專利名稱：一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于檢測細(xì)胞凋亡的試劑盒。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生命周期中的重要組成部分，是一種不同于細(xì)胞死亡的由基因調(diào)控的細(xì)胞自動(dòng)消亡過程，它在胚胎發(fā)育，新舊細(xì)胞交替，某些組織的正常退化與萎縮、增生，或腫瘤細(xì)胞的自發(fā)抑制等過程中起著非常重要的作用。細(xì)胞凋亡的主要特征表現(xiàn)在細(xì)胞萎縮，胞膜結(jié)構(gòu)的改變，核染色質(zhì)致密，內(nèi)源性核酸酶性DNA降解等。與之相對(duì)應(yīng)的檢測方法包括形態(tài)學(xué)方法；反映凋亡細(xì)胞膜改變的方法，如國外進(jìn)口的Annexin V檢測試劑盒；反映DNA有規(guī)律斷裂的方法，如DNA末端標(biāo)記法等。其中，Annexin V檢測法是針對(duì)細(xì)胞凋亡最早期特征而設(shè)計(jì)。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞已喪失了其膜磷脂化合物的對(duì)稱性，磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜表面。Annexin V是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在鈣離子存在情況下與PS有高親和力，結(jié)合熒光染料及流式細(xì)胞儀可作為一敏感探針檢測暴露在凋亡細(xì)胞表面的PS，從而在細(xì)胞凋亡早期即尚未出現(xiàn)DNA鏈斷裂情況下對(duì)其進(jìn)行檢測，具有處理細(xì)胞量多，敏感性高，快捷等優(yōu)點(diǎn)。但目前市售的Annexin V檢測試劑盒均為進(jìn)口產(chǎn)品，試劑盒主要包括熒光標(biāo)記的檢測用蛋白Annexin V，DNA染料及相應(yīng)的緩沖體系。該試劑盒價(jià)格昂貴，且Annexin V基因5’編碼區(qū)GC含量高，在大腸桿菌等表達(dá)體系要獲得高表達(dá)有一定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，與上述Annexin V檢測試劑盒主要不同之處在于檢測用蛋白的不同。本發(fā)明檢測用蛋白為豬囊尾蚴cDNA文庫中克隆的AnnexinB1基因表達(dá)的重組蛋白Annexin B1，其與Annexin V同屬膜聯(lián)蛋白家族，該蛋白含347個(gè)氨基酸，分子量32KDa。Annexin B1 cDNA序列已在GeneBank登錄，登錄號(hào)AF147955。研究表明Annexin B1具有明顯的抗凝血活性，現(xiàn)又發(fā)現(xiàn)Annexin B1在鈣離子存在情況下與凋亡細(xì)胞表面的PS有高親和力，故可以作為一種新型的分子探針用于凋亡細(xì)胞的檢測。
Annexin B1 cDNA序列見核苷酸序列表1，序列長度為1044bp。相對(duì)應(yīng)的AnnexinB1蛋白氨基酸序列見表2，由347個(gè)氨基酸組成。
Annexin B1蛋白制備大致流程為根據(jù)Annexin B1 cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，以目的基因質(zhì)粒PUC-Annexin B1(孫樹漢，王俊霞，陳蕊雯等，中國寄生蟲與寄生蟲病雜志，1997；15(1)15～20)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序正確后插入原核表達(dá)載體pJLA-503(購自美國菌種保藏中心)，然后轉(zhuǎn)入宿主菌XLl-Blue(購自Clontech公司)。熱誘導(dǎo)表達(dá)Annexin B1后，經(jīng)離子交換及凝膠過濾層析法制備高純度蛋白。本發(fā)明所用熱誘導(dǎo)型原核表達(dá)載體pJLA-503全長4.9Kb(千堿基對(duì))，含有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ori)，氨芐抗性基因(APT)和PRPL啟動(dòng)子。本發(fā)明采用熱誘導(dǎo)型表達(dá)載體，原因是考慮到大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)熱誘導(dǎo)方式成本低，且誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)該蛋白表達(dá)量也比較高。
本發(fā)明試劑盒組成包括1、用熒光染料異硫氰酸熒光黃(FITC)標(biāo)記的檢測用蛋白Annexin B1，即Annexin B1-FITC；2、碘化丙啶(PI)；3、結(jié)合緩沖液(bindingbuffer)。其中，Annexin B1-FITC用來識(shí)別凋亡細(xì)胞；PI是一種DNA染料，用PI做染色排斥實(shí)驗(yàn)，以從Annexin B1-FITC染色呈陽性的細(xì)胞群中區(qū)別出壞死細(xì)胞；因?yàn)锳nnexin B1與PS的結(jié)合需要一定濃度鈣離子的存在，故試劑盒中加入供反應(yīng)發(fā)生的含鈣離子的結(jié)合緩沖液。
也可用別的熒光素標(biāo)記Annexin B1蛋白，如生物素(biotin)、藻紅蛋白(PE)等。用FITC標(biāo)記蛋白時(shí)，相對(duì)應(yīng)的DNA染料為PI；用PE標(biāo)記蛋白時(shí)，相對(duì)應(yīng)的DNA染料一般用7-氨基放線菌素D(7-ADD)。


圖1為熱誘導(dǎo)型原核表達(dá)質(zhì)粒pJLA-Annexin B1的構(gòu)建流程2為Annexin B1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化的電泳圖譜AAnnexinB1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的電泳圖譜泳道1未誘導(dǎo)的菌體蛋白泳道2誘導(dǎo)后3小時(shí)菌體蛋白泳道3誘導(dǎo)后4小時(shí)菌體蛋白泳道4誘導(dǎo)后5小時(shí)菌體蛋白泳道5標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白BAnnexin B1蛋白純化的電泳圖譜泳道1標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白泳道2菌體蛋白泳道3菌體超聲后上清液的蛋白泳道4過DEAE Sepharose Fast Flow層析柱后蛋白泳道5過SOURCE 15Q層析柱后蛋白泳道6過Superdex 200層析柱后蛋白圖3為用本發(fā)明試劑盒結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果分析。其中，“A”代表活細(xì)胞，“B”代表受損傷細(xì)胞，“C”代表凋亡細(xì)胞，“D”代表晚期凋亡細(xì)胞及繼發(fā)性壞死細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)敘述。
一、制備Annexin B1蛋白1、熱誘導(dǎo)型原核表達(dá)質(zhì)粒pJLA-Annexin B1的構(gòu)建據(jù)Annexin B1 cDNA序列設(shè)計(jì)兩條PCR引物。正向引物為5’CCATATGGCCTACTGTCGCTCCCTGGTTC3’，其中Nde I酶切位點(diǎn)“CATATG”包含起始密碼子“ATG”。反向引物為5’GCGGATCCTATTATGCAGGGCCGATGAGTTTCAAG3’，其中包含BamH I酶切位點(diǎn)“GGATCC”和終止密碼子“TAA”。以目的基因質(zhì)粒PUC-Annexin B1為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Genecore公司測序證實(shí)完全正確后用常規(guī)方法純化Annexin B1 DNA片斷，并分別用Nde I和BamH I雙酶切，然后定向克隆入同樣用Nde I和BamH I雙酶切的原核表達(dá)載體pJLA-503，得到重組質(zhì)粒pJLA-Annexin B1。
2、制備工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pJLA-Annexin B1轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLl-Blue后即成工程菌。采用常用的氯化鈣轉(zhuǎn)化法進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。先將宿主菌菌株XLl-Blue置于50mlLB培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，pH7.0，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4時(shí)，4℃以4000rpm離心10分鐘，去上清。宿主菌用5ml預(yù)冷的100mmol/L的氯化鈣溶液懸浮，10000rpm離心2分鐘，用1～2ml預(yù)冷的100mmol/L的氯化鈣溶液懸浮。冰浴2小時(shí)，即為感受態(tài)細(xì)菌。將構(gòu)建的pJLA-Annexin B1質(zhì)粒100ng與上述感受態(tài)細(xì)菌混勻后置于冰浴30分鐘。然后42℃熱休克90秒，冰浴10分鐘。加入0.8ml LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，取0.2ml轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有氨芐抗生素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12～15小時(shí)，可獲含有重組表達(dá)質(zhì)粒pJLA-Annexin B1的單克隆菌，即為工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)。
3、重組蛋白Annexin B1的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取上述工程菌的單菌落至100ml含氨芐100mg/L的LB培養(yǎng)基中，28℃振搖培養(yǎng)過夜。次日，取100ml菌液接種至含氨芐100mg/L的1L LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在28℃振蕩培養(yǎng)，至細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)期(分光光度計(jì)檢測，波長為600nm處吸光值為A600＝0.5)時(shí)，將培養(yǎng)液置于70℃熱水浴中快速升溫至42℃，再于42℃水浴搖床振蕩培養(yǎng)4～5小時(shí)。A600增至1.2左右，菌體內(nèi)可表達(dá)大量的重組蛋白Annexin B1，約占菌體總蛋白的30％。(見圖2A)4、重組蛋白Annexin B1的純化培養(yǎng)后的菌液10000rpm離心10分鐘，棄上清。用1×STE緩沖液重懸菌體(1×STE緩沖液配方為0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·HCl，PH8.0，1mmol/L EDTA，PH8.0)，冰浴超聲破菌。超聲時(shí)，根據(jù)菌液濃度和體積調(diào)整超聲參數(shù)，當(dāng)菌液由混濁變至半透明時(shí)即可終止，并注意不要有泡沫產(chǎn)生。10000rpm離心5分鐘后，取上清液，聚乙二醇20000(Amresco公司)濃縮后過0.45μm濾膜除去雜質(zhì)，移至透析袋中透析，透析液為20mM Tris·HCl，20mM NaCl，pH8.0，4℃磁力攪拌透析12～14小時(shí)，期間換液3～4次。
透析平衡后，樣品過弱陰離子交換柱(層析介質(zhì)為二乙胺基乙基瓊脂糖，DEAESepharose Fast Flow，Pharmacia公司)進(jìn)行離子交換層析。在20mM Tris·HCl，20mM NaCl，pH8.0條件下，0～1mol/L NaCl進(jìn)行濃度梯度洗脫，依次收集各峰，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定重組蛋白所在峰值。收集目的蛋白峰洗脫液，20mMTris·HCl，20mM NaCl，pH8.0透析液透析平衡，然后過SOURCE 15Q柱(Pharmacia公司)進(jìn)行精細(xì)純化，平衡液及洗脫液成分同第一步純化步驟。SDS-PAGE電泳確定目的蛋白主峰，經(jīng)濃縮后，再過Superdex-200柱(Pharmacia公司)行凝膠層析進(jìn)一步除鹽除雜蛋白。收集蛋白樣品經(jīng)12％SDS-PAGE電泳，考馬氏亮藍(lán)染色顯示為單一蛋白條帶，灰度掃描純度達(dá)98％以上(見圖2B泳道6)。采用考馬斯亮蘭染色法(Bradford法)測定純化蛋白濃度。將所得蛋白冷凍干燥后分裝，置4℃保存。
利用本發(fā)明重組蛋白Annexin B1的純化工藝，每克濕菌可獲約30mg Annexin B1高純度蛋白。
二、制備試劑盒中的試劑1、制備熒光標(biāo)記的Annexin B1蛋白(Annexin B1-FITC)在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰基(-N＝C＝S)可與蛋白的自由氨基(主要是賴氨酸的ε-氨基)經(jīng)碳酰胺化形成穩(wěn)定的硫碳氨基鍵，成為熒光標(biāo)記蛋白。熒光標(biāo)記蛋白的方法采用半透膜滲透標(biāo)記法(Clark法)。用0.025mol/L PH9.6的碳酸鹽緩沖液將上述制備的Annexin B1蛋白稀釋到一定濃度(5～10mg/ml)后裝入透析袋，將FITC(Sigma公司)用相同緩沖液配成0.1～0.5mg/ml溶液(蛋白與熒光素用量比1∶50～1∶100)。然后將裝有Annexin B1蛋白的透析袋浸沒于FITC液，放4℃冰箱，在電磁攪拌下平衡結(jié)合18～24小時(shí)后取出，標(biāo)記即告完成。標(biāo)記后蛋白過G-25柱去除游離熒光素，洗脫用緩沖液為50mM Tris·HCl，50mM NaCl，lmM EDTA，PH8.0。收集標(biāo)記蛋白峰，將Annexin B1-FITC用洗脫液配制成20μg/ml濃度，分裝小管，加入NaN3至終濃度0.02％，4℃冰箱避光保存。若待標(biāo)蛋白溶液體積較大，也可采用直接標(biāo)記法(Marshall法或Chadwick法)。(以上蛋白標(biāo)記方法可參照《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2002年)。
2、制備碘化丙啶(PI)PI是一種DNA染料。由于壞死細(xì)胞失去膜的完整性，PS也會(huì)暴露，故用試劑盒檢測必須能區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞。Annexin B1-FITC用于分析凋亡細(xì)胞外層PS，而PI則用于區(qū)別壞死細(xì)胞。本發(fā)明試劑盒中PI(Sigma公司)濃度為50μg/ml，用1×PBS緩沖液配制，1×PBS配方為8g NaCl；0.2g KCl；1.44g Na2HPO4·7H2O；0.24gKH2PO4·H2O。0.1M NaOH調(diào)PH至7.4，加去離子水定容至1L。
3、制備結(jié)合緩沖液(binding buffer)Annexin B1與PS的結(jié)合需要一定濃度鈣離子的存在，其結(jié)合緩沖液的配方為10mM HEPES/NaOH PH7.4；140mM NaCl；2.5mM CaCl2。也可據(jù)試劑盒包裝大小配成10倍緩沖液，使用前用去離子水稀釋。
三、組裝試劑盒將上述制備的三種試劑分別分裝入管，各取一管置于試劑盒，即成本發(fā)明試劑盒。
試劑盒可根據(jù)使用量的需要做成不同大小的包裝，例如可供做50次實(shí)驗(yàn)的小包裝則各管分別為含濃度為20μg/ml的Annexin B1-FITC 250μl一管，含濃度為50μg/ml的PI 500μl一管以及含50ml的結(jié)合緩沖液一管。按此用量配比依次類推，可組裝成100次、500次等實(shí)驗(yàn)用中大型試劑盒。
試劑盒儲(chǔ)存于2～8℃。因PI、NaN3有毒性，故配制和使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。
四、試劑盒使用方法1、標(biāo)記細(xì)胞1.1取待測細(xì)胞0.5～1×106個(gè)/ml，用預(yù)冷(2～8℃)PBS洗滌2次，離心500～1000rpm，5～10分鐘，棄上清。
1.2用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/ml。
1.3取100μl細(xì)胞懸液進(jìn)行標(biāo)記，加入5μl濃度為20μg/ml的Annexin B1-FITC及10μl濃度為50μg/ml的PI。
1.4室溫避光輕輕混勻反應(yīng)體系10～15分鐘，即完成細(xì)胞熒光標(biāo)記過程。
2、檢測分析檢測分析方法有如下兩種(1)熒光顯微鏡分析取上述熒光標(biāo)記的細(xì)胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。正常細(xì)胞無任何熒光標(biāo)記；凋亡細(xì)胞膜上染有熒光標(biāo)記呈黃綠光環(huán)；壞死細(xì)胞胞膜也呈黃綠光環(huán)，但胞核被PI染成紅色。這樣就把凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞及壞死細(xì)胞區(qū)分開來了。
(2)流式細(xì)胞儀分析取上述熒光標(biāo)記的細(xì)胞懸液每反應(yīng)體系加400μl結(jié)合緩沖液，1小時(shí)內(nèi)流式細(xì)胞儀分析。
進(jìn)行分析時(shí)，在樣品雙色熒光標(biāo)記二維點(diǎn)陣圖上(見圖3)，顯示四個(gè)獨(dú)特細(xì)胞群①活細(xì)胞群(A)顯示低濃度FITC和低濃度PI信號(hào)。②受損傷細(xì)胞(B)顯示低濃度FITC和高濃度PI信號(hào)。③凋亡細(xì)胞(C)顯示高濃度FITC和低濃度PI信號(hào)。④繼發(fā)性壞死細(xì)胞(D)顯示高濃度FITC和高濃度PI信號(hào)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明試劑盒能有效快速檢測早期細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分群清楚。檢測用蛋白AnnexinB1在大腸桿菌表達(dá)體系中為可溶性蛋白，表達(dá)量高，為后續(xù)純化工作帶來了便利。該凋亡檢測試劑盒生產(chǎn)工藝簡單，與國外類似產(chǎn)品相比生產(chǎn)成本低廉，且同樣具有處理細(xì)胞量多，敏感性高，快捷等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1制備熒光標(biāo)記蛋白Annexin B1-FITC從-80℃冰箱取出凍存的工程菌XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)于室溫融化后，用接種環(huán)蘸取少量菌液劃線接種于1.5％的含100μg/ml氨芐的LB瓊脂平板。28℃培養(yǎng)過夜后，取單克隆接種于100ml含100μg/mL氨芐的LB培養(yǎng)液，該LB培養(yǎng)液含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，pH7.0。28℃培養(yǎng)12小時(shí)，作為種子液。按1∶10的比例將種子液接種于1升含100μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)液。于30℃培養(yǎng)2小時(shí)后將三角搖瓶置于70℃熱水浴中快速升溫至42℃，再置于42℃中振蕩培養(yǎng)5小時(shí)進(jìn)行熱誘導(dǎo)。
熱誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌液于10000rpm離心5分鐘，收集菌體。將菌體懸浮于50ml 1×STE緩沖液，分裝成5管，每管10ml，常規(guī)超聲破菌。然后10000rpm離心5分鐘，取上清，PEG濃縮后過0.45μm濾膜除去雜質(zhì)，移至透析袋中透析，透析液為20mMTris·HCl，20mM NaCl，pH8.0，4℃磁力攪拌透析12小時(shí)，期間換液3次。透析平衡的蛋白樣品經(jīng)DEAE Sepharose FF進(jìn)行離子交換層析。以20mM Tris·HCl，pH8.0+1mol/L NaCl pH8.0梯度洗脫，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定重組蛋白所在峰值。收集峰值段洗脫液，透析除鹽后過SOURCE 15Q柱進(jìn)行精細(xì)純化，平衡液及洗脫液成分同第一步純化步驟。SDS-PAGE電泳確定目的蛋白主峰，經(jīng)濃縮后，再過Superdex-200柱行凝膠層析進(jìn)一步除鹽除雜蛋白。最終蛋白樣品經(jīng)12％SDS-PAGE電泳，考馬氏亮藍(lán)染色顯示為單一蛋白條帶。采用考馬斯亮蘭染色法(Bradford法)測定純化蛋白濃度，計(jì)算回收率。將所得蛋白冷凍干燥后分裝保存。然后采用半透膜滲透標(biāo)記法(Clark法)進(jìn)行熒光標(biāo)記蛋白。0.025mol/L PH9.6的碳酸鹽緩沖液將蛋白稀釋到5mg/ml后裝入透析袋，用同樣的緩沖液將FITC配成0.1mg/ml溶液。將透析袋浸沒于FITC液，放4℃冰箱，在電磁攪拌下平衡結(jié)合24小時(shí)后取出，蛋白標(biāo)記即告完成。標(biāo)記后的蛋白過G-25柱去除游離熒光素(緩沖體系為50mM Tris·HCl，50mMNaGl，1mM EDTA，PH8.0)，收集蛋白峰，按20μg/ml濃度分裝小管，加入NaN3至終濃度0.02％，即完成Annexin B1-FITC的制備。
實(shí)施例2檢測細(xì)胞凋亡選用幼齡小鼠胸腺細(xì)胞，誘導(dǎo)凋亡試劑為地塞米松。取2-3周Balb/c小鼠，眼球放血致死后無菌取胸腺，常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞至1×106個(gè)/ml。胸腺細(xì)胞液5ml置于培養(yǎng)皿中，除對(duì)照外，余加地塞米松至終濃度10-5mol/L。對(duì)照及誘導(dǎo)組均置CO2孵育箱中37℃培養(yǎng)，5小時(shí)后收集細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞兩次，1×bindingbuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)l×106個(gè)/ml。吸取100μl細(xì)胞懸液，加入5μl濃度為20μg/ml Annexin B1-FITC，10μl PI液，室溫避光輕輕混勻反應(yīng)體系15分鐘后每管加400μl結(jié)合緩沖液，送流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果如圖3所示，未誘導(dǎo)組凋亡細(xì)胞占所測細(xì)胞總數(shù)的10.3％，活細(xì)胞為83.5％；地塞米松誘導(dǎo)組凋亡細(xì)胞占所測細(xì)胞總數(shù)的75.1％，活細(xì)胞為15.3％。正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞三群細(xì)胞分群清楚，反映該試劑盒是一種敏感性高、快捷的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。
表1Annexin B1 cDNA核苷酸序列1 atggcctact gtcgctccct ggttcatcta tatgccccca atggagagaa gtacaaaccg61 actattaccc caacacccgg gttctcaccg accgctgatg ctgagcactt gaagcgtgca121 atgcgaggac ttggcacgaa tgaacgtgcg atcattgaca ttcttggaaa ccgaacttca181 gccgaaagaa tggccattcg tgacgcctat ccgtcgattt ccagcaagac cctgcacgat241 gctctaacca gcgagctgag tggcaagttc cggaggttcg ccttgttgct aatccaatca301 ccgtggcagg tgatggcaga ggctctttac gacgccatga agggggctgg cactaaggaa361 cgcgtactca atgaaattat tgccgggtgt tcaaaggatg acatccctca gttgaaaaaa421 gcttttgaag aagtgagcgg aggagaaacc cttgatgatg cgatcaaggg ggacacgagt481 ggcgactacc gcgaggccct tctgctagcg ctcgccggtc aggctgatga accacaggcg541 atgcaactca aaaacctaac accctccact ctcagtcagg ttgtgaatcc cggccttgct601 gaaacggatg cgaaggagct gtacgcctgc ggtgaggggc gcccgggcac agcagagagt661 cgtttcatgc gtcctatcgt caatcgctca ttccttcaat taaacgcaac gaatgaggct721 tacaatcggg cctacggtca cccgttgatt gatgcaataa agaaggagac gtcgagagac781 cttgaggact ttctcataac tagagttcgc tacgccactg atcgcgccag tctgtttgcc841 gaactccttc actttgccat gagaggagct ggcaccaagg actccacttt gcaacgtgtt901 cttgccttga gggctgatac tgatctagga agcatcaagg agaagtatgc ggagctctat961 ggtgaaacct tggaagcggc aatcaagggt gatacttctg gtgactatga ggctctctgc1021 ttgaaactca tcggccctgc ataa表2 Annexin B1蛋白氨基酸序列MAYCRSLVHL YAPNGEKYKP TITPTPGFSP TADAEHLKRA MRGLGTNERA IIDILGNRTSAERMAIRDAY PSISSKTLHD ALTSELSGKF RRFALLLIQS PWQVMAEALY DAMKGAGTKERVLNEIIAGC SKDDIPQLKK AFEEVSGGET LDDAIKGDTS GDYREALLLA LAGQADEPQAMQLKNLTPST LSQVVNPGLA ETDAKELYAC GEGRPGTAES RFMRPIVNRS FLQLNATNEAYNRAYGHPLI DAIKKETSRD LEDFLITRVR YATDRASLFA ELLHFAMRGA GTKDSTLQRVLALRADTDLG SIKEKYAELY GETLEAAIKG DTSGDYEALC LKLIGPAZ
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，試劑包括熒光標(biāo)記的檢測用蛋白、DNA染料及結(jié)合緩沖液，其特征在于檢測用蛋白為Annexin B1。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，其特征在于熒光標(biāo)記的檢測用蛋白為Annexin B1-FITC，DNA染料為PI。
3.權(quán)利要求1所述細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的檢測用蛋白Annexin B1的制備方法，包括構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒、制備工程菌、表達(dá)重組蛋白、重組蛋白的純化，其特征在于構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒為pJLA-Annexin B1。
4.權(quán)利要求3所述細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的檢測用蛋白Annexin B1的制備方法，其特征在于制備的工程菌為XLl-Blue(pJLA-Annexin B1)。
5.權(quán)利要求1所述細(xì)胞凋亡檢測試劑盒用于檢測細(xì)胞凋亡用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于檢測細(xì)胞凋亡的試劑盒。現(xiàn)有的Annexin V檢測試劑盒為進(jìn)口產(chǎn)品，檢測用蛋白為Annexin V，價(jià)格昂貴。本發(fā)明試劑盒檢測用蛋白為Annexin B1，Annexin B1與Annexin V同屬膜聯(lián)蛋白家族，但Annexin B1在大腸桿菌中表達(dá)量高，且為可溶性表達(dá)，故生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低廉，且本發(fā)明試劑盒同樣具有檢測細(xì)胞量多、敏感性高和快捷等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1431319SQ0215502
公開日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者孫樹漢, 張毅, 王芳, 郭瀛軍, 顏宏利 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)