并不再罹患感染或疾病的受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，未在參照樣品中檢測(cè)出KARI蛋白或其免疫原性片段，然而，在患者樣品中檢測(cè)出了所述KARI蛋白或其免疫原性片段，表明所述樣品來(lái)源的患者正罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，或?qū)l(fā)生急性感染。或者，KARI蛋白或其免疫原性片段的量與參照樣品中檢測(cè)出的水平相比可以是增強(qiáng)的。同樣，這表明所述生物樣品所分離自的患者正罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，或會(huì)發(fā)生急性感染。在本文中描述的診斷/預(yù)后方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述生物樣品是之前從所述受試者獲得的。依照上述實(shí)施例，所述預(yù)后或診斷方法是離體進(jìn)行的。還在另一個(gè)實(shí)施例中，本主題診斷/預(yù)后方法還包括加工來(lái)自受試者的樣品以產(chǎn)生包括所述分析物的衍生物或提取物(例如，胸膜液或痰或血清)。合適的樣品包括來(lái)自下述組織的提取物如腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉和骨組織，或體液，如痰、血清、血漿、全血、血清或胸膜液。優(yōu)選地，所述生物樣品是選自下組的體液或組織樣品唾液、血漿、血、血清、痰、尿液和肺。并不排除其他樣品。從本文的描述，顯而易見(jiàn)優(yōu)選的樣品可包含下述循環(huán)的免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物包含與人免疫球蛋白復(fù)合的KARI蛋白或其片段。檢測(cè)上述免疫復(fù)合物明確地落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。依照該實(shí)施例，捕捉試劑例如用于捕捉KARI抗原(KARI蛋白、多肽或其免疫活性的片段或表位)的捕捉抗體除了與受試者循環(huán)中的分離的抗原復(fù)合之外，還與所述受試者的免疫球蛋白復(fù)合。抗Ig抗體，任選地偶合于可檢測(cè)的標(biāo)記，用于特異性的結(jié)合被捕獲的CIC，由此檢測(cè)CIC患者樣品。在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，所述抗Ig抗體優(yōu)先結(jié)合于樣品中的IgM、IgA或IgG。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，所述抗Ig抗體結(jié)合于人Ig，例如人IgA、人IgG或人IgM。所述抗Ig抗體可偶合于本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)的可檢測(cè)標(biāo)記。這對(duì)于檢測(cè)由病原體(例如，細(xì)菌或病毒)造成的感染，或?qū)τ谠\斷任何與CIC相關(guān)的疾病或病癥是特別有用的。相應(yīng)地，可對(duì)根據(jù)本文中任何實(shí)施例描述的診斷方法進(jìn)行修飾，其中來(lái)源于所述受試者的樣品包含一種或多種下述循環(huán)免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物包含結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白或其一種或多種免疫原性KARI肽、片段或表位的免疫球蛋白(Ig)，且其中檢測(cè)抗原_抗體復(fù)合物的形成包括將抗-Ig抗體與所述循環(huán)免疫復(fù)合物免疫球蛋白部分在足以形成復(fù)合物的條件下相接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)結(jié)合的抗-Ig抗體。本發(fā)明明確地涵蓋供診斷由結(jié)核分枝桿菌造成的感染的多分析物測(cè)試。舉例而言，供檢測(cè)結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體的測(cè)定法可與供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌BSX或谷氨酰胺合成酶(GS)蛋白的測(cè)定法組合。在此方面，本發(fā)明人還產(chǎn)生了下述漿細(xì)胞瘤，所述漿細(xì)胞瘤產(chǎn)生結(jié)合于BSX或GS的免疫原性片段或肽或表位的單克隆抗體。2.基于抗體的測(cè)定法本發(fā)明提供了在受試者中診斷由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體，其中所述抗體在樣品中的存在指示感染。所述感染可為過(guò)去的或現(xiàn)在的感染，或潛在感染。優(yōu)選地，懷疑所述受試者罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，和/或有形成結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)，和/或有受結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)?；诳贵w的測(cè)定法主要用于檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌造成的活動(dòng)感染(activeinfection)0優(yōu)選地，考慮受試者的臨床史，因?yàn)樵谟山Y(jié)核分枝桿菌造成的最近過(guò)去的感染或慢性感染中可能存留殘余的抗體水平。該形式是廉價(jià)并高度敏感的，然而，對(duì)于在免疫妥協(xié)的個(gè)體中檢測(cè)感染并不像基于抗原的測(cè)定法形式一樣有用。然而，基于抗體的測(cè)定法顯然可用于在HIV—或非免疫妥協(xié)的HIV+個(gè)體中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在受試者中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的方法，所述方法包括將來(lái)源于受試者的生物樣品與KARI蛋白或其免疫原性片段或表位相接觸并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。在本文中所述的基于抗體的測(cè)定法中，優(yōu)選用于檢測(cè)所述抗體的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位與來(lái)自未受感染的受試者并無(wú)高度交叉反應(yīng)性。相應(yīng)地，分離的或重組的KARI優(yōu)選用于本文中所述的基于抗體的平臺(tái)。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的診斷測(cè)定法可用于確定受試者中由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的進(jìn)展。依照本發(fā)明的這些預(yù)后性應(yīng)用，在來(lái)自受試者的血液或血清、血漿或免疫球蛋白級(jí)分中結(jié)合于KARI蛋白或片段或表位的抗體的量與感染狀態(tài)正相關(guān)。舉例而言，針對(duì)其的抗KARI蛋白的水平低于在罹患結(jié)核病或感染的癥狀的受試者中可檢測(cè)出的抗KARI蛋白抗體的水平表明所述受試者正從感染恢復(fù)。類似地，所述抗體在來(lái)自受試者的樣品中比健康個(gè)體高的水平表明所述受試者并未完全擺脫所述疾病或感染。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了確定具有由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)使用治療化合物對(duì)所述結(jié)核病或感染進(jìn)行治療的反應(yīng)的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體，其中相比在正常或健康的受試者中可檢測(cè)出的抗體水平增強(qiáng)的抗體的水平表明所述受試者并未響應(yīng)所述治療或并未完全擺脫疾病或感染。同樣，優(yōu)選分離的或重組的KARI蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了確定具有由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者對(duì)使用治療化合物對(duì)所述結(jié)核病或感染進(jìn)行治療的反應(yīng)的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體，其中所述抗體的水平低于在罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的受試者中可檢測(cè)出的抗體的水平表明所述受試者對(duì)所述治療有反應(yīng)或已經(jīng)完全擺脫了疾病或感染。在來(lái)自罹患結(jié)核病的受試者的生物樣品中檢測(cè)出的針對(duì)KARI蛋白或片段的抗體的量可與參照樣品相比較，其中所述參照樣品來(lái)源于一個(gè)或多個(gè)之前并未感染結(jié)核分枝桿菌或最近并未感染結(jié)核分枝桿菌的健康受試者。上述陰性對(duì)照受試者會(huì)具有低的循環(huán)抗體效價(jià)，這使其成為基于抗體的測(cè)定法形式中合適的標(biāo)樣。舉例而言，結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段的抗體無(wú)法在所述參照樣品中檢測(cè)出，且僅在患者樣品中檢測(cè)出，表明所述樣品來(lái)源的患者正罹患由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病，或會(huì)發(fā)生急性感染。分離的或重組的KARI蛋白優(yōu)選用于上述實(shí)施例。在本文中所述的診斷/預(yù)后方法的一個(gè)實(shí)施例中，所述生物樣品是之前從所述受試者獲得的。依照上述實(shí)施例，所述預(yù)后或診斷方法是離體進(jìn)行的。還在另一個(gè)實(shí)施例中，本主題的診斷/預(yù)后方法還包括加工來(lái)自所述受試者的樣品以產(chǎn)生包含所述分析物的衍生物或提取物(例如，血、血清、血漿或任何含免疫球蛋白的樣品)。合適的樣品包括，例如，來(lái)自包含免疫球蛋白的組織(如血、骨)的提取物，或體液如血清、血漿、全血、血清的含免疫球蛋白的級(jí)分、血漿的含免疫球蛋白的級(jí)分、血的含免疫球蛋白的級(jí)分。3.檢測(cè)系統(tǒng)本文中考慮到的優(yōu)選的檢測(cè)系統(tǒng)包括任何已知用于在從人受試者分離的生物樣品中檢測(cè)蛋白或抗體的測(cè)定法，例如，SDS/PAGE，等電聚焦，二維凝膠電泳包括SDS/PAGE和等電聚焦，免疫測(cè)定法，使用抗體或蛋白的非抗體配體的基于檢測(cè)的系統(tǒng)，所述配體例如小分子(例如，化合物、蛋白的激動(dòng)劑、拮抗劑、變構(gòu)調(diào)節(jié)劑(allostericmodulator)、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)。依照這些實(shí)施例，所述抗體或小分子可用于任何適用于檢測(cè)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)的固相或溶液相測(cè)定法形式。本發(fā)明明確地涵蓋光學(xué)或熒光檢測(cè)，例如，使用質(zhì)譜法、MALDI-T0F、生物傳感技術(shù)(biosensortechnology)、瞬時(shí)的光纖(evanescentfiberoptics)、或熒光共振能量轉(zhuǎn)移。特別涵蓋了適用于高通量篩選大量樣品的測(cè)定系統(tǒng)，特別是高通量光譜共振方法(例如，MALDI-T0F、電噴射MS或納米電噴射(nano-electrospray)MS)。特別優(yōu)選免疫測(cè)定法形式，例如，選自下組的免疫測(cè)定法免疫印跡、Western印跡、斑點(diǎn)印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫測(cè)定法(RIA)酶免疫測(cè)定法。使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、同位素編碼親和標(biāo)記(ICAT)、質(zhì)譜(例如基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflight，MALDI-T0F)、電噴射電離(ESI)、生物傳感技術(shù)、瞬時(shí)的光纖技術(shù)或蛋白芯片技術(shù)的修飾的免疫測(cè)定法也是有用的。優(yōu)選地，所述測(cè)定法是半定量測(cè)定法或定量測(cè)定法。標(biāo)準(zhǔn)的固相ELISA形式對(duì)確定來(lái)自多個(gè)患者樣品的蛋白或抗體的濃度是特別有用的。在一種形式，如一種測(cè)定法中，涉及將包含抗KARI蛋白抗體的生物樣品，或者KARI蛋白或其免疫原性片段固定于固體基質(zhì)上，例如，聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或浸漬片、膜或玻璃支持物(例如，玻璃載玻片)上。在基于抗原的測(cè)定法的情況下，將特異性結(jié)合KARI蛋白的固定的抗體與所述生物樣品直接接觸，并與其在所述樣品中的任何靶蛋白形成直接鍵合。對(duì)于基于抗體的測(cè)定法，將固定的分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位與所述生物樣品接觸。在溶液中添加的抗體或蛋白通常用可檢測(cè)的報(bào)道分子標(biāo)記，例如，膠體金、熒光標(biāo)記(例如FITC或TexasRed)或酶(例如，辣根過(guò)氧化物酶(HRP))，堿性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)。作為替代或附加手段，可使用結(jié)合于第一抗體或所述分離的/重組的KARI抗原的第二標(biāo)記抗體。在洗滌去除任何未結(jié)合的抗體或KARI抗原之后，所述標(biāo)記可直接檢測(cè)(在熒光標(biāo)記的情況下)，或通過(guò)添加底物來(lái)檢測(cè)，所述底物例如過(guò)氧化氫、TMB或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(x-gal)。上述基于ELISA的系統(tǒng)特別適用于對(duì)樣品中蛋白或抗體的量進(jìn)行定量，例如，通過(guò)將檢測(cè)系統(tǒng)針對(duì)已知量的標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn)。在另一種形式中，ELISA由將特異性結(jié)合KARI蛋白的抗體固定于固體基質(zhì)(例如，膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯浸漬片或玻璃支持物)上組成。然后使患者樣品與所述抗體產(chǎn)生物理聯(lián)系，樣品中的抗原被結(jié)合或“被捕獲(captured)”。然后可使用標(biāo)記的抗體檢測(cè)結(jié)合的蛋白。舉例而言，如果所述蛋白是從人樣品中捕獲的，則使用抗人Ig抗體來(lái)檢測(cè)被捕獲的蛋白。本發(fā)明的該實(shí)施例的一個(gè)實(shí)施例包括(i)將特異性結(jié)合免疫原性KARI肽或KARI蛋白的抗體固定于固體基質(zhì)或支持物上；(ii)將結(jié)合的抗體與從受試者獲得的樣品在足以使得被固定的抗體結(jié)合于樣品中的KARI蛋白或其片段并由此形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下相接觸一段時(shí)間，優(yōu)選所述樣品為含抗體的樣品，如血、血清或其含Ig的級(jí)分；和(iii)在下述方法中檢測(cè)形成的抗原-抗體復(fù)合物，所述方法包括將所述復(fù)合物與識(shí)別人Ig的抗體相接觸，其中所述人Ig的存在表明結(jié)核分枝桿菌在患者樣品中的存在。依據(jù)該實(shí)施例，固定的抗體的特異性保證分離的或經(jīng)免疫復(fù)合的KARI蛋白或包含所述抗體識(shí)別的表位的片段實(shí)際上結(jié)合，而抗人Ig的特異性保證僅檢測(cè)經(jīng)免疫復(fù)合的KARI蛋白或片段。在此語(yǔ)境下，術(shù)語(yǔ)“經(jīng)免疫復(fù)合的(immime-complexed)”應(yīng)指患者樣品中KARI蛋白或其片段與人Ig(如人IgA或人IgM或人IgG等)復(fù)合。相應(yīng)地，該實(shí)施例對(duì)檢測(cè)在受試者中產(chǎn)生了免疫應(yīng)答的結(jié)核分枝桿菌的存在或由結(jié)核分枝桿菌造成的感染的存在是特別有用的。通過(guò)適當(dāng)?shù)剡x取檢測(cè)抗體，例如，抗人IgA或抗人IgG或者抗人IgM，還可以確定所述受試者免疫應(yīng)答涉及的同種型。上述結(jié)合于人IgA、IgM或IgG的抗體檢測(cè)對(duì)于本領(lǐng)域而言是公眾可獲得的。作為前述實(shí)施例的替代或附加手段，可使用結(jié)合第二(檢測(cè))抗體的第三標(biāo)記抗體。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)本文中所述的測(cè)定法形式可適用于高通量形式，例如篩選方法的自動(dòng)化，或適用于微點(diǎn)陣形式，如描述于Mendoza等，Biotechniques27(4)77778-788,1999的。此外，上述測(cè)定法的變化(例如，競(jìng)爭(zhēng)性ELISA)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的?；蛘?，抗-KARI蛋白抗體，或者KARI蛋白或其免疫原性片段的存在，是使用放射性免疫測(cè)定法(RIA)檢測(cè)的。該測(cè)定法的基本原理是使用放射性標(biāo)記的抗體或抗原以檢測(cè)抗體抗原相互作用。舉例而言，特異性結(jié)合于KARI蛋白的抗體可結(jié)合于固體支持物，且將生物樣品與所述抗體直接接觸。為了檢測(cè)結(jié)合的抗原，將經(jīng)放射性標(biāo)記的分離和/或重組形式的抗原與相同的抗體相接觸。在洗滌之后，檢測(cè)結(jié)合的放射性強(qiáng)度的量。因?yàn)樯飿悠分械娜魏慰乖种平?jīng)放射性標(biāo)記的抗原的結(jié)合，檢測(cè)出的放射性強(qiáng)度的量與樣品中抗原的量成反比。上述測(cè)定法可通過(guò)使用利用遞增的已知濃度的分離抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)量化。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，上述測(cè)定法可經(jīng)修飾以使用任何報(bào)道分子替換放射性標(biāo)記，所述報(bào)道分子，例如，酶或熒光分子。Western印跡也可用于檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段。在上述測(cè)定法中，來(lái)自生物樣品的蛋白使用十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來(lái)分離，所述技術(shù)描述于，例如Scopes(In=ProteinPurificationPrinciplesandPractice,ThirdEdition，SpringerVerlag，1994)。然后將分離的蛋白使用本領(lǐng)域眾所周知的方法(例如電轉(zhuǎn)移)轉(zhuǎn)移至固體支持物，例如，膜，或更具體地，硝酸纖維素膜、尼龍膜或PVDF膜。然后將該膜封閉，并用特異性結(jié)合KARI蛋白的標(biāo)記的抗體或配體探測(cè)。或者，可使用標(biāo)記的第二或甚至第三抗體或配體以檢測(cè)特異性一抗的結(jié)合。特別優(yōu)選供檢測(cè)抗-KARI蛋白抗體，或者KARI蛋白或其免疫原性片段存在與否的高通量方法。在一個(gè)實(shí)施例中，使用質(zhì)譜法(例如MALDI-T0F)以供快速鑒定經(jīng)一維或二維凝膠電泳分離的蛋白。相應(yīng)地，無(wú)需使用特異性結(jié)合于目標(biāo)蛋白的抗體或配體以檢測(cè)目標(biāo)蛋白。相反，使用凝膠電泳使用本領(lǐng)域已知方法分離來(lái)自生物樣品的蛋白，并使用MALDI-T0F分析在大約正確分子量和/或等電點(diǎn)的那些蛋白以確定目標(biāo)蛋白的存在與否?；蛘?，使用質(zhì)譜法(例如，MALDI或ESI，或方法的組合)以確定特定蛋白在生物樣品(例如痰)中的濃度。上述蛋白優(yōu)選之前就其參數(shù)(如分子量和等電點(diǎn))已經(jīng)被良好地表征。生物傳感裝置通常將電極表面與整合入裝置的電流或阻抗測(cè)定元件的組合與測(cè)定底物組合使用(如描述于美國(guó)專利號(hào)5，567，301中的)。優(yōu)選將特異性結(jié)合于目標(biāo)蛋白的抗體摻入生物傳感裝置的表面，并將從患者分離的生物樣品(例如，使用本文中所述的方法溶解的痰)與所述裝置相接觸。由所述生物傳感裝置檢測(cè)到的電流或阻抗的變化表明蛋白結(jié)合于所述抗體或配體。本領(lǐng)域中已知的一些形式的生物傳感器亦依賴于質(zhì)子表面共振(surfac印lasmonresonance)以檢測(cè)蛋白相互作用，其中質(zhì)子表面共振表面反射的變化指示蛋白結(jié)合于配體或抗體(美國(guó)專利號(hào)5，485，277和5，492，840號(hào))。由于將上述系統(tǒng)應(yīng)用于微米或納米尺度的便利性，生物傳感器特別適用于高通量分析。此外，上述系統(tǒng)可方便地應(yīng)用于合并幾種檢測(cè)試劑，使得在單一生物傳感器單元中并行處理多個(gè)診斷試劑成為可能。這使得同時(shí)檢測(cè)少量體液中的幾種表位成為可能。還優(yōu)選瞬時(shí)的生物傳感器(evanescentbiosensor)，因其無(wú)需在檢測(cè)目標(biāo)蛋白之前預(yù)處理生物樣品。瞬時(shí)的生物傳感器通常依賴于具預(yù)決波長(zhǎng)的光與熒光分子(例如，附加于探針表面附近的熒光抗體)的相互作用，以在診斷性蛋白結(jié)合于抗體或配體時(shí)發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光。為了產(chǎn)生蛋白芯片，將能夠結(jié)合特定抗體或目標(biāo)蛋白的蛋白、肽、多肽、抗體或配體結(jié)合于固體支持物(例如玻璃、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、金屬或氮化硅)。該固定過(guò)程是直接的(例如，通過(guò)共價(jià)連接，例如，Schiff堿形成、二硫鍵連接或酰胺或尿鍵形成)或間接的。生成蛋白芯片的方法在本領(lǐng)域是已知的，并描述于，例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0020136821,20020192654,20020102617和美國(guó)專利號(hào)6，391，625。為了將蛋白結(jié)合于固體支持物，常常需要處理所述固體支持物從而在其表面形成化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)，例如，用含醛的硅烷試劑處理。或者，可將抗體或配體捕獲在微加工的(microfabricated)聚丙烯酰胺凝膠墊上，并使用如描述于Arenkov等Anal.Biochem.278:123_131，2000的微電泳加速進(jìn)入凝膠中。優(yōu)選如此生成蛋白芯片，從而使得幾種蛋白、配體或抗體排列在所述芯片上。該形式使得同時(shí)在樣品中篩選幾種蛋白的存在成為可能。或者，蛋白芯片可僅包含一種蛋白、配體或抗體，并用于就一種目標(biāo)多肽的存在篩選一個(gè)或多個(gè)患者樣品。上述芯片還可用于就目標(biāo)多肽同時(shí)篩選一個(gè)陣列的患者樣品。優(yōu)選地，將待使用蛋白芯片分析的樣品附于報(bào)道分子，例如可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)出的熒光分子、放射性分子、酶或抗體。相應(yīng)地，通過(guò)將蛋白芯片與標(biāo)記樣品相接觸，并隨后洗滌去除任何未結(jié)合的蛋白，可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法(例如，使用DNA微點(diǎn)陣讀數(shù)器(DNAmicroarrayreader)檢測(cè)結(jié)合的蛋白的存在。或者，使用生物分子相互作用分析-質(zhì)譜法(biomolecularinteractionanalysis-massspectrometry,ΒΙΑ-MS)ftjSjft^IlJ^^ΕISMM飛摩爾(fmol)水平存在于復(fù)雜生物樣品中的蛋白(Nelson等Electrophoresis21:1155-1163,2000)。一種在分析蛋白芯片中有用的技術(shù)是用表面增強(qiáng)的激光解吸/電離飛τWIeOMiHfe(surfaceenhancedlaserdesorption/ionization-timeofflight-massspectrometry,SELDI-T0F-MS)技術(shù)以表征結(jié)合于所述蛋白芯片的蛋白。或者，所述蛋白芯片是使用ESI如描述于美國(guó)專利申請(qǐng)20020139751來(lái)進(jìn)行分析的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，蛋白芯片特別適用于并行處理多種檢測(cè)試劑。相應(yīng)地，可將分別能夠特異性結(jié)合于不同肽或蛋白的幾種抗體或配體結(jié)合于所述蛋白芯片的不同區(qū)域。使用所述芯片分析生物樣品便使得檢測(cè)多種目標(biāo)蛋白，或KARI蛋白的多個(gè)B細(xì)胞表位成為可能。本發(fā)明特別地考慮了并行處理多種診斷和預(yù)后標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用ICAT或ITRAC分析樣品，基本上如美國(guó)專利申請(qǐng)20020076739所述。該系統(tǒng)依賴于用試劑標(biāo)記來(lái)自一個(gè)來(lái)源(即，健康個(gè)體)的蛋白樣品，并用第二試劑標(biāo)記來(lái)自另一個(gè)來(lái)源(即，結(jié)核病患者)的蛋白樣品，第二試劑與第一試劑在化學(xué)上是同一的，但由于同位素組成在分子量上有所不同。優(yōu)選第一和第二樣品還包含生物素分子。然后將等濃度兩種樣品混合，并通過(guò)親和素親和層析回收肽。然后使用質(zhì)譜法分析樣品。重和輕肽離子之間峰高度的任何差異與生物樣品中蛋白豐度的差異直接相關(guān)。然后，上述蛋白的身份可使用本領(lǐng)域眾所周知的方法確定，例如MALDI-T0F或ESI。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，對(duì)包含抗-KARI蛋白抗體，或者KARI蛋白或其免疫原性片段的生物樣品進(jìn)行二維凝膠電泳。依照該實(shí)施例，優(yōu)選在電泳之前例如通過(guò)離心、過(guò)濾或離心和過(guò)濾的組合去除某些顆粒狀物質(zhì)。然后分離生物樣品中的蛋白。舉例而言，所述蛋白可根據(jù)其電荷使用等電聚焦和/或根據(jù)其分子量進(jìn)行分離。二維分離使得鑒定蛋白的多種同種型成為可能，因?yàn)榫哂邢嗨品肿恿康牡鞍走€通過(guò)其電荷分離。使用質(zhì)譜法，可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于患者樣品中。如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，本文中所述的診斷或預(yù)后測(cè)定法可為多路并行處理的(multiplexed)測(cè)定法。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“多路并行處理”)應(yīng)理解為不僅指在單一樣品中同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種診斷或預(yù)后標(biāo)志物，但還涵蓋在單一樣品中連續(xù)檢測(cè)兩種或更多種診斷或預(yù)后標(biāo)志物、在不同但匹配的樣品中同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種診斷或預(yù)后標(biāo)志物，以及在不同但匹配的樣品中連續(xù)檢測(cè)兩種或更多種診斷或預(yù)后標(biāo)志物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“匹配的樣品”應(yīng)理解為指來(lái)源于相同的初始生物樣品的兩個(gè)或更多個(gè)樣品，或在相同時(shí)間點(diǎn)分離的兩個(gè)或更多個(gè)生物樣品。相應(yīng)地，多路并行處理的測(cè)定法可包括在相同反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)幾個(gè)抗-KARI蛋白抗體和/或KARI表位的測(cè)定法，或者，其可檢測(cè)除了一種或多種抗-KARI蛋白抗體和/或KARI表位之外的其他一種或多種抗原/抗體。本發(fā)明明確地涵蓋供檢測(cè)除了通過(guò)細(xì)胞表面的一種或多種受體檢測(cè)CD4+T輔助細(xì)胞和/或一種或多種HIV-I和/或HIV-2抗原之外檢測(cè)KARI蛋白抗體和KARI表位的多路并行處理方法。上述測(cè)定法對(duì)同時(shí)獲得針對(duì)結(jié)核分枝桿菌和HIV-I和/或HIV-2的共感染的信息，和/或確定具有結(jié)核分枝桿菌的受試者是否免疫妥協(xié)是特別有用的。顯然，上述多路并行處理的測(cè)定法形式可用于監(jiān)測(cè)HIV+/TB+個(gè)體的健康。如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，如果上述測(cè)定法是基于抗體或配體的，則這些抗體均必需在相同條件下起作用。4.生物樣品和參照樣品優(yōu)選地，對(duì)其中KARI蛋白或抗-KARI蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)的生物樣品是選自下組的樣品肺、肺相關(guān)的淋巴樣組織、鼻旁竇、支氣管、細(xì)支氣管、肺泡、呼吸道具纖毛的粘膜上皮、呼吸道的粘膜上皮、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、肺泡襯液(alveolarliningfluid)、痰、粘液、唾液、血液、血清、血漿、尿液、腹膜液、心包液、胸膜液、呼吸道的鱗狀上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、杯形細(xì)胞、肺細(xì)胞(1型或2型)、內(nèi)上皮樹(shù)突狀細(xì)胞(intraepithelialdendriticcell)、PBMC、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或所述組織、液體或細(xì)胞中任意一種或多種的任何含免疫球蛋白的級(jí)分。在一個(gè)實(shí)施例中，生物樣品是之前從受試者獲得的。優(yōu)選地，懷疑所述樣品所獲得自的受試者罹患結(jié)核病或受結(jié)核分枝桿菌感染和/或具有形成結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)和/或具有受結(jié)核分枝桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，生物樣品從受試者通過(guò)選自下組的方法獲得手術(shù)或其他切出方法、吸取(aspiration)體液(如高張生理鹽水或丙二醇)、支氣管肺泡灌洗、支氣管鏡檢查、用玻璃試管、唾液小杯(salivette)(SarstedtAG,Sevelen,Switzerland)、Ora-sure(EpitopeTechnologiesPtyLtd,Melbourne,Victoria,Australia)、omni-sal(SalivaDiagnosticSystems,Brooklyn,NY,USA)搜集唾液和使用本領(lǐng)域眾所周知的任何方法收集血，例如，使用注射器。特別優(yōu)選的生物樣品是痰，其使用例如描述于Gershman，N.H.等，JAl1ergyClinImmune-I，10(4):322_328，1999的方法從患者肺分離。優(yōu)選地，所述痰是咳出的(expectorated)，即天然咳出來(lái)的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，生物樣品是從患者使用本領(lǐng)域眾所周知的方法收集的血中分離出的血漿。在一個(gè)實(shí)施例中，處理生物樣品以裂解所述樣品中的細(xì)胞。上述方法包括使用洗滌劑、酶、反復(fù)凍融所述細(xì)胞、聲處理(sonication)或在玻璃珠的存在下渦旋振蕩所述細(xì)胞，等等。在另一個(gè)實(shí)施例中，處理生物樣品以使得存在于所述樣品的蛋白變性。蛋白變性的方法包括加熱樣品，用2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、N-乙酰基半胱氨酸、洗滌劑或其他化合物(例如，胍或尿素)處理樣品。舉例而言，優(yōu)選使用DTT以供液化痰。還在另一個(gè)實(shí)施例中，處理生物樣品以濃縮所述樣品中的蛋白。濃縮蛋白的方法包括沉淀、凍干、使用漏斗管凝膠(funneltubegel)(TerBushandNovick,JournalofBiomolecularTechniques,10(3)；1999)、超濾或透析。如顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明提供的診斷和預(yù)后方法需要一定程度的定量以確定對(duì)感染或疾病進(jìn)展診斷或預(yù)后的蛋白的量。上述定量可通過(guò)在本文中所述的測(cè)定法中包括合適的參照樣品來(lái)確定，其中所述參照樣品來(lái)源于健康的或正常的個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述參照樣品包含例如來(lái)自之前或最近未經(jīng)感染并未罹患感染或疾病的健康受試者的細(xì)胞、液體或組織。方便地，上述參照樣品是來(lái)自液體或無(wú)需手術(shù)切除或介入來(lái)獲取的組織。相應(yīng)地，優(yōu)選體液及其衍生物。高度優(yōu)選的參照樣品包括痰、粘液、唾液、血液、血清、血漿、尿、BAL液、腹膜液、心包液、胸膜液、PBMC、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或所述組織、液體或細(xì)胞中任意一種或多種的任何含免疫球蛋白的級(jí)分。對(duì)參照樣品和測(cè)試(或患者)樣品進(jìn)行加工、分析或測(cè)定，并比較自參照樣品和測(cè)試樣品獲得的數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)參照樣品和測(cè)試樣品同時(shí)進(jìn)行加工、分析或測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)參照樣品和測(cè)試樣品在不同時(shí)間進(jìn)行加工、分析或測(cè)定。在另一個(gè)實(shí)施例中，測(cè)定法中并不包括參照樣品。作為替代，可從之前生成的確立的數(shù)據(jù)組中推出參照樣品。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施例中，參照樣品包括來(lái)自健康個(gè)體樣本群體研究(samplepopularstudyofhealthyindividuals)的數(shù)據(jù)，例如，對(duì)于經(jīng)測(cè)試的實(shí)體中健康范圍的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著數(shù)據(jù)。然后將從測(cè)試樣品的加工、分析或測(cè)定推出的數(shù)據(jù)與對(duì)于樣品群體獲得的數(shù)據(jù)比較。從足夠大量以致代表群體的參照樣品獲得的數(shù)據(jù)使得生成供確定具體參數(shù)的平均水平的數(shù)據(jù)組成為可能。相應(yīng)地，可對(duì)于個(gè)體的任何群體和對(duì)于來(lái)源于所述個(gè)體的任何樣品確定對(duì)感染或疾病為診斷性或預(yù)后性的蛋白的量，以供隨后與針對(duì)待測(cè)定的樣品確定的表達(dá)產(chǎn)物的水平相比較。當(dāng)依賴于上述經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)組時(shí)，優(yōu)選在每個(gè)進(jìn)行的測(cè)定法中包括內(nèi)部對(duì)照以就變動(dòng)進(jìn)行對(duì)照。診斷性測(cè)定法試劑盒本發(fā)明提供了供在生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒包含⑴一種或多種結(jié)合于KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體；和(ii)供檢測(cè)抗原_抗體復(fù)合物形成的手段。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒包括(i)分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位；和(ii)供檢測(cè)抗原_抗體復(fù)合物形成的手段。本主題試劑盒的抗體、免疫原性KARI肽和檢測(cè)手段優(yōu)選選自本文中上述的抗體和免疫原性KARI肽，且該實(shí)施例應(yīng)自其描述以提述的方式并入本文。對(duì)于任何測(cè)定法形式選取相容的試劑盒組分對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地根據(jù)描述顯而易見(jiàn)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本主題試劑盒包括(i)結(jié)合于分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的抗體；和(ii)抗人Igo優(yōu)選地，所述試劑盒還包括一定量的全長(zhǎng)KARI蛋白的一種或多種免疫原性肽片段或任何兩種或更多種所述肽的融合物。任選地，所述試劑盒還包括供檢測(cè)抗體、其片段或配體對(duì)KARI蛋白結(jié)合的手段。上述手段包括報(bào)道分子，例如酶(如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)、底物、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)(luminescentgroup)、熒光基團(tuán)(fluorescentgroup)、生物素或膠體顆粒(如膠體金或硒)。優(yōu)選上述報(bào)道分子直接連接于所述抗體或配體。還在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒還可包括參照樣品。上述參照樣品可例如，為來(lái)源于從一個(gè)或多個(gè)結(jié)核病受試者分離的生物樣品的蛋白樣品?；蛘撸瑓⒄諛悠房砂◤囊粋€(gè)或多個(gè)正常健康個(gè)體分離的生物樣品。上述參照樣品任選地包含于供診斷或預(yù)后測(cè)定法的試劑盒中。在另一個(gè)實(shí)施例中，參照樣品包含由抗體或配體檢測(cè)的肽。優(yōu)選地，所述肽是已知濃度的。上述肽特別地用作標(biāo)樣。相應(yīng)地，多種已知濃度的上述肽可使用本文中所述的預(yù)后或診斷測(cè)定法進(jìn)行檢測(cè)。還在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒任選地包含供樣品制備的手段，例如，細(xì)胞裂解的手段。優(yōu)選地，上述手段為溶解痰的手段，例如洗滌劑(例如，三丁基膦、C7BZ0、硫酸右旋糖酐、DTT、N_乙酰基半胱氨酸或聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(polyoxyethylenesorbitanmonolaurate))。還在另一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包含供蛋白分離的手段(ScopesdiuProteinPurificationPrinciplesandPractice,ThirdEdition,SpringerVerlag,1994)。預(yù)防和治療方法KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，當(dāng)施于動(dòng)物受試者時(shí)，可誘導(dǎo)特異性產(chǎn)生高效價(jià)抗體。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了引發(fā)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗體產(chǎn)生的方法，包括將分離的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以引發(fā)抗體(例如，結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的中和抗體)產(chǎn)生的條件下施于所述受試者一段時(shí)間。還在足以引發(fā)抗體(例如，結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的中和抗體)產(chǎn)生的條件下施用一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段時(shí)間是落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)的。上述施用可為與施用KARI蛋白或片段同時(shí)進(jìn)行(S卩，共施用)，或者，在將KARI蛋白或片段施于受試者之前或之后進(jìn)行。優(yōu)選地，根據(jù)前述任何實(shí)施例的中和抗體為高效價(jià)的中和抗體。用于產(chǎn)生抗體的KARI蛋白或其他蛋白或其表位的有效量根據(jù)所述免疫原性B細(xì)胞表位的特性、給藥途徑、用于免疫接種的動(dòng)物和尋求的抗體的特性變動(dòng)。所有上述變量可通過(guò)本領(lǐng)域已知手段憑經(jīng)驗(yàn)確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫性的方法，包括將分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在足以引發(fā)針對(duì)所述分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的體液免疫應(yīng)答的條件下施于所述受試者一段時(shí)間。還在足以引發(fā)針對(duì)該抗原的體液免疫應(yīng)答的條件下施用一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段時(shí)間也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。上述施用可為與施用KARI蛋白或片段同時(shí)進(jìn)行(S卩，共施用)，或者，在將KARI蛋白或片段施于受試者之前或之后進(jìn)行。免疫接種的抗原可如本文中所述以任何方便的配制劑的形式施用?！绑w液免疫應(yīng)答”指針對(duì)免疫接種的抗原生成足以阻止由結(jié)核分枝桿菌造成的感染的次級(jí)免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，生成的體液免疫性包括在受試者中引發(fā)持續(xù)水平的結(jié)合于免疫接種抗原中B細(xì)胞表位的抗體?！俺掷m(xù)水平的抗體”指足以結(jié)合于B細(xì)胞表位以阻止由結(jié)核分枝桿菌造成的感染的循環(huán)抗體的水平。優(yōu)選地，抗體水平持續(xù)至少約六個(gè)月或9個(gè)月或12個(gè)月或2年。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)受試者免疫系統(tǒng)的方法，包括在足以在所述受試者中賦予或增強(qiáng)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗性的條件下施用具免疫活性的KARI蛋白或其表位或包含所述KARI蛋白或表位的疫苗組合物一段時(shí)間。還在足以在所述受試者中賦予或增強(qiáng)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抗性的條件下施用一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX或S9或GS或其免疫原性片段)一段時(shí)間也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。上述施用可為與施用KARI蛋白或片段同時(shí)進(jìn)行(S卩，共施用)，或者，在將KARI蛋白或片段施于受試者之前或之后進(jìn)行?！百x予或增強(qiáng)抗性”指發(fā)生在所述受試者中的結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答選自下組(i)在所述受試者中產(chǎn)生針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的KARI蛋白或所述蛋白的表位的抗體；(ii)在所述受試者中產(chǎn)生結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌的中和抗體；(iii)在受試者中激活對(duì)結(jié)核分枝桿菌的KARI蛋白具有特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和/或CTL前體；和(iv)受試者具有針對(duì)后續(xù)結(jié)核分枝桿菌感染或潛在結(jié)核分枝桿菌感染的再激活的增強(qiáng)免疫性。本發(fā)明應(yīng)理解為涵蓋在未受感染的人受試者中提供或增強(qiáng)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌免疫性的方法，包括在足以提供針對(duì)由結(jié)核分枝桿菌造成的將來(lái)感染的免疫記憶的條件下將具免疫活性的KARI蛋白或其表位，或包含所述KARI蛋白或表位的疫苗組合物施于所述受試者一段時(shí)間。還在足以提供針對(duì)由結(jié)核分枝桿菌造成的將來(lái)感染的免疫記憶的條件下施用一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX或GS或其免疫原性片段)一段時(shí)間也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。上述施用可為與施用KARI蛋白或片段同時(shí)進(jìn)行(S卩，共施用)，或者，在將KARI蛋白或片段施于受試者之前或之后進(jìn)行。本發(fā)明提供了在受試者中治療結(jié)核病的方法，包括進(jìn)行本文中所述的診斷方法或預(yù)后方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了預(yù)防方法，包括(i)在來(lái)自受試者的生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的存在和(ii)施用治療上有效量的本文中所述的藥物組合物以減少受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中病原性桿菌數(shù)。如從本文的公開(kāi)顯而易見(jiàn)，根據(jù)該實(shí)施例的合適的組合物包括KARI蛋白或其免疫原性片段，任選地與一種或多種其他免疫原結(jié)核分枝桿菌蛋白或肽片段一起，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合。包含根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的KARI蛋白或其片段，或肽或表位或片段的組合或混合物，以及一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX和/或S9和/或Rvl265和/或EF-Tu和/或P5CR和/或TetR和/或GS或其免疫原性片段，例如SEQIDN0:3-60中任一所述的或其組合/混合物)的上述組合物也落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。優(yōu)選地，將所述組合物施用于攜帶潛在的或活動(dòng)的結(jié)核分枝桿菌感染的受試者。雖不愿拘于任何理論或作用模式，但所述治療方法增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別并裂解攜帶結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞的能力，或瞬時(shí)地或以持續(xù)方式增強(qiáng)T細(xì)胞識(shí)別結(jié)核分枝桿菌抗原的T細(xì)胞表位的能力。類似地，可在激活潛在的結(jié)核分枝桿菌感染之后，或在重新感染結(jié)核分枝桿菌之后，或者用本發(fā)明的KARI蛋白或表位或疫苗組合物對(duì)之前經(jīng)感染的受試者進(jìn)行免疫接種之后重新激活T細(xì)胞群體?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定CTL激活是否發(fā)生于受試者中(例如，使用細(xì)胞毒性測(cè)定法、ELISPOT)或在受試者的PBMC中確定IFN-γ的產(chǎn)生。優(yōu)選地，將所述肽或衍生物或變體或疫苗組合物在足以引發(fā)或增強(qiáng)⑶8+Τ細(xì)胞的擴(kuò)展的條件下施用一段時(shí)間。還更優(yōu)選地，將所述肽或衍生物或變體或疫苗組合物在足以在受試者中增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫(CMI)的條件下施用一段時(shí)間?！敖Y(jié)核分枝桿菌特異性CMI，，指激活的和克隆擴(kuò)展的CTL是MHC限制性的(MHC-resctricted)，并對(duì)本發(fā)明的CTL表位具有特異性。CTL是基于抗原特異性和MHC限制性來(lái)進(jìn)行分類的(即，非特異性CTL和抗原特異性、MHC限制性CTL)。非特異性CTL由多種細(xì)胞類型組成，包括NK細(xì)胞和抗體依賴性細(xì)胞毒性，且可在免疫應(yīng)答中非常早地起作用以減少病原體負(fù)載，此時(shí)抗原特異性應(yīng)答仍在確立之中。與之相對(duì)，MHC限制性的CTL在與非特異性CTL相比較晚時(shí)取得最優(yōu)的活性，通常是在抗體產(chǎn)生之前?？乖禺愋訡TL抑制或減少結(jié)核分枝桿菌的傳播，并優(yōu)選地結(jié)束感染。CTL激活、克隆擴(kuò)展或CMI可為系統(tǒng)性誘導(dǎo)的或區(qū)域性局限的(compartmentallylocalized)。在區(qū)域性局限的作用的情況下，優(yōu)選使用適當(dāng)?shù)嘏渲茷楣┦┯糜谠搮^(qū)域的疫苗組合物。在另一方面，對(duì)在受試者中系統(tǒng)性誘導(dǎo)CTL激活、擴(kuò)展或CMI并無(wú)上述嚴(yán)格的限制。KARI蛋白或其表位，任選地與一種或多種其他蛋白或表位組合(例如，來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌的BSX或GS或S9蛋白)單獨(dú)施用或在疫苗組合物中施用以引發(fā)CTL激活、克隆擴(kuò)展或CMI的有效量，根據(jù)免疫原性表位的特性，給藥途徑，進(jìn)行免疫接種的受試者的體重、年齡、性別和一般健康情況，以及所尋求的CTL應(yīng)答的特性而變動(dòng)。所有上述變量是通過(guò)本領(lǐng)域已知手段憑經(jīng)驗(yàn)確定的。將KARI蛋白或其表位，任選地與一種或多種其他蛋白或表位組合(例如，來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌的BSX或GS或S9蛋白)，并任選地與任何合適的或需要的載體、佐劑、BRM或藥學(xué)上可接受的賦形劑配制，以可注射的組合物形式方便地進(jìn)行給藥。注射可為鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他已知的途徑。對(duì)于靜脈內(nèi)注射，包含一種或多種液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑是理想的。待施用的最優(yōu)劑量和優(yōu)選的給藥途徑是使用動(dòng)物模型確立的，例如，通過(guò)用包含所述肽的配制劑注射小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、馬、牛、山羊或豬，并然后使用任何常規(guī)測(cè)定法監(jiān)測(cè)針對(duì)所述表位的CTL免疫應(yīng)答。也可使用過(guò)繼轉(zhuǎn)移(adoptivetransfer)以賦予或增強(qiáng)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的抗性或阻止或減少重新激活的潛在感染的嚴(yán)重性。相應(yīng)地，在相關(guān)的實(shí)施例中，提供了在未感染的人類受試者中增強(qiáng)或賦予針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫性的方法，包括在離體情況下將從人受試者獲得的T細(xì)胞與具免疫活性的KARI蛋白或其表位或包含所述蛋白或表位的疫苗組合物在足以賦予所述T細(xì)胞針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的活性的條件下接觸一段時(shí)間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了增強(qiáng)人受試者的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞介導(dǎo)免疫的方法，所述方法包括(i)在離體情況下將從人受試者得到的T細(xì)胞與具免疫活性的KARI蛋白或其CTL表位或包含所述蛋白或表位的疫苗組合物在足以賦予所述T細(xì)胞針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的活性的條件下接觸一段時(shí)間；和(ii)將激活的T細(xì)胞自體引入所述受試者，或同種異體引入另一個(gè)人受試者。如本文中所述的其他實(shí)施例，本發(fā)明涵蓋施用附加的免疫原性蛋白或表位，例如，來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌BSX或S9或GS蛋白的。所述T細(xì)胞可為CTL或CTL前體細(xì)胞。所述T細(xì)胞所獲得自的人受試者可為與受治療的受試者相同或不同的受試者。受治療的受試者可為任何攜帶潛在或活動(dòng)結(jié)核分枝桿菌感染或有結(jié)核分枝桿菌感染或結(jié)核分枝桿菌感染重新激活風(fēng)險(xiǎn)的人受試者，或者其他情況下需要獲得針對(duì)結(jié)核分枝桿菌疫苗接種或渴望獲得針對(duì)結(jié)核分枝桿菌疫苗接種的人。上述過(guò)繼轉(zhuǎn)移方法的進(jìn)行優(yōu)選如Einsele等，Blood99，3916-3922，2002所述進(jìn)行，而結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)性的測(cè)定基本上也根據(jù)該文獻(xiàn)所述進(jìn)行，該方法以提述的方式并入本文。“結(jié)核分枝桿菌活性”意指使得T細(xì)胞能夠如本文中上述定義一般被激活(即，所述T細(xì)胞會(huì)識(shí)別并裂解攜帶結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞，或能夠識(shí)別結(jié)核分枝桿菌抗原的T細(xì)胞表位，無(wú)論是瞬時(shí)地還是以持續(xù)的方式)。相應(yīng)地，特別優(yōu)選所述τ細(xì)胞為CTL前體，其通過(guò)本發(fā)明的方法使其能夠識(shí)別和裂解攜帶結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞或能夠識(shí)別結(jié)核分枝桿菌抗原的T細(xì)胞表位，無(wú)論是瞬時(shí)地還是以持續(xù)的方式。對(duì)于上述離體應(yīng)用，所述T細(xì)胞優(yōu)選包含于從人受試者獲得的生物樣品中，例如包含初級(jí)或中樞淋巴樣器官(例如，骨髓或胸腺)或次級(jí)或外周淋巴樣器官(例如，血、PBMC或由其來(lái)源的暗黃覆蓋層級(jí)分(buffycoatfraction))的活檢樣本。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞或包含T細(xì)胞的樣本是之前從人受試者獲得的，例如，通過(guò)與將所述樣本委托病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析的醫(yī)師進(jìn)行磋商。優(yōu)選地，本主題方法還包括獲得包含所述受試者的T細(xì)胞的樣品，且更優(yōu)選地，從所述受試者獲得所述樣品。配制劑本發(fā)明明確地涵蓋了KARI蛋白或其免疫原性片段或表位在制備針對(duì)人或其他動(dòng)物受試者中結(jié)核分枝桿菌感染的治療性或預(yù)防性亞單位疫苗中的用途。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包含KARI蛋白或其免疫原性片段或表位與藥學(xué)上可接受的稀釋劑組合的藥物組合物或疫苗。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，根據(jù)該實(shí)施例的組合物包含KARI蛋白或其免疫原性片段，任選地還包括一種或多種其他免疫原性結(jié)核分枝桿菌蛋白或肽片段，與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的組合。包含根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例的KARI蛋白或其片段，或肽或表位或片段的組合或混合物，以及一種或多種第二抗原(例如結(jié)核分枝桿菌BSX和/或S9和/或Rvl265和/或EF-Tu和/或P5CR和/或TetR和/或GS或其免疫原性片段，例如SEQIDNO3-60中任一所述的或其組合/混合物)的上述組合物顯然落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。方便地將所述KARI蛋白，以及任選地其他蛋白，或其免疫原性片段或表位配制于藥學(xué)上可接受的賦形劑或稀釋劑中，例如，水性溶劑、非水性溶劑、無(wú)毒賦形劑(如鹽)、防腐劑、緩沖液等。非水性溶劑的實(shí)施例為丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。水性溶劑包括水、醇/水溶液、生理鹽水溶液、非消化道溶劑載體(parenteralvehicle)(如氯化鈉)、Ringer’s葡萄糖(Ringer’sdextrose)等。防腐劑包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。所述藥物組合物多種組分的PH和準(zhǔn)確濃度根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)進(jìn)行調(diào)整。在某些情況下，亦可能想要將所述KARI蛋白以及任選地，其他蛋白或其免疫原性片段或表位，與佐劑一同配制以增強(qiáng)對(duì)B細(xì)胞表位的免疫應(yīng)答。同樣，嚴(yán)格意義上這并非必需的。上述佐劑包括任何可接受的免疫刺激性化合物(immune-stimulatorycompound),例如，細(xì)胞因子、毒素或合成組合物。示例性的佐劑包括IL-1、IL-2、BCG、氫氧化鋁、N-乙?；鵢胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thur-MDP)、N_乙酰基-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱作去甲-MDP)、N-乙?；邗?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’，2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酸基氧)-乙醇胺(CGP)1983A，稱作MTP-PE)、脂質(zhì)A、MPL和RIBI，其包含三種從細(xì)菌提取的組分單磷酸脂質(zhì)A、海藻糖二霉菌酸酯和細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)在2%鯊烯/Tween80中的乳液。特別優(yōu)選用于針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的疫苗的佐劑，例如，描述于Elhay和AndersenImmune-1.CellBiol.75,595-603,1997；orLindbladetal.,Infect.Immun.65,1997?？赡芟胍獙⑸飸?yīng)答調(diào)節(jié)劑(BRM)與所述KARI蛋白或其免疫原性片段或表位共同給藥，以下調(diào)抑制性T細(xì)胞的活性。示例性的BRM包括但不僅限于，西咪替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline,PA,USA)；吲哚美辛(IND；150mg/d)(Lederle,NJ,USA)；或低劑量的環(huán)磷酰胺(CYP；75、150或300mg/m.sup.2)(Johnson/Mead,NJ,USA)。供施用所述KARI蛋白或任選的其他蛋白或其免疫原性片段或表位的優(yōu)選載體(vehicle)包括脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是由一種或多種圍繞水性區(qū)室的脂質(zhì)雙層組成的微觀囊泡(microscopicvesicle)(Bakker-ffoudenbergEur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)，S61(1993)；andKim,Drugs46,618(1993))。脂質(zhì)體在組成上與細(xì)胞膜相似，因此脂質(zhì)體通?？砂踩慕o藥，并為生物可降解的。供制備脂質(zhì)體和與脂質(zhì)體配制(例如，包埋)多種分子(包括肽和寡核苷酸)的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。取決于制備方法，脂質(zhì)體可為單層的或多層的，且其大小可從0.02μm至大于10μm的范圍內(nèi)變動(dòng)。多種試劑可包埋于脂質(zhì)體中。疏水物質(zhì)(hydrophobicagent)分配于雙層中，而親水物質(zhì)(hydrophilicagent)分配在內(nèi)部水性空間內(nèi)(Machy等，LIPOSOMESINCELLBIOLOGYANDPHARMAC0L0GY(JohnLibbey1987)，和Ostro等，AmericanJ.Hosp.Pharm.46，1576(1989))。脂質(zhì)體還可吸附于幾乎任何類型的細(xì)胞，然后釋放其包埋的試劑。或者，所述脂質(zhì)體與靶細(xì)胞融合，從而將脂質(zhì)體的內(nèi)含物排空至靶細(xì)胞?；蛘?，吸附的脂質(zhì)體可被吞噬性的細(xì)胞胞吞(endocytose)。在胞吞作用(endocytosis)之后發(fā)生脂質(zhì)體脂質(zhì)的溶酶體內(nèi)降解，并釋放出包埋的物質(zhì)(Scherphof等，Ann.N.Y.Acad.Sci.446，368(1985))。在本文的語(yǔ)境下，KARI蛋白或其免疫原性片段或表位可位于脂質(zhì)體的表面，以便于抗原呈遞，而無(wú)需對(duì)所述脂質(zhì)體進(jìn)行破壞或胞吞作用。然而，無(wú)論機(jī)理或遞送為如何，結(jié)果是相關(guān)的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位布置于胞內(nèi)。脂質(zhì)體載體可為陰離子的或陽(yáng)離子的。陰離子脂質(zhì)體載體包括在胞吞作用或內(nèi)體酸化之后破壞內(nèi)體膜或與內(nèi)體膜融合的PH敏感性脂質(zhì)體。陽(yáng)離子脂質(zhì)體優(yōu)選用于在體外介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染或核酸的一般性遞送，但可用于遞送其他治療劑，如肽或脂肽。陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備物是通過(guò)常規(guī)方法制備的(Feigner等，Proc.Nat'1Acad.SciUSA84,7413(1987)；Schreier,LiposomeRes.2，145(1992))。商業(yè)性制備物，如Lipofectin(LifeTechnologies,Inc.，Gaithersburg，Md.USA)，可容易地獲得。待給藥的脂質(zhì)體量基于劑量響應(yīng)曲線來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，F(xiàn)eigner等，見(jiàn)上。其他用于本發(fā)明方法中的合適的脂質(zhì)體包括多層囊泡(multilamellarvesicles，MLV)、寡層囊泡(oligolamellarvesicles,0LV)、單層囊泡(unilamellarvesicles,UV)、^MiIl-M^^(smallunilamellarvesicles,SUV)>(medium-sizedunilamellarvesicles,MUV)、大型單層囊泡(largeunilamelIarvesicles,LUV)、巨大型單層囊泡(giantunilamellarvesicles,GUV)、多泡囊泡(multivesicularvesicles,MVV)、通過(guò)反相蒸發(fā)方法制備的單層或寡層囊泡(singleoroligolamellarvesiclesmadebyreverse-phaseevaporationmethod,REV)、通過(guò)反相蒸發(fā)方法制備的多層囊泡(multilamellarvesiclesmadebythereverse-phaseevaporationmethod,MLV-REV)、穩(wěn)定多層囊泡(stableplurilamellarvesicles,SPLV)、凍融MLV(frozenandthawedMLV,F7VTMLV)、通過(guò)擠出方法制備的囊泡(vesiclespreparedbyextrusionmethods，VET)、通過(guò)弗氏壓碎器制備的囊泡(vesiclespreparedbyFrenchpress,FPV)、通過(guò)融合制備的囊泡(vesiclespreparedbyfusion，F(xiàn)UV)、脫水-再水合囊泡(dehydration-rehydrationvesicles,DRV)、以及水泡體(bubblesomes,BSV)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道供制備這些脂質(zhì)體的技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。(參見(jiàn)COLLOIDALDRUGDELIVERYSYSTEMS,vol.66，J.Kreuter，編，MarcelDekker,Inc.1994)。也考慮了其他形式的遞送顆粒，例如，微球等，以供遞送KARI蛋白和任選的其他蛋白，或其免疫原性片段或表位。制備合適的配制劑和藥學(xué)上有效的溶劑載體的方法，例如，見(jiàn)于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第83-92章，第1519-1714頁(yè)(MackPublishingCompany1990)，其以提述的方式并入本文?；蛘?，所述肽或衍生物或變體是作為細(xì)胞疫苗通過(guò)施用自體或同種異體的抗原呈遞細(xì)胞(APC)或樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)配制的，所述細(xì)胞在體外經(jīng)處理使得其在其表面呈遞所述肽。還考慮了基于核酸的疫苗，其包含編碼具免疫活性的KARI蛋白和任選的其他蛋白，或其表位的核酸(例如，DNA或RNA)，并克隆入合適的載體(例如，牛痘、金絲雀痘、腺病毒或其他真核病毒載體)。優(yōu)選地，將編碼KARI蛋白和任選的其他蛋白的DNA配制為DNA疫苗，例如，與現(xiàn)存的卡介苗(BCG)或免疫佐劑如牛痘病毒、弗氏佐劑或另一免疫刺激劑組合配制。本發(fā)明進(jìn)一步參照下述非限定性實(shí)施例進(jìn)行描述。實(shí)施例1樣品收集和加工，抗體產(chǎn)生和免疫測(cè)定法使用下述一般方法進(jìn)行樣品收集和加工，抗體產(chǎn)生和衡量，其服從于后續(xù)實(shí)施例(即，實(shí)施例2及其后續(xù))中的公開(kāi)。使用在該實(shí)施例中提及的方法，除非在后續(xù)實(shí)施例(即，實(shí)施例2及其后續(xù))中特別記載了另一種方法。在后續(xù)實(shí)施例中提及的方法應(yīng)視為就該特定實(shí)施例而言。1.患者痰樣品的收集使用TB陰性和TB陽(yáng)性痰以衡量用于如后續(xù)實(shí)施例中所述的TB診斷的抗體對(duì)Becton,Dickinson&CO.,ResearchTrianglePark,Durham,NorthCarolina,USA獲得了類似地未經(jīng)加工的痰，并在本文中稱作“痰-BD”。其他樣品從在Johannesburg，SouthAfrica的另一^iiEfPiAHealthConceptsInternationalLimited，Thailand―。2.痰的預(yù)處理a)“痰-Ml”在一個(gè)實(shí)施例中，本文中稱作“痰-Ml”的痰級(jí)分是通過(guò)將收集的痰1l(v/v)稀釋至終濃度為在50mM磷酸鹽緩沖液pH7.4中IOmM新鮮制備的二硫蘇糖醇(DTT)來(lái)制備的。適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)生產(chǎn)商或供應(yīng)商的說(shuō)明添加不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合(cocktail)片劑(RocheMolecularBiochemicals,Cat#1873580)以提供最終的14(ν/ν)稀釋的痰。將樣品通過(guò)渦旋振蕩攪拌約30秒，然后在4°C使用定軌振蕩器(orbitalshaker)或輕柔渦旋振蕩混合30秒，小心避免大量的細(xì)胞裂解。然后將液化的痰以2000xg在4°C離心約10分鐘以沉淀細(xì)胞并去除不溶物質(zhì)。將上清在4°C以14000xg離心約10分鐘，以沉淀細(xì)微的顆粒狀物質(zhì)。移除上清，并使用0.2μm孔徑GD/XPVDF無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，并將濾過(guò)物保留并在-20°C冷凍儲(chǔ)藏。b)“痰-Cl”在另一個(gè)實(shí)施例中，本文中稱作“痰-Cl”的痰級(jí)分是通過(guò)將收集的痰1l(v/v)稀釋至終濃度為在50mM磷酸鹽緩沖液pH7.4中IOmM新鮮制備的二硫蘇糖醇(DTT)來(lái)制備的。適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)生產(chǎn)商或供應(yīng)商的說(shuō)明添加不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合(cocktail)片劑(RocheMolecularBiochemicals,Cat#1873580)以提供最終的12(ν/ν)稀釋的痰。將樣品通過(guò)渦旋振蕩攪拌約30秒，然后在4°C使用定軌振蕩器或輕柔渦旋振蕩混合30秒，小心避免大量的細(xì)胞裂解。然后將液化的痰以2000xg在4°C離心約10分鐘以沉淀細(xì)胞并去除不溶物質(zhì)。將上清在4°C以14000xg離心約10分鐘，以沉淀細(xì)微的顆粒狀物質(zhì)。移除上清，并不經(jīng)過(guò)濾在-20°C冷凍儲(chǔ)藏。3.加工冷凍的痰以供測(cè)定使用了四種不同的方法以供進(jìn)一步加工如上所述制備的冷凍的經(jīng)預(yù)處理的痰。a)方法1如上所述制備的痰-Ml(2.5mL)等同于約0.6mL未稀釋的(“純粹的”)痰。在此示例性的方法中，未對(duì)痰-Ml進(jìn)行進(jìn)一步加工，將其用于使用17x150μL替代的替代ELISA測(cè)定中。b)方法2如上所述制備的痰-Cl(1.8mL)等同于0.9mL未稀釋的(“純粹的”)痰。在此示例性的方法中，將痰-Cl通過(guò)丙酮沉淀減少至0.6mL的體積，用于使用4x150μL替代的替代ELISA測(cè)定中。具體而言，將痰-Cl離心以去除不溶物質(zhì)，將上清轉(zhuǎn)移至未經(jīng)使用的(fresh)試管中，并添加四倍(4)體積的冷丙酮，并將樣品在-80°C溫育30分鐘，然后將其在4°C以4000xg離心30分鐘以收集沉淀的蛋白級(jí)分。保留蛋白沉淀，并將其風(fēng)干約30分鐘，輕柔地重新溶解于0.6mL的50mMTrispH7.8,5mMMgCl2中。c)方法3如上所述制備的痰-Cl(9mL)等同于4.5mL未稀釋的(“純粹的”)痰。在此示例性的方法中，對(duì)痰-Cl進(jìn)行大小分級(jí)、脫鹽并配為約0.6mL的體積，用于使用4x150μL替代的替代ELISA測(cè)定中。簡(jiǎn)言之，融解冷凍的痰-Cl，調(diào)整為終濃度0.3mMEDTA，并添加4mL的50mMTris7.8,5mMMgCl20將樣品在環(huán)境溫度以4000xg離心20分鐘以沉淀不溶物質(zhì)。保留上清，轉(zhuǎn)移至未經(jīng)使用的試管，稀釋于等體積的50mMTris7.8,5mMMgCl2,上樣于IOOkDaMW截取值的大小排阻旋轉(zhuǎn)柱(sizeexclusionspincolumn)，并以4000xg在環(huán)境溫度離心25分鐘。保留洗脫物，并轉(zhuǎn)移至5kDa麗截取值的大小排阻旋轉(zhuǎn)柱，并以4000xg(環(huán)境溫度)離心至少約60分鐘或直至收集了0.6mL的洗脫物。將樣品體積用50mMTrispH7.8，5mMMgCl2調(diào)整為約0.62mL,以用于如上所述的替代ELISA測(cè)定法。d)方法4如上所述制備的痰-Ml(ISmL)等同于4.5mL未稀釋的(“純粹的”)痰。在此示例性的方法中，對(duì)痰-Ml進(jìn)行大小分級(jí)、脫鹽并配為0.6mL的體積，用于使用4x150μL替代的替代ELISA測(cè)定中。簡(jiǎn)言之，融解冷凍的痰-Ml，調(diào)整為終濃度0.3mMEDTA,并添加4mL的50mMTris7.8,5mMMgCl20將樣品在環(huán)境溫度以4000xg離心20分鐘以沉淀不溶物質(zhì)。保留上清，轉(zhuǎn)移至未經(jīng)使用的試管，稀釋于等體積的50mMTris7.8,5mMMgCl2,上樣于IOOkDaMW截取值的大小排阻旋轉(zhuǎn)柱，并以4000xg在環(huán)境溫度離心25分鐘。保留洗脫物，并轉(zhuǎn)移至5kDaMW截取值的大小排阻旋轉(zhuǎn)柱，并以4000xg(環(huán)境溫度)離心至少約60分鐘或直至收集了0.6mL的洗脫物。將樣品體積用50mMTrispH7.8，5mMMgCl2調(diào)整為約0.62mL,以用于如上所述的替代ELISA測(cè)定法。4.從痰、血清或血漿制備IgG級(jí)分將患者痰、血清或血漿在8.2ml免疫純的IgG結(jié)合緩沖液(Pierce)中稀釋，然后通過(guò)0.22μm過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，然后上樣于AKTAExplorer(AmershamBiosciences)所附的蛋白A柱。用免疫純Ag/Ab溫和洗脫緩沖液(Pierce)洗脫結(jié)合的抗體。匯集洗脫的級(jí)分(結(jié)合于抗原的IgG)并置于冰上3小時(shí)以使得免疫復(fù)合物能夠解離。然后將IgG級(jí)分通過(guò)經(jīng)100000分子量截?cái)嘀档闹?Millipore)過(guò)濾來(lái)從抗原級(jí)分分離。將兩個(gè)級(jí)分和蛋白A柱的流過(guò)物用苯甲?；耐肝瞿?Sigma)相對(duì)于4升的磷酸鹽緩沖鹽水pH7.2在41透析過(guò)夜，然后再用4升緩沖液透析3小時(shí)。將所有的級(jí)分(流過(guò)物和來(lái)自所述100000截取值的柱的滲余物和蛋白A柱的流過(guò)物)以10份丙酮對(duì)1份樣品的比例在-20°C用丙酮沉淀1小時(shí)，然后以4000g旋轉(zhuǎn)20分鐘。將沉淀的樣品溶解于包含5M尿素，2M硫脲，2%CHAPS,2%SB3-10和40mMTris的樣品緩沖液中至約2mg/ml的終濃度，然后用5mM三丁基膦還原并用IOmM丙烯酰胺烷化1.5小時(shí)。通過(guò)添加DTT至IOmM的終濃度來(lái)淬滅烷化反應(yīng)。將樣品分為200μ1的等分試樣并儲(chǔ)藏于-20°C。5.■碰__選擇用于基于抗原的診斷測(cè)定法的結(jié)核分枝桿菌抗原的主要標(biāo)準(zhǔn)是其存在于TB陽(yáng)性的痰中，以及其免疫原性，以提供簡(jiǎn)單的診斷測(cè)試。在TB陽(yáng)性痰中如下述段落所描述鑒定候選抗原。a)確定蛋白含量樣品的蛋白含量使用Bradford測(cè)定法進(jìn)行估計(jì)。在重新水合IPG條之前，將樣品以21000xg離心10分鐘。收集上清并每毫升添加10μ11%OrangeG(Sigma)作為指示劑染料(indicatordye)。b)二維凝膠電泳第一維將干燥的IlcmIPG條(Amersham-Biosciences)用180μ1蛋白樣品重新水合16-24小時(shí)。將經(jīng)重新水合的條在ProteanIEFCell(Bio-Rad,Hercules,CA)或ProteomeSystem'sIsoElectrlQ電泳裝置上聚焦大約140kVhr，最大值為10kV。然后將經(jīng)聚焦的條平衡于尿素/SDS/Tris-HCl/溴酚藍(lán)緩沖液中。c)第二維將經(jīng)平衡的條插入6-15%(w/v)Tris-乙酸SDS-PAGE預(yù)澆的10cmxl5cmGelChips(TyrianDiagnostics,SydneyAustralia)的上樣孑匕中°以每個(gè)凝膠50mA進(jìn)行1.5小時(shí)的電泳，或直至示蹤染料(trackingdye)到達(dá)凝膠的底部。使用SyproRuby(MolecularProbes)對(duì)來(lái)自滲余物級(jí)分或流過(guò)物級(jí)分的蛋白進(jìn)行染色。用銀對(duì)來(lái)自洗脫物級(jí)分的蛋白根據(jù)Shevchenko等(AnalChem.68(5)=850-8,1996)的方法進(jìn)行染色。在脫色之后使用AlphaImagerSystem(AlphalnnotechCorp.)掃描凝膠圖像。然后用CoomassieG-250對(duì)凝膠進(jìn)行染色以幫助使后續(xù)分析中蛋白斑點(diǎn)(proteinspot)可視化。d)質(zhì)譜法在進(jìn)行質(zhì)譜分析之前，通過(guò)膠內(nèi)(in-gel)胰蛋白酶消化來(lái)制備蛋白樣品。使用Xcise，一種與MontageIn—GelDigestionKit(由TyrianDiagnostics開(kāi)發(fā)，并由Millipore,Billerica,Ma,01821,USA發(fā)售(distribute))相結(jié)合的切出/液體處理機(jī)器人(TyrianDiagnostics,Sydney,Australia禾口Shimadzu-Biotech,Kyoto,Japan)將蛋白凝膠塊切出、脫色、消化并脫鹽。在切割斑點(diǎn)之前，將2-D凝膠在水中溫育以保持恒定的尺寸并防止干燥。然后，將2-D凝膠置于Xcise上，拍攝數(shù)字圖像，并選取待切割的斑點(diǎn)。在自動(dòng)切出斑點(diǎn)之后，對(duì)凝膠塊進(jìn)行自動(dòng)液體處理和膠內(nèi)消化。簡(jiǎn)言之，用ΙΟΟμΙ的50%(ν/ν)乙腈/IOOmM碳酸氫銨對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)進(jìn)行脫色。通過(guò)添加100%乙腈對(duì)凝膠塊進(jìn)行干燥，5秒鐘后去除乙腈，并通過(guò)在37°C蒸發(fā)剩余的乙腈將所述凝膠完全干燥。蛋白分解消化是通過(guò)用30μ1包含5μg/mL經(jīng)修飾的豬胰蛋白酶的50mM碳酸氫銨(pH7.8)將干燥的凝膠塊重新水合，并在37°C溫育過(guò)夜來(lái)進(jìn)行的。如果需要進(jìn)行附加的液相層析(LC)-電噴射電離(ESI)MS分析，將十微升(10μ1)經(jīng)胰蛋白酶消化的肽混合物移除至干凈微滴定板上。在MALDIMS之前的自動(dòng)脫鹽和濃縮經(jīng)胰蛋白酶消化的肽是使用基于R2的層析進(jìn)行的。將吸附的肽使用2μ1的90%(ν/ν)乙腈和0.085%(v/v)TFA中的2mg/mlα-氰基4-羥基肉桂酸從尖部洗脫至384-位MALDI-T0F樣品靶板(sampletargetplate)上(Kratos,Manchester,UKorBrukerDaltronics,Germany)。使用Axima-CFRMALDIMS質(zhì)譜儀(Kratos，Manchester，UK)以陽(yáng)離子反射模式(positiveionreflectronmode)分析消化產(chǎn)物(digest)。使用具有337nm波長(zhǎng)的氮?dú)饧す馄?nitrogenlaser)照射樣品。只保存超過(guò)特定標(biāo)準(zhǔn)的譜。譜以自動(dòng)模式在600Da至4000Da的分子量范圍對(duì)每個(gè)樣品點(diǎn)施以64-點(diǎn)光柵來(lái)獲取。對(duì)所有的光譜使用自體消化的胰蛋白酶峰分子量，m/z842.51Da以及摻入的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)肽，m/z2465.117Da進(jìn)行內(nèi)部?jī)牲c(diǎn)校準(zhǔn)(internaltwopointcalibration)。使用如包含于基于網(wǎng)絡(luò)的蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)BioinformatIQ(TyrianDiagnostics)中的由TyrianDiagnostics設(shè)計(jì)的軟件來(lái)從MS譜提取同位素峰。蛋白鑒定是通過(guò)將經(jīng)胰蛋白酶消化的肽的單同位素分子量(即，肽分子量指紋)與來(lái)自蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的理論分子量使用IonIQ或MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)搜索軟件(ProteomeSystemLimited,NorthRyde,Sydney,Australia)進(jìn)行匹配來(lái)進(jìn)行的。查詢(query)是針對(duì)非冗余的SwissProt(Release40)和TrEMBL(Release20)數(shù)據(jù)庫(kù)(2002年6月版本)進(jìn)行的，并通過(guò)MOWSE評(píng)分系統(tǒng)的修飾來(lái)對(duì)蛋白身份進(jìn)行分類(rank)。考慮到了丙酰胺-半胱氨酸(cys-PAM)或羧酰胺基甲基-半胱氨酸(cys-CAM)和氧化的甲硫氨酸修飾，并允許IOOppm的分子量容限(tolerance)。僅在初始不考慮錯(cuò)切(miscleavage)的搜索進(jìn)行之后考慮錯(cuò)切位點(diǎn)。使用下述標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量搜索結(jié)果=MOWSE評(píng)分，與候選蛋白匹配的肽的數(shù)量和強(qiáng)度，匹配的肽對(duì)候選蛋白序列的覆蓋，以及凝膠上的位置。作為附加或替代手段，使用LC-ESI-MS分析蛋白。將經(jīng)胰蛋白酶消化的蛋白溶液(10μ1)通過(guò)納米流(nan0fl0W)LC/MS使用配備了由自動(dòng)采樣器和泵組成的SurveyorLC系統(tǒng)的LCQDecaIonTrap質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan，Sanjose，CA)來(lái)進(jìn)行分析。將肽使用偶聯(lián)于C18PicoFrit柱(NewObjective)的P印Finder試劑盒(Thermo-Finnigan)進(jìn)行分離。在30-60分鐘的期間進(jìn)行從含0.1%(ν/ν)甲酸(流動(dòng)相Α)至含0.1%(ν/ν)甲酸(流動(dòng)相B)的90%(ν/ν)乙腈的梯度洗脫。將質(zhì)譜儀設(shè)定為獲得三個(gè)掃描事件一次全掃描(從400-2000amu)，繼以兩次數(shù)據(jù)依存性MS/MS掃描。e)生物信息學(xué)分析在自動(dòng)收集了質(zhì)譜峰之后，如下所述處理數(shù)據(jù)。對(duì)所有的譜首先檢查肽分子量的正確校準(zhǔn)。然后對(duì)譜進(jìn)行處理以去除背景噪音，包括對(duì)應(yīng)于胰蛋白酶峰和基質(zhì)的分子量。然后將數(shù)據(jù)針對(duì)公眾可獲得的SwissProt和TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)使用TyrianDiagnostics搜索引擎IonIQv69和/或MASCOT。將PSD數(shù)據(jù)針對(duì)相同數(shù)據(jù)庫(kù)使用內(nèi)部的搜索引擎FragmentastIQ進(jìn)行搜索。還將LCMS-MS數(shù)據(jù)使用SEQUEST搜索引擎軟件針對(duì)該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。6.X仔編■艦iif·碰__膽體對(duì)候選診斷標(biāo)志物和抗體的驗(yàn)證是通過(guò)在來(lái)源于命名為H37Rv的結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株的培養(yǎng)物的全細(xì)胞裂解液(WCL)中，和來(lái)源于命名為CSU93、HN898和⑶C1551的兩個(gè)結(jié)核分枝桿菌臨床菌株的培養(yǎng)物的全細(xì)胞裂解液(WCL)中，使用根據(jù)本發(fā)明任何實(shí)施例所述的擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)來(lái)確定相應(yīng)的內(nèi)源抗原的存在來(lái)進(jìn)行的。亦使用了細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠級(jí)分、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、和全細(xì)胞裂解液的濾過(guò)物。選取在所有菌株中可檢測(cè)出的抗原和抗體以供進(jìn)一步驗(yàn)證。候選診斷標(biāo)志物和抗體的驗(yàn)證還通過(guò)在來(lái)源于非分枝桿菌生物(例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和釀酒酵母)的培養(yǎng)物的全細(xì)胞裂解液(WCL)中使用根據(jù)本發(fā)明下文所述的擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)來(lái)確定相應(yīng)的內(nèi)源抗原的特異性表達(dá)來(lái)進(jìn)行的。還使用了全細(xì)胞裂解液的濾過(guò)物。優(yōu)選在結(jié)核分枝桿菌中特異性檢出的抗原和抗體。候選診斷標(biāo)志物和抗體的驗(yàn)證還通過(guò)在來(lái)源于命名為H37Rv的結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株的培養(yǎng)物的全細(xì)胞裂解液(WCL)中使用根據(jù)本發(fā)明下文所述的擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)來(lái)確定相應(yīng)的內(nèi)源抗原的特異性表達(dá)，并將其與在其他分枝桿菌菌種例如鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌中的表達(dá)相對(duì)比(opposeto)來(lái)進(jìn)行的。亦使用了全細(xì)胞裂解液的濾過(guò)物。優(yōu)選由特定抗體特異性在結(jié)核分枝桿菌中特異性檢測(cè)出的抗原，然而并不舍棄亦表達(dá)于鳥(niǎo)分枝桿菌和/或胞內(nèi)分枝桿菌中的那些。這是因?yàn)闇y(cè)試樣品中任何分枝桿菌的診斷性測(cè)試作為預(yù)先的一般性測(cè)定(genericassay)是有用的，且可與針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的菌種特異性測(cè)試一同使用，例如，使用本文中公開(kāi)的特異性診斷標(biāo)志物和/或培養(yǎng)測(cè)試以確定結(jié)核分枝桿菌的存在與否。7.全細(xì)胞裂解液的制備從凍干的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞中提取蛋白。將細(xì)胞重懸于提取緩沖液，并在砂磨機(jī)(beadmill)中加工以使細(xì)胞破裂并釋放蛋白。通過(guò)離心沉淀細(xì)胞碎片，并使用上清作為全細(xì)胞裂解液(WCL)。進(jìn)行Bradford比色測(cè)定法以估計(jì)蛋白濃度。在一些情況下，使用來(lái)自ColoradoStateUniversity的胞質(zhì)溶膠提取物。8.抗體產(chǎn)生方法抗體通過(guò)用來(lái)源于如后續(xù)實(shí)施例中所述鑒定的結(jié)核分枝桿菌的特異性免疫原性蛋白的合成的免疫原性肽進(jìn)行免疫接種來(lái)制備，或者，通過(guò)用使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)重組手段產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌全長(zhǎng)免疫原性蛋白或結(jié)核分枝桿菌免疫原性蛋白的免疫原性片段來(lái)制備。對(duì)于重組蛋白或片段的產(chǎn)生，將編碼所述免疫原的結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的DNA序列分離并克隆入合適的載體以供在大腸桿菌中表達(dá)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的層析技術(shù)純化表達(dá)的92蛋白或片段。b)單克隆抗體使用全長(zhǎng)重組蛋白，或來(lái)源于全長(zhǎng)序列的肽片段作為抗原根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行抗體產(chǎn)生。將大約5mg肽/蛋白提供給NeoClonhMadison，Wisconsin以供根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行單克隆抗體的生成。提供了約Img肽/蛋白作為生物素化產(chǎn)物以供質(zhì)量控制(qualitycontrol)0用蛋白根據(jù)Neoclone的標(biāo)準(zhǔn)免疫接種方法對(duì)BALB/cByJ雌性小鼠進(jìn)行接種。以規(guī)則的間隔進(jìn)行經(jīng)免疫接種的小鼠的測(cè)試放血以用于使用生物素化的肽的質(zhì)量控制血清ELISA。使用ELISA確定具有最高效價(jià)的多克隆血清。將具有至少1000多克隆抗體效價(jià)的小鼠用于ABL-MYC感染方法。將具有與肽抗原交叉反應(yīng)的多克隆抗體的最高效價(jià)的約3-5只小鼠的脾根據(jù)NeoClone的標(biāo)準(zhǔn)感染方法用于ABL-MYC感染。將經(jīng)ABL-MYC感染的小鼠的脾細(xì)胞移植入約20只未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的(naive)小鼠。分離在經(jīng)移植的小鼠中形成的腹水，并就產(chǎn)生結(jié)合于靶肽抗原的單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞進(jìn)行篩選。分離了產(chǎn)生mAb的細(xì)胞系(即，漿細(xì)胞瘤)。使用ELISA確證了結(jié)合親和性和同種型特異性。將mAb以Iml等分試樣(大約)的腹水與相關(guān)的細(xì)胞系一同提供。對(duì)當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定時(shí)具有高效價(jià)的那些單克隆抗體制備物，如本文中所述進(jìn)行進(jìn)一步的診斷測(cè)試，使用所述單克隆血清作為捕捉和/或檢測(cè)試劑。所述mAb是從腹水使用蛋白G或蛋白A柱純化的。c)多克隆抗體多克隆抗體制備物是針對(duì)全長(zhǎng)重組結(jié)核分枝桿菌蛋白通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)雞或兔進(jìn)行免疫接種來(lái)制備的。就命名而言，命名為“Chx/Y”的多克隆抗血清指包含在雞中制備的單獨(dú)批次“ChX”和“ChY”的匯集制備物。針對(duì)重組結(jié)核分枝桿菌蛋白的多克隆抗體制備物是就其使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，ELISA)測(cè)定時(shí)的高效價(jià)而選取的，并對(duì)其如本文中所述進(jìn)行進(jìn)一步的診斷測(cè)試，使用所述多克隆血清作為捕捉和/或檢測(cè)試劑。8.抗體選擇標(biāo)準(zhǔn)抗體是基于其在ELISA中對(duì)于免疫原的敏感性和特異性進(jìn)行選擇的，其優(yōu)選檢出限(LOD)為，例如在單位點(diǎn)ELISA中少于約lOOng/mL重組抗原，和/或在擴(kuò)增的雙位點(diǎn)ELISA中少于約500pg/mL抗原。還選擇在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌抗原而對(duì)其他分枝桿菌菌種或非分枝桿菌病原體具有很少或不具有交叉反應(yīng)性的抗體。首先通過(guò)使用單位點(diǎn)ELISA在每個(gè)情況下針對(duì)免疫原的反應(yīng)性來(lái)篩選抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，單位點(diǎn)ELISA需要結(jié)合于固體底物的表面的未標(biāo)記的重組免疫原和標(biāo)記的檢測(cè)抗體，例如，偶合于可檢測(cè)標(biāo)志物(如膠體金或生物素)的抗體，其中所述檢測(cè)抗體特異性結(jié)合于包含于固定的免疫原中的靶抗原上的表位。檢測(cè)抗體結(jié)合于所述固定的免疫原，從而使得其固定于所述固體底物，并通過(guò)結(jié)合所述檢測(cè)抗體上的標(biāo)記間接地被標(biāo)記。作為替代或附加手段，進(jìn)行雙位點(diǎn)ELISA，這受制于能否獲得與測(cè)試抗體在雙位點(diǎn)測(cè)試中配對(duì)的抗體。雙位點(diǎn)ELISA需要結(jié)合于固體底物表面的未標(biāo)記的捕捉抗體和標(biāo)記的檢測(cè)抗體，例如，偶合于可檢測(cè)標(biāo)志物(如膠體金或生物素)的抗體，其中捕捉抗體和檢測(cè)抗體均特異性結(jié)合于靶抗原，但分別結(jié)合于靶抗原上不同的或不相互干擾的表位。當(dāng)抗原存在于測(cè)試樣品中時(shí)，檢測(cè)抗體和捕捉抗體將抗原夾在中間(“sandwich")，從而使得其固定于所述固體底物，并通過(guò)結(jié)合所述檢測(cè)抗體上的標(biāo)記間接地被標(biāo)記。一般而言，對(duì)于在雙位點(diǎn)ELISA中具有少于約500pg/mL的LOD的抗體，進(jìn)行Western印跡(WB)免疫電泳以確證所述抗體對(duì)于重組蛋白的特異性，以及存在于全細(xì)胞裂解液中的具有預(yù)期分子量的內(nèi)源結(jié)核分枝桿菌蛋白。簡(jiǎn)言之，將重組蛋白和全細(xì)胞裂解液在一維SDS/聚丙烯酰胺凝膠(10%聚丙烯酰胺Nu-PAGE凝膠)上使用MOPS或MES緩沖液系統(tǒng)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明通過(guò)電泳進(jìn)行分離。將經(jīng)分辨的蛋白使用半干燥電印跡系統(tǒng)(semi-dryelectroblottingsystem)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用針對(duì)對(duì)應(yīng)抗原的一抗探測(cè)所述膜，接著用能夠結(jié)合所述抗體探針的HRP偶合的二抗進(jìn)行探測(cè)。然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)將特異性信號(hào)顯影，并使用X射線膠片繼以掃描或使用Fuji-LAS-3000成像儀獲取圖像，以直接地從經(jīng)處理的印跡獲取圖像。對(duì)于每個(gè)經(jīng)測(cè)試的抗原，對(duì)Western印跡條件就所需的一抗和二抗的稀釋程度進(jìn)行優(yōu)化以提供最優(yōu)的信噪比(數(shù)據(jù)未顯示)。將復(fù)制印跡(r印licablot)用一抗和二抗(陽(yáng)性對(duì)照)或者僅用二抗(陰性對(duì)照)進(jìn)行探測(cè)。這些Western數(shù)據(jù)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)得以確證，在所述實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行Western印跡之前，將一抗用摩爾過(guò)量的重組免疫原在溶液中預(yù)溫育以由此競(jìng)爭(zhēng)在經(jīng)分辨的蛋白上的表位。因此，在Western印跡中信號(hào)的喪失確證了起初對(duì)抗體特異性的結(jié)論。簡(jiǎn)言之，如前文所述進(jìn)行Western印跡，只不過(guò)將一抗用100至200摩爾過(guò)量的相應(yīng)重組蛋白進(jìn)行預(yù)溫育。用通常方法探測(cè)印跡。9.抗體對(duì)的詵擇對(duì)于抗體對(duì)的選擇，使用符合前述部分中所述的抗體選擇標(biāo)準(zhǔn)可獲得的最敏感的抗體進(jìn)行雙位點(diǎn)ELISA。在選擇抗體對(duì)的語(yǔ)境下，進(jìn)行雙位點(diǎn)ELISA時(shí)，本發(fā)明人將候選抗體在兩種配置中分別用于檢測(cè)抗體和捕捉抗體，以由此確定捕捉抗體和檢測(cè)抗體的最優(yōu)配置。一般而言，對(duì)于每個(gè)測(cè)試的捕捉抗體濃度針對(duì)重組免疫原的滴定以不同稀釋程度使用檢測(cè)抗體。用于此目的的優(yōu)選檢測(cè)抗體為生物素化的抗體，其可使用多HRP偶合的鏈霉抗生物素蛋白進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)無(wú)法獲得生物素化的檢測(cè)抗體時(shí)，優(yōu)選的檢測(cè)抗體包括下述未標(biāo)記的檢測(cè)抗體，所述抗體可通過(guò)順序結(jié)合(i)針對(duì)所述檢測(cè)抗體的生物素化的二抗(例如，抗兔Ig或抗雞Ig或抗小鼠Ig)和(ii)針對(duì)結(jié)合的生物素化二抗的多HRP偶合的鏈霉抗生物素蛋白來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。10.ELISA形式a)單位點(diǎn)ELISA將NUNC板用重組蛋白的系列稀釋進(jìn)行包被，并在4°C溫育過(guò)夜。在封閉之后，將板用測(cè)試抗體的多種稀釋繼以HRP偶合的二抗和TMB進(jìn)行溫育。每個(gè)反應(yīng)的體積是50μ1。在每次添加之間洗滌板。免疫反應(yīng)通過(guò)基于視覺(jué)檢查顯色所得的合適時(shí)間(通常約30分鐘)之后通過(guò)添加0.5ΜH2SO4中止，并在微板讀數(shù)器中在450nm和620nm的波長(zhǎng)讀取OD。將所得的數(shù)據(jù)輸出到MicrosoftExcel，其中記錄DeltaOD(0D450-620)(稱作0D)以供數(shù)據(jù)分析。所述測(cè)定法的敏感性如下所述進(jìn)行確定，并表示為L(zhǎng)ODAbT。對(duì)具有少于約100ng/mL的LODAbT的抗體就其在夾心ELISA中作為捕捉抗體或檢測(cè)抗體適合性進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。b)標(biāo)準(zhǔn)雙位點(diǎn)或“夾心”ELISA標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA是使用所選的抗體對(duì)進(jìn)行的，例如，以確定其作為捕捉抗體或檢測(cè)抗體的適合性。用多種稀釋程度的捕捉抗體包被NUNC免疫板，然后將其順序用相關(guān)的重組蛋白或包含測(cè)試免疫原的全細(xì)胞裂解液濾過(guò)物，以及多種稀釋程度的檢測(cè)抗體、HRP偶合的二抗和SIGMATMB進(jìn)行溫育。每個(gè)反應(yīng)的體積為50μ1。在每次添加之間洗滌板。免疫反應(yīng)通過(guò)基于視覺(jué)檢查顯色所得的合適時(shí)間(通常約30分鐘)之后通過(guò)添加0.5ΜH2SO4中止，并在微板讀數(shù)器中在450nm和620nm的波長(zhǎng)讀取OD。將所得的數(shù)據(jù)輸出至MicrosoftExcel以供分析。測(cè)定法的敏感性如下所述進(jìn)行確定，并稱作L0D;選擇產(chǎn)生最低LOD得分(例如，少于約3ng/mL)的抗體對(duì)以供在擴(kuò)增的夾心ELISA中進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。c)擴(kuò)增的夾心ELISA擴(kuò)增的夾心ELISA如本文中上述的標(biāo)準(zhǔn)夾心ELISA來(lái)進(jìn)行，并通過(guò)相同方法進(jìn)行分析，只不過(guò)將板用生物素化的檢測(cè)抗體或檢測(cè)抗體繼以生物素化的二抗進(jìn)行溫育。擴(kuò)增是通過(guò)添加50μ1多種稀釋程度的多聚80-HRP-鏈霉抗生物素蛋白繼以50μ1的PierceTMB來(lái)達(dá)成的。選擇產(chǎn)生最低LOD得分(例如，少于約500pg/mL)的抗體對(duì)。d)ELISA數(shù)據(jù)分析將ELISA數(shù)據(jù)輸出至MicrosoftExcel進(jìn)行分析。使用X-Y圖對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行作圖，使得平均OD+SD(0D=OD450nm-OD620J置于Y軸，而重組蛋白/肽濃度(例如，pg/mL)置于X軸(對(duì)數(shù)尺度)。使用變異系數(shù)(計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)偏差除以平均值，并表示為百分比CV%)作為測(cè)定法內(nèi)和測(cè)定法間變異性的量度。使用GraphPadPrism軟件用標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合4_參數(shù)的對(duì)數(shù)曲線。未知樣品的抗原濃度是通過(guò)將OD值在生成的曲線上內(nèi)插來(lái)確定的。e)檢出限(L0D值)的確定當(dāng)可獲得合適的校準(zhǔn)曲線時(shí)，在雙位點(diǎn)“夾心”ELISA中抗體對(duì)的檢出限(LOD)定義為使用GraphPadPrism軟件中可獲得的功能，產(chǎn)生等同于平均基線指加3xSD的OD值的免疫原濃度。對(duì)于單位點(diǎn)ELISA，或?qū)τ跓o(wú)法獲得校準(zhǔn)曲線的夾心ELISA，使用MicrosoftExcel估計(jì)抗體或抗體對(duì)的L0D。對(duì)于每個(gè)分析的免疫原性蛋白，使用來(lái)自ELISA劑量響應(yīng)曲線的吸光度數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算LOD值。對(duì)于單位點(diǎn)ELISA對(duì)于單位點(diǎn)ELISA數(shù)據(jù)或雙位點(diǎn)ELISA數(shù)據(jù)，當(dāng)數(shù)據(jù)點(diǎn)不足以使軟件應(yīng)用非線性回歸曲線擬合功能時(shí)，在Excel中獲得LOD的估計(jì)。如下所述確定劑量響應(yīng)曲線的基線和基線平均0D+3xSD確定吸光度的增值，其計(jì)算為對(duì)于給定免疫原濃度的吸光度和下一個(gè)更高免疫原濃度的吸光度之間的差值。當(dāng)吸光度的增值低于約0.050D單位時(shí)，該時(shí)間點(diǎn)視為基線的起點(diǎn)。使用重復(fù)樣品在視為的基線起點(diǎn)處以及下兩個(gè)增值點(diǎn)處的的吸光度平均值和SD來(lái)計(jì)算該系列的平均值+3xSD。產(chǎn)生大于平均基線0D+3xSD的吸光度的免疫原濃度視為L(zhǎng)OD值。對(duì)于夾心ELISA:在一個(gè)方法中，將重組蛋白/肽免疫原的濃度，S卩“Iogltl[免疫原]，，值和從夾心ELISA獲得的重復(fù)的吸光度值轉(zhuǎn)移至為了從原始ELISA數(shù)據(jù)自動(dòng)計(jì)算所需值而生成的Excel工作表模板。生成R2值作為對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好程度的估計(jì)，且大于約0.99的值被接受為良好的擬合。還計(jì)算了99%置信區(qū)間(Cl)值的范圍。在擬合曲線的底部漸近線范圍中從擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中內(nèi)插得到最大值。所述內(nèi)插值，當(dāng)取反對(duì)數(shù)時(shí)，表示具有等于平均基線值加3xSD的OD值的重組蛋白濃度。該值，稱作LOD值，視為表明所述ELISA的敏感性。或者，將Iogltl[免疫原]和相應(yīng)的重復(fù)吸光度值輸出至GraphPadPrism，其中使用非線性回歸曲線擬合功能來(lái)將數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合至4-參數(shù)對(duì)數(shù)曲線。使用非線性回歸曲線擬合功能將數(shù)據(jù)擬合至S形曲線(sigmoidcurve)0生成R2值作為對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好程度的估計(jì)，且大于約0.99的值被接受為良好的擬合。對(duì)應(yīng)于基線平均值吸光度(OD)加3xSD的重組蛋白/肽免疫原濃度是從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插得到的。實(shí)施例2使用結(jié)合于乙酮醇酸結(jié)核分枝桿菌還原異構(gòu)酶(KARI)的對(duì)由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的基于抗原的診斷1.在TB陽(yáng)件警試者中鑒定KARI蛋白在TB+樣品中識(shí)別出具有約36kDa分子量的蛋白。來(lái)自MALDI-T0F數(shù)據(jù)的十個(gè)肽的序列與SEQIDNO:1所述的結(jié)核分枝桿菌ilvC基因編碼的序列匹配。該10個(gè)肽對(duì)SEQIDNO1的覆蓋百分比為約37%，表明所述肽片段來(lái)源于該同一個(gè)蛋白標(biāo)志物。具有SEQIDNO:1所述的氨基酸序列的鑒定的蛋白為推定的乙酮醇酸還原異構(gòu)酶，并命名為“KARI”。2.抗體多克隆抗體是使用標(biāo)準(zhǔn)方法針對(duì)由結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因編碼的重組KARI蛋白制備的。單克隆抗體是使用ABL-MYC技術(shù)(NeoClone,MadisonWI53713，USA)以產(chǎn)生分泌針對(duì)由結(jié)核分枝桿菌的ilvC基因編碼的全長(zhǎng)重組KARI蛋白的單克隆抗體(mAb)，以及針對(duì)所述全長(zhǎng)蛋白的肽片段的單克隆抗體(mAb)的細(xì)胞系來(lái)制備的。用于制備單克隆抗體的肽片段包含全長(zhǎng)蛋白的下述氨基酸區(qū)域a)SEQIDNO1的殘基40_56，任選地添加C-端半胱氨酸殘基；b)SEQIDNO1的殘基290-300，任選地添加C-端半胱氨酸殘基；和c)SEQIDNO=I的殘基298-310，任選地添加C-端半胱氨酸殘基。產(chǎn)生了超過(guò)十個(gè)抗體，包括多克隆和單克隆抗體制備物，并就其適合性如實(shí)施例1所述進(jìn)行篩選。具體而言，產(chǎn)生了命名為“Ch34/35”的多克隆抗體制備物，以及幾種單克隆抗體制備物，例如，命名為Mol283F、MolE7、Mo2C7、Mo3A2、Mo2Bl、Mo4F7、Mo3C3、MolCIO、Mo4C10、MolF6、Mo2D6、Mo3H3和Mo4Dll的。命名為Ch34/35、Mol283F、MolF6和Mo2Bl的抗體是針對(duì)重組KARI蛋白制備的。命名為Mo4F7和Mo4C10的抗體是針對(duì)包含SEQIDNO1的殘基40_56的合成肽產(chǎn)生的。命名為Mo2D6的抗體是針對(duì)包含SEQIDNO1的殘基290-300的合成肽制備的。命名為MolA4、MolH2、Mo2E5、Mo2G2、Mo3H3、Mo4C3、Mo4D2和Mo4Dll的單克隆抗體是針對(duì)包含SEQIDNO1的殘基298-310的合成肽來(lái)制備的，且在這些制備物中，Mo3H3和Mo4Dll在ELISA中具有最高的效價(jià)。將抗體如實(shí)施例1所述進(jìn)行篩選以確定最優(yōu)的抗體對(duì)和在雙位點(diǎn)ELISA中優(yōu)選的取向。在一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于小鼠的單克隆抗體Mol283F作為捕捉抗體而來(lái)源于雞的多克隆抗體Ch34/35作為檢測(cè)載體，例如，參見(jiàn)圖1-14。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于小鼠的單克隆抗體Μο2Β1(或簡(jiǎn)稱為“2B1”)作為捕捉抗體，并配以來(lái)源于雞的抗體Ch34/35作為檢測(cè)抗體，例如，參見(jiàn)圖15_23e。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于小鼠的單克隆抗體MolF6(或簡(jiǎn)稱為“1F6”)作為捕捉抗體，并配以來(lái)源于小鼠的單克隆抗體Μο2Β1作為檢測(cè)抗體，例如，參見(jiàn)圖24和28。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于小鼠的單克隆抗體Mo2D6(或簡(jiǎn)稱為“2D6”)作為捕捉抗體，并配以來(lái)源于小鼠的單克隆抗體Μο2Β1作為檢測(cè)抗體，例如，參見(jiàn)圖28。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用來(lái)源于雞的抗體Ch34/35作為捕捉抗體，并配以單克隆抗體Μο2Β1作為檢測(cè)抗體，例如，參見(jiàn)圖29。還在另一個(gè)實(shí)施例中，使用單克隆抗體2B1作為捕捉抗體，并配以單克隆抗體1F6作為檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用單克隆抗體2B1作為捕捉抗體，并配以單克隆抗體2D6作為檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用單克隆抗體2D6作為捕捉抗體，并配以單克隆抗體1F6作為檢測(cè)抗體。在另一個(gè)實(shí)施例中，使用單克隆抗體1F6作為捕捉抗體，并配以單克隆抗體2D6作為檢測(cè)抗體。并未排除其他的取向和抗體的組合。3.KARI蛋白的線件表位定位將針對(duì)KARI蛋白和肽制備的抗體針對(duì)一組(apepsetof)來(lái)源于SEQIDNO1中所述的全長(zhǎng)KARI蛋白的序列的合成肽來(lái)進(jìn)行篩選，以在全長(zhǎng)蛋白上定位線性B-細(xì)胞表位。數(shù)據(jù)(未顯示)表明結(jié)核分枝桿菌的全長(zhǎng)KARI蛋白包含下述線性B-細(xì)胞表位，其可用作診斷性肽基試劑，并用于制備診斷抗體a)SEQIDNO1的殘基1-23；b)SEQIDNO1的殘基40-71，且優(yōu)選SEQIDNO1的殘基57-71;c)SEQIDNO1的殘基97-111；d)SEQIDNO1的殘基169-199；e)SEQIDNO1的殘基265-279；f)SEQIDNO1的殘基290-300；優(yōu)選SEQIDNO1的殘基298-300；禾口g)SEQIDNO1的殘基313-333。舉例而言，單克隆抗體Mol283F結(jié)合于SEQIDNO1的殘基97-111之內(nèi)；單克隆抗體Mo4F7和Mo4C10結(jié)合于SEQIDNO:1的殘基40-56之內(nèi)；而單克隆抗體Mo2D6結(jié)合于SEQIDNO:1的殘基290-300之內(nèi)，并優(yōu)選與SEQIDNO:1的298-300結(jié)合。參見(jiàn)，例如，圖24-28。對(duì)這些線性B-細(xì)胞表位區(qū)域(a)至(g)的精細(xì)定位是通過(guò)測(cè)試針對(duì)KARI蛋白的抗體結(jié)合于在這些區(qū)域內(nèi)或與這些區(qū)域重疊的5聚體肽的能力，和/或這些抗體結(jié)合于相對(duì)于基礎(chǔ)序列(即，SEQIDNO1)包含氨基酸取代的突變體肽的能力來(lái)進(jìn)行的。作為替代或附加手段，對(duì)這些線性B-細(xì)胞表位區(qū)域(a)至(g)的精細(xì)定位是通過(guò)測(cè)試在這些區(qū)域內(nèi)或與這些區(qū)域重疊的5聚體肽，和/或相對(duì)于基礎(chǔ)序列(即，SEQIDNO1)包含氨基酸取代的突變體肽，引發(fā)結(jié)合于KARI蛋白的抗體的產(chǎn)生的能力來(lái)進(jìn)行的。4.驗(yàn)證KARI及針對(duì)其的抗體作為診斷試劑將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的KARI蛋白的氨基酸序列表示為SEQIDNO=I0其翻譯產(chǎn)物具有約36kDa的預(yù)期分子量?；旧先鐚?shí)施例1所述進(jìn)行的對(duì)經(jīng)六組氨酸標(biāo)記的rKARI蛋白的一維SDS/PAGE分析顯示所述KARI蛋白作為大約37kDa的單一條帶遷移(數(shù)據(jù)未顯示)，其為基于翻譯產(chǎn)物和六組氨酸標(biāo)記部分理論分子量的融合蛋白預(yù)期分子量。使用ELISA捕捉抗體(Mol283F)和檢測(cè)抗體(Ch34/35)分別進(jìn)行Western印跡分析，以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌H37Rv、結(jié)核分枝桿菌CSU93和結(jié)核分枝桿菌HN878的全細(xì)胞裂解液中的重組KARI蛋白和內(nèi)源KARI蛋白。兩個(gè)抗體均在來(lái)源于所有三個(gè)結(jié)核分枝桿菌菌株的全細(xì)胞裂解液中識(shí)別具有天然KARI蛋白預(yù)期分子量(即，約36kDa)的條帶，并檢測(cè)出略微較大的重組KARI蛋白(圖13)。結(jié)合為高度特異性的，幾乎無(wú)背景。因此，可獲得的數(shù)據(jù)確證了抗體Mol283F和Ch34/35對(duì)于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的特異性?；旧先鐚?shí)施例1所述進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性Western印跡分析也表明多克隆抗體Ch34/35與重組的KARI蛋白和內(nèi)源KARI蛋白的結(jié)合可通過(guò)將抗體與過(guò)量濃度的未標(biāo)記的重組KARI蛋白預(yù)溫育來(lái)消除(圖13)?？傊?，可獲得的數(shù)據(jù)表明抗體Mol283F和Ch34/35抗體特異性結(jié)合于結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白。在類似的實(shí)驗(yàn)中，顯示命名為Mo2Bl、MolE7、Mo2C7和Mo3A2的單克隆抗體特異性結(jié)合于培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌H37Rv的全細(xì)胞裂解液(WCL)(泳道3)，且命名為Μο2Β1和Mo3A2的抗體亦在Western印跡中結(jié)合于重組KARI蛋白(圖14)。5.供檢測(cè)丨結(jié)核分fe桿菌KARI蛋白的擴(kuò)增的夾心ELISA擴(kuò)增ELISA基本上如本實(shí)施例和實(shí)施例1中所述進(jìn)行，使用5μg/mL的Mol283F抗體作為捕捉試劑，而2.5μg/mL的Ch34/35多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，以及用生物素化的二抗與HRP偶合的鏈霉抗生物素蛋白以檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。在圖1中表示的數(shù)據(jù)表明在測(cè)試的測(cè)定條件下，并使用這種雖然并非必需的，但為優(yōu)選的抗體取向，具有低背景噪音和約1690pg/mL的L0D。本發(fā)明人認(rèn)為在夾心ELISA中上述檢測(cè)的敏感性連同低背景落在有用的限制范圍內(nèi)。6.抗-KARI抗體與不同結(jié)核分feffIf分離株t丨旬的交叉反應(yīng)個(gè)牛為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)KARI作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，并評(píng)價(jià)針對(duì)KARI蛋白制備的抗體的特異性，本發(fā)明人比較了結(jié)核分枝桿菌臨床菌株CSU93和HN878與結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株H93Rv的細(xì)胞提取物之間，抗體在如上所述進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mol283F包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)分離株的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1稀釋的二抗(例如，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。將樣品在全細(xì)胞提取物的三個(gè)稀釋中重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定?；贙ARI蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化水平產(chǎn)生校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖2中表示的數(shù)據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白以可比較的水平存在于臨床結(jié)核分枝桿菌分離株CSU93和實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv中。在結(jié)核分枝桿菌H878中可檢測(cè)出較低水平的KARI蛋白，表明針對(duì)KARI蛋白的抗體可能無(wú)法分辨具體的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株。還在使用單克隆抗體Μο2Β1作為捕捉抗體而Ch34/35作為檢測(cè)抗體在擴(kuò)增的夾心ELISA中進(jìn)行的一組類似實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了這些數(shù)據(jù)(圖15)。圖15中的數(shù)據(jù)還表明H37Rv和另一種臨床分離株⑶C1551之間具有可比較的水平。在圖2和15中表示的數(shù)據(jù)并未否認(rèn)(abrogate)針對(duì)KARI蛋白的抗體在一般的單分析物診斷測(cè)試中，或者作為多分析物測(cè)試一部分與如本文所述或本領(lǐng)域已知的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特定菌株的抗體一同使用時(shí)的有用性。舉例而言，若需要，可將針對(duì)KARI蛋白的抗體與來(lái)自KARI陽(yáng)性臨床樣本的結(jié)核分枝桿菌的后續(xù)培養(yǎng)物一同使用以產(chǎn)生關(guān)于樣品中存在的臨床相關(guān)菌株的信息。為了確定KARI表達(dá)是否限于特定的亞細(xì)胞級(jí)分，或是否所述蛋白在HN878中的較低水平是由于在特定亞細(xì)胞級(jí)分中的抑制蛋白，對(duì)H37Rv、HN878和CDC1551的胞質(zhì)溶膠級(jí)分、細(xì)胞膜級(jí)分和細(xì)胞壁級(jí)分進(jìn)行擴(kuò)增ELISA，使用Μο2Β1作為捕捉抗體，而Ch34/35作為檢測(cè)抗體。在圖16-19中表示的數(shù)據(jù)表明KARI蛋白可在每個(gè)級(jí)分中檢測(cè)出，而在每個(gè)級(jí)分中KARI蛋白的相對(duì)水平與細(xì)胞裂解液中的水平一致。7.不同分枝桿菌菌種之間的交叉反應(yīng)件為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)KARI作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，并評(píng)價(jià)針對(duì)KARI蛋白制備的抗體的特異性，本發(fā)明人比較了在分枝桿菌菌種結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的細(xì)胞提取物之間，抗體在如上所述進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mol283F包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)分枝桿菌菌種的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原_抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1稀釋的二抗(例如，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。將樣品在全細(xì)胞提取物的三個(gè)稀釋中重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定。基于KARI蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化水平產(chǎn)生校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。類似的實(shí)驗(yàn)是使用單克隆抗體Μο2Β1作為捕捉試劑而Ch34/35多克隆抗體用作檢測(cè)試劑來(lái)進(jìn)行的。在圖3、4和21中表示的數(shù)據(jù)顯示在三個(gè)分枝桿菌菌種之間具有可檢測(cè)出但是低的交叉反應(yīng)性，表明結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白可能更適于在這些測(cè)定條件下使用Μο2Β1作為捕捉試劑進(jìn)行物種特異性的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)。這并不否認(rèn)Mol283F或Μο2Β1，或其他針對(duì)KARI蛋白的抗體在一般的單分析物診斷測(cè)試，或者作為多分析物測(cè)試一部分與如本文所述或本領(lǐng)域已知的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的菌種特異性標(biāo)志物的抗體一同使用時(shí)的有用性。舉例而言，可將針對(duì)KARI蛋白的抗體與來(lái)自KARI陽(yáng)性臨床樣本的結(jié)核分枝桿菌的后續(xù)培養(yǎng)物一同使用。作為替代或附加手段，可將針對(duì)KARI蛋白的抗體與具有與其他測(cè)試的分枝桿菌的低交叉反應(yīng)性的一種或多種針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rvl265和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌EF-Tu和/或結(jié)核分枝桿菌S9蛋白的抗體如本文中所述同時(shí)使用。在解釋上述多分析物測(cè)試時(shí)，針對(duì)KARI蛋白的抗體的結(jié)合表明臨床樣品中分枝桿菌的存在，而附加的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rv1265和/或結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌EF-Tu和/或結(jié)核分枝桿菌S9蛋白的抗體結(jié)合表明更高可能性的結(jié)核分枝桿菌感染。對(duì)于上述應(yīng)用，特別優(yōu)選針對(duì)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體和一種或多種針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rvl265蛋白的抗體以及針對(duì)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的組合，基于針對(duì)Rvl265和BSX的抗體與鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的低交叉反應(yīng)性。8.■碰、日1_對(duì)刷牛為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)KARI作為在生物樣品中的結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，本發(fā)明人比較了在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(實(shí)驗(yàn)室菌株)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和釀酒酵母的細(xì)胞提取物之間進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的抗體交叉反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mol283F或Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)微生物的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原_抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1二抗(即，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。在圖5、20和21中表示的數(shù)據(jù)未顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的抗體與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、或釀酒酵母細(xì)胞提取物在測(cè)試條件下有顯著的交叉反應(yīng)性，表明所述抗體形成了結(jié)核分枝桿菌特異性測(cè)試的基礎(chǔ)。9.在臨床樣品中檢測(cè)KARI蛋白為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)KARI作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，本發(fā)明人確定了抗體在從TB陽(yáng)性受試者獲得的臨床樣品中檢測(cè)內(nèi)源KARI蛋白的能力，所述受試者是之前根據(jù)涂片測(cè)試和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)測(cè)定法的結(jié)果診斷的。將患者根據(jù)涂片測(cè)試和培養(yǎng)測(cè)試的結(jié)果，和HIV狀態(tài)分類。所有測(cè)試的受試者均為涂片陰性且培養(yǎng)陰性，或者，涂片陽(yáng)性且培養(yǎng)陽(yáng)性。簡(jiǎn)言之，如本文中如上所述對(duì)痰樣品進(jìn)行夾心ELISA，所述痰是通過(guò)方法3制備的，并作為17x150微升等分試樣在替代擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法(見(jiàn)下)下進(jìn)行測(cè)定。將ELISA板用捕捉抗體Mol283F或Μο2Β1包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將經(jīng)處理的痰添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中。作為對(duì)于每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原后，將檢測(cè)抗體Ch34/35與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1二抗溫育(即，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)一小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘并確定450-620nm的吸光度。在圖6、7和10-12中表示的數(shù)據(jù)(Mol283F:Ch34/35抗體對(duì))和在圖23a_e中表示的數(shù)據(jù)(Mo2Bl:Ch34/35抗體對(duì))顯示在所有測(cè)試的TB陽(yáng)性樣品中檢測(cè)出顯著較高水平的KARI蛋白，所述陽(yáng)性樣品之前顯示為涂片陽(yáng)性和/或培養(yǎng)陽(yáng)性。在絕大多數(shù)TB涂片陰性樣品中檢測(cè)出背景信號(hào)。然而，少數(shù)涂片陰性樣品針對(duì)結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白使用兩種抗體組合均測(cè)試為陽(yáng)性(圖11、12和圖23a-c)，表明替代測(cè)定法(例如，涂片測(cè)試)和/或如根據(jù)本文任何實(shí)施例所述的其他使用針對(duì)BSX和/或Rvl265和/或S9的抗體基于抗原的測(cè)試在增強(qiáng)所述測(cè)定法的特異性或確證針對(duì)KARI蛋白結(jié)果方面的有用性。舉例而言，如本文表1所示，本文中例示的6/7的涂片陰性，針對(duì)KARI蛋白測(cè)試100為陽(yáng)性的樣品顯示為針對(duì)其他本文中例示的抗原(例如，S9蛋白和/或BSX蛋白和/或Rvl265蛋白)為陰性的。還對(duì)針對(duì)KARI蛋白測(cè)試為陽(yáng)性的涂片陰性樣品就本文中所述的其他蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了篩選，如果平均信號(hào)大于測(cè)定緩沖液空白以上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，則將其記錄為陽(yáng)性。表1涂片陰性臨床樣品的檢測(cè)涂片測(cè)試樣品IDKARI(ilvC)Rvl265BSXS90MPC364陽(yáng)性陰性陰性陰性0MPC363陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陰性0MPC375陽(yáng)性有疑問(wèn)0MPC388陽(yáng)性陰性0MPC339陽(yáng)性陰性陰性0MPC311陽(yáng)性陽(yáng)性陰性陰性0MPC313陽(yáng)性陰性陰性陰性10.評(píng)估樣品對(duì)信號(hào)的抑制為了評(píng)價(jià)是否在痰中存在可能不利地影響測(cè)定敏感性(例如，在ELISA或護(hù)理位置(point-of-care)或現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)(fieldtest)形式中)的抑制性或信號(hào)抑制性(signal-suppressing)因子，將痰樣品摻以lOng/mL重組結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白，并將所得的樣品分三步127(v/v)系列稀釋。將樣品溫育過(guò)夜，并如上所述通過(guò)擴(kuò)增ELISA分析，或立即測(cè)定。在圖8和9中表示的數(shù)據(jù)(右下小圖，標(biāo)為“ilvC”)表明痰包含一些抑制KARI蛋白信號(hào)檢測(cè)的因子，因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度在添加未稀釋的痰之后減少，無(wú)論所述測(cè)定法是否立即進(jìn)行或在溫育過(guò)夜之后進(jìn)行。然而，該信號(hào)強(qiáng)度的喪失可通過(guò)稀釋痰進(jìn)行性地抑制，且將痰稀釋至少約19(ν/ν)時(shí)很大程度上阻止了信號(hào)強(qiáng)度的喪失。信號(hào)強(qiáng)度還在過(guò)夜溫育痰中的重組蛋白之后減少，且該信號(hào)強(qiáng)度的喪失也可部分地通過(guò)稀釋痰樣品來(lái)阻止。這些數(shù)據(jù)表明推薦將痰19(ν/ν)稀釋至封閉緩沖液中并快速分析樣品來(lái)增強(qiáng)在這些條件下測(cè)定KARI蛋白的信號(hào)強(qiáng)度。11.在分枝桿菌中細(xì)胞可檢測(cè)出的KARI蛋白的相對(duì)水平為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)KARI作為分枝桿菌感染的診斷性標(biāo)志物的適合性，確定在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv、CSU93和ΗΝ878以及結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌全細(xì)胞裂解液中相對(duì)于本文中所述的其他10個(gè)結(jié)核分枝桿菌抗原(包括BSX、EF-Tu,P5CR、Rvl265、S9和TetR樣蛋白)的KARI蛋白的水平?；旧先缭搶?shí)施例和實(shí)施例1中所述進(jìn)行擴(kuò)增的夾心ELISA，以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法鑒定每種抗原的相對(duì)水平，并包括了校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)以使得量化成為可能。示于圖122-125的數(shù)據(jù)表明KARI在所有三種測(cè)試的結(jié)核分枝桿菌菌株中當(dāng)基于總細(xì)胞蛋白表示時(shí)，是相對(duì)豐富的蛋白。據(jù)此，在測(cè)試的11個(gè)免疫原性蛋白中，結(jié)核分枝桿菌Rvl265、BSX和S9也是相對(duì)豐富的。示于圖126-132的數(shù)據(jù)表明KARI蛋白一般地在分枝桿菌菌種中也是相對(duì)豐富的蛋白，而其他測(cè)試的主要免疫原性蛋白，即BSX、Rvl265和S9，當(dāng)基于細(xì)胞表示時(shí)(圖104-105)或基于全細(xì)胞裂解液蛋白的微克數(shù)時(shí)(圖128-129)或基于全細(xì)胞裂解液濾過(guò)物的微升數(shù)時(shí)(圖130-131)，似較之KARI具有對(duì)結(jié)核分枝桿菌更強(qiáng)的特異性。這些數(shù)據(jù)表明了KARI作為結(jié)核分枝桿菌感染類別性的(generic)單分析物標(biāo)志物，或作為針對(duì)分枝桿菌感染或結(jié)核分枝桿菌感染的多分析物測(cè)試的一部分與BSX和/或Rvl265和/或S9蛋白組合時(shí)的有用性。并未排除其他用于對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染進(jìn)行多分析物測(cè)試的組合和/或?qū)?duì)KARI蛋白的測(cè)定與涂片測(cè)試組合。12.優(yōu)化檢出限為了進(jìn)一步增強(qiáng)夾心ELISA的敏感性，使用替代性擴(kuò)增方法以在用捕捉抗體包被所述ELISA板之后進(jìn)行反復(fù)的抗原結(jié)合?；旧?，這會(huì)導(dǎo)致結(jié)合于捕捉抗體的抗原量增加，盡管96-孔ELISA板的50μ1體積限制。簡(jiǎn)言之，該反復(fù)的抗原加載涉及在夾心ELISA中在洗滌并添加檢測(cè)抗體之前重復(fù)幾次抗原結(jié)合步驟，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每個(gè)等分試樣的抗原樣品是在標(biāo)準(zhǔn)的溫育期間之后，下一等分試樣添加之前去除的?？尚薷闹貜?fù)數(shù)以優(yōu)化測(cè)定法(例如，參數(shù)如信噪比、檢出限和在半最大信號(hào)處檢測(cè)出的抗原量)，這取決于測(cè)試的樣品的特性(例如，樣品類型)，而無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)。舉例而言，可使用多至約20次重復(fù)樣品加載(即，多至20χ替代性擴(kuò)增)以提供結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白的低背景信號(hào)和降低的檢出限。實(shí)施例3使用結(jié)合于命名為BSX的推定的結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的抗體進(jìn)行的由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的基于抗原的診斷1.在TB陽(yáng)性受試者中鑒定BSX蛋白在TB+樣品中識(shí)別出具有約15kDa分子量的蛋白。來(lái)自MALDI-T0F數(shù)據(jù)的十二個(gè)肽的序列與SEQIDNO2所述的結(jié)核分枝桿菌pbsX基因編碼的序列匹配。該12個(gè)肽對(duì)SEQIDNO:2的覆蓋百分比為約70%，表明所述肽片段來(lái)源于該同一個(gè)蛋白標(biāo)志物。具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列的蛋白鑒定為結(jié)核分枝桿菌推定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，并命名為“BSX”。2.抗體針對(duì)重組BSX蛋白制備了四十六(46)個(gè)抗體，并針對(duì)通過(guò)對(duì)合成肽的PEPSET進(jìn)行線性B-細(xì)胞表位篩選衍生的免疫原性BSX肽制備了幾種抗體，所述篩選掃描BSX蛋白的氨基酸序列。獲得了多克隆和單克隆抗體，并就其適合性如本文中或?qū)嵤├?中所述進(jìn)行篩選。該方法導(dǎo)致鑒定了如該實(shí)施例所述供診斷結(jié)核分枝桿菌的幾個(gè)抗體對(duì)。除了那些具體描述于該實(shí)施例中的抗體組合和抗體取向之外，本發(fā)明還涵蓋多種抗體組合和抗體取向，包括例示的抗體以任何取向(例如，作為捕捉或檢測(cè)抗體)的任何組合。3.使用抗體Mo639F和Ch12/13驗(yàn)證作為診斷標(biāo)志物的BSX針對(duì)結(jié)核分枝桿菌制備的抗體包括命名為“Mo639F”的來(lái)源于小鼠的抗體和命名為“Chl2/13”的來(lái)源于雞的多克隆抗體。這些抗體與其他抗體一同用于驗(yàn)證BSX作為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的診斷標(biāo)志物。在一個(gè)實(shí)施例中，如下所述，將所述抗體用于說(shuō)明在結(jié)核分枝桿菌全細(xì)胞提取物中對(duì)BSX的特異性檢測(cè)。將來(lái)自結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的BSX蛋白的氨基酸序列表示為SEQIDNO:2。其翻譯產(chǎn)物具有約16kDa的預(yù)期分子量?；旧先鐚?shí)施例1所述進(jìn)行的對(duì)經(jīng)六組氨酸標(biāo)記的rBSX蛋白的一維SDS/PAGE分析顯示所述BSX蛋白作為大約17kDa的單一條帶遷移(數(shù)據(jù)未顯示)，其為基于翻譯產(chǎn)物和六組氨酸標(biāo)記部分理論分子量預(yù)期的融合蛋白的分子量。使用ELISA捕捉抗體(Mo639F)和檢測(cè)抗體(Chl2/13)分別進(jìn)行Western印跡分析，以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌H37Rv、結(jié)核分枝桿菌CSU93和結(jié)核分枝桿菌HN878的全細(xì)胞裂解液中的重組BSX蛋白和內(nèi)源BSX蛋白。兩個(gè)抗體均在來(lái)源于所有三個(gè)結(jié)核分枝桿菌菌株的全細(xì)胞裂解液中識(shí)別具有天然BSX蛋白預(yù)期分子量(即，約16kDa)的條帶，并檢測(cè)出略微較大的重組BSX蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)?？蓹z測(cè)出極低的背景或無(wú)背景。因此，可獲得的數(shù)據(jù)確證了抗體Mo639F和Chl2/13對(duì)于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的特異性?；旧先鐚?shí)施例1所述進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性Western印跡分析表明多克隆抗體Chl2/13與重組的BSX蛋白和內(nèi)源BSX蛋白的結(jié)合可通過(guò)將抗體與過(guò)量濃度的未標(biāo)記的重組BSX蛋白預(yù)溫育來(lái)消除(數(shù)據(jù)未顯示)?？傊?，可獲得的數(shù)據(jù)表明抗體Mo639F和Chl2/13可用于在實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)核分枝桿菌菌株的全細(xì)胞裂解液中特異性地檢測(cè)BSX。4.針對(duì)結(jié)核分枝桿菌BSX的抗體R16、C44和Mo403B的滴定針對(duì)結(jié)核分枝桿菌制備的抗體還包括命名為R16的兔多克隆抗BSX抗體(針對(duì)BSX肽培育)、命名為C44的雞抗BSX多克隆抗體(針對(duì)重組蛋白培育)和命名為Mo403B的小鼠抗-BSX單克隆抗體(針對(duì)BSXC-端培育)。使用這些抗BSX抗體之一(即R16或C44或Mo403B)作為捕捉抗體而用這些抗體中的另一個(gè)作為檢測(cè)抗體進(jìn)行ELISA測(cè)定法。用多種抗BSX抗體，包括雞(Ch)抗BSXpAbC44、兔(Ra)抗BSXpAbR16和小鼠(Mo)抗BSXmAbMo403B，均以20μg/ml使用每孔50μ1包被ELISA板。以從50ng/ml減至3pg/ml的濃度添加滴定量的重組BSX。抗原檢測(cè)使用ομg/ml的兔抗BSX(用重組BSX蛋白進(jìn)行預(yù)溫育，或不進(jìn)行預(yù)溫育)繼以通過(guò)使用以15000(ν/ν)稀釋的綿羊抗兔IgHRP偶合物(對(duì)于雞捕捉系統(tǒng))的檢測(cè)，或者20μg/ml的雞抗BSXpAbC44繼以以15000(ν/ν)稀釋的綿羊抗雞IgGHRP偶合物(對(duì)于小鼠和兔捕捉系統(tǒng))來(lái)進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示于圖30。5.抗體C44和Μο403Β在夾心ELISA中的檢出限(LOD)在確定對(duì)于檢測(cè)純化的重組BSX而言抗BSXmAbMo403B和pAbC44的檢出限之后，我們的初始研究著眼于優(yōu)化使用mAbMO403B作為捕捉抗體而pAbC44作為檢測(cè)抗體的夾心ELISA。簡(jiǎn)言之，將抗BSXmAbMo403B以從10-40μg/ml范圍的濃度如上所述固定于ELISA平板上作為捕捉抗體。然后使用純化的雞抗BSX々13丄44，以10或2(^8/1111的濃度如上所述作為檢測(cè)抗體，繼以用以15000(ν/ν)稀釋的綿羊抗雞IgGHRP和供信號(hào)檢測(cè)的TMB溫育以篩選從50ng/ml減至0.39ng/ml的重組BSX的滴定量。數(shù)據(jù)示于圖31。在這些條件下，重組BSX的檢出限為2-3ng/ml。6.使用抗體R16和C44在患者樣品中檢測(cè)BSX將來(lái)自南非的TB患者和來(lái)自南非(前綴“M”)和來(lái)自澳大利亞(前綴“CGS”)的罹患非TB呼吸道疾病的對(duì)照患者的痰樣品(50μ1+50μ1封閉緩沖液)分別通過(guò)夾心ELISA就BSX抗原的存在進(jìn)行篩選。將純化的兔抗BSX(肽28)pAb，R16作為捕捉抗體以20μg/ml的濃度固定于ELISA板上。使用純化的雞抗BSXpAb，C44以5μg/ml的濃度用作檢測(cè)抗體。使用以15000(ν/ν)稀釋的綿羊抗雞IgGHR和TMB進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。向來(lái)自對(duì)照患者CGS25的痰摻入5ng/ml重組BSX作為陽(yáng)性對(duì)照(紅色)。數(shù)據(jù)顯示于圖32。7.使用抗體對(duì)Mo403B和C44或R16和C44供檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的擴(kuò)增的夾心ELISA將ELISA板用純化的抗BSXmAbMo403B以40μg/ml的濃度或純化的雞抗BSXpAbC44以5μg/ml的濃度使用每孔50μ1進(jìn)行包被。將純化的重組BSX的滴定量以50ng/ml減至0.39ng/ml的濃度添加。使用10μg/ml的濃度的雞抗BSX，繼以以多種稀釋的驢抗雞IgG生物素偶合物，并最終以15000(ν/ν)稀釋的鏈霉抗生物素蛋白-HRP，或者使用多種濃度的抗BSXmAbΜο403Β，繼以以130000(ν/ν)稀釋的山羊抗小鼠IgG，和以15000(ν/ν)的驢抗山羊IgGHRP偶合物進(jìn)行兩個(gè)擴(kuò)增系統(tǒng)。所述擴(kuò)增系統(tǒng)是用于與基礎(chǔ)抗原檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行比較，在后者中，以10μg/ml的濃度使用雞抗BSX，接著以15000(ν/ν)的稀釋使用綿羊抗雞IgGHRP偶合物。如圖33所示，擴(kuò)增ELISA比標(biāo)準(zhǔn)ELISA敏感大約10倍。當(dāng)在所述擴(kuò)增系統(tǒng)中使用兔PAb作為捕捉抗體，而雞pAb作為第一檢測(cè)Ab時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度略微較高(圖34)。本發(fā)明人還調(diào)查了擴(kuò)增ELISA系統(tǒng)，其如圖33和35所示，使用純化的兔抗BSXpAbR16作為捕捉抗體，而純化的雞抗BSXpAbC44作為檢測(cè)抗體，然后用生物素化的第二檢測(cè)Ab進(jìn)行擴(kuò)增。該系統(tǒng)與之前描述的擴(kuò)增系統(tǒng)(圖35；圖36)相比使得敏感性進(jìn)一步增加2倍(圖35;圖36)。本發(fā)明人還進(jìn)行下述研究使用擴(kuò)增的基于生物素的ELISA以篩選來(lái)自TB和非TB呼吸道疾病對(duì)照患者的臨床痰樣品，永遠(yuǎn)應(yīng)注意由于涂片顯微術(shù)和培養(yǎng)測(cè)定法的低敏感性，在非TB呼吸道疾病組中可能有多至30-40%的患者具有TB共感染(圖37)。為了調(diào)查抗體位點(diǎn)是否被內(nèi)源BSX所飽和，本發(fā)明人還用來(lái)自相同的對(duì)應(yīng)患者的痰樣品的新鮮等分試樣比較了(i)溫育時(shí)間；和(ii)順序溫育的作用。將溫育從1小時(shí)增加至2小時(shí)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度并無(wú)任何作用。與之相對(duì)，預(yù)先數(shù)據(jù)表明用痰的兩個(gè)不同的樣品加載進(jìn)行的順序溫育增加了信號(hào)強(qiáng)度(圖38)。雖然所述增加并不大，這些預(yù)先觀察表明有必要進(jìn)一步調(diào)查。有趣的是，信號(hào)強(qiáng)度的增加對(duì)于檢測(cè)作為陽(yáng)性對(duì)照的重組蛋白而言是最顯著的。8.使用命名為Mo639F和Chl2/13的抗體進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA另一個(gè)供診斷結(jié)核分枝桿菌的抗體對(duì)由命名為“Mo639F”的來(lái)源于小鼠的抗體作為優(yōu)選的捕捉抗體和命名為“Chl2/13”的來(lái)源于雞的多克隆抗體作為優(yōu)選的檢測(cè)抗體組成。并未排除其他的取向和抗體組合。擴(kuò)增ELISA基本上是如本實(shí)施例和實(shí)施例1中所述進(jìn)行的，使用2μg/mL的Mo639F抗體作為捕捉試劑，而5μg/mL的Chl2/13多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，以及用生物素化的驢抗雞IgG二抗與HRP-偶合的多聚-40鏈霉抗生物素蛋白以檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)抗體。在圖39中表示的數(shù)據(jù)表明在測(cè)試的測(cè)定條件下，以及這種雖然并非必需的，但為優(yōu)選的抗體取向下，具有低背景噪音和約89pg/mL的L0D。本發(fā)明人認(rèn)為在夾心ELISA中上述檢測(cè)的敏感性以及低背景落在有用的限制范圍內(nèi)。9.杭-BSX杭體與不同結(jié)核分feffff分離株的奪Ui件為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BSX作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，并評(píng)價(jià)針對(duì)BSX蛋白制備的抗體的特異性，本發(fā)明人比較了結(jié)核分枝桿菌臨床菌株CSU93和HN878與結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室菌株H93Rv的細(xì)胞提取物之間，Mo639F和Chl2/13抗體在如上所述進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mo639F包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)分離株的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Chl2/13與結(jié)合的抗原_抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1稀釋的二抗(例如，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。將樣品在全細(xì)胞提取物的三個(gè)稀釋中重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定。基于BSX蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化水平產(chǎn)生校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖40中表示的數(shù)據(jù)顯示結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白在臨床菌株中以與實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv中相比高的水平存在。在結(jié)核分枝桿菌H878中可檢測(cè)出比CSU93中低的BSX蛋白水平，然而，這些數(shù)據(jù)表明針對(duì)BSX蛋白的抗體在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的臨床分離株中具有一般性用途。在圖40中表示的數(shù)據(jù)支持針對(duì)BSX蛋白的抗體在一般的單分析物診斷測(cè)試中，或者作為多分析物測(cè)試一部分與如本文所述或本領(lǐng)域已知的針對(duì)特定菌株的結(jié)核分枝桿菌的抗體一同使用時(shí)的有用性。若需要，還可將針對(duì)BSX蛋白的抗體與來(lái)自BSX陽(yáng)性臨床樣本的結(jié)核分枝桿菌的后續(xù)培養(yǎng)物一同使用以產(chǎn)生關(guān)于樣品中存在的臨床相關(guān)菌株的信息。10.不同分枝桿菌菌種之間的交叉反應(yīng)性為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BSX作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，并評(píng)價(jià)針對(duì)BSX蛋白制備的抗體的特異性，本發(fā)明人比較了在分枝桿菌菌種結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的細(xì)胞提取物之間，抗體在如上所述進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mo639F包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)分枝桿菌菌種的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Chl2/13與結(jié)合的抗原_抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1稀釋的二抗(例如，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。將樣品在全細(xì)胞提取物的三個(gè)稀釋中重復(fù)進(jìn)行兩次測(cè)定?；贐SX蛋白的標(biāo)準(zhǔn)化水平產(chǎn)生校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖41a和41b中表示的數(shù)據(jù)顯示三種分枝桿菌菌種之間幾乎無(wú)可檢測(cè)出的交叉反應(yīng)性，表明結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白對(duì)于在這些測(cè)定條件下或使用所選的抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌具有菌種特異性。這支持針對(duì)BSX蛋白的抗體在一般的或菌種特異性的單分析物診斷測(cè)試，或者作為多分析物測(cè)試一部分與如本文所述或本領(lǐng)域已知的針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的其它標(biāo)志物的抗體一同使用時(shí)的有用性。舉例而言，可將針對(duì)BSX蛋白的抗體與一種或多種針對(duì)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌Rvl265和/或結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白和/或結(jié)核分枝桿菌EF-Tu和/或結(jié)核分枝桿菌S9蛋白的抗體如本文中所述同時(shí)使用。還可將針對(duì)BSX蛋白的抗體與來(lái)自BSX陽(yáng)性臨床樣本的結(jié)核分枝桿菌的后續(xù)培養(yǎng)物一同使用。11.結(jié)核分feffff與非分feffff病本少個(gè)的低,奪件為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BSX作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，本發(fā)明人比較了在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv(實(shí)驗(yàn)室菌株)、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的細(xì)胞提取物之間，進(jìn)行的擴(kuò)增的夾心ELISA中的抗體交叉反應(yīng)性。簡(jiǎn)言之，將ELISA板用捕捉抗體Mo639F包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體后，將來(lái)自每個(gè)微生物的細(xì)胞提取物添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板孔中。作為每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用不含細(xì)胞提取物的緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原之后，將檢測(cè)抗體Chl2/13與結(jié)合的抗原_抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1二抗(即，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育1小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘，并確定450-620nm的吸光度。在圖42中表示的數(shù)據(jù)未顯示針對(duì)結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的抗體與大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或銅綠假單胞菌的細(xì)胞提取物在測(cè)試條件下有顯著的交叉反應(yīng)性，表明所述抗體形成了結(jié)核分枝桿菌特異性測(cè)試的基礎(chǔ)。12.在臨床樣品中檢測(cè)BSX蛋白為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BSX作為生物樣品中結(jié)核分枝桿菌存在的診斷標(biāo)志物的適合性，本發(fā)明人確定了抗體在從TB陽(yáng)性受試者獲得的臨床樣品檢測(cè)內(nèi)源BSX蛋白的能力，所述受試者是之前根據(jù)涂片測(cè)試和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)測(cè)定法的結(jié)果診斷的。將患者根據(jù)涂片測(cè)試和培養(yǎng)測(cè)試的結(jié)果，和HIV狀態(tài)分類。所有測(cè)試的受試者均為涂片陰性且培養(yǎng)測(cè)試陰性，或者，涂片陽(yáng)性且培養(yǎng)陽(yáng)性。在一個(gè)實(shí)施例中，如圖43的圖例所述進(jìn)行免疫磁珠測(cè)定法，其使用包被以抗BSXChS多克隆抗體的磁珠以從之前診斷出的受試者的經(jīng)處理的痰捕捉BSX，而Mo639F單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，并對(duì)所述檢測(cè)抗體進(jìn)行使用偶合于HRP的抗小鼠Ig的擴(kuò)增。如圖43所示，在TB涂片陽(yáng)性和培養(yǎng)陽(yáng)性受試者中，與TB陰性受試者相比較，鑒定出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著較高水平的BSC蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，如上所述對(duì)患者痰樣品進(jìn)行擴(kuò)增的夾心ELISA，所述痰是通過(guò)方法3制備的，并作為4x150微升等分試樣在替代擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方法(見(jiàn)下)下進(jìn)行測(cè)定。將ELISA板用捕捉抗體Mo639F或其他合適的抗BSX抗體包被過(guò)夜。在洗滌去除未結(jié)合的抗體之后，將經(jīng)處理的痰添加至經(jīng)抗體包被的ELISA板的孔中。作為對(duì)于每個(gè)測(cè)定法的陰性對(duì)照，使用緩沖液。在溫育1小時(shí)并洗滌去除未結(jié)合的抗原后，將檢測(cè)抗體Chl2/13或其他合適的抗體與結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物相接觸。在室溫溫育1小時(shí)之后，洗滌板，用50μ1二抗(即，生物素化的驢抗雞IgG和多聚-40鏈霉抗生物素蛋白-HRP偶合物)溫育一小時(shí)，再次洗滌，用TMB溫育10分鐘并確定450-620nm的吸光度。在圖44和45中表示的數(shù)據(jù)顯示在之前顯示為培養(yǎng)陽(yáng)性和涂片陽(yáng)性的4個(gè)測(cè)試的TB陽(yáng)性樣品中至少3個(gè)中檢測(cè)出顯著較高水平的BSX蛋白。與之相對(duì)在TB陰性樣品中檢測(cè)出背景信號(hào)。13.評(píng)估樣品對(duì)信號(hào)的抑制為了評(píng)價(jià)是否在痰中存在可能不利地影響敏感性(例如，在ELISA或護(hù)理位置或現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)形式中)的抑制性或信號(hào)抑制性因子，將痰樣品摻以lOng/mL重組結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白，并將所得的樣品分三步127(v/v)系列稀釋。將樣品溫育過(guò)夜，并如上所述通過(guò)擴(kuò)增ELISA分析，或立即測(cè)定。在圖87和88中表示的數(shù)據(jù)(左上小圖，標(biāo)為“BSX”)表明痰包含一些抑制BSX蛋白信號(hào)檢測(cè)的因子，因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度在添加未稀釋的痰之后減少，無(wú)論所述測(cè)定法是否立即進(jìn)行或在溫育過(guò)夜之后進(jìn)行。然而，該信號(hào)強(qiáng)度的喪失可通過(guò)稀釋痰進(jìn)行性地抑制，且將痰稀釋至少約19(ν/ν)時(shí)很大程度上阻止了信號(hào)強(qiáng)度的喪失。信號(hào)強(qiáng)度還在過(guò)夜溫育痰中的重組蛋白之后減少，且該信號(hào)強(qiáng)度的喪失也可通過(guò)稀釋痰樣品來(lái)部分阻止。這些數(shù)據(jù)表明推薦將痰至少19(ν/ν)稀釋至封閉緩沖液和快速分析樣品來(lái)增強(qiáng)在這些條件下測(cè)定BSX蛋白的信號(hào)強(qiáng)度。14.^Mmmm^ΦBT^HI,ψ,^BSX蛋白的相對(duì)水平為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BSX作為分枝桿菌感染的診斷性標(biāo)志物的適合性，在結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv、CSU93和HN878以及結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌全細(xì)胞裂解液中相對(duì)于本文中所述的其他10個(gè)結(jié)核分枝桿菌抗原(包括KARI、EF-Tu、P5CR、Rvl265、S9和TetR樣蛋白)確定BSX蛋白的水平。基本上如本實(shí)施例和實(shí)施例1中所述進(jìn)行擴(kuò)增的夾心ELISA，以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法鑒定每種抗原的相對(duì)水平，并包括了校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)以使得量化成為可能。示于圖124-125的數(shù)據(jù)表明BSX在所有三種測(cè)試的結(jié)核分枝桿菌菌株中當(dāng)基于總細(xì)胞蛋白表示時(shí)，是相對(duì)豐富的蛋白。據(jù)此，在測(cè)試的11個(gè)免疫原性蛋白中，結(jié)核分枝桿菌Rvl265、BSX和S9蛋白也是相對(duì)豐富的。示于圖126-127的數(shù)據(jù)表明BSX蛋白一般地在分枝桿菌菌種中也是相對(duì)豐富的蛋白，而其他測(cè)試的主要免疫原性蛋白，即BSX、Rvl265和S9，當(dāng)基于細(xì)胞表示時(shí)(圖126-127)或基于全細(xì)胞裂解液蛋白的微克數(shù)時(shí)(圖128-129)或基于全細(xì)胞裂解液濾過(guò)物的微升數(shù)時(shí)(圖130-131)，似較之BSX具有對(duì)結(jié)核分枝桿菌更強(qiáng)的特異性。這些數(shù)據(jù)表明了BSX作為結(jié)核分枝桿菌感染類別性的單分析物標(biāo)志物，或作為針對(duì)分枝桿菌感染或結(jié)核分枝桿菌感染的多分析物測(cè)試的一部分與BSX和/或Rvl265和/或S9蛋白組合時(shí)的有用性。并未排除其他供對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染進(jìn)行多分析物測(cè)試的組合。11.優(yōu)化檢出限為了進(jìn)一步增強(qiáng)夾心ELISA的敏感性，使用替代性擴(kuò)增方法以在用捕捉抗體包被所述ELISA板之后進(jìn)行反復(fù)的抗原結(jié)合。基本上，這會(huì)導(dǎo)致結(jié)合于捕捉抗體的抗原量增加，盡管96-孔ELISA板的50μ1體積限制。簡(jiǎn)言之，該反復(fù)的抗原加載涉及在夾心ELISA中在洗滌并添加檢測(cè)抗體之前重復(fù)幾次抗原結(jié)合步驟，例如，2或3或4或5次等。自然而然，每個(gè)等分試樣的抗原樣品是在標(biāo)準(zhǔn)的溫育期間之后，下一等分試樣添加之前去除的。可修飾重復(fù)的次數(shù)以優(yōu)化測(cè)定法(例如，參數(shù)如信噪比、檢出限和在半最大信號(hào)處檢測(cè)出的抗原量)，這取決于測(cè)試的樣品的特性(例如，樣品類型)，而無(wú)需不必要的實(shí)驗(yàn)嘗試。舉例而言，可使用多至約20次重復(fù)樣品加載(S卩，多至20x替代性擴(kuò)增)以提供結(jié)核分枝桿菌BSX蛋白的低背景信號(hào)和降低的檢出限。實(shí)施例4使用結(jié)合于命名為S9的推定的結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白的抗體進(jìn)行的由結(jié)核分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的基于抗原的診斷1.在TB陽(yáng)件警試者中鑒定S9蛋白在來(lái)自TB+樣品的血清免疫球蛋白級(jí)分中識(shí)別出具有約30.2kDa分子量的蛋白(圖46)。來(lái)自MALDI-T0F數(shù)據(jù)的四個(gè)肽的序列(SEQIDNO15-18，含15和18)與具有SwissProt登錄號(hào)P66638的蛋白(SEQIDNO14)匹配。該4個(gè)肽(SEQIDNO15-18)對(duì)P66638的覆蓋百分比為約14-15%，表明所述肽片段來(lái)源于該同一個(gè)蛋白標(biāo)志物。該結(jié)論受下述支持僅有六個(gè)具有零錯(cuò)切的理論的經(jīng)胰蛋白酶消化的肽，和十四個(gè)具有一個(gè)錯(cuò)切的理論的經(jīng)胰蛋白酶消化的肽。鑒定的具有SEQIDNO:14中所述的氨基酸序列的蛋白命名為“S9”。有趣的是，S9蛋白的估計(jì)分子量?jī)H為約16.4kDa，而S9的估計(jì)等電點(diǎn)為約10.7。由于S9蛋白觀察到的分子量比估計(jì)值高約14kDa，所述蛋白非?？赡苁墙?jīng)翻譯后修飾的(例如，通過(guò)糖基化)，或與其他影響分子類型(如核酸)一同遷移。2.抗體抗體是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的重組S9蛋白(rS9)和針對(duì)從全長(zhǎng)S9蛋白序列衍生的合成肽使用本文中所述方法制備的。針對(duì)rS9大約產(chǎn)生了八個(gè)(8)抗體，并如實(shí)施例1中所述就其適合性進(jìn)行篩選。a)針對(duì)合成S9肽的抗體合成來(lái)自30S核糖體蛋白S9，包含序列H-MTETTPAPQTPAAPAGPAQSFC-NH2的合成肽至78%純度，所述純度是通過(guò)藉由模擬表位(Mimotopes)的液相層析使用固相肽合成技術(shù)確定的。該肽通過(guò)馬來(lái)酰亞胺己?；?N-羥基琥珀酰亞胺接頭偶聯(lián)于匙孔血藍(lán)蛋白(KHL)。為了便于檢測(cè)針對(duì)該表位培育的抗體，還將肽與GSGL間隔物一同合成，并附于生物素(PAPQTPAAPAGPAQSTOSGL-生物素)，其純度根據(jù)液相層析為93%。對(duì)兔根據(jù)下述注射實(shí)驗(yàn)方案注射每劑量600μg的合成肽，所述合成肽包含連接于KHL的氨基酸序列H-MTETTPAPQTPAAPAGPAQSFC-NH2預(yù)放血第0周初次接種第0周第一次加強(qiáng)第3周第二次加強(qiáng)第6周測(cè)試放血第7.5周權(quán)利要求1.一種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的分枝桿菌的分離的或重組的免疫原性蛋白，其為推定的乙酮醇酸還原異構(gòu)酶(下文中稱作“KARI”)，或其免疫原性肽或免疫原性片段或表位。2.權(quán)利要求1的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白，其中所述蛋白包含SEQIDNO1所述的氨基酸序列或與SEQIDNO1至少約95%相同的氨基酸序列。3.權(quán)利要求1的免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中所述肽、片段或表位包含SEQIDNO1所述序列中的至少約5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中所述肽、片段或表位包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記或可檢測(cè)部分。5.一種融合蛋白，其包含一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫原性KARI肽、片段或表位，和接頭。6.一種融合蛋白，其包含多個(gè)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫原性KARI肽、片段或表位。7.一種融合蛋白，其包含融合于載體蛋白、可檢測(cè)標(biāo)記或報(bào)道分子的權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白、免疫原性KARI肽、免疫原性KARI片段或表位。8.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在檢測(cè)受試者中由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的過(guò)去的感染、活動(dòng)的感染或潛在的感染中的用途，其中所述感染是通過(guò)在從所述受試者獲得的樣品中的抗體與所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的結(jié)合來(lái)確定的。9.一種分離的或重組的抗體，其特異性結(jié)合于權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白、免疫原性KARI肽、免疫原性KARI片段或表位，或特異性結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體。10.權(quán)利要求9的分離的或重組的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。11.權(quán)利要求9的分離的或重組的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。12.權(quán)利要求9的分離的或重組的抗體，其中所述抗體是重組抗體。13.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體，其中所述抗體用報(bào)道分子標(biāo)記。14.權(quán)利要求13的分離的或重組的抗體，其中所述報(bào)道分子是生物素。15.一種分離的抗體產(chǎn)生細(xì)胞或抗體產(chǎn)生細(xì)胞群體，其產(chǎn)生權(quán)利要求9-12任一項(xiàng)所述的抗體。16.權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體，或其免疫反應(yīng)性片段在受試者中診斷結(jié)核病和/或檢測(cè)由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的過(guò)去的或現(xiàn)在的感染或潛在的感染中的用途，其中所述感染是通過(guò)所述抗體或片段與從所述受試者獲得的生物樣品中存在的KARI蛋白或其免疫原性片段或表位的結(jié)合來(lái)確定的。17.權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體或其免疫反應(yīng)性片段在鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的細(xì)菌或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌感染的細(xì)胞或者在對(duì)所述細(xì)菌或所述細(xì)胞進(jìn)行分選或計(jì)數(shù)中的用途。18.權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體或其免疫反應(yīng)性片段在醫(yī)藥中的用途。19.一種組合物，其包含權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體，和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。20.一種在受試者中診斷結(jié)核病或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)針對(duì)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位的抗體，其中所述抗體在樣品中的存在指示感染。21.權(quán)利要求20的方法，包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位在足以使得抗原_抗體復(fù)合物形成的條件下接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。22.權(quán)利要求21的方法，其中檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成包括檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物中的人免疫球蛋白。23.權(quán)利要求22的方法，其中檢測(cè)人免疫球蛋白包括將所述抗原-抗體復(fù)合物與包含抗人免疫球蛋白的第二抗體在足以使得所述第二抗體與復(fù)合物中的人免疫球蛋白結(jié)合的條件下接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)結(jié)合的抗人免疫球蛋白。24.權(quán)利要求23的方法，其中所述第二抗體用可檢測(cè)標(biāo)志物或報(bào)道分子標(biāo)記。25.權(quán)利要求21-M任一項(xiàng)所述的方法，其中將來(lái)源于受試者的生物樣品與所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白相接觸，所述蛋白包含SEQIDNO1所述的氨基酸序列。26.權(quán)利要求21-M任一項(xiàng)所述的方法，其中將來(lái)源于受試者的生物樣品與SEQIDNO1的免疫原性KARI肽片段相接觸。27.權(quán)利要求21-25任一項(xiàng)所述的方法，還包括將來(lái)源于受試者的生物樣品與除了分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的免疫原性蛋白或肽相接觸。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述除了分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Ql1141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。29.權(quán)利要求四的方法，其中所述除了分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。30.權(quán)利要求四的方法，其中所述除了分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位之外的免疫原性蛋白或肽選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。31.一種在受試者中診斷結(jié)核病或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染的方法，包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中使用權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體檢測(cè)免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，其中在樣品中所述蛋白或免疫原性片段或表位的存在指示疾病、疾病進(jìn)展或感染。32.權(quán)利要求31的方法，包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與分離的或重組的抗體在足以使得抗原-抗體復(fù)合物形成的條件下相接觸一段時(shí)間，然后檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。33.權(quán)利要求32的方法，包括進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗體和檢測(cè)抗體的夾心ELISA。35.權(quán)利要求31-34任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括來(lái)自腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。36.權(quán)利要求31-34任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括體液。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述體液為痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。38.權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO:28-29)和/或P5CR蛋白(Uniftx)tKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。39.權(quán)利要求31-38任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitPrc^KB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)，核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO:14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。40.權(quán)利要求31-38任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。41.權(quán)利要求31-40任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。43.一種確定具有結(jié)核病或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染的受試者對(duì)用治療性化合物治療所述結(jié)核病或感染的響應(yīng)的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中與在正?；蚪】凳茉囌咧锌蓹z測(cè)出的蛋白或片段或表位的水平相比，增強(qiáng)、或未減弱、或未正在減弱的蛋白或片段或表位的水平指示所述受試者未響應(yīng)所述治療，或尚未擺脫疾病或感染。44.權(quán)利要求43的方法，包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種分離的或重組的抗體相接觸并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。45.權(quán)利要求44的方法，包括進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗體和檢測(cè)抗體的夾心ELISA。47.權(quán)利要求43-46任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括來(lái)自腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。48.權(quán)利要求43-46任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括體液。49.權(quán)利要求48的方法，其中所述體液為痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。50.權(quán)利要求43-49任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO28-29)和/或P5CR蛋白(Uniftx)tKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。51.權(quán)利要求43-50任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitPrc^KB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)，核糖體蛋白S9(UniPrc^KB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。52.權(quán)利要求43-50任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。53.權(quán)利要求43-52任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。55.一種確定具有結(jié)核病或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染的受試者對(duì)用治療性化合物治療所述結(jié)核病或感染的響應(yīng)的方法，所述方法包括在來(lái)自所述受試者的生物樣品中檢測(cè)KARI蛋白或其免疫原性片段或表位，其中與罹患結(jié)核病或由所述一種或多種分枝桿菌造成的感染的受試者中可檢測(cè)出的蛋白或片段或表位的水平相比，較低的蛋白或片段或表位的水平指示所述受試者響應(yīng)所述治療，或已擺脫疾病或感^feο56.權(quán)利要求55的方法，包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種分離的或重組的抗體相接觸并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。57.權(quán)利要求56的方法，包括進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。58.權(quán)利要求57的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗體和檢測(cè)抗體的夾心ELISA。59.權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括來(lái)自腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。60.權(quán)利要求55-58任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括體液。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述體液為痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。62.權(quán)利要求55-61任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO:28-29)和/或P5CR蛋白(Uniftx)tKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。63.權(quán)利要求55-61任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitPrc^KB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)，核糖體蛋白S9(UniPrc^KB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDN0:14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。64.權(quán)利要求55-61任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。65.權(quán)利要求55-64任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者。66.權(quán)利要求65的方法，其中所述免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。67.一種在受試者中監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展、對(duì)治療的響應(yīng)或由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染狀態(tài)的方法，所述方法包括使用權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體在不同時(shí)間在來(lái)自所述受試者的生物樣品中確定結(jié)核分枝桿菌KARI蛋白或其免疫原性片段或表位水平，其中所述KARI蛋白、片段或表位水平的變化指示所述受試者的疾病進(jìn)展、對(duì)治療的響應(yīng)或感染狀態(tài)的變化。68.權(quán)利要求67的方法，還包括當(dāng)KARI蛋白、片段或表位的水平隨時(shí)間增加而增加時(shí)，施用用于治療由一種或多種所述分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的化合物。69.權(quán)利要求67的方法，包括將來(lái)源于所述受試者的生物樣品與一種或多種分離的或重組的抗體相接觸并檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成。70.權(quán)利要求69的方法，包括進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。71.權(quán)利要求70的方法，其中所述ELISA是使用捕捉抗體和檢測(cè)抗體的夾心ELISA。72.權(quán)利要求67-71任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括來(lái)自腦、乳房、卵巢、肺、結(jié)腸、胰、睪丸、肝、肌肉、骨的提取物或其混合物。73.權(quán)利要求67-71任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括體液。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述體液為痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸膜液或其混合物或其衍生物。75.權(quán)利要求67-74任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO:28-29)和/或P5CR蛋白(UniPrc^KB/Swiss-I^rot登錄號(hào)Q11141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GQ蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。76.權(quán)利要求67-74任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitPrc^KB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)，核糖體蛋白S9(UniPrc^KB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO:14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。77.權(quán)利要求67-74任一項(xiàng)所述的方法，包括將樣品與結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體相接觸以及與結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體相接觸，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。78.權(quán)利要求67-77任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述免疫妥協(xié)的或免疫缺陷的受試者受人免疫缺陷病毒(HIV)感染。80.一種治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括(i)進(jìn)行權(quán)利要求20-79任一項(xiàng)所述的方法，由此在來(lái)自受試者的生物樣品中檢測(cè)一種或多種所述分枝桿菌的存在；和()施用治療有效量的藥物組合物以減少所述受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中的病原性桿菌數(shù)。81.一種治療由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌造成的感染或結(jié)核病的方法，包括(i)進(jìn)行權(quán)利要求43-66任一項(xiàng)所述的方法，由此在來(lái)自正用第一藥物組合物治療的受試者的生物樣品中檢測(cè)一種或多種所述分枝桿菌的存在；和()施用治療有效量的第二藥物組合物以減少所述受試者的肺、血液或淋巴系統(tǒng)中的病原性桿菌數(shù)。82.一種用于在生物樣品中診斷結(jié)核病和/或檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包含(i)權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的一種或多種分離的或重組的抗體或其免疫反應(yīng)性片段，其特異性結(jié)合于所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或特異性結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體；和()用于檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成的裝置，任選地與使用說(shuō)明一同包裝。83.權(quán)利要求82的試劑盒，其包含多種分離的或重組的抗體，其特異性結(jié)合于所述分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或特異性結(jié)合于包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體。84.權(quán)利要求83的試劑盒，其中所述多種分離的或重組的抗體的至少一種固定于固體支持物上。85.一種用于在生物樣品中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的試劑盒，所述試劑盒包含(i)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的分離的或重組的免疫原性KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位；和()用于檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的形成的裝置，任選地與使用說(shuō)明一同包裝。86.一種固體基質(zhì)，包含吸附于其上的權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的分離的或重組的KARI蛋白或其免疫原性KARI肽或免疫原性KARI片段或表位，或包含所述免疫原性KARI蛋白、肽、片段或表位的融合蛋白或蛋白聚集體。87.—種固體基質(zhì)，包含吸附于其上的權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)所述的分離的或重組的抗體。88.權(quán)利要求87的固體基質(zhì)，其包含結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體以及結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO2)和/或核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8；SEQIDNO:14)和/或蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO21)和/或延伸因子-Tu(EF-Tu)蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U071；SEQIDNO28-29)和/或P5CR蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)Q11141；SEQIDNO36)和/或TetR樣蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A1QW92;SEQIDNO:44)和/或谷氨酰胺合酶(GS)蛋白(UnitProtKB/TrEMBL登錄號(hào)033342)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽，來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，來(lái)源于所述EF-Tu蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述P5CR蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述TetR樣蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于GS蛋白的免疫原性肽，及其組合。89.權(quán)利要求87的固體基質(zhì)，其包含結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體以及結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，核糖體蛋白S9(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)A5U8B8;SEQIDNO:14)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789；SEQIDNO:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽，來(lái)源于所述S9的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。90.權(quán)利要求87的固體基質(zhì)，其包含結(jié)合于KARI或免疫原性KARI肽或片段或表位的抗體以及結(jié)合于來(lái)自結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的一種或多種分枝桿菌的一種或多種蛋白的抗體，其中所述一種或多種蛋白選自下組BSX蛋白(UnitfrotKB/TrEMBL登錄號(hào)A5TZK2；SEQIDNO:2)，蛋白R(shí)vl265(UniProtKB/Swiss-Prot登錄號(hào)P64789;SEQIDN0:21)，來(lái)源于所述BSX蛋白的免疫原性肽和來(lái)源于所述Rvl265的免疫原性肽，及其組合。91.權(quán)利要求87-90任一項(xiàng)所述的固體基質(zhì)，包含膜。92.權(quán)利要求91的固體基質(zhì)，其中所述膜包含尼龍或硝酸纖維素。93.權(quán)利要求87-90任一項(xiàng)所述的固體基質(zhì)，包含聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板。94.權(quán)利要求87-90任一項(xiàng)所述的固體基質(zhì)，包含浸漬片。95.權(quán)利要求87-90任一項(xiàng)所述的固體基質(zhì)，包含玻璃支持物。96.權(quán)利要求87-90任一項(xiàng)所述的固體基質(zhì)，包含層析樹(shù)脂。全文摘要本發(fā)明提供了分離的結(jié)核分枝桿菌蛋白，其為推定的乙酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI；SEQIDNO1)及其免疫原性肽片段，以及針對(duì)所述全長(zhǎng)蛋白和免疫原性肽片段產(chǎn)生的抗體用于在人中診斷由一種或多種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌組的分枝桿菌造成的感染和/或結(jié)核病，例如使用基于抗原的夾心ELISA形式。本發(fā)明還提供了多分析物測(cè)定法，其中本發(fā)明基于KARI的診斷測(cè)定法與檢測(cè)一種或多種來(lái)自一種或多種所述分枝桿菌的其他蛋白的免疫原性表位多路并聯(lián)(multiplex)，所述其他蛋白例如SEQIDNO2、14、21、28-29、36或44中任一，包括其任意組合。文檔編號(hào)C07K16/12GK102124029SQ200980129242公開(kāi)日2011年7月13日申請(qǐng)日期2009年5月26日優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日發(fā)明者伊恩·加思韋特,羅賓·林德納,蘇珊妮·佩德森申請(qǐng)人:泰里安診斷有限公司