專利名稱：一種檢測分枝桿菌感染的試劑、方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，涉及一種微生物分子生物學(xué)檢測方法，尤其涉及一種檢測結(jié)核感染的試劑、方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是當(dāng)今一個主要的公共健康問題，它的病原體是結(jié)核桿菌，屬于分枝桿菌屬。全世界每年大約有800-1000萬新發(fā)結(jié)核病例，每年有200-300萬人因此而失去生命，結(jié)核病是引起成年人死亡的頭號傳染病。據(jù)WHO報道，全球三分之一的人口(約20億)已感染了結(jié)核桿菌，如不采取措施，近10年內(nèi)還將有約3億人受結(jié)核桿菌感染。據(jù)第四次全國流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國受結(jié)核桿菌感染人數(shù)超過4億，每年有13萬人死于結(jié)核病，是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二。在全面實施DOTS (直接督導(dǎo)治療)策略后，中國的結(jié)核發(fā)病率并沒有如預(yù)期地出現(xiàn)下降，這與潛在的大量未被診斷的潛伏感染以及痰菌陰性結(jié)核病人未被及時診斷有關(guān)，這些感染者是一個巨大的結(jié)核病源庫，DOTS計劃只能針對發(fā)病的肺結(jié)核患者，而對于消滅潛伏感染的病人或者痰菌陰性的癥狀不典型的患者沒有貢獻(xiàn)?，F(xiàn)在，發(fā)達(dá)國家已經(jīng)充分注意到這一現(xiàn)象，在7年前甚至更早已經(jīng)啟動對潛伏感染患者的干預(yù)。全球結(jié)核控制的一項策略是在高危人群中實施有效的篩查計劃，這樣可以鑒別出那些有潛伏感染的病人，通過治療他們來預(yù)防結(jié)核。而其中最突出的問題是如何準(zhǔn)確迅速地發(fā)現(xiàn)潛伏感染者和高危人群并加以控制。目前診斷結(jié)核患者中主要采用的方法有胸部X光片、涂片鏡檢、培養(yǎng)法、TST皮試等。其中X光片無法早期及時發(fā)現(xiàn)；涂片法敏感性特異性差；培養(yǎng)法耗時長，需要4-8周時間；TST皮試實驗則特異性差，無法準(zhǔn)確區(qū)分BCG(卡介苗)接種者和結(jié)核病患者。特異性抗原診斷一直是確認(rèn)和評估病原體感染及感染狀況較為可靠的方法，且有早期診斷價值，已經(jīng)在HBV、HCV、HIV等疾病的診斷方面獲得了廣泛的應(yīng)用。由于人體在對抗結(jié)核桿菌的感染中，細(xì)胞免疫起到了關(guān)鍵性的作用，所以尋找結(jié)核桿菌特異性的T細(xì)胞抗原和檢測T細(xì)胞免疫反應(yīng)已經(jīng)成為今年來研究的熱點。國際上已有報道的T-SPOT試劑正是使用結(jié)核桿菌的特異性抗原ESAT-6和CFP-10，以Elispot方法診斷結(jié)核早期感染(中國專利公開號1350546)。但是ESAT-6、Cfp-1O這兩個抗原屬于結(jié)核桿菌早期分泌蛋白，在結(jié)核持續(xù)感染中分泌量減少，導(dǎo)致檢測的敏感性不足，局限了該試劑的推廣。另一方面有研究顯示T-SPOT試劑在發(fā)展中國家的效果并不理想，推測可能與發(fā)展中國家非結(jié)核分枝桿菌感染率高有關(guān)。另外T-SPOT試劑價格昂貴，每一人份約合80美金，在發(fā)展中國家很難推廣。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供了一種特異性高、能夠檢測應(yīng)用范圍廣且成本低廉的檢測結(jié)核感染的試劑、方法和試劑盒。
本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測分枝桿菌感染的試劑，所述試劑中包含SEQ IDNO 1-7所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。
權(quán)利要求
1.一種檢測分枝桿菌感染的試劑，其特征在于，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或類似物中的任何一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測分枝桿菌感染的試劑，其特征在于，所述類似物包括類似肽或通過生物素/抗生物素蛋白鏈菌素系統(tǒng)將多個類似肽的MHC II分子聚合在一起的聚合分子，所述類似肽與SEQ ID NO 1-7所代表的氨基酸序列同源。
3.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的試劑檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，使權(quán)利要求1所述的試劑與宿主T細(xì)胞相接觸，所述試劑中包含SEQ ID NO 1-7所代表的蛋白、多肽或其類似物中的任何一種或多種； 步驟2，通過測定T細(xì)胞與蛋白、多肽或類似物接觸后狀態(tài)是否發(fā)生變化，從而確定T細(xì)胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物， 能夠識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陽性、感染分支桿菌； 不能識別所述蛋白、多肽或類似物的，則判定為陰性、未感染分支桿菌。
4.如權(quán)利要求3所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述步驟2中的變化包括T細(xì)胞開始分泌細(xì)胞因子或分泌量增加，T細(xì)胞大小、數(shù)量(增殖)或表面標(biāo)志的改變。
5.如權(quán)利要求3所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞可在宿主的外周血液、肺泡灌洗液、胸腔積液、淋巴結(jié)、淋巴液及其它包含T細(xì)胞組織中檢出。
6.如權(quán)利要求5所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞或Y 8 T細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求4所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述步驟2中包括預(yù)先加入抗體與所述細(xì)胞因子結(jié)合；通過測定抗體或抗體復(fù)合物的存在來檢測確定所述T細(xì)胞開始分泌細(xì)胞因子或分泌量增加。
8.如權(quán)利要求4或7所述檢測分枝桿菌的方法，其特征在于，所述細(xì)胞因子包括IFN- y、IL-2、IP-10、IL-12、TNF- a。
9.一種用于如權(quán)利要求3所述方法檢測分枝桿菌的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求I所述的檢測分枝桿菌感染的試劑。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包括真空肝素管、用于ELISA實驗檢測IFN-Y的工具、包裝試劑的包裝盒和瓶子；所述工具包括植物血凝集素(PHA)、酶標(biāo)板、IFN- y抗體、洗板液、樣品稀釋液、IgG 一抗、酶偶聯(lián)二抗、顯色液和終止液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測分枝桿菌感染的試劑、方法和試劑盒。試劑中包含SEQIDNO1-7所代表的蛋白、多肽或類似物。方法通過試劑與宿主T細(xì)胞相接觸，檢測確定T細(xì)胞是否識別所述蛋白、多肽或類似物，從而判斷分枝桿菌感染狀態(tài)。試劑盒包括上述用于檢測分枝桿菌感染試劑。本發(fā)明的試劑、檢測方法和試劑盒檢測的敏感性、特異性高，檢測范圍廣并且制造方便、成本低廉。
文檔編號G01N33/569GK103063837SQ20111031598
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者陳嘉臻, 張文宏, 沈瑤杰, 邵凌云, 王森, 張穎, 翁心華 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院