專利名稱：單分子測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求2008年9月19日提交的美國臨時專利申請No. 61/098，712的權(quán)益， 其內(nèi)容經(jīng)此引用全文并入本文。本發(fā)明涉及檢測分析物的一個或多個離散的單分子的測定。
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學研究、醫(yī)療診斷、預(yù)后、監(jiān)測和治療選擇、生物恐怖活動偵測和涉及分析多樣品中低體積和低濃度的分析物的其它領(lǐng)域中的進展已經(jīng)指引開發(fā)出能夠在越來越低的濃度下靈敏檢測樣品中粒子的樣品分析系統(tǒng)。美國專利US 4，793，705和5，209，834 描述了已經(jīng)達到極靈敏檢測的現(xiàn)有系統(tǒng)。本發(fā)明在本領(lǐng)域，具體為細胞因子檢測、定量與表征領(lǐng)域提供了進一步開拓發(fā)展。傳統(tǒng)的細胞因子測定包括測量血清或血漿中的細胞因子，但是各種細胞因子已經(jīng)在其它生物流體中被檢測。例如，Kimball, J. Immunol. 133 :256-260(1984)報道了人尿中的IL-I生物活性。Tamatani等人，Immunology 65 :337-342(1988)采用色譜法和生物測定法公開了在人類羊水中存在IL-I α與IL-Ιβ。同一組人用酶免疫測定法測量人類羊水中的 IL-I α 和 IL-I β (Tsunoda 等，Lymphokine Res. 7 :333，1988)。Wilmott 等， Lymphokine Res. 7 :334(1988)測量了與其它疾病相比囊性纖維化病中支氣管肺泡灌洗液體中的 IL-I β 與 IL-I 生物活性。Khan 等，MoI. CellEndocrinol, 58 :221-230(1988)報道了在人類卵巢卵泡液中證實存在高水平的類IL-I生物活性。在類天皰瘡患者的水皰液體中已經(jīng)報道了淋巴毒素(Jeffes等人，J. CHn. Immunol. 4 :31_35，1984)。在人類汗液中也已經(jīng)報道了 IL-I (Didierjean 等人，Cytokine 2 :438_446，1990)。在貓(Coceani 等人，Brain Res.，446 :245-250,1988)和人(參見例如 Peter 等人，Neurology, 41 121-123，1991)的腦脊髓液(CSF)中已經(jīng)報道發(fā)現(xiàn)了 IL-I。在臨床正常人類的齒齦液中檢測具有類IL-I生物活性的因子(Oppenheim等人，Transplant. Proc. 14 =553-555,1982)，該活性在發(fā)炎的齒齦區(qū)域中比在未發(fā)炎的齒齦區(qū)域中高。測量細胞因子水平的結(jié)合測定可以使用固相或均質(zhì)形式。合適的測定方法包括夾心結(jié)合測定或競爭結(jié)合測定。夾心免疫測定的實例描述在授予GriAb等人的美國專利 US 4，168，146和授予Tom等人的美國專利US 4，366，241中。競爭免疫測定的實例包括授予Deutsch等人的美國專利US 4，235，601、授予Liotta的美國專利US 4，442，204和授予 Buechler等人的美國專利US 5，208, 535中公開的那些?？梢圆捎枚嗦窚y定形式——例如通過使用結(jié)合試劑陣列的多路技術(shù)、使用標記物的光譜鑒別的多路技術(shù)、通過在粒子上進行的結(jié)合測定(例如使用點陣儀系統(tǒng))的流式細胞儀分析的多路技術(shù)——測量多種細胞因子。另一方法包括使用可以單獨識別與詢問的涂布在珠粒上的結(jié)合試劑。國際專利公開W09^6067A1 (ffatkins等人)描述了使用尺寸變化的磁性粒子測定多種分析物；屬于截然不同的尺寸范圍的粒子測定不同的分析物。該粒子設(shè)計為被流式細胞儀辨別并單獨詢問。Vignali已經(jīng)描述了多路結(jié)合測定，其
6中使用微粒子的64個不同珠粒組，各自具有均勻和截然不同的比例的兩種染料(Vignali， D. Α. Α. , “ Multiplexed Particle-Based Flow Cytometric Assays" , J. Immunol. Meth. (2000)243 :243-255) ο已經(jīng)公幵了包括一組15個不同尺寸與熒光的不同珠粒的類似方法可用于同時檢定多種肺炎球菌血清型(Park，M. K.等人，“A Latex Bead-Based Flow Cytometric Immunoassay Capable Of Simultaneous Typing Of Multiple Pneumococcal Serotypes(Multibead Assay) 〃 ， Clin Diagn Lab Immunol. (2000)7:486-9)。 Bishop， J.E.等人已經(jīng)描述了同時量化六種人細胞因子的多路夾心式測定(Bishop，J. Ε.等人’ “Simultaneous Quantification of Six Human Cytokines in a Single Sample Using Microparticle-based Flow Cytometric Technology " , Clin Chem. (1999)45: 1693-1694)。其它方法用于量化特異性細胞因子表達。包括測量細胞因子mRNA或細胞因子多肽的方法。例如，PCR 、競爭PCR 、PCR-ELISA、微陣列、基因表達珠?；鶞y定以及原位雜交技術(shù)可用于測量細胞因子mRNA，免疫組織化學可用于測量細胞因子蛋白質(zhì)水平。公開的美國專利申請US 20060205012公開了測量樣品中一種或多種細胞因子水平的測定方法。目前仍需要用于測量具有診斷或預(yù)后價值的低濃度分析物，例如細胞因子的更靈敏的方法。此外，更有效和高效的分析物單分子檢測的方法、化合物與系統(tǒng)代表各種背景下診斷與預(yù)后的顯著進步。這些和其它需要由本發(fā)明提供。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供進行檢測分析物的單分子的測定的方法。該方法提供在比目前可用方法更低的檢測閾值水平下檢測具有分析、診斷與預(yù)測意義的物類。此外，本發(fā)明的不同實施方案提供了具有比目前可用方法更寬的動態(tài)范圍的單分子測定。對需要高靈敏度和魯棒的檢測動態(tài)范圍的快速、廉價的單一-和多種-生物標記物診斷測定的強有力的臨床需求進一步增加了本發(fā)明的方法的意義。本發(fā)明的方法不同于微量培養(yǎng)板基測定。微量培養(yǎng)板基測定不能輕易地從檢測物類與分析物之間形成的復(fù)合物中除去基本所有未結(jié)合的檢測物類。在各種實施方案中， 本發(fā)明提供一種方法，該方法包括通過在從夾心復(fù)合物中洗脫檢測抗體之前將該捕獲抗體-分析物-檢測抗體夾心復(fù)合物轉(zhuǎn)移到不含該檢測抗體的容器中來分離未結(jié)合的可檢測物類與該復(fù)合物。測定混合物產(chǎn)生不精確的高信號，在所述測定混合物中存在非特異性結(jié)合的檢測抗體，且所述非特異性結(jié)合的檢測抗體連同與該夾心復(fù)合物特異性結(jié)合的檢測抗體一起洗脫到檢測混合物中。在第一方面，本發(fā)明提供進行檢測與可檢測物類特異性結(jié)合到其上的分析物單分子相關(guān)的可檢測物類單分子的測定的方法。該方法包括在檢測該可檢測物類之前將基本所有未結(jié)合的可檢測物類與該捕獲抗體-分析物-檢測抗體夾心復(fù)合物分離。由此，在一示例性實施方案中，本發(fā)明提供包括在第一容器中在該分析物與特異性結(jié)合該分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物的方法。該捕獲物類固定在磁性粒子上。在捕獲該分析物后且仍在第一容器中，該復(fù)合物與特異性結(jié)合到該分析物上的可檢測物類接觸，由此形成固定的可檢測物類的復(fù)合物。該固定的復(fù)合物隨后從第一容器中移出，并轉(zhuǎn)移到不含該可檢測物類的第二容器中。一旦在第二容器中，從固定的復(fù)合物上洗脫該可檢測物類。使用合適的單分子檢測裝置檢測可檢測物類單分子。在各種實施方案中，可檢測物類單分子是多個具有基本相同結(jié)構(gòu)的可檢測物類的分子之一。在另一些實施方案中，存在兩個或多個可檢測物類的群體，每個群體包括不同結(jié)構(gòu)的可檢測物類。在一示例性實施方案中，該捕獲物類是抗體。在各種實施方案中，該可檢測物類是標記抗體，例如用熒光團標記的抗體。在一示例性實施方案中，本發(fā)明提供如上所述的方法，其中該可檢測物類單分子與分析物單分子相關(guān)聯(lián)，該分析物單分子是選自細胞因子與生長因子的一員，該可檢測物類特異性結(jié)合到其上。在各種實施方案中，該測定能夠以小于或等于約5pg/mL的量檢測可檢測物類。在某些實施方案中，該測定以小于或等于約2pg/mL的量檢測可檢測物類單分子。本發(fā)明的方法還提供具有魯棒的動態(tài)范圍的測定。例如，在各種實施方案中，本發(fā)明提供具有至少約21og、優(yōu)選至少31og且更優(yōu)選至少約41og的動態(tài)范圍的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)單分子測定的結(jié)果決定診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)和/或治療方法的方法。該方法基本如上所述，額外要素是在逐單分子基礎(chǔ)上(不同于平均濃度)量化可檢測物類的多個單分子，并將由該量化推導(dǎo)出的量與診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)或治療方法聯(lián)系起來。本發(fā)明還包括實施本發(fā)明的方法的試劑和試劑盒。在一種實施方案中，試劑盒包含在本發(fā)明方法中測量的分析物(例如細胞因子)抗體。該試劑盒可進一步包含測定稀釋劑、標樣、對照物和/或可檢測標記物。該測定稀釋劑、標樣和/或?qū)φ瘴锟筛鶕?jù)特定樣品基質(zhì)進行優(yōu)化。例如，對血液、血清或血漿樣品中的測量，該稀釋劑、標樣和對照物可以包括 i)人類血液、血清或血漿；ii)動物血液、血清或血漿或iii)人造血液、血清或血漿代用品。各種細胞因子可能可用作實施診斷和/或監(jiān)測各種疾病和篩選藥物或候選藥物治療疾病的效力的本發(fā)明方法用的診斷標記物。此外，如下文中詳細描述的那樣，本發(fā)明的某些實施方案提供確定在這些和其它分析中充當標記物的特定候選細胞因子的效力的方法。采用本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員之一無需過度試驗即可確定一種或多種所選細胞因子或其它標記物(包括本文中未明確列舉和實踐中尚未發(fā)現(xiàn)的細胞因子與其它標記物)用作標記物的能力，該標記物的測得水平/概況可用于進行本發(fā)明的各種診斷與篩選方法。本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點和方法將由下列詳述更為顯而易見。


包括附圖與說明書的組成部分以描述本發(fā)明的某些方法。參考附圖中顯示的示例性和因此非限制性的實施方案，更容易看出本發(fā)明和用本發(fā)明提供的系統(tǒng)的部件和運行的更清楚概念，在附圖中，類似標號(如果它們在多于一個視圖中出現(xiàn))是指相同元件。通過與本文中提出的描述一起參照這些圖的一副或多幅可以更好地理解本發(fā)明。要注意的是， 圖中描述的特征不必是按比例繪制的。圖1是用于本發(fā)明方法中的示例性光學系統(tǒng)的示意圖。圖2是顯示曲線擬合精確度的曲線圖；在8個連續(xù)測定運行中生成的cTnl標準曲線的反向內(nèi)插(組A，全范圍，組B，全范圍，組B，低端量化范圍)。
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圖3是獲自100名不同獻血者的肝素鋰血漿樣本中cTnl的頻率分布。圖4是獲自健康人類志愿者的血漿中IL-2、IL-5、IL_7和IL-21的頻率分布。圖5是采用本發(fā)明方法測得的來自健康志愿者的樣品中各種白介素(IL-2、IL_5、 IL-7和IL-21)濃度的表格。圖6是顯示圖5中各種白介素濃度的比例的表格。
具體實施例方式引言本文中公開的是用于檢測樣品中具有分析、臨床、預(yù)后和/或診斷意義的物類的單分子的本發(fā)明方法的實例。在各種實施方案中，該樣品取自受試對象。該測定可以包括測量生物試樣中的分析物，例如測量疾病標記物、炎癥標記物和/或細胞因子，其中該分析物的水平指示疾病的存在或嚴重程度。本發(fā)明的各種實施方案涉及檢測和/或辨別各種疾病、預(yù)測此類疾病的進程和/ 或后果的方法，治療此類疾病的方法和用于預(yù)防或抑制此類疾病進展的藥劑。本發(fā)明的示例性實施方案涉及通過按照本發(fā)明的測定方式施以和/或重復(fù)施以診斷試驗以便監(jiān)測患者體內(nèi)的疾病進展或治療的方法。在一實例中，該診斷方法用于通過測量藥物或候選藥物對來自用藥物或候選藥物治療的患者、動物模型、組織樣品和細胞培養(yǎng)的樣品中疾病特異性分析物水平的作用評價藥物或候選藥物治療疾病的效力。在各種實施方案中，本發(fā)明提供進行用于檢測細胞因子參與或涉及其中的疾病的診斷試驗的方法。一示例性實施方案是識別有診斷價值的疾病細胞因子標記物的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明提供測定特定候選分析物(如特定細胞因子)充當診斷和/或監(jiān)測疾病和篩選藥物或候選藥物治療疾病的效力的本發(fā)明方法中的診斷標記物的效力的方法。在各種實施方案中，僅標記混合物中的特異性單分子?？梢詫⒛繕藛畏肿优c標記結(jié)合伴體結(jié)合以實現(xiàn)特異性標記，其中該結(jié)合伴體通過互補的結(jié)合表面特異性地與該目標單分子相互作用。伴體之間的結(jié)合力可以是共價相互作用或非共價相互作用，如疏水鍵合、 親水鍵合、離子鍵合和氫鍵鍵合、范德華引力或配位絡(luò)合物形成。結(jié)合伴體的實例是細胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、抗體和病毒表位、激素(例如嗎啡樣肽、類固醇等等) 和激素受體、酶與酶底物、輔因子和目標序列、藥物和藥物靶標、寡核苷酸和核酸、蛋白質(zhì)和單克隆抗體、抗原和特異性抗體、多核苷酸和互補的多核苷酸、多核苷酸與多核苷酸結(jié)合蛋白質(zhì)；生物素和抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素、酶和酶輔因子；以及凝集素和特異性碳水化合物?？梢猿洚斀Y(jié)合伴體的示例性的受體包括天然存在的受體，例如甲狀腺素結(jié)合球蛋白、凝集素、在細胞表面上發(fā)現(xiàn)的各種蛋白質(zhì)(分化的簇或CD單分子)等等。在一種實施方案中，樣品與珠粒或微球，例如磁性粒子反應(yīng)，其涂布有結(jié)合伴體 (例如捕獲物類)，該結(jié)合伴體與目標單分子反應(yīng)。該珠粒與樣品的任何未結(jié)合成分分離。 在一種實施方案中，捕獲的分析物與可檢測物類接觸，接著除去未結(jié)合的材料，將該分析物-可檢測物類復(fù)合物轉(zhuǎn)移到單獨的容器中，在該容器中其任選被洗滌并用將分析物于可檢測物類離解的洗脫混合物處理。通過本發(fā)明中所用的單分子分析儀檢測該可檢測物類的各個分子。
定義本文中使用的術(shù)語“分析物”和“結(jié)合伴體”是指參與結(jié)合相互作用的分子。例如， 分析物和結(jié)合劑可包括任何有機、無機或生物藥劑。此類藥劑的非限制性例子包括DNA或 RNA片段(例如寡核苷酸)、適體、肽和蛋白質(zhì)(例如抗體)、抗原和有機小分子(例如藥劑、 戰(zhàn)爭試劑、殺蟲劑、除草劑、農(nóng)業(yè)肥料)。在特定的測定中，分析配體與受體之間的結(jié)合相互作用。在示例性測定中，分析物與結(jié)合伴體的結(jié)合是提供可檢測物類的一個步驟，該可檢測物類的一個或多個分子可以在本發(fā)明的測定中檢測。該可檢測物類由此是分析物的代理 (proxy)可檢測物類的分子與分析物分子相關(guān)聯(lián)并對應(yīng)于分析物分子。盡管這種相互關(guān)聯(lián)不必是一對一的，其也是可推斷的或可通過實驗確定的。分析物來自于任何原核或真核個體，包括動物(例如哺乳動物，例如人類；鳥類，魚類等等)、植物、酵母、細菌、病毒、原生動物等等。在分析物或含有該分析物的樣品的來源方面本發(fā)明沒有限制。本文中使用的“樣品”包括來自幾乎任何相關(guān)(of interest)來源的材料。樣品的非限制性實例包括選自血液、血清、血漿、支氣管肺泡灌洗液體、尿、腦脊髓液、胸膜腔積液、 滑液、腹膜液、羊水、胃液、淋巴液、間質(zhì)液、組織勻漿、細胞提取物、唾液、痰、糞便、生理分泌物、眼淚、粘液、汗液、乳汁、精液、精液液體、陰道分泌物、來自潰瘍和其它表面皮疹、膿皰和膿腫的液體、和包括正常、惡性和懷疑組織的活體檢查的組織提取物，或含有該分析物的身體的任何其它成分的那些。在一些實施方案中，該樣品選自血液、血漿或血清。在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，該樣品是已經(jīng)與相應(yīng)分析物分子的熒光標記的特異性抗體接觸的血清樣品；并且其中所述分析包括檢測標記的分析物分子的存在、不存在和/或濃度。在一些實施方案中，通過計數(shù)和量化所選體積單位中可檢測物類的分析物分子的數(shù)量來確定濃度。在一些此類實施方案中，該方法進一步包括根據(jù)該標記分析物分子的所述存在、不存在和/或濃度確定治療、預(yù)后、治療狀態(tài)和/或治療方法。本文中使用的“結(jié)合伴體”是指在本發(fā)明的測定中結(jié)合到相關(guān)分析物上的物類。示例性結(jié)合伴體包括基本上可互換使用的“捕獲物類”和“可檢測物類”。結(jié)合伴體的非限制性實例包括蛋白質(zhì)(例如抗體、受體)、核酸、糖類、氨基酸、脂質(zhì)、毒素、毒液、藥物、病毒、細菌、細胞及其任意組合。在各種實施方案中，當該結(jié)合伴體是可檢測物類時，用可檢測標記物對其進行標記。當該結(jié)合伴體是捕獲物類時，在一些實施方案中，其通過共價或非共價相互作用結(jié)合到磁性粒子上。本文中使用的“可檢測物類”是指分析物的第一可檢測結(jié)合伴體或與該分析物結(jié)合的不同結(jié)合伴體的可檢測結(jié)合伴體。在一種示例性實施方案中，該可檢測物類特異性結(jié)合到該分析物上或結(jié)合到該分析物的不同結(jié)合伴體上。在各種實施方案中，可檢測物類的單分子可以用本發(fā)明的方法檢測。在許多本發(fā)明的實施方案中，與免疫測定有關(guān)的本領(lǐng)域基礎(chǔ)知識(例如夾心、Elisa等等)是可用的，示例性可檢測物類是共軛到可檢測標記物上的抗體。在某些實施方案中，可檢測物類單分子可通過本發(fā)明的方法檢測。在各種實施方案中，該可檢測物類以可逆方式結(jié)合該分析物，由此，在周圍環(huán)境改變時，該分析物從該可檢測物類中釋放。在一優(yōu)選實施方案中，該可檢測物類是以可推斷或可通過實驗確定的方式與該分析物單分子相關(guān)聯(lián)的該分析物的代理?！安东@物類”是指分析物的結(jié)合伴體，該結(jié)合伴體特異性識別該分析物，使得該分析物可以與樣品中至少一種非分析物的污染物質(zhì)分離。在各種實施方案中，該分析物與該捕獲物類之間形成的復(fù)合物在一個或多個洗滌步驟過程中是穩(wěn)定的，使得該分析物能夠與基本所有污染物質(zhì)分離。在各種實施方案中，該捕獲物類以可逆方式結(jié)合該分析物，由此， 在周圍環(huán)境改變時，該分析物從該可檢測物類中釋放。示例性捕獲物類是抗體，例如細胞因子、生長因子或其它生物相關(guān)分析物的抗體。本文中使用的術(shù)語“磁性粒子”是指具有永久或感生偶極矩的磁性珠?；蛄Ｗ?。 用于本發(fā)明的示例性磁性粒子包括容許該粒子與該分析物與該粒子的結(jié)合伴體(“捕獲物類”)之間的共軛的反應(yīng)性官能?；旧暇哂性撎卣鞯娜魏涡问降拇判粤Ｗ泳捎糜诒景l(fā)明。例如，涂布多糖的順磁性微球或納米球可用于標記粒子。授予Molday的美國專利US 4，452，773描述了磁性鐵-葡聚糖磁性粒子的制備，并提供了描述制備適于結(jié)合到生物材料上的粒子的各種方法的概述。用于高梯度磁分離法的磁性粒子的聚合物涂層的描述見于德國專利3720844和授予Miltenyi的美國專利US 5，385，707中，其內(nèi)容均經(jīng)此引用全文并入本文。制備順磁性磁性粒子的方法描述在美國專利US 4，770，183中。通過任何合適的方法用結(jié)合到其上的結(jié)合伴體分子官能化該磁性粒子。例如，磁性粒子可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的幾種偶聯(lián)反應(yīng)(G.T.Hermanson, Bioconjugate Techniques(Academic Press,1996) ；L. Ilium, P. D. Ε. Jones,Methods in Enzymologyl 12,67-84 (1985))之一共軛到核酸，例如 DNA(寡核苷酸)或RNA片段、肽或蛋白質(zhì)、適體和有機小分子上。在本發(fā)明的某些實施方案中，該官能化磁性粒子具有共價鍵合到其上的結(jié)合伴體分子(例如DNA、RNA或蛋白質(zhì))。該結(jié)合伴體分子通過非共價(例如范德華力、疏水-疏水、親水-親水或離子)相互作用結(jié)合到該磁性粒子上。在一種示例性實施方案中，該結(jié)合伴體分子通過生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用共軛到該磁性粒子上。在各種實施方案中，用抗生物素蛋白鏈菌素官能化該磁性粒子，用抗生物素蛋白官能化該結(jié)合伴體。在另一些實施方案中，用生物素官能化該磁性粒子，該結(jié)合伴體共軛到抗生物素蛋白鏈菌素上。用結(jié)合伴體分子官能化該磁性粒子通常需要一步或兩步反應(yīng)，其例如可以用標準液處理機器人技術(shù)和96孔格式平行進行以便將許多合意的結(jié)合伴體連接到指定的磁性粒子上?？梢匀右怨㏎C測量。每批磁性粒子可能提供用于多種測定的材料，由此盡量減少測定間的變動。磁性粒子可以儲存在緩沖的原懸液中直到需要的時候。將該分析物連接到該磁性粒子-固定的捕獲物類上的具體方法對本發(fā)明的實踐而言并非至關(guān)重要，多種備選方法在本領(lǐng)域是已知的。該粘附通常通過該分析物分子與共軛到該磁性粒子上的涂層上并提供用于該相互作用的官能團的特異性結(jié)合伴體的相互作用?？贵w是結(jié)合伴體的實例。抗體可以偶聯(lián)到高親和性結(jié)合體系的一員(例如生物素)上， 該分析物分子粘附到另一員(例如抗生物素蛋白)上。二抗識別物類——原發(fā)抗體的特異性表位，例如抗鼠免疫球蛋白和抗大鼠免疫球蛋白也可用于本發(fā)明。間接偶聯(lián)法能使單一磁偶聯(lián)實體(例如抗體、抗生物素蛋白等等)用于多種分析物分子。本文中使用的術(shù)語“標記物”是指使得一個或多個單分子或一種或多種可檢測物類可以在本發(fā)明中使用的單分子分析儀中獨立檢測的任何物類。用于本發(fā)明的標記物包括染料標簽、電荷標簽、質(zhì)量標簽、量子點或珠粒、磁性標簽、光散射標簽、高分子染料和連接到聚合物上的染料。熒光標記物，或染料是一類用于本發(fā)明的標記物的非限制性實例。熒光標記物的例子可以在 HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH PRODUCTS (R. Haugland，第 9版，Molecular Probes Pub. (2004))中找到。染料包括為材料增添色彩和/或能夠發(fā)光或發(fā)熒光的極其多種的化合物。染料可以在特定波長下吸收光或發(fā)射光。染料可以插入分析物分子中，或非共價或共價地鍵合到分析物分子上。染料本身可以構(gòu)成檢測分析物上各種結(jié)構(gòu)的探針，例如小溝結(jié)構(gòu)、分析物分子的十字形、環(huán)形或其它構(gòu)象要素。染料可以包括BODIPY和ALEXA染料、Cy [η]染料、SYBR染料、溴化乙錠與相關(guān)染料、吖啶橙、二聚體菁染料，如Τ0Τ0、Υ0Υ0、Β0Β0, T0PR0 P0PR0和Ρ0Ρ0及它們的衍生物、雙苯甲亞胺、OliGreen, PicoGreen 與相關(guān)染料、菁染料、熒光素、LDS 751、DAPI、AMCA, Cascade Blue、CL-NERF, Dansyl、二烷基氨基香豆素、4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基熒光素、2’，7’ - 二氯熒光素、 DM-NERF、曙紅、赤蘚紅、熒光素、羥基香豆素、異硫藍、麗絲胺若丹明B、孔雀綠、甲氧基香豆素、萘并熒光素、NBD、0regon Green、PyMP0、芘、若丹明、Rhodol Green、2，，4，，5，，7，-四溴砜熒光素、四甲基若丹明、Texas Red、X-若丹明、Dyomic染料系列、Atto-tec染料系列、香豆素、phycobilliprotein(藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍蛋白)、綠色、黃色、紅色和其它熒光蛋白質(zhì)、上轉(zhuǎn)換熒光粉和量子點。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將認出可在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的其它染料。這并非詳盡名單，可用的染料包括可用于實現(xiàn)用本發(fā)明方法檢測標記分析物分子的所有目前已知或?qū)硪阎娜玖?。在一種示例性實施方案中，可檢測的標記物是發(fā)光標記物或光散射標記物。在一種實施方案中，該可檢測的標記物是熒光標記物。盡管可以使用其它發(fā)光標記物而不離開本發(fā)明的范圍，可用的發(fā)光標記物尤其包括熒光標記物、化學發(fā)光標記物和生物發(fā)光標記物。此外，還可以監(jiān)測熒光猝滅。此外，可以使用其它光散射標記物而不離開本發(fā)明的范圍。 可用的光散射標記物尤其包括金屬，如金、銀、鉬、硒和二氧化鈦。還可以通過該分析物分子的內(nèi)在與外在屬性的任意組合制造可檢測標記物?？捎糜诒景l(fā)明的光散射標簽包括金屬，如鉬、金、銀、硒和二氧化鈦。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認出也可用作光散射標簽的其它微球或珠粒。其它可用標記物包括影響不能電泳分離的相同或不同尺寸的目標分析物分子的電泳速率和/或分離的標記物。此類標記物稱為電荷/質(zhì)量標簽。電荷/質(zhì)量標簽的連接以足以影響目標分析物分子的電泳遷移率與分離的方式改變該目標分析物分子的電荷對平移摩擦阻力的比至足以影響目標分析物分子電泳遷移率與分離的程度。在另一實施方案中，該標記物改變電荷、或質(zhì)量、或電荷與質(zhì)量的組合。結(jié)合到分析物分子上的電荷/質(zhì)量標簽可以借助于它們的行為在電場中的空間差異或借助于它們的行為在電場中的速率差異而區(qū)別于未結(jié)合的分析物分子或未結(jié)合的標簽。標記分析物分子的結(jié)合伴體、將該結(jié)合伴體轉(zhuǎn)化為可檢測物類的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。將標記物連接到分析物分子上可以利用任何已知方法，包括直接連接或使用結(jié)合伴體。在某些情況下，標記的方法是非特異性的。例如，標記所有核酸而不考慮其特定核苷酸序列的方法是已知的。在另一些情況下，該標記是特異性的，其中標記的寡核苷酸特異性結(jié)合到目標核酸序列上。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括對樣品中多種分析物分子進行分析。在一些此類實施方案中，多種分析物分子的每一被檢測分析物分子均包含標記物，并且其中每一被檢測分析物分子通過選自標記物標識、標記物強度、遷移率或其組合的特征彼此區(qū)分。
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本文中使用的術(shù)語“箱元(bin)”是指檢測/測量來自可檢測物類的信號過程中的預(yù)定時間。在一種示例性實施方案中，該箱元是檢測/測量來自熒光標記的光子過程中的時間單元。術(shù)語“事件光子，，是指在本發(fā)明的方法中可檢測的光子集合。事件光子是在檢測箱元中光子時指定時間點位于該“箱元”內(nèi)的那些光子。該事件光子可作為該箱元內(nèi)光振幅的衡量標準量化。術(shù)語“總光子”是指本發(fā)明的方法中可檢測的光子的集合。可以通過合計箱元中所有光子來測量該總光子。實施方式在第一方面，本發(fā)明提供進行檢測與該可檢測物類特異性結(jié)合到其上的分析物的分析物分子相關(guān)聯(lián)的可檢測物類的分析物分子的測定的方法。在本發(fā)明的這種和其它方法中，通常優(yōu)選的是在檢測、測量和/或量化可檢測物類之前將基本所有未特異性結(jié)合到該分析物上的可檢測物類從該測定混合物中除去。在各種實施方案中，本發(fā)明的方法包括在第一容器中在該分析物與特異性結(jié)合該分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物。該捕獲物類固定在磁性粒子上。在捕獲該分析物后且仍在第一容器中，該復(fù)合物與特異性結(jié)合到該分析物上的可檢測物類接觸，由此形成固定的可檢測物類的復(fù)合物。該固定的復(fù)合物隨后從第一容器中移出，并轉(zhuǎn)移到不含該可檢測物類的第二容器中。一旦在第二容器中，將可檢測物類從固定的復(fù)合物中洗脫。使用合適的單分子檢測裝置檢測可檢測物類單分子。在某些實施方案中，可檢測物類單分子是多個具有基本相同結(jié)構(gòu)的可檢測物類的分子之一。在另一些實施方案中，存在兩個或多個可檢測物類的群體，每個群體包括可區(qū)分的不同結(jié)構(gòu)的可檢測物類。在各種實施方案中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的測定結(jié)果確定診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)和治療方法的方法。一示例性方法包括上述步驟，額外要素是在逐單分子基礎(chǔ)上(不同于平均濃度)量化可檢測物類的多個單分子，并將由該量化推導(dǎo)出的量與診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)或治療方法聯(lián)系起來。還提供了用單分子分析儀檢測至少一種分析物分子的方法?？捎玫膯畏肿臃治鰞x的特定特征是檢測大范圍分析物分子的能力?？梢员辉摲治鰞x檢測的分析物分子包括但不限于有機和無機分子以及生物制劑、超分子復(fù)合物、細胞器、珠粒、分子的締合、超分子復(fù)合物的締合以及有機體。可以使用該分析儀和本發(fā)明的方法檢測的分析物的非限制性實例包括生物聚合物，如蛋白質(zhì)，例如細胞因子、核酸、碳水化合物和有機與無機的小分子化學實體。后者的例子包括但不限于反自身免疫缺陷綜合癥的物質(zhì)、抗體、抗癌物質(zhì)、抗生素、抗病毒物質(zhì)、酶、酶抑制劑、神經(jīng)毒素、阿片樣物質(zhì)、安眠藥、抗組胺劑、安定藥、抗癲癇藥、肌肉松弛藥和抗帕金森病藥物、解痙藥物和肌肉收縮劑、縮瞳藥和抗膽堿能藥、免疫抑制劑(例如環(huán)孢霉素)、抗青光眼溶質(zhì)、抗寄生蟲和/或抗原生動物溶質(zhì)、抗高血壓藥、鎮(zhèn)痛藥、退熱和抗炎劑(如非留體抗炎藥)、局部麻醉藥、眼藥、前列腺素類、抗抑郁藥、治療精神病的物質(zhì)、 止吐劑、顯影劑、特定的靶向制劑、神經(jīng)傳遞素、蛋白質(zhì)和細胞反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。類似地，可檢測的化學實體包括小分子，如氨基酸、核苷酸、類脂、糖類、藥物、毒素、毒液、底物、藥效團及其任意組合。蛋白質(zhì)還可用于多種治療與診斷，如檢測細胞群體、血型、病原體、對病原體的免疫反應(yīng)、免疫復(fù)合物、糖類、凝集素、天然生成的受體等等?？蓹z測分子的其它實例包括納米球、微球、枝聚物、染色體、細胞器、膠粒和載體分子。同樣可以在本發(fā)明的方法中檢測的是由單分子復(fù)合物、具有結(jié)合的標記物的有機體、兩種或多種核酸的復(fù)合物以及結(jié)合到一個或多個抗體或抗體片段上的目標單分子的復(fù)合物組成的單一物類。其中檢測兩種或多種類型單分子的示例性復(fù)合物包括選自蛋白質(zhì)、 受體、DNA、RNA、PNA、LNA、碳水化合物、細胞器、病毒、細胞、細菌、真菌、其片段及其組合的單分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文中提供的大量實施例將認識到如何調(diào)節(jié)本發(fā)明的分析儀與相關(guān)方法以檢測這些和其它單分子。在一種實施方案中，通過本發(fā)明的方法檢測的化學實體包括合成或天然存在的激素、天然藥物、合成藥物、污染物、過敏原、影響因子分子、生長因子、趨化因子、細胞因子、淋巴因子、氨基酸、寡肽、化學中間體、核苷酸和寡核苷酸。本發(fā)明的方法包括檢測樣品中具有共同關(guān)聯(lián)或提供所需信息的多種類型的單分子(即“組”)的存在、不存在和/或濃度。本文中所用的“組”包括可以通過本發(fā)明的測定法檢測其存在的一組分析物分子。該分析物分子可具有使它們能夠被本發(fā)明的系統(tǒng)檢測的固有特性，或需要標記以便被檢測。由此，本發(fā)明的方法包括用合適的用于檢測一組分析物分子的一個或多個成員的存在、不存在和/或濃度的標記物或多種標記物接觸樣品。此類分析物分子的組可用于例如生物恐怖主義樣品分析、體格檢查、診斷、預(yù)后、監(jiān)測和/或治療選擇；生物醫(yī)學研究、取證、農(nóng)業(yè)分析和工業(yè)應(yīng)用。例如，組可以與特定類型的診斷相關(guān)聯(lián)，例如傳染性有機體的組、疾病，如心血管病、癌癥或特定類型的癌癥、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、 阿爾茨海默氏病等等的標記物的組，或者為了評估各系統(tǒng)的機能，例如內(nèi)分泌組，組可以與生物恐怖相關(guān)聯(lián)，例如可能的生物恐怖生物體或毒素的組；組可用于醫(yī)藥篩選，例如與特定遺傳多態(tài)性或突變相關(guān)的蛋白質(zhì)組，所述特定遺傳多態(tài)性或突變與特定疾病或病理學癥狀相關(guān)，或與正?；虺０Y狀相關(guān)；組可以與預(yù)后相關(guān)聯(lián)，例如與特定綜合征、疾病或失調(diào)癥 (例如癌癥)相關(guān)聯(lián)的標記物組可用于在欲根除該綜合征、疾病或失調(diào)癥的治療后確定該綜合征、疾病或失調(diào)癥的復(fù)發(fā)和/或進展。組還可用于篩選血液樣品，并可以包括該血液篩選所針對的多種傳染物和/或抗體。類似地，可在本發(fā)明的方法中分析單一樣品以檢測多種濫用物質(zhì)、環(huán)境物質(zhì)或獸醫(yī)學上重要的物質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)點在于能夠組合一組試驗，它們可以在懷疑患有失調(diào)癥、疾病或綜合征的個體上進行以同時檢測該失調(diào)癥、疾病或綜合征的病原體。組可用的其它領(lǐng)域包括用于研究。本發(fā)明還包括實施本發(fā)明的方法的試劑和試劑盒。在一種實施方案中，試劑盒包含在本發(fā)明方法中測量的該分析物(例如細胞因子)的抗體。該試劑盒可進一步包含測定稀釋劑、標樣、對照物和/或可檢測標記物。該測定稀釋劑、標樣和/或?qū)φ瘴锟筛鶕?jù)特定樣品基質(zhì)進行優(yōu)化。例如，對血液、血清或血漿樣品中的測量，該稀釋劑、標樣和對照物可以包括i)人類血液、血清或血漿；ii)動物血液、血清或血漿或iii)人造血液、血清或血漿代用品O作為可通過本發(fā)明檢測的分析物蛋白質(zhì)分子的實例，要注意的是多種細胞因子可能用作進行診斷和/或監(jiān)測多種疾病和篩選藥物或候選藥物治療疾病的效力的本發(fā)明方法的診斷標記物。實際上，如下文中更詳細地描述的那樣，本發(fā)明的某些實施方案提供確定特定候選細胞因子充當此類診斷標記物的效力的方法。采用本發(fā)明的方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將在無需過度試驗的情況下能夠確定一種或多種所選細胞因子或其它標記物，包括沒有具體列舉在本文中和實際上尚未發(fā)現(xiàn)的細胞因子與其它標記物用作其測得水平/概況可用于實施本發(fā)明的各種診斷與篩選方法的標記物的能力。細胞因子在各種實施方案中，使用本發(fā)明的測定方法檢測的該分析物分子包括炎性標記物，如細胞因子、參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的分泌蛋白質(zhì)。細胞因子包括白介素(IL)、干擾素 (IFN)、趨化因子、腫瘤壞死因子(TNF)和多種集落刺激因子(CSF)。對研究與診斷而言，細胞因子用作多種病癥、疾病、病理學等等的標記物，并可以包括在幾種不同的組中。當前存在超過100種其協(xié)調(diào)或不協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)具有臨床意義的細胞因子/趨化因子。目前用于標記物檢測群體中并可用于在本發(fā)明的方法與組合物中使用的檢測群體中的示例性細胞因子包括但不限于 BDNF、CREBpS133、CREB Total、DR-5、EGF, ENA-78、Eotaxin、脂肪酸結(jié)合蛋白、 FGF-basic、G-CSF, GCP-2、GM-CSF、GRO-KC, HGF、ICAM-U IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-IU IL-12、IL-12p40、IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-I α、 IL-I β、IL-lra、IL_lra/IL_IF3、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IP-10、JE/ MCP-l、KC、KC/GROa、LIF、Lymphotacin、M-CSF、MCP-l、MCP-l(MCAF)、MCP_3、MCP_5、MDC、MIG、 MIP-I α ,MIP-I β、MIP_1γ、MIP_2、MIP_3β、OSM、PDGF_BB、RANTES、Rb(pT821)、Rb(total)、 Rb pSPT249/252、Tau(pS214)、Tau(pS396)、Tau(total)、Tissue Factor、TNF- α、TNF- β、 TNF-RI、TNF-RII、VCAM-1、VEGF。本文中使用的術(shù)語細胞因子還包括可溶性細胞因子受體。如那些技術(shù)人員將認識到的那樣，細胞因子是可以通過本發(fā)明的方法檢測的可用標記物的代表性實例。關(guān)注于細胞因子是為了清楚地舉例說明，且本文參照細胞因子闡述的方法同樣適用于檢測其它標記物的分析物分子。在各種實施方案中，為了使具體疾病過程與細胞因子水平的改變相關(guān)聯(lián)，有前途的途徑使用本發(fā)明的方法分析各樣品中的多種細胞因子。按照本發(fā)明的各種實施方案，在從臨床診斷患有或懷疑患有疾病(例如使用常規(guī)診斷方法，如醫(yī)生面診、內(nèi)窺鏡檢查、透視顯像和/或活組織檢查)的個體和從健康個體收集的樣品中測量細胞因子或其它候選疾病標記物的水平。在本發(fā)明的非限制性實施例中， 可以采用檢視數(shù)據(jù)，例如繪制在一維或多維圖上的數(shù)據(jù)，或通過利用統(tǒng)計分析的方法，如對照個體與患病患者之間的統(tǒng)計權(quán)重差異(statistically weighted difference)和/或 Receiver Operating Characteristic(ROC)曲線分析，由此識別可用作區(qū)別正常人和患病患者的標記物的特異性細胞因子。用在本發(fā)明的此類和其它實施方案重的數(shù)據(jù)分析的其它模式在下文中陳述。在本發(fā)明的某些實施方案中，確定疾病的存在或程度可以包括將一種或多種細胞因子的水平與指示該疾病的不存在、存在或程度的細胞因子概況比較。在一實例中，將血液、血清和血漿樣品中一種或多種細胞因子的水平與指示該疾病的存在或程度的細胞因子概況比較。在一種示例性實施方案中，比較步驟可以包括將細胞因子水平與檢測臨界值比較，比較細胞因子水平的比率與檢測臨界比率值；將兩種細胞因子的水平與細胞因子與兩種分析物的相關(guān)圖中的檢測臨界線比較，將多種細胞因子的水平與多分析物相關(guān)圖中的檢測臨界曲線或表面比較和/或?qū)⒍喾N細胞因子的水平與多分析物相關(guān)圖中的檢測區(qū)(例如檢測面積或檢測體積)比較。
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本發(fā)明的一種實施方案包括診斷疾病的方法。該方法包括采用本文中所述的單分子檢測測量樣品中細胞因子的水平；并由測得的水平診斷該疾病存在或不存在于該研究對象體內(nèi)。在本發(fā)明的各種實施方案中，提供檢測疾病的方法，包括測量樣品中，例如獲自懷疑患有該疾病的患者的樣品中細胞因子的水平；并由測得的水平診斷該患者體內(nèi)存在或不存在該疾病。在本發(fā)明的某些實施方案中，該方法包括由測得的細胞因子水平確定該患者是否患有炎性疾病和/或由測得的細胞因子水平確定炎性疾病導(dǎo)致的炎癥程度和/或獲得并測量不同時間下的樣品以監(jiān)控炎性疾病的進展或?qū)Υ祟惣膊〉闹委熜Я?。在一種實施方案中，該方法包括測量細胞因子水平。在某些實施方案中，本發(fā)明提供包括測量多種細胞因子的方法，還可包括將這些細胞因子的水平與確定指示該疾病的細胞因子概況比較?？梢苑治龆喾N樣品。在某些實施方案中，該樣品可以通過非外科手術(shù)過程從人類患者獲得，并可例如包括血液、血清、血漿、 糞便或尿液樣品?？梢愿鶕?jù)由不同群體測得的水平確定特定細胞因子的特定水平是高或是低。示例性群體包括但不限于強直性脊柱炎患者、關(guān)節(jié)外受累患者、樞關(guān)節(jié)破壞患者以及健康個體的群體。與特定的綜合癥、疾病或失調(diào)癥聯(lián)系在一起的其它細胞因子對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并可用于本文中公開和列舉的方法。本領(lǐng)域中認識到，表現(xiàn)出類似病癥的患者在他們的血清、血漿、滑液、組織、腦脊髓液或其它體液樣品中可具有不同的特定細胞因子水平。因此，確定外周血液、血清、血漿、滑液、組織、腦脊髓液或其它體液細胞因子概況可用于確定每名個體患者的正確治療方案。例如，具有類似癥狀的兩名患者在他們的血清中可以具有不同的IL-10水平。具有低水平的患者可以受益于IL-10的治療，而具有高IL-10水平的患者可以受益于用IL-10抑制劑，如抗-IL-10抗體藥物(一類稱為生物藥物的藥物)的治療。由此，確定患者的細胞因子概況可以有助于向醫(yī)生與患者提供可用于確定適當治療并測量個別患者的治療反應(yīng)的信息。本發(fā)明的一種實施方案包括一種方法，其包括測量第一細胞因子的水平，例如， 在獲自患有或懷疑患有炎性疾病的患者的樣品中測量；測量一種或多種另外的細胞因子的水平，其中一種或多種另外的細胞因子不同于該第一細胞因子；并由測得水平確定來自該疾病的炎癥程度。將分析物細胞因子分子類型彼此區(qū)分的示例性方法描述在本文中。特別地，檢測與分析物單分子相互關(guān)聯(lián)的可檢測物類單分子的方法可以使用組合標記物信號強度(例如不同單分子上標記物的不同數(shù)量)、標記物標識(例如不同單分子上的不同標記物)和原動力為電動時的標記物遷移率(例如不同單分子的不同遷移率)或其組合。本發(fā)明的方法的某些實施方案可以根據(jù)所選細胞因子的測得水平進一步區(qū)分第一疾病與第二疾病。例如，區(qū)分第一疾病與第二疾病的示例性方法包括將測得的細胞因子水平與辨識臨界值比較，其中低于辨識臨界值的測得水平被認為指示克羅恩氏病，高于辨識臨界值被認為指示潰瘍性結(jié)腸炎。在一種示例性實施方案中，由第一細胞因子水平和由一種或多種另外的細胞因子的水平確定患者是否患有疾病包括將一種或多種細胞因子水平與確定為指示該疾病的細胞因子概況比較。比較的步驟可以包括將細胞因子水平與檢測臨界值比較，將水平的比率與檢測臨界比率值比較和/或?qū)⑺脚c多分析物相關(guān)圖中的檢測臨界線、曲線或表面比較。比較的步驟可以包括將水平與辨識臨界值比較、將水平的比率與辨識臨界比率值比較和/或?qū)⑺脚c辨識臨界線比較。在一種實施方案中，通過將細胞因子水平與細胞因子辨識臨界值比較來區(qū)分第一疾病與第二疾病，其中低于該細胞因子辨識臨界值的細胞因子水平被認為指示該第一疾病，高于該細胞因子辨識臨界值被認為指示該第二疾病。在又一實施方案中，通過比較細胞因子水平與細胞因子辨識臨界線來區(qū)分潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩氏病，其中低于細胞因子辨識臨界值的細胞因子水平被認為指示克羅恩氏病，高于細胞因子辨識臨界線被認為指示潰瘍性結(jié)腸炎。在又一實施方案中，通過比較測得的細胞因子水平與定義為位于相關(guān)圖上第一檢測臨界線與第二辨識臨界線之間區(qū)域的細胞因子概況，由此區(qū)分第一疾病和第二疾病。在又一實施方案中，提供確定處于炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)的患者是否傾向于出現(xiàn)嚴重的炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)的方法，包括(a)獲得患者樣品；(b)按照本發(fā)明的方法測量患者樣品中一種或多種細胞因子的水平；(c)比較測得的細胞因子水平與預(yù)先確定的出現(xiàn)(developing)或患有嚴重的炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細胞因子水平比較；和(d)確定所述患者是否傾向于出現(xiàn)嚴重的炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)。在一種實施方案中，通過比較患者體內(nèi)測得的兩種或多種細胞因子與指示患有潰瘍性結(jié)腸炎的患者、患有克羅恩氏病的患者和健康個體的這兩種或多種細胞因子的概況， 例如在相關(guān)圖上的值、比率、線或區(qū)域，由此區(qū)分潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩氏病。在一種實施方案中，高于細胞因子檢測臨界值的第一細胞因子水平和低于細胞因子檢測臨界值的另外的細胞因子水平被認為指示疾病。在另一實施方案中，高于檢測臨界比率值的第一細胞因子水平對一種另外的細胞因子水平的比率被認為指示疾病。在又一實施方案中，高于細胞因子檢測臨界線的細胞因子水平被認為指示疾病。在本發(fā)明的另一些實施方案中，提供評價藥物或候選藥物治療疾病的功效的方法。例如，本發(fā)明包括評價藥物和/或候選藥物功效的方法，其包括將患有疾病的人類或非人類動物和/或模型體系，例如組織、細胞培養(yǎng)或生化系統(tǒng)暴露于藥物或候選藥物；測量獲自人類或非人類動物或模型體系的樣品中細胞因子的水平；由通過本發(fā)明的方法測得的該細胞因子水平確定該藥物或候選藥物的功效。在另一實施例中，本發(fā)明包括評價藥物或候選藥物的功效的方法，其包括將患有疾病的人類或非人類動物和/或模型體系，例如組織、細胞培養(yǎng)或生化系統(tǒng)暴露于藥物或候選藥物；測量獲自人類或非人類動物或模型體系的樣品中第一細胞因子的水平；測量相同樣品或獲自相同人類或非人類動物或模型體系的不同樣品中一種或多種另外的細胞因子的水平，其中該一種或多種另外的細胞因子不同于該第一細胞因子；并由測得的水平確定該藥物或候選藥物的功效。該方法還包括將一種或多種細胞因子水平與沒有用該藥物或候選藥物治療的對照人類或非人類動物中的水平比較。這些藥物評價方法中的人類或非人類動物可以用體外疾病模型體系，例如模擬疾病行為的組織、細胞培養(yǎng)或生化體系來代替。
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同樣提供的是炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)的治療的評估方法，包括(a)對炎性或自身免疫性疾病狀態(tài)患者施以治療；(b)從所述患者處獲得樣品；(c)測量該患者樣品中多種細胞因子的水平；(d)將多種細胞因子的水平與預(yù)先確定的細胞因子水平比較；和(e)確定該治療是否有效。該方法可進一步包含根據(jù)功效測定作出關(guān)于更改治療方案的決定。在各種實施方案中，患者樣品包括外周血液、血清、血漿、腦脊髓液、組織樣品、皮膚或其它體液樣品。預(yù)先確定的水平可以包含關(guān)于患者樣品中發(fā)現(xiàn)的細胞因子中值水平的信息。預(yù)先確定的水平可以包含一種或多種細胞因子的治療前水平、健康對象和/或患有該疾病的患者中觀察到的一種或多種細胞因子的水平。在一種示例性實施方案中，患者樣品來自患有關(guān)節(jié)外受累和 /或患有主要關(guān)節(jié)破壞的患者。按照本發(fā)明的一種實施方案，診斷上有價值的細胞因子可以選自下述的組。此外， 按照該實施方案，與這些細胞因子相關(guān)的各種跡象的診斷、預(yù)后以及療程可以用本發(fā)明的方法確定。通過人類角質(zhì)形成細胞大量表達白介素-Ia (IL-la)。IL-I-α還可以通過來自不同來源(肺泡巨噬細胞、肝巨噬細胞、粘附的脾和腹膜巨噬細胞)的活化巨噬細胞和通過外周血中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、角質(zhì)形成細胞、皮膚的郎格罕氏細胞、破骨細胞、星形細胞、胸腺和角膜的上皮細胞、T細胞和B細胞來制造。IL-I的合成可以通過包括TNF-a、IFN-a、IFN-γ和IFN-β的其它細胞因子以及還通過細菌內(nèi)毒素、病毒、促細胞分裂劑和抗原來引發(fā)。在人類皮膚成纖維細胞中，IL-Ia 和TNF-α引發(fā)IL-I β的合成。人類單核細胞對細菌內(nèi)毒素非常敏感，并響應(yīng)pg/mL量的內(nèi)毒素合成IL-1。在人類單核細胞中，細菌脂多糖對IL-I β引發(fā)了比對IL-Ia多大約10 倍的mRNA和各自的蛋白質(zhì)。IL-I的主要生物活性是刺激T協(xié)助細胞，其被引發(fā)以分泌IL-2和表達IL-2受體。 病毒感染的巨噬細胞產(chǎn)生大量IL-I抑制劑(IL-Ira)，該抑制劑可支持機會性傳染病和患有T細胞成熟缺陷的患者體內(nèi)的細胞轉(zhuǎn)化。IL-I刺激自然殺傷細胞和成纖維細胞、胸腺細胞、成膠質(zhì)細胞瘤細胞的增殖和活化。其還有助于星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的增殖，并可以介入病理過程，如星形膠質(zhì)細胞增生和脫髓鞘。IL-I似乎是人類胃癌細胞與甲狀腺癌細胞的自分泌生長調(diào)節(jié)劑。IL-I還對某些腫瘤細胞類型具有抗增殖和殺細胞活性。IL-I在如靜脈血栓形成、動脈硬化、脈管炎和彌散性血管內(nèi)凝血的病理過程中起重要的作用。IL-I顯著提高了花生四烯酸(特別是環(huán)前列腺素和PGE2)在如成纖維細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞和破骨細胞的炎性細胞中的代謝。IL-I激活破骨細胞并因此抑制新骨的形成。但是低濃度的IL-I有助于新骨生長。IL-I抑制脂肪細胞中的酶脂蛋白脂肪酶。在血管平滑肌細胞和皮膚成纖維細胞中，IL-I引發(fā)bFGF的合成，其是這些細胞的促細胞分裂劑。類似白介素-2(IL-2)，IL-I 也調(diào)節(jié)神經(jīng)元的電生理學行為。IL-I還直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。IL-2越來越多地用于治療患有常規(guī)治療難以治愈的癌癥的患者(Waldmarm等人，Annals of the New York Academy of Sciences 685 :603_10，1993)。在一定比仿ij的黑色素瘤或急性骨髓性白血病患者中也表現(xiàn)出客觀與長期的臨床反應(yīng)(Broom等，British Journal of Cancer. 66 :1185_7，1992)。
IL-4被認為是何杰金氏淋巴瘤的自分泌生長調(diào)節(jié)劑(Okabe等人，Lymphoma 8 57-63，1992)。IL-4在炎性疾病和自身免疫性疾病的治療中具有臨床重要性，因為其通過單核細胞和T細胞抑制炎性細胞因子，如IL-l、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生。IL4抑制結(jié)腸與乳腺癌的生長(Toi等人，Cancer Research 52 :275_9，1992)。其已被證明增強了淋巴因子激活殺傷細胞(LAK細胞)的生長。IL-4可以在慢性淋巴細胞性白血病的發(fā)病機制中起基本的作用，這可以通過在它們分化的中間階段通過防止惡性B細胞增殖與死亡而阻止的慢分裂與長壽命單克隆B細胞的積聚來表征。其保護慢性淋巴細胞性白血病B細胞不會通過細胞凋亡而死亡，并上調(diào)保護性基因——BCL-2的表達(Dancescu等人，Journal of Experimental Medicinel76 :1319-26,1992)。測定IL-6血清水平可用于監(jiān)測骨髓瘤的活性和用于計算腫瘤細胞團塊。在單株丙種球蛋白病和在悶燒骨髓瘤中觀察到低IL-6血清水平，而在進行性疾病患者中以及在血漿細胞白血病患者中IL-6血清水平顯著提高(Van Oers等人，Ann. Hematology 66: 219-23(1993))。IL-6的解除管制的表達可能是涉及多種疾病發(fā)病機制的主要因素之一 (Leger-Ravet等人，Blood，78 =2923-30,1991)。已經(jīng)在多種病理癥狀，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、 多發(fā)性骨髓瘤、Lennert綜合征(組織細胞淋巴瘤)、Castleman病(具有血漿細胞大規(guī)模浸潤、超Y-球蛋白血、貧血和急性期蛋白質(zhì)的提高濃度的淋巴結(jié)病)、心臟粘液瘤和肝硬化中觀察到IL-6的過度生產(chǎn)過剩(Hsu等人，Hum. Pathol. ,24 :833-9,1993)。IL-6通過成膠質(zhì)細胞瘤的組成性合成和IL-6分泌到腦脊髓液中可以解釋急性期蛋白質(zhì)的提高的水平和該血清中的免疫復(fù)合物(Mule 等人 Research Immunology, 143 :777-9,1991)。IL-6可能還在慢性多關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中起作用，因為在該滑液中發(fā)現(xiàn)過量濃度的IL-6。因其對造血細胞的作用，已經(jīng)提出16適用于治療某些類型的貧血和血小板減少癥(Brach 等人，International Journal of Clinical and Laboratory Research, 22: 143-51，1992)。采用IL_3的預(yù)治療和隨后服用IL_6已經(jīng)顯示提高了血小板數(shù)。與其它細胞因子(例如，IL-2) —起，IL-6可用于治療某些類型的腫瘤(Dullens等人，In vivo, 5 567-70,1991)。在細菌和病毒性腦膜炎中常常觀察到腦脊髓液中極高水平的IL-6。檢測移植患者尿液中IL-6的提高的濃度可以是移植物抗宿主反應(yīng)的早期指標(Kishimoto等人，Blood 74 :1-10,1990) 0檢測羊水中的IL-6可能是羊膜腔內(nèi)感染的跡象。在炎性腸道疾病中， IL-6的提高的血漿水平可能是疾病狀況的指標(Wolvekamp等人，Immunology Letters, 24 :1-9,1990)。在系膜增生性腎小球腎炎患者體內(nèi)，IL-6的提高的尿液水平也是疾病狀況的指標(Van Snick等人，Annual Review of Immunology，8 :253_78，1990)。監(jiān)測手術(shù)后的血清IL-6水平可能比監(jiān)測C-反應(yīng)蛋白水平更有助于評估炎性狀況和早期檢測急性期反應(yīng) (Ohzato等人，Surgery, 111 :201-9,1992)。血清和尿液IL-6水平已經(jīng)證明是川崎病活性的預(yù)測因素(Furukawa 等人，European Journal of Pediatr, . 151 :44-7,1992)。因此已經(jīng)提出，IL-7單獨或與IL-2 —起可用作自體骨髓移植后患者體內(nèi)惡性腫瘤的鞏固免疫治療。通過IL-7的促生長作用及其由角質(zhì)形成細胞合成猜測IL-7參與了炎性皮膚病和皮膚T細胞淋巴瘤的發(fā)病機制。IL-8可能在銀屑病和類風濕性關(guān)節(jié)炎中具有臨床相關(guān)性。在銀屑病患者的鱗屑中觀察到提高的濃度，這可以解釋在這些細胞中觀察到的高增生速度(Gillitzer等人， Journal of Investigative Dermatology,97 :73-9,1991) IL-8 也可以是不同炎性過程的標記物。已經(jīng)在活性非霍奇金淋巴瘤患者的分組血清中檢測到IL-10。IL-10水平似乎與中度或高度非霍奇金淋巴瘤患者中的低存活相關(guān)(Blay等人，Blood,82 =2169-74,1993)。IL-12的最強有力的誘導(dǎo)劑是細菌、細菌產(chǎn)物和寄生蟲。IL-12已表明在多種癥狀中，包括在毛細胞白血病患者體內(nèi)加強天然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性(Bigda等人，Leuk. Lymphoma, 10 121—5，1993)。IL-13在高度純化的表面IgD-陽性或總B-細胞培養(yǎng)物中在活化的⑶4 (+) T-細胞無性系存在下誘發(fā)相當大的IgM和IgG水平，但沒有IgA。IL-13已經(jīng)證明強烈抑制了細菌脂多糖引發(fā)的組織因子表達并降低了 IL-I或TNF的發(fā)熱效應(yīng)，由此保護內(nèi)皮和單核細胞表面免受炎性介質(zhì)引發(fā)的促凝血變化。IL-13在體外抑制主要(primary)血源性人類巨噬細胞中的人類1型免疫缺陷病毒生成。IL-13在體內(nèi)抑制原發(fā)性血源性人類巨噬細胞中的人類1型免疫缺陷病毒生成。IL-15刺激T細胞的增殖。此外，IL-15還能夠引發(fā)細胞溶解型細胞和(淋巴因子激活殺傷)LAK細胞的生成。IL-15似乎起到了 NK細胞特異性成熟因子的作用。其還被證實在體內(nèi)起自然殺傷細胞存活因子的作用。已經(jīng)在許多類型的淋巴樣細胞(包括外周血液單核細胞和自然殺傷細胞)上觀察到高親合力IL-15結(jié)合。白介素-17(IL-17)充當血管生成的介質(zhì)，其刺激血管內(nèi)皮細胞遷移和索的形成并調(diào)節(jié)促進血管生成的多種生長因子的產(chǎn)生(Numasaki等人，Blood, 101 (7) =2620-7, 2002)。白介素-18(IL-18)編碼通過 T 細胞(Okamura 等人，Nature, 378 :88-91,1995 ； Micallef 等人，Cancer Immunology and Immunotherapy,43 :361-367,1996)禾口天然殺傷細胞(Tsutsui 等人，J Immunology, 157 =3967-3973,1996)產(chǎn)生 IFN- γ 的誘導(dǎo)齊[J， 其是比 IL-12 更有力的誘導(dǎo)劑(Kikkawa 等人，Biochemical Biophysical Research Communications, 281 (2) :461-7,2001),已經(jīng)證明，單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生大量的各種 IL-18物類。在急性免疫反應(yīng)過程中由巨噬細胞和未成熟樹突細胞產(chǎn)生IL-18。IL-18被認為是促炎性細胞因子之一。IL-18的一個重要功能是調(diào)節(jié)細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)所需T輔助細胞的不同功能的亞類(Nakanishi等人，Annual Reviews of Immunology, 19 =423-74, 2001)。IL-18充當Thl細胞的生長和分化因子。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)由單核細胞、巨噬細胞與中性白細胞在細胞活化后分泌(Demetri等人，Blood，78 :2791-2808，1991)。其也可由基質(zhì)細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞產(chǎn)生。上皮癌、急性骨髓性白血病細胞與各種腫瘤細胞系(膀胱癌、髓母細胞瘤)也表達該因子。G-CSF的合成由細菌內(nèi)毒素、TNF、IL-I和GM-CSF引發(fā)。在采髓前用重組人 G-CSF預(yù)治療可以改善移植。用G-CSF治療的一般效果似乎是明顯減少了通常觀察到發(fā)生在柯士文綜合征患者中的嚴重感染與發(fā)熱(Jakubowski等人，New England Journal of
20Medicine, 320 :38_42，1989)。G-CSF治療還能夠用各種抗腫瘤藥物制度劑量強化(Gianni 等人，Journal of CUn. Oncol.，10 1955-62，1992)。GM-CSF可用于所有特征在于血細胞異常成熟或白細胞生產(chǎn)減少的疾病中的造血生理重組。GM-CSF還可用于矯正化療引發(fā)的血細胞減少和用于抵消與血細胞減少相關(guān)的感染與出血的傾向(Fan等人，hvivo，5 :571-8，1991)。一些研究已經(jīng)證實，使用GM-CSF 提高了對細胞毒類藥治療的容限，并可用于防止細胞毒類藥治療的副作用所迫使的劑量減少(Negrin 等人，Advances in Pharmacol.，23 :263_296，1992)。目前，GM-CSF 代表了骨髓移植方面的重要進展，并已成為一種標準療法(Armitage等人，Semin. Hematology, 29 sl4-8，1992)。GM-CSF提高了接受自體或異體骨髓抑制的患者和骨髓抑制后患有延遲植入的患者體內(nèi)的造血系統(tǒng)重建Gchuster等人，Infection, 20 :S95_9，1992)。IFN-α抑制了某些腫瘤細胞類型在體外的生長，其還可刺激腫瘤相關(guān)細胞表面抗原的合成。在腎癌中，IFN-α降低EGF的受體的表達。IFN-α還抑制成纖維細胞和單核細胞在體外的生長。IFN-α還抑制B細胞在體外的增殖，并阻斷抗體的合成。IFN-α還選擇性阻斷某些線粒體基因的表達。IFN-β提高了低親和力IgE受體⑶23的合成。在活化的單核細胞中，IFN-β引發(fā)新喋呤的合成。其還提高了 β 2-微球蛋白的血清濃度。IFN-β選擇性抑制某些線粒體基因的表達。像其它干擾素那樣，IFN-Y可用作抗病毒和抗寄生蟲劑(Stuart-Harris等人， Med. Journal ofAust.，156 =869-72,1992)。IFN- γ已經(jīng)證實可以有效地治療慢性多關(guān)節(jié)炎(Machold等人，Ann. Rheum. Dis. ,51 1039-43，1992)。該治療(其可能包括調(diào)節(jié)巨噬細胞活性)顯著減輕了關(guān)節(jié)疼痛，并改善了各臨床參數(shù)，并能夠降低皮質(zhì)類固醇劑量。IFN-Y 可以在AIDS患者機會性感染的治療中有價值。其還被證明降低了嚴重過敏性皮炎中的炎癥、臨床癥狀和嗜酸粒細胞增多(Hanifin 等人，Am. Acad. Dermatology, 28 189-97，1993)。腫瘤壞死因子-α (TNF-α)由巨噬細胞、單核細胞、中性白細胞、T細胞、天然殺傷細胞在它們被細菌脂多糖刺激后分泌(Beutler等人，Annual Review of Biochemistry, 57 :505-18,1988)。與化學治療藥物相反，TNF-β特異性攻擊惡性腫瘤細胞。廣泛的臨床前研究已經(jīng)記載了 TNF-α在無毛(免疫缺陷)小鼠中針對人類皮下異種移植和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直接抑制細胞與細胞毒效應(yīng)，以及對各種免疫效應(yīng)細胞(包括中性白細胞、巨噬細胞和T 細胞)的多種免疫調(diào)節(jié)作用(Gifford等人，Biotherapy，3 :103-11，1991)。巨噬細胞趨化性蛋白質(zhì)-I(MCP-I)，現(xiàn)在稱為CCL2，在體內(nèi)激活單核細胞與巨噬細胞的破壞腫瘤活性。其調(diào)節(jié)細胞表面抗原(CDllc、CDllb)的表達和細胞因子IL-I與IL-6 的表達(Jiang等人，1992)。CCL2是強有力的人嗜堿細胞活化劑，引發(fā)脫粒和組胺的釋放 (Bischoff 等人，Journal of Experimental Medicine, 175 1271-5，1992)。在被 IL-3、IL-5 或GM-CSF活化的嗜堿細胞中，CCL2提高了白細胞三烯C4的合成(Bischoff等人，European Journal of Immunology, 23 :761-7,1993) CCL2已證明表現(xiàn)出除趨化性之外的生物活性。 其可以引發(fā)稱為CHAK(CC-趨化因子激活的殺傷細胞)的殺傷細胞的增殖與活化，其類似于被 IL-2 激活的細胞(LAK 細胞)(Hora 等人，Proc Natl Acad Science USA，89 1745-9， 1992)。CCL2也是最強的組胺誘發(fā)因素之一。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在神經(jīng)元與其它腫瘤的藥理學中是重要的，可能充當人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的血管生成的有效促進劑。也可以通過缺氧引發(fā)其合成。作為對VEGF的響應(yīng)觀察到的細胞外滲可以是決定遠距離位置定殖的重要因素。因其對血管通透性的影響， VEGF還可以涉及在正常和病理條件下改變血腦屏障功能。表皮生長因子(EGF)控制和刺激表皮和上皮細胞，包括成纖維細胞、腎小管上皮細胞、人神經(jīng)膠質(zhì)細胞、卵巢顆粒細胞和甲狀腺細胞的增殖。EGF單獨和與其它細胞因子一起是介導(dǎo)傷口愈合過程的重要因素。EGF可以是胃腸道黏膜的營養(yǎng)物質(zhì)并因其刺激黏膜細胞增殖的能力而起保護胃的作用。EGF已經(jīng)被證明在不會抑制胃酸合成的濃度下有效地促進了潰瘍的愈合。與可通過本發(fā)明的方法檢測的特定細胞因子相關(guān)的示例性、非限制性標志如下文所述。所述每種示例性細胞因子可以在單分子基礎(chǔ)上檢測，或它們可以通過計數(shù)事件光子或總光子來檢測。在各種示例性實施方案中，該病狀是強直性脊柱炎，檢測的細胞因子選自CCL4、 CCL2、CCLlU EGF、IL-I β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、CXCL8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-17、TNF- α、IFN γ、GM-CSF, G-CSF 及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是銀屑病關(guān)節(jié)炎，檢測的細胞因子選自GM-CSF、 IL-17、IL-2、IL-10、IL-13、IFN-γ、IL-6、CCL4/MIP-1β、CCL ll/Eotaxin、EGF、CCL2/MCP_l 及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，檢測的細胞因子選自IL-12、 IFN-γ、IL-I β、IL-13、IL-17, CCL4/MCP-1、TNF-α、IL-4、GM-CSF, CCLll/Eotaxin、EGF、 IL-6及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是腸病性關(guān)節(jié)炎，檢測的細胞因子選自CXCL8/ IL-8、IL-10、IL-4、G-CSF、CCL2/MCP-1、CCLll/Eotaxin、EGF、IFN-γ、TNF-α 及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，檢測的細胞因子選自 IL-7、CXCL8/IL-8、IFN- y、TNF- α、EGF、VEGF、IL-1 β 及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是克羅恩氏病(CD)，檢測的細胞因子選自 TNF-α、IFN-γ、IL-I β、IL-6, IL-7, IL-13, IL-2,1L_4、GM-CSF、G-CSF、CCL2/MCP-1、EGF、 VEGF, CXCL8/IL-8 及其組合。在各種示例性實施方案中，該病狀是類風濕性關(guān)節(jié)炎，檢測的細胞因子分子選自 IFN- y、IL-I β、TNF- α、G-CSF, GM-CSF, IL-6, IL-4, IL-10, IL-13, IL-5, CCL4/MIP-1 β、 CCL2/MCP-1、EGF、VEGF, IL-7 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是系統(tǒng)性紅斑狼瘡，檢測的細胞因子分子選自 IL-10、IL-2、IL-4、IL-6、IFN- γ、CCL2/MCP-1、CCL4/MIP-1 β、CXCL8/IL-8、VEGF、EGF、IL-17 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是家族性地中海熱(FMF)，檢測的細胞因子分子選自 G-CSF、IL-2、IFN- y、TNF- α、IL-I β、CXCL8/IL-8 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)，檢測的細胞因子分子選自 CCL2/MIP-1 β、CXCL8/IL-8、IL-12, IL-I β、VEGF、IL-13 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是腸易激綜合征(IBS)，檢測的細胞因子分子選自 TNF- α、IFN- y、IL-I β、IL-6, IL-7, GM-CSF, G-CSF, CCL2/MCP-1、CXCL8/IL-8 及其組合。
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在各種示例性實施方案中，病狀是青少年類風濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)，檢測的細胞因子分子選自 IFN-Y、IL-I β、TNF-α、G_CSF、GM_CSF、IL-6、IL-4、IL-10、IL-13、IL-5、IL-7 及
其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是舍格倫綜合征，檢測的細胞因子分子選自CCL2/ MCP-I、IL-12、CXCL8/IL-8、CCLll/Eotaxin、TNFa、IL-2、IFNa、IL-15、IL-17、IL-1 a、 IL-I β、IL-6、GM-CSF 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是早期關(guān)節(jié)炎，檢測的細胞因子分子選自CCL4/ MIPl β、CXCL8/IL-8、IL-2, IL-12, IL-17, IL-13, TNF a、IL-4, IL-5, IL-10 及其組合。在各種示例性實施方案中，病狀是神經(jīng)發(fā)炎，檢測的細胞因子分子選自CCL2/ MCP-I、IL-12、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-6, IL-17 及其組合。在各種實施方案中，在本發(fā)明的測定中測量的特異性細胞因子包括但不限于 IL-Ia、IL-I β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-12、IL-21、G-CSF、GM-CSF、hTNF a、mTNFa ,IFNy 和 hVEGF。按照本發(fā)明的一個方面，有利地在通過非外科手術(shù)收集技術(shù)獲得的樣品中，如在來自患有或懷疑患有細胞因子參與其中或其檢測和/或量化產(chǎn)生診斷或預(yù)后價值(yield)的疾病的患者的血液、血清、血漿、糞便或尿液樣品中測量該分析物。在一些實施方案中，該方法包括使用本發(fā)明的檢測方法確定超過一種，例如2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 或更多種細胞因子的水平。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供如上所述的方法，其中該可檢測物類單分子與其為選自細胞因子和生長因子的一員的分析物單分子相關(guān)，所述可檢測物類特異性結(jié)合到該分析物單分子上。在各種實施方案中，該測定能夠以小于或等于約5pg/mL的量檢測所述可檢測物類。在某些實施方案中，該測定以小于或等于約2pg/mL的量檢測該可檢測物類單分子。本發(fā)明還提供魯棒動態(tài)范圍的測定。在示例性實施方案中，該動態(tài)檢測范圍為至少約21og、優(yōu)選至少約31og和更優(yōu)選至少約41og。本發(fā)明的測定對細胞因子和其它疾病標記物高度敏感。例如，在一種實施方案中， 該方法提供能夠以小于或等于約5pg/mL、4pg/mL、3pg/mL、2pg/mL、lpg/mL、0. 5pg/mL和甚至小于或等于約0. lpg/mL的量檢測至少一種細胞因子的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約2pg/mL、小于約lpg/mL、小于約0. Spg/ mL、小于約0. 6pg/mL、小于約0. 4pg/mL或小于約0. 3pg/mL的濃度下檢測IL-2的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-2的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-2的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 07pg/mL的IL-2的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. lpg/mL至約2pg/mL、優(yōu)選約0. 16pg/mL至約1. 5pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-2。 示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL (例如約0. 07pg/mL)的IL-2的L0D，并在約0. Ipg/ mL至約2pg/mL、優(yōu)選約0. 16pg/mL至約1. 5pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-2。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約20pg/mL、小于約10pg/mL、小于約8pg/ mL、小于約6pg/mL或小于約4pg/mL濃度下檢測IL-5的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-2的量。
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在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-5的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約1. 2pg/mL，例如約0. 9pg/mL的IL-5的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約1. 5pg/mL至約19. 5pg/mL、優(yōu)選約2. Opg/mL至約19pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-5。 示例性測定具有小于或等于約1. 2pg/mL(例如約0. 9pg/mL)的IL-5的L0D，并在約1. 5pg/ mL至約19. 5pg/mL、優(yōu)選約2. Opg/mL至約19pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-5。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約3pg/mL、小于約2pg/mL、小于約lpg/mL、 小于約0. 8pg/mL或小于約0. 6pg/mL的濃度下檢測IL-7的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-2的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-7的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 02pg/mL，例如約0. 012pg/mL的IL-7的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. 5pg/mL至約3pg/mL、優(yōu)選約0. 4pg/mL至約2. 7pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-7。示例性測定具有小于或等于約0. 02pg/mL(例如約0. 012pg/mL)的IL-7的L0D，并在約0. 5pg/mL至約3pg/mL、優(yōu)選約0. 4pg/mL至約2. 7pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-7。 在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約12pg/mL、小于約10pg/mL、小于約8pg/ mL、小于約6pg/mL或小于約4pg/mL的濃度下檢測IL-21的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-2的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-21的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 06pg/mL的IL-21的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約2pg/mL至約10pg/mL、優(yōu)選約1. 8pg/mL至約9. 3pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-21。 示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL(例如約0. 06pg/mL)的IL-21的L0D，并在約2pg/ mL至約10pg/mL、優(yōu)選約1. 8pg/mL至約9. 3pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-21。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約12pg/mL、小于約0.4pg/mL、小于約 0. 3pg/mL、小于約0. 2pg/mL或小于約0. lpg/mL的濃度下檢測IL-Ib的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-Ib的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-Ib的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 06pg/mL的IL-21的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. 03pg/mL至約0. 3pg/mL、優(yōu)選約0. 05pg/mL至約0. 2pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-lb。示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL(例如約0. 06pg/mL)的IL-Ib的L0D， 并在約0. 03pg/mL至約0. 3pg/mL、優(yōu)選約0. 05pg/mL至約0. 2pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-lb。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約7pg/mL、小于約6pg/mL、小于約5pg/mL、 小于約4pg/mL或小于約3pg/mL的濃度下檢測IFNg的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-Ib的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IFNg的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 09pg/mL的IFNg的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約7pg/mL至約2pg/mL、優(yōu)選約6. 7pg/mL至約2. 6pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IFNg。示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL (例如約0. 06pg/mL)的IFNg的L0D，并在約7pg/mL 至約2pg/mL、優(yōu)選約6. 7pg/mL至約2. 6pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IFNg。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約9pg/mL、小于約6pg/mL、小于約3pg/mL、 小于約2pg/mL或小于約lpg/mL的濃度下檢測IL-6的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-Ib的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-6的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 01pg/mL，例如約0. 003pg/mL的IL-6的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約9pg/mL至約0. 5pg/mL、優(yōu)選約8. 9pg/mL至約0. 48pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-6。示例性測定具有小于或等于約0. 01pg/mL(例如約0. 06pg/mL)的IL-6的L0D，并在約9pg/mL至約0. 5pg/mL、優(yōu)選約8. 9pg/mL至約0. 48pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-6。 在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約lpg/mL、小于約0. 8pg/mL、小于約 0. 6pg/mL、小于約0. 4pg/mL或小于約0. lpg/mL的濃度下檢測IL-17A的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-17A的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-17A的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 08pg/mL的IL-17A的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. 7pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約0. 6pg/mL至約0. 06pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-17A。示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL(例如約0. 06pg/mL)的IL-17A的 L0D,并在約0. 7pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約0. 6pg/mL至約0. 06pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-17A。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約3pg/mL、小于約2pg/mL、小于約lpg/mL、 小于約0. 8pg/mL或小于約0. 6pg/mL的濃度下檢測TNFa的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的TNFa的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對TNFa的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 01pg/mL，例如約0. 006pg/mL的TNFa的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. 3pg/mL至約0. 5pg/mL、優(yōu)選約2. 7pg/mL至約0. 6pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 TNFa0示例性測定具有小于或等于約0. 01pg/mL(例如約0. 08pg/mL)的TNFa的L0D，并在約0. 3pg/mL至約0. 5pg/mL、優(yōu)選約2. 7pg/mL至約0. 6pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的TNFa。 在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約1. 5pg/mL、小于約lpg/mL、小于約 0. 75pg/mL、小于約0. 5pg/mL或小于約0. 4pg/mL的濃度下檢測IL-4的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-4的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-4的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 15pg/mL，例如約0. llpg/mL的IL-4的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約lpg/mL至約0. lpg/mL、優(yōu)選約0. 8pg/mL至約0. 2pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-4。 示例性測定具有小于或等于約0. 15pg/mL(例如約0. llpg/mL)的IL-4的L0D，并在約Ipg/ mL至約0. lpg/mL、優(yōu)選約0. 8pg/mL至約0. 2pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-4。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。
在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約lpg/mL、小于約5pg/mL、小于約0. 3pg/ mL、小于約0. 2pg/mL或小于約0. lpg/mL的濃度下檢測IL-Ia的方法。在各種實施方案中， 檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-Ia的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-Ia的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. lpg/mL，例如約0. 06pg/mL的IL-Ia的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約0. 6pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約0. 5pg/mL至約0. 07pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-la。示例性測定具有小于或等于約0. lpg/mL(例如約0. 06pg/mL)的IL-Ia的L0D， 并在約0. 6pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約0. 5pg/mL至約0. 07pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-Ia0在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約2pg/mL、小于約1. 5pg/mL、小于約Ipg/ mL、小于約0. 8pg/mL或小于約0. 5pg/mL的濃度下檢測GM-CSF的方法。在各種實施方案中， 檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的GM-CSF的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對GM-CSF的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 05pg/mL，例如約0. 03pg/mL的GM-CSF的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約1. 3pg/mL至約0. 2pg/mL、優(yōu)選約1. lpg/mL至約0. 3pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 GM-CSF0示例性測定具有小于或等于約0. 05pg/mL (例如約0. 06pg/mL)的GM-CSF的L0D， 并在約1. 3pg/mL至約0. 2pg/mL、優(yōu)選約1. lpg/mL至約0. 3pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 GM-CSF。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約2pg/mL、小于約lpg/mL、小于約0. 5pg/ mL、小于約0. 2pg/mL或小于約0. lpg/mL的濃度下檢測IL-12的方法。在各種實施方案中， 檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-12的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-12的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 008pg/mL，例如約0. 01pg/mL的IL-12的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約1. 2pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約lpg/mL至約0. 08pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-12。示例性測定具有小于或等于約0. 008pg/mL(例如約0. 01pg/mL)的IL-12的L0D， 并在約1. 2pg/mL至約0. 05pg/mL、優(yōu)選約lpg/mL至約0. 08pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 IL-12。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約150pg/mL、小于約100pg/mL、小于約 80pg/mL、小于約60pg/mL或小于約40pg/mL的濃度下檢測G-CSF的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的G-CSF的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對G-CSF的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 2pg/mL，例如約0. 12pg/mL的G-CSF的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約110pg/mL至約30pg/mL、優(yōu)選約97pg/mL至約25pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 G-CSF0示例性測定具有小于或等于約0. 2pg/mL(例如約0. 01pg/mL)的G-CSF的L0D，并在約110pg/mL至約30pg/mL、優(yōu)選約97pg/mL至約25pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的G-CSF。 在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約50pg/mL、小于約40pg/mL、小于約30pg/ mL、小于約20pg/mL或小于約10pg/mL的濃度下檢測IL-22的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-22的量。
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在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-22的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 03pg/mL，例如約0. 02pg/mL的IL-22的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約40pg/mL至約3pg/mL、優(yōu)選約39pg/mL至約4pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-22。示例性測定具有小于或等于約0. 03pg/mL(例如約0. 01pg/mL)的IL-22的L0D，并在約40pg/ mL至約3pg/mL、優(yōu)選約39pg/mL至約4pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-22。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約40pg/mL、小于約30pg/mL、小于約20pg/ mL或小于約10pg/mL的濃度下檢測IL-10的方法。在各種實施方案中，檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的IL-10的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對IL-10的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 5pg/mL，例如約0. 4pg/mL的IL-10的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約40pg/mL至約8pg/mL、優(yōu)選約35pg/mL至約10pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-10。示例性測定具有小于或等于約0. 5pg/mL (例如約0. 4pg/mL)的IL-10的L0D，并在約40pg/mL 至約8pg/mL、優(yōu)選約35pg/mL至約10pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的IL-10。在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。在各種實施方案中，本發(fā)明提供在小于約70pg/mL、小于約60pg/mL、小于約50pg/ mL、小于約40pg/mL或小于約30pg/mL的濃度下檢測ΜΙΡ-la的方法。在各種實施方案中， 檢測的量對應(yīng)于在健康對象體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MIP-Ia的量。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供對MIP-Ia的靈敏度(檢測限(LOD))為小于或等于約0. 3pg/mL，例如約0. 2pg/mL的MIP-Ia的測定。在各種實施方案中，本發(fā)明的測定在約65pg/mL至約25pg/mL、優(yōu)選約63pg/mL至約22pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的 ΜΙΡ-la。示例性測定具有小于或等于約0. 3pg/mL (例如約0. 2pg/mL)的MIP-Ia的L0D，并在約65pg/mL至約25pg/mL、優(yōu)選約63pg/mL至約22pg/mL的范圍內(nèi)量化血漿中的ΜΙΡ-la。 在一種實施方案中，該血漿來自健康的對象。此外，本發(fā)明的檢測方法提供具有寬動態(tài)范圍的魯棒的測定。例如，本發(fā)明的方法提供具有至少llogU. 51og、21og、2. 51og、31og、3. 51og和最高41og和高于至少41og的動態(tài)范圍的測定。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供確定患者是健康還是受疾病、綜合征或其它疾病(malady)侵害的方法。該方法包括制備分析物的樣品并如本文中所述那樣檢測與該分析單分子相應(yīng)的可檢測物類。在各種實施方案中，檢測的細胞因子是選自IL-2、IL-5、 IL-7、IL-21及其組合的一員(圖5)。將測得的細胞因子濃度與細胞因子的濃度參考標準， 或相應(yīng)于健康個體的臨界細胞因子濃度比較。如果測得的樣品中細胞因子濃度從該參考標準或從臨界健康細胞因子值離散超過一預(yù)定值，這表明對象被疾病、綜合征或其它疾病侵害。在這些實施方案的變體中，取第一細胞因子濃度與第二細胞因子濃度的比。隨后將該比與參照比(例如相應(yīng)于健康對象體內(nèi)細胞因子濃度的比)比較，如果樣品中測得的細胞因子濃度的比值從該參考離散超過一預(yù)定量，這表明對象被疾病、綜合征或其它疾病侵害。在示例性實施方案中，該比選自[IL-5]/[IL-2]、[IL-5]/[IL-7]、[IL-5]/[IL-21]及其組合(圖6)。在示例性實施方案中，指示健康對象的[IL-5]/[IL-2]比為約30或更小、約20或更小、約15或更小、約10或更小或約8或更小。在示例性實施方案中，指示健康對象的[IL-5]/[IL-7]比為約25或更小、約15或更小、約10或更小、約5或更小、約3或更小。在各種實施方案中，指示健康對象的[IL-5]/[IL-21]比為約5或更小、約4或更小、約 3或更小、約2或更小或約1或更小。樣品制備本發(fā)明的各種實施方案基于這樣的認識某些樣品參數(shù)實現(xiàn)具有提高的靈敏性和動態(tài)范圍的測定。通常，現(xiàn)有技術(shù)認識到這樣做的優(yōu)點以小體積制備測定樣品，由此盡量減少導(dǎo)致測定靈敏性損失的轉(zhuǎn)移損失。本發(fā)明提供通過使用比業(yè)內(nèi)公認為有用的體積大的體積提高測定靈敏度的方法。使用更高液體體積改變的測定特性包括由測定混合物內(nèi)的非分析物物類的非特異性基質(zhì)效應(yīng)結(jié)合造成的對靈敏度的有害作用。在一種示例性實施方案中，本發(fā)明提供其體積足以提供比更低體積下相同的測定混合物更低量級的機制結(jié)合作用的測定混合物。例如，在某些實施方案中，以至少約25 μ L、例如約25 μ L至約1000 μ L、約40 μ L 至約800 μ L、約60 μ L至約500 μ L和約75 μ L至約300 μ L的緩沖溶液量形成該分析物與該捕獲物類之間的復(fù)合物。類似地，本發(fā)明人認識到，在該磁性粒子固定捕獲物類與使用特定重量范圍的磁性粒子固定捕獲物類的該分析物之間形成復(fù)合物提高了該測定的靈敏性與動態(tài)范圍。在一種示例性實施方案中，使用共軛到該捕獲物類上的至少約0. 1 μ g、例如約0. 1 μ g至約 40 μ g、約0. 5 μ g至約20 μ g和約l.Oyg至約10 μ g的磁性粒子。在各種實施方案中，通過控制用于將該可檢測物類從包含該分析物、該捕獲物類和該可檢測物類的復(fù)合物中洗脫的體積量級來提高本發(fā)明的測定的靈敏性。由此，在一種實施方案中，該可檢測物類的洗脫體積小于原始樣品量。在各種實施方案中，該洗脫體積比原始樣品體積小約2倍至約100倍，例如比原始樣品體積小約2倍至約20倍。在各種實施方案中，該洗脫體積比原始樣品體積小約5倍至約15倍。在一種示例性實施方案中，約200μ L的樣品量在本發(fā)明的方法的過程中降低至比原始樣品體積小約2倍至約20倍的洗脫體積。在另一種示例性實施方案中，約IOOyL 的樣品量在本發(fā)明的方法的過程中降低至比原始樣品體積小約2倍至約20倍的洗脫體積。 在另一些示例性實施方案中，約100 μ L至約200 μ L的原始樣品體積降低至約1 μ L至約 40 μ L，例如約5 μ L至約30 μ L或約10 μ L至約20 μ L的體積。在一種示例性實施方案中，在包含加入到約25 μ L至約1000 μ L的緩沖溶液中的約0. 1 μ g至約40 μ g的多種磁性粒子的混合物中形成該捕獲物類與該分析物之間的復(fù)合物。在某些實施方案中，通過將約0. 5 μ g至約25 μ g的多種磁性粒子與約100 μ L至約 1000 μ L的血漿樣品形成該復(fù)合物。在一種實施方案中，提供的該方法類似于夾心式測定。由此，單克隆抗體用作結(jié)合伴體。初級抗體連接到磁性粒子上以充當捕獲抗體(“捕獲物類”)。隨后添加該樣品，具有由該抗體識別的抗原表位的單分子在表面上結(jié)合到該抗體上。洗掉未結(jié)合的分析物分子，基本上僅留下特異性結(jié)合的分析物分子。結(jié)合的分析物分子/抗體與含有可檢測標記物的檢測抗體(“可檢測物類”)反應(yīng)。在允許(allow)該檢測抗體與分析物分子之間反應(yīng)的培育后，洗掉非特異性結(jié)合的檢測抗體。在一種示例性實施方案中，通過將磁性粒子轉(zhuǎn)移到不存在其它測定組分，特別是該可檢測物類的容器中，使該分析物-抗體-可檢測物類復(fù)合物基本不含污染性的未結(jié)合的可檢測物類。使用洗脫緩沖液分離該單分子與檢測抗體， 該可檢測物類在該單分子分析儀中?；蛘?，僅可以釋放和檢測結(jié)合到該可檢測物類上的標記物，由此間接檢測該單分子。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到的那樣，抗體用作捕獲和/或可檢測物類是為了說明清楚，基本任何其它捕獲或可檢測物類可以代替該實施例中混入的抗體，而不偏離本發(fā)明的精神。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，將未結(jié)合的可檢測物類與該分析物-抗體-可檢測物類復(fù)合物分離的其它方法在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在各種實施方案中，通過使用可重復(fù)組成的樣品提高本發(fā)明的精確度。因此，在一種示例性實施方案中，將樣品分離成具有更高和更低的樣品成分濃度的區(qū)域，或?qū)悠肪灾圃炀鶆驑悠?。在一種實施方案中，該樣品是分離成其各種組分的濃度梯度的血清樣品。例如，將一個樣品離心以制造可檢測地分離為三層或更多層的樣品。在一實例中，該樣品分離為三個可檢測的層，包括脂質(zhì)層(例如脂質(zhì)上層)、含有相關(guān)分析物的中間層和含有血纖維蛋白凝塊的層(例如血纖維蛋白下層)。在各種示例性實施方案中，相關(guān)分析物停留 (resides in)在該中間層中。本發(fā)明提供其中從中間層中提取樣品的測定。檢測本文中所述方法能夠在單分子通過該探詢空間時一次一個地計數(shù)該單分子?？梢杂晒潭〞r間長度內(nèi)的計數(shù)的單分子數(shù)和通過該探詢空間的樣品體積確定該樣品的濃度。在探詢空間包括該樣品流的整個橫截面的情況下，僅需要在固定時間長度內(nèi)的計數(shù)的單分子數(shù)和流經(jīng)該樣品流橫截面的體積以計算該樣品的濃度。當探詢空間小于該樣品流時，可以通過由采用標準濃度的對照樣品生成的標準曲線的內(nèi)插確定該單分子的濃度。在各種實施方案中，通過比較測得的單分子與內(nèi)部單分子標準確定該單分子的濃度?？梢詮挠嫈?shù)的單分子數(shù)推出濃度。例如，已知樣品稀釋度，可以計算起始樣品中的單分子濃度。根據(jù)本發(fā)明的方法檢測單分子的示例性裝置公開在共同擁有的公開的美國專利申請No. 20060078998和20080171；352中。合適的系統(tǒng)的其它實施例是Singulex，Inc.制造的光學系統(tǒng)，圖1。在一種示例性實施方案中，單分子檢測使用單分子分析儀。示例性單分子分析儀包括發(fā)射電磁輻射的電磁輻射源。該源任選是連續(xù)波輻射源。該分析儀還包括定位以接收該電磁輻射源發(fā)射的電磁輻射的第一探詢空間。該探詢空間是任選可調(diào)的，并在一些實施方案中具有約0. 02pL至約300pL、約0. 05pL至約50pL或約0. IpL至約25pL的體積。該分析儀還包括可操作地連接到第一探詢空間以測量所述可檢測物類單分子的第一電磁特征的第一電磁輻射檢測器。在各種實施方案中，該分析儀還包括能夠?qū)χ辽僖环N樣品自動取樣并在樣品容器與所述第一探詢空間之間提供流體連通的取樣系統(tǒng)。在某些實施方案中，該分析儀系統(tǒng)進一步包括與第一探詢空間流體連通的樣品回收系統(tǒng)。理想地， 該回收系統(tǒng)能夠回收基本所有樣品。該分析儀可任選包括樣品制備系統(tǒng)。有助于本發(fā)明的方法的極高靈敏性的特征是檢測和計數(shù)在一些實施方案中連接到待檢測的單分子上或?qū)?yīng)于待檢測的單分子的可檢測物類的方法。簡而言之，在一種示例性實施方案中，向給定探詢空間施以來自于在適于該標記物用熒光部分的激發(fā)波長下發(fā)光的激光器的EM輻射一段預(yù)定時間，并檢測該時間過程中發(fā)射的光子，由此將流經(jīng)該檢測設(shè)備的處理樣品有效地分為一系列檢測事件。將檢測器檢測的信號分為各自具有預(yù)先選擇
29的時間長度(箱元寬度)的的任意時間片段(箱元)。盡管可以使用其它箱元寬度而不偏離本發(fā)明的范圍，在一種實施方案中在大約10微秒至約5毫秒的范圍內(nèi)選擇該箱元寬度。 示例性的箱元寬度為1。確認(established)每個片段中所含的信號。每個預(yù)定的時間段為一個“箱元(bin) ”。如果在給定箱元中檢測到的光子總數(shù)超過預(yù)定的閾值水平，則對該箱元記錄為檢測事件，即檢測到標記物。如果光子的總數(shù)未達到預(yù)定的閾值水平，則不記錄檢測事件。在一些實施方案中，處理樣品濃度被充分稀釋，對于大部分檢測事件而言，檢測事件僅僅代表一個可檢測物類通過窗口，其對應(yīng)于原始樣品中的相應(yīng)單分子，也就是說，極少的檢測事件代表單個箱元中超過一個標記物。在一些實施方案中，應(yīng)用進一步的精制以便在待精確檢測的處理樣品中獲得更高的標記物濃度，即兩個或多個標記物檢測為單一檢測信號的可能性不再微乎其微。在一種示例性實施方案中，該方法提供僅通過計數(shù)單分子的檢測。本發(fā)明的方法還包括計數(shù)單個箱元中的多份可檢測物類。由此，在另一種實施方案中，本發(fā)明提供通過計數(shù)選自來自單分子的光子、事件光子、總光子及其組合的一員的檢測。在一種實施方案中，首先分析檢測的信號以確定噪音水平，并在利用該數(shù)據(jù)前選擇高于閾值的信號。在一種實施方案中，通過平均大量箱元中的信號來確定噪音水平。在另一些實施方案中，由平均噪音水平和根均方噪音確定該背景水平。在其它情況下，選擇典型噪音值或統(tǒng)計值。在大多數(shù)情況下，噪音預(yù)計呈泊松分布。在各種實施方案中，確定閾值以以區(qū)別真實信號(峰、碰撞、單分子)與噪音。必須仔細選擇閾值以盡量減少來自隨機噪音的假陽性信號數(shù)，同時盡量減少被排除的真實信號數(shù)。選擇閾值的方法包括測定高于噪音水平的固定值，并根據(jù)噪音信號的分布計算閾值。 在一種實施方案中，閾設(shè)定為高于背景水平的標準偏差的固定值。假定噪音為泊松分布，采用該方法可以估算試驗的整個事件過程內(nèi)假陽性信號數(shù)。在一些實施方案中，本發(fā)明中使用的分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠在小于1納摩爾、 或1皮摩爾、或1毫微微摩爾、或1微微微摩爾、或1仄摩爾(zeptomolar)的水平下檢測分析物，例如生物標記物。在一些實施方案中，當該生物標記物以小于1納摩爾、或1皮摩爾、或1飛摩爾(femtomolar)、或1渺摩爾(attomolar)、或1仄摩爾(ζ印tomolar)的濃度存在于該樣品中，且當各樣品量小于約100、50、40、30、20、10、5、2、1、0. 1,0. 01,0. 001或 0. 0001 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由一種樣品到另一種樣品的小于約小于約 0. 1、1、2、5、10、20、30、40、50、60或80%的該分析物或多種分析物，例如一種或多種生物標記物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約1皮摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約50μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約 20%的該分析物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約100飛摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約50 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約20%的該分析物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約50 飛摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約50 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約20%的該分析物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約5飛摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約50 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約20%的該分析物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約5飛摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約5 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約20%的該分析物的濃度變化。在一些實施方案中，當該分析物以小于約1飛摩爾的濃度存在時，且當各樣品量小于約5 μ L時，該分析儀或分析儀系統(tǒng)能夠檢測由第一樣品到第二樣品的小于約20%的該分析物的濃度變化。可以通過檢測一種或多種可檢測物類上的一種或多種標記物來檢測該分析物的單分子。在本發(fā)明的示例性實施方案中，通過至少兩個標記物提供令該可檢測物類單分子可檢測的非本征性質(zhì)。例如，目標單分子用兩種或多種標記物進行標記，可以由有別于其它標記物的在一個或多個波長下的檢測的發(fā)射區(qū)分每種標記物。在這種實例中，該單分子通過在兩個或多個波長下的檢測的發(fā)射的比區(qū)別于游離標記物(或偶然鍵合到分析物或樣品組分上的標記物)。在另一實施例中，用兩種或多種標記物標記該單分子，且該標記物的至少兩種在相同的波長下發(fā)光。在該實例中，根據(jù)檢測到的來自于連接到每個單分子上的兩種、三種或多種標記物的發(fā)射所產(chǎn)生的熒光強度區(qū)別單分子。在另一實施方案中，該染料具有相同或重疊的激發(fā)光譜，但是具有可區(qū)別的發(fā)射光譜。優(yōu)選選擇染料以使它們具有基本不同的發(fā)射光譜，優(yōu)選具有相隔超過約IOnm的發(fā)光最大值，更優(yōu)選具有相隔超過約25nm的發(fā)光最大值，再更優(yōu)選相隔超過約50nm。當合意的是使用儀器方法區(qū)分兩種染料時，多種濾光器和光柵使得能夠獨立檢測各自的發(fā)射光譜。 還可以通過選擇具有窄帶寬而非寬帶寬的染料提高儀器的辨識度；但是，此類染料必須具有高振幅發(fā)光或以積分信號強度損失不損害信號檢測的足夠濃度存在。在使用超過一種標記物的各種實施方案中，第二標記物可以猝滅第一標記物的熒光，導(dǎo)致雙重標記的單分子的熒光信號損失。合適的熒光/猝滅對的例子包括 5，6-FAMTM/3，Dabcy 1,5' Oregon Green 488-XNHS Ester/3，Dabcy 1,5' Texas Red "X NHS Ester/3' BlackHole Quencher -1 (Biosearch Technologies, Novato, CA)。在另一實施例中，兩種標記物用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(“FRET”)，其為兩種染料單分子的激發(fā)態(tài)之間的距離依賴性相互作用。在這種情況下，激發(fā)從給體轉(zhuǎn)移到受體單分子， 而不會由給體發(fā)射光子。該給體和受體單分子必須密切接近(例如在約100埃)。合適的給體、受體對包括熒光素/四甲基若丹明、LAEDANS/熒光素、EDANS/dabcyl、熒光素/QSY7 (R. Haugland, ‘‘ Molecular Probes"，第九版，2004)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多其它給體 /受體對?？梢杂贸^一種類型的標記物——如染料標簽和質(zhì)量標簽標記單分子以幫助檢測和/或辨別。例如，分析物可以用兩種可檢測物類(例如兩種可區(qū)分的抗體)標記，其一未標記并充當質(zhì)量或質(zhì)量/電荷標簽，另一個具有染料標簽。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)與僅結(jié)合到具有染料標簽的抗體上的另一大小類似的蛋白質(zhì)的區(qū)別在于其在使用例如電泳作為原動力時的較慢速度(由另外的結(jié)合抗體的提高的質(zhì)量或質(zhì)量/電荷造成)。數(shù)據(jù)處理在收集樣品中的單分子檢測數(shù)據(jù)后，在各種實施方案中，將該數(shù)據(jù)與在相同實驗條件下獲得的參考數(shù)據(jù)組比較以確定在該分析物的單分子檢測中是否存在代表分析、診斷或預(yù)后價值差異的變化。在示例性實施方案中，試驗與參考數(shù)據(jù)之間的差值指示病狀、病狀的進展、病狀的階段或治療方法對該病狀的效力。進行該比較的多種方法均有效。在一種示例性實施方案中，使用多變量分析。
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獲自具有微妙變化的樣品的數(shù)據(jù)之間的辨別需要采用魯棒和靈敏的分析方法。這些方法必須將由各種原因引起的非線性建模并考慮儀器設(shè)置的逐日偏移。樣品處理錯誤、 噪擾帶、基線位移、批次變化、非診斷性碎片的存在以及不利地影響辨別的所有其它因素也優(yōu)選充分考慮和建模。最后，對于提供魯棒性的方法，其必須區(qū)分質(zhì)量好和質(zhì)量差的數(shù)據(jù)，并排除不代表參考組(reference set)的樣品。非代表性樣品稱為離群樣品(outlier sample) 0離群樣品是統(tǒng)計上不同于該參考組中所有其它樣品的樣品。在如細胞因子的物類的單分子檢測情況下，離群數(shù)據(jù)組來自于具有小于最佳數(shù)量副本的單分子和/或富含非診斷性碎片的樣本的樣品。在各種實施方案中，參考數(shù)據(jù)組代表所選單分子的數(shù)據(jù)組中所有的預(yù)期變化。隨后使用例如光譜數(shù)據(jù)分析或多變量分析的經(jīng)典方法的方法處理所有樣品的數(shù)據(jù)。多變量分析已經(jīng)用于分析生體試樣。例如，Robinson等人在美國專利US 4，975，581 (1990年12月4日公布)描述了使用多變量分析確定已知生物流體中生物分析物相似性的定量方法。主成分分析(PCA)和判別分析用于區(qū)分正常和不正常的生物樣品。參見Ge，等人， Applied Spectroscopy 49 :432-436 (1995)。Haaland，等人在美國專利US 5, 596, 992(1997 年1月觀日公布)教導(dǎo)了使用多變量法檢測正常細胞與惡性腫瘤細胞樣品之間的差異。在本發(fā)明中，當使用多變量分析時，可以通過偏最小二乘法(PLS)或主成分分析 (PCA)統(tǒng)計方法對可被預(yù)處理(即平滑和/或衍生)、或未平滑和未衍生的數(shù)據(jù)進行單分子檢測數(shù)據(jù)的比較。優(yōu)選使用PCA進行使用主成分回歸(PCR)的比較。進行這些統(tǒng)計方法的大量計算機程序是可得的，包括PCR-32 (來自Bio-feid，Cambridge, Mass.，USA) 和 PLS- PLUS 和DISCRIMINATE (來自 Galactic Industries, Salem, NH, USA)。 基本理論和計算的討論可以在例如Haaland，等人，Anal. Chem. 60 :1193-1202(1988)； Cahn，等人，Applied Spectroscopy, 42 :865-872(1988)；和 Martens，等人，MULTIVARIATE CALIBRATION, John Wiley and Sons, New York, NY (1989)中找到。PCR 和 PLS 均使用來自于參考單分子樣品的單分子的數(shù)據(jù)庫以創(chuàng)造參考組，其中在基本相同的條件下獲得每個數(shù)據(jù)組。數(shù)據(jù)分析技術(shù)由數(shù)據(jù)壓縮(在PCR的情況下，該步驟稱為PCA)和線性回歸組成。利用因素或主成分的線性組合，導(dǎo)出重構(gòu)數(shù)據(jù)組。重構(gòu)數(shù)據(jù)組與充當分類基礎(chǔ)的未知試樣的數(shù)據(jù)組比較。在本發(fā)明的某些方面中，在對檢測的單分子的特定物類獲得的數(shù)據(jù)組上“平均”各個數(shù)據(jù)組生成的預(yù)測分數(shù)。在該樣品群上“平均”來自樣品上的各個數(shù)據(jù)組的“平均”分數(shù)。 “平均”法可包括簡單地取預(yù)測分數(shù)的算術(shù)平均值，或可以依靠本領(lǐng)域已知的確定群體分布的其它統(tǒng)計方法。該方法包括例如，確定該預(yù)測分數(shù)群的中值和平均值。通過建立分散的度量標準(例如標準偏差、四分位數(shù)間距、距離偏差(range)和平均偏差)來評估群體在確定的中心任一側(cè)上的離散程度。用于實施本發(fā)明的建立預(yù)測分數(shù)群的“平均值”和群體離散程度的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。在分析未知樣品之前，可以使用相同單分子的另一組數(shù)據(jù)來驗證和優(yōu)化該參考。 第二組數(shù)據(jù)通過確定模型的等級(rank of the model)提高了 PCR或PLS模型的預(yù)測精確度。通過將PCR或PLS預(yù)測與已知診斷進行比較，從一定范圍的等級中確定最佳等級。由被確定為最佳的等級提高或降低會不利地影響該PLS或PCR預(yù)測。例如，當該等級從最佳逐漸降至次最佳時，PCR或PLS會造成參考光譜中越來越小的變化。相反，超過被確定為最佳的等級的等級逐漸提高會造成PCR或PLS法模擬隨機變化而非參考光譜中的有效信息。通常，參考組包括越多單分子檢測數(shù)據(jù)，該模型就越好，將由儀器偏移和折光指數(shù)變化引起的批次間變化、基線偏移和非線性計入考慮的幾率越好。由差樣品操作與制備、樣品雜質(zhì)和操作員錯誤引起的誤差也可計入考慮，只要參考數(shù)據(jù)實現(xiàn)未知樣品的真實表示。使用PCR和PLS分析的另一優(yōu)點在于這些方法測量未知樣品相對于參考數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)噪音水平。生物樣品常常遇到許多來源擾動。某些擾動強烈影響數(shù)據(jù)質(zhì)量，并不利地影響 “診斷”結(jié)果。因此，優(yōu)選區(qū)分符合參考數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)和那些不符合的數(shù)據(jù)(例如離群樣品)。 F比是檢測數(shù)據(jù)組(樣品)與參考數(shù)據(jù)的符合度或欠符合性的有力工具。通常顯著大于參考值的F比表明“欠符合”，并應(yīng)從分析中排除。排除離群樣品的能力增加了 PCR和PLS的魯棒性和可靠性，因其避免由低劣和損壞的數(shù)據(jù)產(chǎn)生“診斷”?？梢酝ㄟ^Haaland等人，Anal. Chem. 60 :1193-1202(1988)和 Cahn 等人，Applied Spectroscopy 42:865-872(1988)中描述的方法計算F比。當辨別來自不同樣品的單分子數(shù)據(jù)時，該生物材料不再具有已知的組分濃度。結(jié)果，在示例性實施方案中，參考數(shù)據(jù)確定了允許樣品被歸為參考成員的變動范圍，還應(yīng)包括預(yù)處理算法以將樣品組成的多樣性計入考慮。其它數(shù)據(jù)處理算法用于本發(fā)明。例如在本發(fā)明的一種示例性實施方案中，具有診斷價值的細胞因子(或其它標記物)可以首先使用對照物個體和疾病患者之間的統(tǒng)計加權(quán)差分進行識別(identify)，以D_N σ D* σ N形式計算，其中D是診斷為患有特定疾病的患者體內(nèi)細胞因子的中值濃度，N是對照物個體的中值，D*是D的標準偏差，σ N是N的標準偏差。量級越大，患病和正常群體之間的統(tǒng)計差異越大。按照本發(fā)明的一種實施方案，導(dǎo)致對照物個體和疾病患者之間的統(tǒng)計加權(quán)差分大于0. 2,0. 5、1、1. 5、2、2. 5或3的細胞因子被認定為有診斷價值的標記物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識的那樣，患者本身可以是“對照物”。例如，如果該測定是監(jiān)測治療或疾病進展的過程的一部分，在治療過程開始時或在發(fā)現(xiàn)或診斷疾病時獲自該患者的數(shù)據(jù)可以充當評價治療或疾病進展導(dǎo)致的疾病標記物變化用的參考數(shù)據(jù)組。其中來自提供本發(fā)明測定用樣品的患者的數(shù)據(jù)充當參考數(shù)據(jù)組或基線數(shù)據(jù)組的另一些實施方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。用于測定充當診斷標準物的特定候選分析物，如特定細胞因子的效力的本發(fā)明方法中使用的另一種統(tǒng)計分析方法是受試者工作特征(ROC)曲線分析。ROC曲線是考察取舍標準(例如對診斷標志，如測定信號或分析物水平的取舍值)對正確鑒別陽性與陰性樣品或?qū)ο蟮脑\斷能力的作用的圖形化方式。在示例性分析中，ROC曲線的一條軸是真陽性率 (TPR，真陽性樣品/對象被正確識別為陽性的概率)或者假陰性率(FNR= 1-TPR，真陽性樣品/對象被不正確地識別為陰性的概率)。另一軸是真陰性率(TNR，真陰性樣品被正確識別為陰性的概率)或假陽性率(FPR= I-TNR，真陰性樣品被不正確地識別為陽性的概率)。 使用樣品/對象群體測定結(jié)果，通過改變用于鑒別樣品為陽性或陰性的診斷取舍值并對每一取舍值的TPR(或FNR)和TNR(FPR)的計算值繪圖，由此生成該ROC曲線。曲線下方的面積(本文中稱為ROC面積)是該診斷分離陽性和陰性樣品/對象的能力的一個指標。診斷測定和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析領(lǐng)域的技術(shù)人員在本文中提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)下能夠在
33沒有不必要的負擔的情況下選擇最適于滿足特定用途的需要(例如靈敏性和特異性)的取舍值、線、比率、區(qū)域等等。多種統(tǒng)計工具，如受試者工作特征(ROC)曲線，可用于評估取舍值的調(diào)節(jié)對測定性能(例如預(yù)測的真陽性率、假陽性率、真陰性率和假陰性率)的影響。 或者，患者群體的統(tǒng)計分析能夠?qū)⑻囟ǚ治鑫镏缔D(zhuǎn)化為患者患有或不患有疾病的概率。關(guān)于用于確定參考范圍的個體群的選擇和分析的背景，參見Boyd J.C. “ Reference Limits in the Clinical Laboratory" in Professional Practice in Clinical Chemistry :A Companion Text ；D. R. Dufour Ed. ,1999, Washington D. C American Assoc. CLIN. CHEM., 第2章，第2-1至2-7頁。關(guān)于決定限(即取舍值)的選擇或由試驗結(jié)果計算疾病可能性的背景，參見Boyd J. C. “ Statistical Aids for Test Interpretation" in Professional Practice in Clinical Chemistry :ACompanion Text ；D.R.Dufour Ed. ,1999,Washington D. C. =American Assoc. CLIN. CHEM.，第 3 章，第 3-1 至 3-11 頁。在本發(fā)明的教導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員也會認識到第一標記物(例如第一細胞因子)和一種或多種另外的標記物(例如第二細胞因子)的選擇可以調(diào)換相關(guān)圖軸 (correlation plot axes)和因此調(diào)換用于確定是落在特定取舍比、線和/或概圖上方還是下方的測得的患者樣品標記物水平指示病狀的標準，并能夠相應(yīng)地調(diào)節(jié)該分析。本發(fā)明還提供獲自分析物單分子分析的數(shù)據(jù)組。在一種示例性實施方案中，該數(shù)據(jù)組包括與收集自所述分析物的單分子測定的來自分析物的信號對應(yīng)的至少一個數(shù)據(jù)點， 所述測定具有小于0. 5pg/mL的檢測限和至少2. 51og的動態(tài)范圍。在另一方面，本發(fā)明提供商業(yè)方法。在一種實施方案中，本發(fā)明提供一種營業(yè)方法，包括由一個實體使用本發(fā)明的方法獲得樣品測定結(jié)果，報告所述結(jié)果，并為該結(jié)果報告向該實體付款。在一些實施方案中，該實體是臨床實驗室改進修正(CLIA)實驗室。在一些實施方案中，該實體是非CLIA實驗室的實驗室。該樣品可以是能夠被單一粒子檢測器分析的任何類型的樣品。在一些實施方案中，該樣品來自個體。該個體可以是如本文所述的任何類型的個體。在一些實施方案中，該個體是需要篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測和/或確定治療方法的患者(例如動物，例如人類)。在一些實施方案中，該個體是參與臨床試驗或臨床前試驗研究的個體(例如動物，例如人類)。在一些實施方案中，該樣品來自作為研究項目，例如醫(yī)學研究、農(nóng)業(yè)研究、工業(yè)研究、教育研究、生物恐怖主義研究等等的一部分的個體。在一些實施方案中，可以由接收該結(jié)果報告的個體，例如醫(yī)療保健專家和/或被抽取樣品的個體， 向進行該分析的實體，例如CLIA實驗室付費，或者可以由被抽取樣品的個體向從進行分析的實體接收報告的個體付費和/或向該實體本身付費，或其一定的組合。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種營業(yè)方法，包括由衛(wèi)生保健提供者使用能夠檢測單一粒子的具有兩個探詢空間的檢測器獲得來自個體的樣品的測定結(jié)果，將所述結(jié)果報告給該個體或他們的代表；并由該個體為所述結(jié)果報告付費。試劑盒本發(fā)明還提供進行本發(fā)明的分析的試劑盒。在一種示例性實施方案中，該試劑盒包括一種或多種捕獲物類、可檢測物類和磁性粒子。該試劑盒還包括用于實施本發(fā)明的方法的反應(yīng)物或試劑。還提供進行本發(fā)明的測定的使用說明。實施例2中描述了示例性試劑盒及其在檢測IL-6中的用途。提供下列實施例以闡述本發(fā)明的某些實施方案，并且這些和本發(fā)明的任何其它實施方案是非限制性的。實施例實施例1材料與方法材料抗體與分析物(重組體)獲自R&D Systems (Minneapolis,麗)。制造商建議是遵循匹配的抗體對。熒光染料和生物素琥珀酰亞胺酯(用于標記抗體)獲自 Invitrogen (Carlsbad, CA)。大鼠、狗和猴cTnl從天然來源提純，獲自Hytest (Sweden)。人檸檬酸鋰血漿標本購自hterstate血庫(St. Louis,M0)。抗生物素蛋白鏈菌素涂布的順磁性微粒(MPs)獲自hvitr0gen(MyOne，#650-01)。采用制造商建議，抗體用熒光染料(檢測抗體，通常為多克隆的)和生物素(捕獲抗體，通常為單克隆的)標記。Mb在飽和條件下用生物素化抗體涂布(按照制造商的建議)，洗滌并儲存在測定緩沖液中。測定緩沖液由1% BSA、Tris-緩沖鹽水(pH 7.4,0. 05% TritonX-100)和異嗜白細胞/HAMA抗體阻斷劑(購自 Scantibodies Laboratories, Roche Life Sciences)組成并按照制造商建議使用。Erenna免疫測定系統(tǒng)除非另行規(guī)定，如下進行典型的Ererma免疫測定。樣品或標樣(例如 50 μ L-100 μ L)用含有捕獲抗體涂布的MPs的測定緩沖液稀釋(例如150 μ L)，并在96孔板在25°C下在搖振下培育一至二小時。所有血漿或血清樣品不經(jīng)預(yù)處理而純地測試。使用磁體床(Ambion，Texas)分離MPs。移去上清液，MPs洗滌一次并隨后加入20 μ L的檢測抗體(50-500 μ g/mL，在測定緩沖液中稀釋)并在25°C下在搖振下培育60分鐘。再次磁性分離該MPs并用Tris-緩沖鹽水加0. 05%的Triton X-100洗滌六次。在除去剩余的洗滌緩沖液后，加入20 μ L洗脫緩沖液(4Μ脲)。該試劑妨礙抗體-分析物相互作用，導(dǎo)致檢測抗體從該MPs中釋放。在每一 96-孔中的溶液隨即轉(zhuǎn)移到384-孔濾板(0. 2微米，AcroPr印， East Hills NY)并在3，000RPM下離心3分鐘以便令洗脫緩沖液中的檢測抗體與MI3s分離。 384-孔板中的洗脫和過濾的材料隨后放置到該Ererma免疫測定系統(tǒng)(Singulex，he.)中。Erenna免疫測定系統(tǒng)該Ererma免疫測定系統(tǒng)基于單分子計數(shù)技術(shù)。液體從該384孔板的每個孔中吸出并泵送經(jīng)過直徑為100微米的毛細管流動池。液體流經(jīng)該毛細管中的探詢空間。如圖 1中所述，激光器發(fā)出的光經(jīng)分色鏡和共焦顯微鏡透鏡導(dǎo)入該探詢空間。當染料標記的抗體流經(jīng)該空間時，它們發(fā)射熒光，經(jīng)共焦顯微鏡透鏡和光子探測器測量該熒光。來自該檢測器的輸出是一系列脈沖，每個脈沖代表檢測到的一個光子。將這些脈沖發(fā)送到電子計數(shù)設(shè)備(counting electronics)，在此計數(shù)1毫秒箱元中的脈沖。使用輸出信號的組合獲得 4. 5+log的動態(tài)報告范圍。首先，確定背景水平，并基于該水平創(chuàng)造高于該背景的5標準偏差閾。僅計數(shù)高于該閾的閃光。這些單個峰(無信號強度)在一分鐘間隔內(nèi)求和或直到獲得1，000個峰。最終的信號是所有此類測得的事件的和，并稱為檢測事件(DE)。第二輸出稱為事件光子(EP)，是在所有檢測事件中計數(shù)的光子的和。當兩個分子在相同的1毫秒計數(shù)箱元內(nèi)經(jīng)過該檢測器的概率相當大時，在更高的濃度下使用該測量。在最高的分析物濃度下，EP事件開始飽和，使用總光子(TP)，所有光子事件的總和。DE、EP和TP信號用于生成適于每種信號類型的加權(quán)四參數(shù)邏輯曲線。為了評估未知的濃度，從每個標準曲線上內(nèi)插掉該DE、EP和TP信號以獲得三個單獨的濃度評估值。根據(jù)標準曲線的斜率用加權(quán)平均值結(jié)合這三個濃度。這提供了 > 4. 51og的線性報道范圍。結(jié)果這一部分陳述來自使用不同分析物的一系列不同試驗的代表性數(shù)據(jù)，意在提供 Erenna免疫測定系統(tǒng)的性能的概覽。 報道范圍、線性、精確性和可重現(xiàn)性用人IL-17測定生成的典型信號數(shù)據(jù)的實施例顯示在表1中。用于構(gòu)造標準曲線的DE、EP和TP信號以粗體顯示。為了確定曲線擬合的精確度，表1中的信號值用曲線擬合算法回插，結(jié)果顯示為實測值vs預(yù)期值皮克/毫升。表1.來自人IL-17Ererma測定標準曲線的信號、回插值和回收率
權(quán)利要求
1.進行檢測與可檢測物類特異性連接到其上的分析物單分子相關(guān)聯(lián)的可檢測物類單分子的測定的方法，所述方法包括(a)在第一容器中，(i)在所述分析物和特異性結(jié)合所述分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物，其中所述捕獲物類固定在磁性粒子上；和( )在(i)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合到所述分析物上的所述可檢測物類接觸，由此形成所述可檢測物類的固定的復(fù)合物；(b)將所述固定的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到不含所述所述可檢測物類的第二容器中；(c)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測物類；和(d)檢測所述可檢測物類的所述單分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述捕獲物類通過選自共價和非共價相互作用的相互作用固定在所述磁性粒子上。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述捕獲物類通過生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用固定在所述磁性粒子上。
4.權(quán)利要求1的方法，其中，在(a)(i)之前，所述分析物的所述單分子從三層血漿樣品的中間層中移出，所述三層血漿樣品包含脂質(zhì)上層、包含所述分析物的所述單分子的所述中間層和血纖維蛋白凝塊的下層；所述分析物的所述單分子以等分形式從所述樣品的所述中間層中移出。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述捕獲物類選自核酸、多肽、脂質(zhì)和糖類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述捕獲物類是抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可檢測物類選自核酸、多肽、脂質(zhì)和糖類。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可檢測物類是抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物選自細胞因子和生長因子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細胞因子是白介素。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述細胞因子選自IL-la、IL-li3、IL-2、IL-4、 IL-8、IL-12、IL-21、G-CSF、GM-CSF、hTNFa、mTNFa , IFNy 和 hVEGF。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述方法提供能夠以小于或等于約2pg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述方法提供能夠以小于或等于約0.5pg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞因子選自IL-Ia、IL-I β , IL-8, IL-12、IL-21、G-CSF、GM-CSF、hTNFa、mTNFa、IFN γ 和 hVEGF，且所述方法提供能夠以小于或等于約0. 4pg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述細胞因子選自IL-Ia、IL-Iβ、IL-8, IL-12、IL-21、G-CSF、GM-CSF, hTNF a , IFN y和hVEGF，且所述方法提供能夠以小于或等于約0. 3pg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞因子選自IL-Iβ、IL-21、G-CSF、 hTNF α和hVEGF，且所述方法提供能夠以小于或等于約0. 2pg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細胞因子選自G-CSF、hTNFa和hVEGF，且所述方法提供能夠以小于或等于約0. lpg/mL的量檢測所述細胞因子的測定。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測定具有大于約21og的動態(tài)范圍。
19.權(quán)利要求15的方法，其中所述測定具有至少約31og的動態(tài)范圍。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述測定具有至少約41og的動態(tài)范圍。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合物在約25μ L至約1000 μ L體積的緩沖溶液中形成。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合物在至少約25μ L體積的緩沖溶液中形成。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述磁性粒子是以約0.1 μ g至約40 μ g的量存在于所述第一容器中的多種磁性粒子的一員。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述磁性粒子是以至少0.1 μ g的量存在于所述第一容器中的多種磁性粒子的一員。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測物類包含共價結(jié)合到其上的熒光團。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)合物在由以下成分組成的混合物中在所述磁性粒子上形成約0. 1 μ g至約40 μ g的多種磁性粒子和約25 μ L至約1000 μ L的緩沖溶液。
27.權(quán)利要求25的方法，其中通過將約0.5 μ g至約25 μ g的所述多種所述磁性粒子與約100 μ L至約1000 μ L的血漿樣品接觸，由此形成所述復(fù)合物。
28.權(quán)利要求1的方法，還包括(e)確定所述單一可檢測物類分子的群體的濃度。
29.權(quán)利要求27的方法，還包括(f)將所述單一可檢測物類的所述濃度與所述分析物的所述單分子的群體的濃度相關(guān)聯(lián)。
30.權(quán)利要求1的方法，還包括(g)計數(shù)所述單一可檢測物類分子的群體的各個成員，由此確定所述單一可檢測物類分子的數(shù)量。
31.權(quán)利要求15的方法，還包括(h)將所述單一可檢測物類分子的所述數(shù)量與所述分析物的所述單分子數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測包括使用單分子分析儀，包括(a)能夠檢測所述可檢測物類的所述單分子的分析儀系統(tǒng)，所述分析儀包含i.發(fā)射電磁輻射的電磁輻射源；ii.定位以接收該電磁輻射源發(fā)射的電磁輻射的第一探詢空間； iii.可操作地連接到該第一探詢空間以測量所述可檢測物類的所述單分子的第一電磁特征的第一電磁輻射檢測器。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述分析儀系統(tǒng)還包括(b)能夠自動取樣至少一種樣品并在樣品容器與所述第一探詢空間之間提供流體連通的取樣系統(tǒng)。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述分析儀系統(tǒng)還包含能夠回收基本所有樣品的與該第一探詢空間流體連通的樣品回收系統(tǒng)。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述分析儀系統(tǒng)還包含樣品制備系統(tǒng)。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述電磁輻射源是連續(xù)波電磁輻射源。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述第一探詢空間具有約0.02pL至約300pL的體積。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述第一探詢空間具有約0.05pL至約50pL的體積。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一探詢空間具有約0.IpL至約25pL的體積。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述第一探詢空間的體積是可調(diào)的。
41.進行檢測與所述可檢測抗體特異性結(jié)合到其上的分析物單分子相關(guān)聯(lián)的可檢測抗體單分子的測定的方法，所述方法包括(a)在第一容器中，(i)在所述分析物與特異性結(jié)合所述分析物的捕獲抗體之間形成半抗原-抗體復(fù)合物，其中所述捕獲抗體包含生物素，并通過所述生物素與所述抗生物素蛋白鏈菌素之間的相互作用固定在包含抗生物素蛋白鏈菌素的磁性粒子上；和( )在(i)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合所述分析物的所述可檢測抗體接觸，由此形成所述可檢測抗體的固定的復(fù)合物；(b)將所述固定的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到不含所述可檢測抗體的第二容器中；(c)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測抗體；和(d)檢測所述可檢測抗體的所述單分子。
42.權(quán)利要求41的方法，其中，在(a)(i)之前，所述分析物的所述單分子從三層血漿樣品的中間層中移出，所述三層血漿樣品包含脂質(zhì)上層、包含所述分析物的所述單分子的所述中間層和血纖維蛋白凝塊的下層；所述分析物的所述單分子以等分形式從所述樣品的所述中間層中移出。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述生物素在選自胺部分和鉸鏈糖基部分的位置處結(jié)合到所述捕獲抗體上。
44.進行檢測與分析物單分子相關(guān)聯(lián)的可檢測物類單分子的樣品測定的方法，所述分析物單分子是選自細胞因子與生長因子的一員，所述可檢測物類特異性結(jié)合到其上，所述測定能夠以小于或等于約5pg/mL的量檢測所述可檢測物類，且所述測定具有至少約21og 的動態(tài)范圍；所述方法包括(a)在第一容器中，(i)在所述分析物與特異性結(jié)合所述分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物，其中所述捕獲物類包含生物素，并通過所述生物素與所述抗生物素蛋白鏈菌素之間的相互作用固定在包含抗生物素蛋白鏈菌素的磁性粒子上；和( )在(i)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合到所述分析物上的所述可檢測物類接觸，由此形成所述可檢測物類的固定的復(fù)合物；(b)檢測所述可檢測物類的所述單分子。
45.權(quán)利要求44的方法，在(b)之前還包括(c)將所述固定的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到不含所述可檢測物類的第二容器中。
46.權(quán)利要求44的方法，在步驟(b)之前還包括(d)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測物類。
47.權(quán)利要求44的方法，其中所述測定設(shè)計成能夠在與所述對象的臨床健康的、非疾病狀態(tài)相關(guān)的范圍內(nèi)檢測所述分析物。
48.根據(jù)單分子測定的結(jié)果確定選自診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)和治療方法的一員的方法， 所述方法包括(a)在第一容器中，(i)在所述分析物和特異性結(jié)合所述分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物，其中所述捕獲物類固定在磁性粒子上；和( )在(i)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合到所述分析物上的所述可檢測物類接觸，由此形成所述可檢測物類的固定的復(fù)合物；(b)將所述固定的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到不含所述可檢測物類的第二容器中；(c)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測物類；(d)檢測所述可檢測物類的所述單分子；(e)量化多種所述單分子，由此確定所述單分子的濃度；和(f)將所述單分子的所述濃度與選自所述診斷、預(yù)后、治療狀態(tài)和治療方法的一員相關(guān)聯(lián)。
49.來自測定的數(shù)據(jù)組，所述數(shù)據(jù)組包括至少一個與從所述分析物的單分子的測定中收集的來自分析物的信號對應(yīng)的日期點， 所述測定具有小于0. 5pg/mL的檢測限和至少2. 51og的動態(tài)范圍。
50.進行檢測與所述可檢測物類特異性結(jié)合到其上的分析物單分子相關(guān)聯(lián)的可檢測物類單分子的測定的方法，所述方法包括(a)在所述分析物與特異性結(jié)合所述分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物，其中所述捕獲物類固定在磁性粒子上；和(b)在(a)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合到所述分析物上的所述可檢測物類接觸， 由此形成所述可檢測物類的固定的復(fù)合物；(c)將所述可檢測物類的所述固定的復(fù)合物與基本上所有未結(jié)合到所述可檢測物類的所述固定的復(fù)合物上的可檢測物類分離；(d)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測物類；和(e)檢測所述可檢測物類的所述單分子。
51.進行檢測與所述可檢測物類特異性結(jié)合到其上的分析物單分子相關(guān)聯(lián)的可檢測物類的測定的方法，所述方法包括(a)在所述分析物與特異性結(jié)合所述分析物的捕獲物類之間形成復(fù)合物，其中所述捕獲物類固定在磁性粒子上；和(b)在(a)之后，將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合到所述分析物上的所述可檢測物類接觸， 由此形成所述可檢測物類的固定的復(fù)合物；(c)將所述可檢測物類的所述固定的復(fù)合物與基本上所有未結(jié)合到所述可檢測物類的所述固定的復(fù)合物上的可檢測物類分離；(d)從所述固定的復(fù)合物中洗脫所述可檢測物類；和(e)檢測選自與所述可檢測物類的單分子對應(yīng)的光子、與多份所述可檢測物類對應(yīng)的事件光子、與多份所述可檢測物類對應(yīng)的總光子及其組合的一員。
52.權(quán)利要求1、50或51的方法，其中所述分析物在樣品體積內(nèi)，且所述可檢測物類洗脫至小于所述樣品體積的洗脫體積。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于分析、診斷或預(yù)后測定的物類的單分子分析。在示例性實施方案中，該測定利用公開方法所制備的樣品，提供具有出乎意料的靈敏度和魯棒性的測定。參考細胞因子測定以非限制性方式描述了該方法。
文檔編號G01N33/537GK102216778SQ200980146315
公開日2011年10月12日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月19日
發(fā)明者約翰·托德 申請人:神谷來克斯公司