專利名稱：用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，涉及可用于生理或病理學(xué)細(xì)胞膜電位檢測(cè)的技術(shù)，利用電壓敏感染料將細(xì)胞或組織的膜電位變化信號(hào)轉(zhuǎn)化成光學(xué)信息進(jìn)行記錄并重構(gòu)出功能圖像。是在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域?qū)⒐鈱W(xué)技術(shù)、圖像信息處理技術(shù)相結(jié)合而發(fā)明的一項(xiàng)應(yīng)用研究，尤其是一種用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法及裝置。
背景技術(shù)：
生物體在生命活動(dòng)過(guò)程中所表現(xiàn)的電現(xiàn)象稱為生物電(bioelectricity )，幾乎所有生理功能的實(shí)現(xiàn)都伴隨有某種生物電的變化。這些生物電的常用檢測(cè)儀器有近紅外光內(nèi)源信號(hào)成像(Near Infrared, NIR),功能核磁共振成像(functional Magnetic ResonanceImaging, fMRI),正電子發(fā)身寸斷層成像(Positron Emission Computed Tomography,PET), X 光斷層成像(Computed Tomography, CT),心電圖(Eletrocardiogram, ECG),腦 電圖(Electroecephalogram, EEG),腦磁圖(Magnetoencephalogram, MEG),膜片甜(PatchClamp)等，他們?cè)谌藗兊纳聿±頇z查中起到相當(dāng)重要的作用，從宏觀到微觀揭示了生命的奧秘。但是由于生命現(xiàn)象的復(fù)雜性，對(duì)于重要生命過(guò)程的信息，需要快速實(shí)時(shí)的觀察動(dòng)態(tài)過(guò)程，實(shí)時(shí)記錄電生理的變化，比如在心臟電擊除顫時(shí)刻心肌動(dòng)作電位的變化和心肌表面電場(chǎng)分布情況，老鼠胡須探索障礙物時(shí)與大腦皮層中對(duì)應(yīng)信號(hào)的關(guān)系等等。在研究這些生理機(jī)制的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，在空間分辨率上需要我們同時(shí)研究局部的微觀變化(微米/納米級(jí))和整個(gè)組織的整體響應(yīng)(厘米級(jí))，在時(shí)間分辨率上需要我們同時(shí)研究細(xì)胞膜內(nèi)外電信號(hào)的變化(微秒級(jí))，以及整個(gè)組織的電生理功能響應(yīng)(分鐘量級(jí))。上述設(shè)備在某些領(lǐng)域表現(xiàn)非凡，但是難以同時(shí)滿足這些要求，比如PET、fMRI、ECG/EEG等在組織/器官水平應(yīng)用廣泛，而膜片鉗和電鏡則是從分子、細(xì)胞水平進(jìn)行研究，人們迫切需要同時(shí)從宏觀和微觀的水平上動(dòng)態(tài)、連續(xù)的觀察細(xì)胞膜動(dòng)作電位的變化以及整個(gè)組織中電興奮的傳導(dǎo)過(guò)程，滿足研究人員的要求。近年來(lái)一種新的研究探測(cè)手段基于電壓敏感染料(Voltage-Sensitive Dyes,VSDs)的熒光功能成像標(biāo)測(cè)技術(shù)迅速的發(fā)展起來(lái)。光學(xué)標(biāo)測(cè)(Optical Mapping)技術(shù)是利用電壓敏感染料將細(xì)胞膜電位的變化轉(zhuǎn)化成光學(xué)信號(hào)進(jìn)行記錄的一種新的光學(xué)功能成像(optical imaging)技術(shù)。其基本原理是將電壓敏感染料作為分子轉(zhuǎn)換器(Molecular Transduser)對(duì)記錄細(xì)胞或者目標(biāo)組織進(jìn)行灌注染色，當(dāng)膜電位變化而造成膜兩側(cè)電場(chǎng)力變化時(shí)，嵌在膜上的染料分子價(jià)鍵也隨電場(chǎng)的作用發(fā)生細(xì)微的改變，從而造成染料的發(fā)射光譜隨之移動(dòng)，這樣就可以通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度的變化而間接計(jì)算得到膜電位變化。該技術(shù)作為電生理研究的一種新的記錄方法有以下特
占-
^ \\\ ·I.多位點(diǎn)同時(shí)記錄可以同時(shí)測(cè)量多個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞群)或從多側(cè)面記錄單個(gè)細(xì)胞的電活動(dòng)，動(dòng)態(tài)顯示膜電位的傳導(dǎo)過(guò)程；2.時(shí)間分辨率高時(shí)間分辨率跨度超過(guò)9個(gè)數(shù)量級(jí)，可以從微秒級(jí)到小時(shí)級(jí)；3.空間分辨率高空間分辨率跨度超過(guò)5個(gè)數(shù)量級(jí)，可以從微米量級(jí)到分米級(jí)，可以記錄細(xì)胞與細(xì)胞間的電傳導(dǎo)；4.廣泛適用性可以同時(shí)從不同層次著手研究分子水平、細(xì)胞水平、組織水平到整個(gè)神經(jīng)中樞，可以用于各種細(xì)胞和組織的電生理研究，并能克服電刺激造成的偽跡，研究心臟除顫中電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的影響，膜局部極化與激動(dòng)波之間復(fù)雜的作用機(jī)制，可為電除顫和心律失常的臨床治療提供重要的指導(dǎo)性建議。這種方法還可通過(guò)腦部動(dòng)作電位來(lái)在體研究視覺(jué)神經(jīng)、嗅覺(jué)神經(jīng)編碼，提高人們對(duì)腦結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)認(rèn)知水平，為研究人員提供一個(gè)極為有力的技術(shù)工具，提供其他方法無(wú)法比擬的更加豐富的信息。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)該方面的專利。國(guó)外專利中美國(guó)專利No. 7611863德國(guó)申請(qǐng)，2009年11月3日授權(quán)，美國(guó)專利No. 7173130，美國(guó)申請(qǐng)，2007年2月6日授權(quán)，這些方法或者關(guān)注于染料的合成方法，或者使用復(fù)雜的熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)國(guó)外的一些公開發(fā)表的文獻(xiàn)比如Tang D, Li Y, Wong J, etal. “Characteristicsof a charged-coupled-device-based optical mapping system for the study ofcardiac arrhythmias” · J Biomed Opt, 2005, 10 (2) : 1-7.使用激光和氣燈作為光源，Brown NH, Dobrovolny HM,Gauthier DJ,etal “A fiber-based ratiometric optical cardiac mapping channel using a diffraction grating and split detector”. Biophysj, 2007, 93:254-263利用光纖和光柵來(lái)進(jìn)行波長(zhǎng)選擇，系統(tǒng)比較復(fù)雜。這些都未能實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的簡(jiǎn)便易用，造價(jià)昂貴，使得該技術(shù)的應(yīng)用得到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法及裝置，本發(fā)明根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的電壓敏感染料光譜遷移，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)一套單波長(zhǎng)探測(cè)的細(xì)胞膜電位光學(xué)標(biāo)測(cè)方法及裝置。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)解決的這種用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法首先將細(xì)胞跨膜電位變化轉(zhuǎn)變成熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光信號(hào)光強(qiáng)的變化量AF與細(xì)胞跨膜電位的變化AVm，按照下式計(jì)算光學(xué)動(dòng)作電位Vn = -(/·；., -/7 )/77上式中，Vn表示第η幀中某點(diǎn)的細(xì)胞跨膜電位，F(xiàn)n表示該幀中該點(diǎn)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示該細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度；通過(guò)上式計(jì)算得到每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，當(dāng)計(jì)算出一巾貞圖像中每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，則能夠重構(gòu)出某個(gè)時(shí)刻的等電勢(shì)圖；利用簡(jiǎn)化算法先得到平均靜息電位熒光圖像，然后從得到的熒光圖像直接減去背景圖像，最后計(jì)算得到等電勢(shì)圖。進(jìn)一步，利用求導(dǎo)法和閾值法對(duì)得到的等電勢(shì)圖綜合計(jì)算重構(gòu)得到心臟的動(dòng)作電位時(shí)程圖。進(jìn)一步，利用所述動(dòng)作電位時(shí)程圖計(jì)算得到的興奮波前傳導(dǎo)和復(fù)極圖，重構(gòu)出等時(shí)圖。本發(fā)明還提出一種實(shí)現(xiàn)上述用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法的裝置，包括外圍支持系統(tǒng)維持組織細(xì)胞活性并能夠灌注染料；
處理控制單元將熒光信號(hào)的變化與細(xì)胞跨膜電位相關(guān)聯(lián)；光路檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)熒光激發(fā)的方式將待測(cè)細(xì)胞或者組織跨膜電位轉(zhuǎn)變成光學(xué)信號(hào)并記錄，并將光學(xué)信號(hào)傳送給處理控制單元。上述外圍支持系統(tǒng)包括內(nèi)設(shè)有蛇形盤管的水浴加熱裝置、氣瓶、氣液混合瓶、莫菲氏滴管、支架、第一三通閥和第二三通閥；所述氣液混合瓶沒(méi)有瓶底且倒置，所述氣瓶的接出管出口由氣液混合瓶上端敞口伸入至內(nèi)，所述氣液混合瓶的下端連接莫菲氏滴管的進(jìn)口，所述莫菲氏滴管的出口連接至水浴加熱裝置的蛇形盤管進(jìn)口 ；水浴加熱裝置的蛇形盤管的出口連接第一三通閥，第一三通閥通過(guò)管道連接有第二三通閥；所述第二三通閥的出口連接至組織細(xì)胞。在上述第一三通閥和第二三通閥之間還連接有另外一套莫菲氏滴管；所述水浴加熱裝置的蛇形盤管的出口上也連接有套莫菲氏滴管；所述第一三通閥連接有蠕動(dòng)泵。上述光路檢測(cè)系統(tǒng)包括熒光激發(fā)光源、濾光光路和熒光檢測(cè)系統(tǒng)；所述熒光激發(fā) 透鏡和濾光片依次設(shè)置在由熒光激發(fā)光源照射組織細(xì)胞而反射的光路上；所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)為CCD相機(jī)，所述CCD相機(jī)的鏡頭對(duì)準(zhǔn)所述濾光片的出射光。所述處理控制單元為計(jì)算機(jī)。本發(fā)明具有以下有益效果I.多位點(diǎn)同時(shí)記錄可以同時(shí)測(cè)量多個(gè)細(xì)胞(細(xì)胞群)或從多側(cè)面記錄單個(gè)細(xì)胞的電活動(dòng)，動(dòng)態(tài)顯示膜電位的傳導(dǎo)過(guò)程；2.時(shí)間分辨率高時(shí)間分辨率跨度超過(guò)9個(gè)數(shù)量級(jí)，可以從微秒級(jí)到小時(shí)級(jí)；3.空間分辨率高空間分辨率跨度超過(guò)5個(gè)數(shù)量級(jí)，可以從微米量級(jí)到分米級(jí)，可以記錄細(xì)胞與細(xì)胞間的電傳導(dǎo)；4.廣泛適用性可以同時(shí)從不同層次著手研究分子水平、細(xì)胞水平、組織水平到整個(gè)神經(jīng)中樞，可以用于各種細(xì)胞和組織的電生理研究，并能克服電刺激造成的偽跡，研究心臟除顫中電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞的影響，膜局部極化與激動(dòng)波之間復(fù)雜的作用機(jī)制，可為電除顫和心律失常的臨床治療提供重要的指導(dǎo)性建議。這種方法還可通過(guò)腦部動(dòng)作電位來(lái)在體研究視覺(jué)神經(jīng)、嗅覺(jué)神經(jīng)編碼，提高人們對(duì)腦結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)認(rèn)知水平，為研究人員提供一個(gè)極為有力的技術(shù)工具，提供其他方法無(wú)法比擬的更加豐富的信息。本發(fā)明裝置可以給研究人員直觀的提供各種實(shí)時(shí)功能圖像，計(jì)算動(dòng)作電位時(shí)程變化等參數(shù)，同時(shí)灌注系統(tǒng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，不但能保證實(shí)驗(yàn)期間心肌細(xì)胞的生理活性，還可以完成染料加注以及復(fù)灌，消除長(zhǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)中光漂白的影響。


圖I是本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明熒光圖像實(shí)時(shí)采集與處理流程圖。圖3是本發(fā)明重構(gòu)得到的各種功能圖像。圖4-5是本發(fā)明在電生理研究中的一些應(yīng)用，包括組織和器官層次的家兔心臟缺血研究(圖4)以及細(xì)胞層次的培養(yǎng)心肌細(xì)胞自主節(jié)律研究(圖5)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法為首先將細(xì)胞跨膜電位變化轉(zhuǎn)變成熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光信號(hào)光強(qiáng)的變化量AF與細(xì)胞跨膜電位的變化AVm，按照下式計(jì)算光學(xué)動(dòng)作電位Vn ^-(K-T )iT上式中，Vn表示第η幀中某點(diǎn)的細(xì)胞跨膜電位，F(xiàn)n表示該幀中該點(diǎn)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示該細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度；通過(guò)上式計(jì)算得到每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，當(dāng)計(jì)算出一巾貞圖像中每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，則能夠重構(gòu)出某個(gè)時(shí)刻的等電勢(shì)圖；利用簡(jiǎn)化算法先得到平均靜息電位熒光圖像，然后從得到的熒光圖像直接減去背景圖像，最后計(jì)算得到等電勢(shì)圖。另外，本發(fā)明還可以利用求導(dǎo)法和閾值法對(duì)得到的等電勢(shì)圖綜合計(jì)算重構(gòu)得到心臟的動(dòng)作電位時(shí)程圖。然后利用所述動(dòng)作電位時(shí)程圖計(jì)算得到的興奮波前傳導(dǎo)和復(fù)極圖， 重構(gòu)出等時(shí)圖。所述簡(jiǎn)化算法具體為快速計(jì)算細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度，理論上應(yīng)該先計(jì)算得到跨膜電位，然后才能確定靜息時(shí)刻，這樣計(jì)算會(huì)很復(fù)雜。我們?cè)趯?shí)際中采用閾值法快速確定靜息時(shí)刻熒光強(qiáng)度，選定某點(diǎn)熒光強(qiáng)度的最大值與最小值，二者的差就是膜電位的最大變化范圍。然后設(shè)定兩個(gè)閾值，在這兩個(gè)閾值之間的為細(xì)胞靜息時(shí)刻，將這些采樣時(shí)刻的熒光平均后就是該點(diǎn)細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述參照?qǐng)D1，本發(fā)明提出一種用于實(shí)現(xiàn)上述方法的裝置，該裝置包括外圍支持系統(tǒng)，維持組織細(xì)胞活性并能夠灌注染料；處理控制單元，將熒光信號(hào)的變化與細(xì)胞跨膜電位相關(guān)聯(lián)；光路檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)熒光激發(fā)的方式將待測(cè)細(xì)胞或者組織跨膜電位轉(zhuǎn)變成光學(xué)信號(hào)并記錄，并將光學(xué)信號(hào)傳送給處理控制單元。其中外圍支持系統(tǒng)由1-6組成，包括內(nèi)設(shè)有蛇形盤管的水浴加熱裝置4、氣瓶I、氣液混合瓶2、莫菲氏滴管3、支架、第一三通閥5和第二三通閥6 ;氣液混合瓶2沒(méi)有瓶底且倒置，氣瓶I的接出管出口由氣液混合瓶2上端敞口伸入至內(nèi)，氣液混合瓶2的下端連接莫菲氏滴管3的進(jìn)口，莫菲氏滴管3的出口連接至水浴加熱裝置4的蛇形盤管進(jìn)口 ；水浴加熱裝置4的蛇形盤管的出口連接第一三通閥5，第一三通閥5通過(guò)管道連接有第二三通閥6 ;第二三通閥6的出口連接至組織細(xì)胞。其中，如圖所示，第一三通閥5和第二三通閥6均設(shè)置在支架上，心臟等組織細(xì)胞也被固定設(shè)置在支架上。所述第一三通閥5和第二三通閥6連接有蠕動(dòng)泵。在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，為了避免管道中存在氣泡，在第一三通閥5和第二三通閥6之間還連接有另外一套莫菲氏滴管；水浴加熱裝置4的蛇形盤管的出口上也連接有
套莫菲氏滴管。本發(fā)明的光路檢測(cè)系統(tǒng)包括熒光激發(fā)光源7、濾光光路和熒光檢測(cè)系統(tǒng)10。其中熒光激發(fā)光源7采用LED陣列做為光源，設(shè)置在組織細(xì)胞附近，如圖I所示，LED陣列成環(huán)狀照射心臟的一側(cè)，從而使由心臟反射回來(lái)的光能夠通過(guò)環(huán)形陣列被濾光光路所捕獲。本發(fā)明利用LED陣列，可以實(shí)現(xiàn)快速的波長(zhǎng)切換，穩(wěn)定的激發(fā)強(qiáng)度，從而得到很高的信噪比。只要直流穩(wěn)壓電源的輸出電壓的穩(wěn)定度好，LED陣列光源就是一種光強(qiáng)穩(wěn)定的光源。同時(shí)，當(dāng)采用LED陣列光源的時(shí)候，可以通過(guò)電子開關(guān)來(lái)取代光學(xué)快門，降低光照時(shí)間，減小實(shí)驗(yàn)中的染料光毒性和光漂白等現(xiàn)象。濾光光路包括透鏡8和濾光片9，透鏡8和濾光片9依次設(shè)置在由熒光激發(fā)光源照射組織細(xì)胞而反射的光路上。本發(fā)明的熒光檢測(cè)系統(tǒng)10為CCD相機(jī)，該CCD相機(jī)的鏡頭對(duì)準(zhǔn)濾光片9的出射光。本發(fā)明的處理控制單元為計(jì)算機(jī)11，CCD相機(jī)與計(jì)算機(jī)11連接。最終的功能圖像與數(shù)據(jù)分析從計(jì)算機(jī)11獲取。具體實(shí)施過(guò)程如下維持離體心臟或者心肌組織活性并保證染料均勻的灌注由外圍支持系統(tǒng)完成，其中設(shè)備1-4將臺(tái)氏液或者K氏液等離體灌注液加熱到體溫37-37. 5度并維持恒定，并和95%氧氣與5% 二氧化碳?xì)怏w混合，然后經(jīng)過(guò)第一三通閥5與第二三通閥6與電壓敏感染料混合稀釋后灌注到離體心臟或者心肌組織中。并利用第一三通閥5和第二三通閥6完成復(fù)灌與排氣等作用，以消除光漂白等影響。在染料灌注15-20分鐘后，打開熒光激發(fā)光源7，LED陣列組成的激發(fā)光源可根據(jù)染料的激發(fā)波長(zhǎng)，由一 個(gè)或者數(shù)個(gè)波長(zhǎng)LED組成，系統(tǒng)通過(guò)程序控制實(shí)時(shí)選擇某個(gè)波長(zhǎng)作為激發(fā)波長(zhǎng)，相應(yīng)灌注電壓敏感染料的細(xì)胞膜電位熒光信號(hào)經(jīng)過(guò)透鏡8放大與濾光片9后被高速CCD相機(jī)記錄，計(jì)算機(jī)11根據(jù)采集得到的熒光圖像，計(jì)算得到不同膜電位的染料光譜遷移，反解出實(shí)時(shí)細(xì)胞膜電位的變化，并根據(jù)這些變化，重構(gòu)出等時(shí)圖、等勢(shì)圖、激動(dòng)波前圖、動(dòng)作電位時(shí)程圖以及相位圖等功能圖像。在CCD相機(jī)和計(jì)算機(jī)11之間通過(guò)控制算法完成高速熒光圖像的實(shí)時(shí)采集與傳輸控制。參照?qǐng)D2，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)主程序包括一個(gè)主線程和兩個(gè)采集線程，主線程完成線程同步、資源初始化以及顯示功能，兩個(gè)采集線程交替采集和傳輸，以提高采集效率。采集線程完成數(shù)據(jù)從CCD相機(jī)到采集卡內(nèi)存以及從采集卡內(nèi)存到PC內(nèi)存的傳輸，這個(gè)過(guò)程很少占用CPU時(shí)間。顯示線程處理未被采集線程占用的PC內(nèi)存中的數(shù)據(jù)，生成功能圖像并實(shí)時(shí)顯示。CCD相機(jī)初始化成功以后，程序按照相機(jī)配置文件，初始化兩塊同樣大小的采集卡內(nèi)存，提供給兩個(gè)采集線程交替使用。因?yàn)橄鄼C(jī)每秒產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量高達(dá)120MB，而采集卡最大的采集速度是130MB/S，幾乎接近采集卡上限。這樣當(dāng)單線程采集的時(shí)候，傳輸上一幀圖像的時(shí)候會(huì)丟失下一幀圖像的同步信號(hào)而降低采集速度。因此本發(fā)明使用雙采集線程交替采集傳輸來(lái)提高采集性能。當(dāng)采集線程完成一幀數(shù)據(jù)的采集和傳輸后，向主線程發(fā)送消息，消息包括剛剛完成傳輸?shù)膬?nèi)存編號(hào)和線程標(biāo)志信息，主線程按照順序?qū)Σ杉降臒晒鈭D像進(jìn)行顯示和處理。顯示線程設(shè)計(jì)并完成一些簡(jiǎn)單功能圖像的實(shí)時(shí)計(jì)算和顯示，包括熒光圖像中某幾點(diǎn)的光學(xué)動(dòng)作電位的重構(gòu)和顯示，單點(diǎn)動(dòng)作電位的濾波和等電勢(shì)圖的重構(gòu)等。各種功能圖像如圖3所示。圖3中各種功能圖像從左至右分別為原始采集得到的熒光圖像(a)，計(jì)算得到的等電勢(shì)圖(b)，動(dòng)作電位幅度圖(C)，相位圖(d)，等時(shí)圖(e)以及等動(dòng)作電位時(shí)程圖。這其中，等電勢(shì)圖是重構(gòu)其他功能圖像的基礎(chǔ)。等電勢(shì)圖中某個(gè)點(diǎn)代表某個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞群的實(shí)時(shí)跨膜電位變化。光標(biāo)測(cè)檢測(cè)到的熒光光強(qiáng)的變化量AF與細(xì)胞跨膜電位的變化AVm成線性關(guān)系，因此可以通過(guò)AF/F反解出光學(xué)動(dòng)作電位。使用Vn=-Hl -T )/77來(lái)計(jì)算光學(xué)動(dòng)作電位，其中Vn表示第η幀中某點(diǎn)的細(xì)胞跨膜電位，F(xiàn)n表示該幀中該點(diǎn)熒光強(qiáng)度，F(xiàn)表示該細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度。通過(guò)公式可以計(jì)算得到每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，當(dāng)計(jì)算出一幀圖像中每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，就可以重構(gòu)出某個(gè)時(shí)刻的等電勢(shì)圖。在等電勢(shì)圖的基礎(chǔ)上，可以重構(gòu)得到動(dòng)作電位時(shí)程圖APD。在靜息電位基礎(chǔ)上，心肌受閾上刺激后膜電位出現(xiàn)迅速的倒轉(zhuǎn)和恢復(fù)稱為動(dòng)作電位。由于濾波無(wú)法完全濾去噪聲，因此二階差分最大值可以結(jié)合閾值法共同計(jì)算復(fù)極時(shí)間。與APD最大幅度90%閾值最接近的二階導(dǎo)數(shù)最大值即為所求最大值。因?yàn)樯⑸涞挠绊?，在心臟光學(xué)標(biāo)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，利用求導(dǎo)法確定的APD往往比利用幅度法確定的APD可靠，特別是在深層組織出現(xiàn)折返波的情況下。將APD圖經(jīng)過(guò)歸一化，對(duì)按照時(shí)間順序排列的不同圖像進(jìn)行重構(gòu)后，將興奮波前傳導(dǎo)或者APD按照相對(duì)某幀圖像的延遲大小進(jìn)行重構(gòu)，可以提供一幀可以直觀快速反應(yīng)心臟表面激動(dòng)順序的功能圖像，就是等時(shí)圖(isochronal map)。理論上的研究表明，自激動(dòng)系統(tǒng)可以由相空間中激動(dòng)核和恢復(fù)變量之間的關(guān)系來(lái)描述，但是在光學(xué)標(biāo)測(cè)實(shí)驗(yàn)中，只有一個(gè)變量即跨膜電位可供觀測(cè)。可以利用時(shí)間延遲創(chuàng)建 了第二個(gè)變量，F(xiàn)(t)和時(shí)間延遲信號(hào)F(t+T)，利用這兩個(gè)變量研究相空間的變化。相位圖(phase map)就是F(t)和F(t + τ )之間的相位變化。延時(shí)的選擇就非常重要了，如果延時(shí)選擇太小，這樣在動(dòng)作電位的O期和3期，相位都會(huì)有劇烈變化，而在2期和4期，相位變化趨近于O。通過(guò)選擇相位，可以重構(gòu)出直觀反映存在病理情況的相位圖。相位圖中相位劇烈變化的奇異點(diǎn)就是實(shí)際實(shí)驗(yàn)中折返發(fā)生的區(qū)域，奇異點(diǎn)代表該區(qū)域某些點(diǎn)既存在動(dòng)作電位的O期，也存在動(dòng)作電位的3期。各種功能圖像如圖3所示。圖4至圖5為本系統(tǒng)在定量電生理研究中的一些應(yīng)用。圖4為光學(xué)標(biāo)測(cè)系統(tǒng)在家兔心臟急性全局性心肌缺血研究中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)挑選2kg左右的家兔(雌雄不限)，耳外側(cè)靜脈注射麻醉藥戊巴比妥鈉(35mg/kg)及肝素(1000單位/kg)。麻醉后開胸剪開心包，取出心臟，注意要留出一定長(zhǎng)度的主動(dòng)脈。將取出心臟迅速置于預(yù)先備好的4°C灌注液使其停博，并用手指輕壓心室以利于排出殘留血液，防止凝血形成血塊。心臟停跳后，打開灌注系統(tǒng)的流量控制開關(guān)，將主動(dòng)脈和灌流系統(tǒng)插管結(jié)扎固定，灌注首先采用37°C不含BDM的普通臺(tái)氏液(濃度mM，NaCl 130，KCl 4. O, CaC121. 8, MgC121 O, NaHC0324, NaH2P041. 2，葡萄糖5. 6。實(shí)驗(yàn)前調(diào)整灌注液的PH值為7. 4)，心臟經(jīng)溫暖的充氧灌注液灌流后，一般可立即恢復(fù)跳動(dòng)，但起初心率較慢并常伴有心律不齊，以后逐步恢復(fù)正常并穩(wěn)定。用32導(dǎo)生理參數(shù)記錄儀(Cadwell Easy II)觀察并記錄三導(dǎo)聯(lián)心電信號(hào)。觀察電極記錄的心電圖，主要是查看心率。等心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后再換用含BDM的灌注液，使心臟停止收縮但還保留電活動(dòng)。加入BDM后不應(yīng)立即加入染料，而應(yīng)該觀察一段時(shí)間，等待心電圖上觀察到的心率逐步恢復(fù)且穩(wěn)定后再加注電壓敏感染料di-4-ANEPPS O. 4 μ I (5mg染料溶入4 μ I DMSO中)。灌注染料后15 - 20分鐘后開始記錄數(shù)據(jù)，并將灌流速度降低到正常速度的30%，同時(shí)記錄時(shí)間，一段時(shí)間以后恢復(fù)灌流速度，觀察缺血再灌注的現(xiàn)象。為了降低染料的光漂白，在不記錄數(shù)據(jù)的時(shí)刻關(guān)閉光源開關(guān)。所有功能圖像都如圖3所述方法重構(gòu)的。從圖中可以看出，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，APD呈逐漸縮短的趨勢(shì)，急性全心臟缺血導(dǎo)致動(dòng)作電位幅度有所降低，除極速度變慢，動(dòng)作電位上升沿斜率降低，同時(shí)動(dòng)作電位平臺(tái)期有所縮短，但是復(fù)極速度沒(méi)有明顯變化。圖5光學(xué)標(biāo)測(cè)系統(tǒng)在培養(yǎng)小鼠心室肌細(xì)胞中的應(yīng)用。心室肌細(xì)胞通過(guò)胰酶消化獲得細(xì)胞懸液，經(jīng)過(guò)染色后通過(guò)熒光顯微鏡獲取原始熒光圖像，其功 能圖像如圖3所述各方法重構(gòu)得到。圖中可看到剛出生小鼠分離出來(lái)的心室肌細(xì)胞仍然具有自律 性。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法，其特征在于首先將細(xì)胞跨膜電位變化轉(zhuǎn)變成熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光信號(hào)光強(qiáng)的變化量AF與細(xì)胞跨膜電位的變化A Vm,按照下式計(jì)算光學(xué)動(dòng)作電位 ) / /' 上式中，Vn表示第n巾貞中某點(diǎn)的細(xì)胞跨膜電位，F(xiàn)n表示該巾貞中該點(diǎn)突光強(qiáng)度，F(xiàn)表示該細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度； 通過(guò)上式計(jì)算得到每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，當(dāng)計(jì)算出一幀圖像中每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，則能夠重構(gòu)出某個(gè)時(shí)刻的等電勢(shì)圖；然后利用簡(jiǎn)化算法先得到平均靜息電位熒光圖像，從中直接減去背景圖像，最后計(jì)算得到等電勢(shì)圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法，其特征在于，所述簡(jiǎn)化算法具體為采用閾值法確定靜息時(shí)刻熒光強(qiáng)度，選定某點(diǎn)熒光強(qiáng)度的最大值與最小值，二者的差就是膜電位的最大變化范圍；然后設(shè)定兩個(gè)閾值，在這兩個(gè)閾值之間的為細(xì)胞靜息時(shí)刻，將這些采樣時(shí)刻的熒光平均后就是該點(diǎn)細(xì)胞靜息時(shí)刻的平均熒光強(qiáng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法，其特征在于，利用求導(dǎo)法和閾值法對(duì)得到的等電勢(shì)圖綜合計(jì)算重構(gòu)得到心臟的動(dòng)作電位時(shí)程圖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法，其特征在于，利用所述動(dòng)作電位時(shí)程圖計(jì)算得到的興奮波前傳導(dǎo)和復(fù)極圖，重構(gòu)出等時(shí)圖。
5.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求I所述用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法的裝置，其特征在于，包括 外圍支持系統(tǒng)維持組織細(xì)胞活性并能夠灌注染料； 處理控制單元將熒光信號(hào)的變化與細(xì)胞跨膜電位相關(guān)聯(lián)； 光路檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)熒光激發(fā)的方式將待測(cè)細(xì)胞或者組織跨膜電位轉(zhuǎn)變成光學(xué)信號(hào)并記錄，并將光學(xué)信號(hào)傳送給處理控制單元。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，所述外圍支持系統(tǒng)包括內(nèi)設(shè)有蛇形盤管的水浴加熱裝置(4)、氣瓶(I)、氣液混合瓶(2)、莫菲氏滴管(3)、支架、第一三通閥(5)和第二三通閥(6);所述氣液混合瓶(2)沒(méi)有瓶底且倒置，所述氣瓶(I)的接出管出口由氣液混合瓶(2)上端敞口伸入至內(nèi)，所述氣液混合瓶(2)的下端連接莫菲氏滴管(3)的進(jìn)口，所述莫菲氏滴管(3)的出口連接至水浴加熱裝置(4)的蛇形盤管進(jìn)口 ；水浴加熱裝置(4)的蛇形盤管的出口連接第一三通閥(5)，第一三通閥(5)通過(guò)管道連接有第二三通閥(6);所述第二三通閥(6)的出口連接至組織細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，在所述第一三通閥(5)和第二三通閥(6)之間還連接有另外一套莫菲氏滴管；所述水浴加熱裝置(4)的蛇形盤管的出口上也連接有一套莫菲氏滴管；所述第一三通閥(5)連接有蠕動(dòng)泵。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，所述光路檢測(cè)系統(tǒng)包括熒光激發(fā)光源(7)、濾光光路和熒光檢測(cè)系統(tǒng)(10)； 所述熒光激發(fā)光源(7)采用LED陣列做為光源，設(shè)置在組織細(xì)胞附近； 所述濾光光路包括透鏡(8 )和濾光片(9 )，所述透鏡(8 )和濾光片(9 )依次設(shè)置在由熒光激發(fā)光源照射組織細(xì)胞而反射的光路上； 所述熒光檢測(cè)系統(tǒng)(10)為CCD相機(jī)，所述CCD相機(jī)的鏡頭對(duì)準(zhǔn)所述濾光片(9)的出射光。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，所述處理控制單元為計(jì)算機(jī)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于測(cè)定或者監(jiān)測(cè)組織或細(xì)胞跨膜電位變化的方法及裝置，其首先將細(xì)胞跨膜電位變化轉(zhuǎn)變成熒光信號(hào)，檢測(cè)熒光信號(hào)光強(qiáng)的變化量ΔF與細(xì)胞跨膜電位的變化ΔVm，然后計(jì)算光學(xué)動(dòng)作電位，計(jì)算得到每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，當(dāng)計(jì)算出一幀圖像中每個(gè)點(diǎn)的動(dòng)作電位，則能夠重構(gòu)出某個(gè)時(shí)刻的等電勢(shì)圖；利用簡(jiǎn)化算法先得到平均靜息電位熒光圖像，然后從得到的熒光圖像直接減去背景圖像，最后計(jì)算得到等電勢(shì)圖。本發(fā)明可以滿足大多數(shù)電生理研究的需要。外圍支持系統(tǒng)可將染料灌注到細(xì)胞膜上，在待測(cè)時(shí)間內(nèi)保持基本穩(wěn)定，并在實(shí)驗(yàn)期間維持細(xì)胞活性。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102809593SQ201210289749
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者張鎮(zhèn)西, 王晶, 徐正紅, 梅建生, 隆弢 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)