專利名稱：一種香菇多糖分子量與分子量分布的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定方法，更具體地，本發(fā)明公開了一種多糖分子量和分子量分布的測定方法。
背景技術(shù)：
香菇多糖是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，它通過增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫防御反應(yīng)或改變機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)而產(chǎn)生機(jī)體或細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效果，發(fā)揮間接的抗腫瘤作用，被認(rèn)為是繼手術(shù)、放療和化療三大治療手段之后的第四種治療腫瘤的方法。研究其測定方法對于控制其質(zhì)量具有很重要的意義。
目前測定香菇多糖分子量與分子量分布的方法有激光光散射法和高效凝膠滲透色譜法-HPGPC法(以下均簡稱為HPGPC法)，在國家食品藥品監(jiān)督管理局生產(chǎn)批件YBH07782006所附標(biāo)準(zhǔn)檢測中香菇多糖分子量與分子量分布使用了HPGPC法。
在中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?3112908.0發(fā)明名稱為香菇多糖分子量與分子量分布測定方法的專利中公開了上述的HPGPC法，要求保護(hù)的是一種香菇多糖分子量及分子量分布測定方法，其特征在于采用高效凝膠滲透色譜法-HPGPC；HPGPC的流動相可以是超純水，0.1～0.5mol/L硝酸鈉，0.1～0.5mol/L醋酸鈉和磷酸鹽緩沖溶液；HPGPC的分析柱可以選用適合多糖的色譜柱，可以用一～四根，分離范圍為2,000,000～10,000道爾頓的色譜柱組成；HPGPC分析柱的柱溫可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以為0.1ml/min～1.0ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是Dextran或者Pullulan；繪制HPGPC普適校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為香菇多糖的分級分離產(chǎn)品。
將上述方法具體應(yīng)用于香菇多糖分子量及分子量分布測定有許多不足之處，首先所采用磷酸鹽緩沖液容易長菌，室溫下2天左右會變渾濁，有絮狀物產(chǎn)生，而該方法進(jìn)樣后收集時間較長，大約2小時，一次試驗(yàn)包括校正曲線、理論板數(shù)測定、樣品測定等經(jīng)常會持續(xù)2～3天；其次所采用磷酸鹽緩沖液濃度較大，在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-032)-2004Z和生產(chǎn)批件YBH07782006、YBH14462005所附標(biāo)準(zhǔn)中濃度均為0.2mol/L(背景技術(shù)發(fā)明中公開的最佳實(shí)施例)，經(jīng)常引起色譜系統(tǒng)壓力升高，終斷試驗(yàn)；而且在實(shí)驗(yàn)過程中必須嚴(yán)格控制柱溫，而由于目前凝膠色譜柱較長，控制柱溫需要特制的柱溫箱，才能得到理想的基線，此種柱溫箱不是一般液相色譜儀的標(biāo)準(zhǔn)配置，需訂購特制，增加了實(shí)驗(yàn)的成本。
因此，雖然上述的HPGPC法在實(shí)踐中可以使用，但仍需要更穩(wěn)定的方便應(yīng)用的測定香菇多糖分子量及分子量分布的HPGPC的方法。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的申請人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，改進(jìn)了流動相和色譜柱，使用檸檬酸三鈉和檸檬酸組成的緩沖液替代背景技術(shù)專利中公開的緩沖液，由于檸檬酸鹽緩沖液在濃度較低時(0.09mol/L)就可以達(dá)到較好的峰形，而且由于濃度低，不易引起色譜壓力升高而終斷實(shí)驗(yàn)，檸檬酸鹽還有一定的抗菌性.不易長菌，從而克服了背景技術(shù)專利中公開的緩沖液容易長菌，室溫下2天左右會變渾濁，有絮狀物產(chǎn)生且經(jīng)常引起色譜系統(tǒng)壓力升高，終斷試驗(yàn)的缺點(diǎn)；本發(fā)明的申請人使用5支色譜柱串聯(lián)，得到了更高的理論板數(shù)。本發(fā)明公開的方法不需柱溫箱控制柱溫，室溫下即可獲得理想的基線，增強(qiáng)了色譜系統(tǒng)的耐用性。另外，通過對多種流動相篩選，證明檸檬酸鹽緩沖液、草酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、Tris-磷酸緩沖液均可以作為流動相使用；解決流動相長菌還可以通過向流動相中加入小劑量防腐劑解決。
更具體地，本發(fā)明公開了一種利用HPGPC法測定香菇多糖分子量與分子量分布的方法，其特征在于色譜柱為五根或五根以上適合多糖的分離范圍為2,000,000～10,000道爾頓的色譜柱；流動相選用檸檬酸鹽緩沖液、草酸鹽緩沖液、Tris緩沖液(如Tris-鹽酸緩沖液或Tris-磷酸緩沖液)、酒石酸鹽緩沖液之一，其濃度范圍0.05mol/L～0.1mol/L；HPGPC的柱溫為室溫；流速為0.1ml/min～1ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的物質(zhì)用葡聚糖。
上述公開的方法，其中流動相為檸檬酸鹽緩沖液。
上述公開的方法，其中流動相檸檬酸鹽緩沖液為檸檬酸三鈉和檸檬酸的水溶液，其濃度為0.09mol/L，pH＝8。
上述公開的方法，其中流速為0.5ml/min。
上述公開的方法，其中香菇多糖用氫氧化鈉溶液完全溶解后，用鹽酸溶液調(diào)pH至7～8。
上述公開的方法，其中氫氧化鈉溶液的濃度為0.5mol/L，鹽酸溶液的濃度為0.5mol/L。
上述公開的方法，其中流動相中可以加入防腐劑，防腐劑可以是疊氮鈉、甲醇、乙腈之一。
上述公開的方法，其中防腐劑為疊氮鈉，上述公開的方法，其中疊氮鈉的用量為25mg/l。
利用本發(fā)明公開的方法，與背景技術(shù)專利中公開的方法進(jìn)行了比較，并進(jìn)行了室溫留樣實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)包括穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)及方法的可靠性考察，結(jié)果表明本發(fā)明公開的方法具有可靠性高、準(zhǔn)確性，同時具有更好的耐用性。
另外，需要說明的是，本發(fā)明中所言明的色譜柱為分離范圍為2,000,000～1,000道爾頓的色譜柱，常用的有TSK-GEL PW、SW、GMH、Alpha系列，JORDI聯(lián)合公司SEC系列，ZORBAX GF系列凝膠色譜柱，sephadex或agarose品牌凝膠色譜柱等，本發(fā)明中所言明的色譜柱為這些之一，最優(yōu)的是二支多糖專用凝膠預(yù)柱多糖專用凝膠預(yù)柱TSK-5000PW 7.5×10cm和三支多糖專用凝膠柱TSK-5000PW 7.5×300cm一起使用，對于利用一到四根超長柱(如果市售柱有單只更長的，稱超長柱)基本達(dá)到這五根凝膠柱聯(lián)用從而達(dá)到本發(fā)明的使用效果的方法，也在本發(fā)明公開的范圍之內(nèi)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖購自中國生物制品檢定所供試品香菇多糖石家莊精晶藥業(yè)有限公司，實(shí)施例中產(chǎn)品批號為精晶藥業(yè)有限公司產(chǎn)品批號。
儀器島津10AT型泵、島津10A型示差折光檢測器色譜軟件凝膠色譜工作站(北京龍智達(dá)公司)色譜柱三支多糖專用凝膠柱TSK-5000PW 7.5×300cm；二支多糖專用凝膠預(yù)柱多糖專用凝膠預(yù)柱TSK-5000PW 7.5×10cm。
實(shí)施例1香菇多糖分子量與分子量分布的測定流動相0.09mol/L檸檬酸鹽緩沖液流動相的配制0.09mol/L檸檬酸鹽緩沖液(精密稱取檸檬酸三鈉26.46和檸檬酸0.63g，溶于1000ml超純水中，抽濾，pH＝8)。
流速0.5ml/min示差折光檢測器溫度35℃柱溫室溫 進(jìn)樣量200ul供試品溶液制備取供試品2mg，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml使溶脹，研磨，溶解，再滴加0.5mol/L鹽酸溶液至pH試紙呈7～8，加水至2.0ml，搖勻，過濾。
標(biāo)準(zhǔn)曲線取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)200萬、13.38萬、8.44萬、4.11萬、2.14萬、1.00萬，分別用流動相配置為1.0mg/ml的溶液。注入液相色譜儀，記錄色譜圖，輸入各標(biāo)準(zhǔn)的重均分子量及k、α值(葡聚糖的k＝0.580，α＝0.338)，采用GCP專用軟件建立工作曲線。
理論板數(shù)按葡萄糖(0.1％葡萄糖的水溶液)峰計算，應(yīng)不小于2000；香菇多糖的分配系數(shù)(Kd)應(yīng)為0-1之間。標(biāo)樣為已知分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)，重均分子量為10000-2000000的系列組分組成(共6個)，分別用流動相配制成1mg/ml溶液，過濾，取200μl進(jìn)樣。
取供試品溶液200ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，輸入香菇多糖的k、α值(香菇多糖的k＝0.0539，α＝0.607)。采用GCP專用軟件處理，計算。
香菇多糖重均分子量(Mw)為40萬～80萬道爾頓，大于2萬道爾頓的組分大于等于90％。
與背景技術(shù)中專利公開的測定方法(簡稱原方法)進(jìn)行相同批次樣品的測定
取050601、060601、060602、060603樣品，分別以上述方法和批件YBH07782006所附標(biāo)準(zhǔn)方法檢測檢查分子量和分子量分布，結(jié)果見表1。表中Mw、M90是龍智達(dá)GPC軟件計算得到兩個指標(biāo)，Mw含義為供試品重均分子量，M90含義為供試品中分子量大于M90的部分占90％。根據(jù)測定法中要求，Mw在40萬～80萬之間，M90大于2萬，即可判定符合規(guī)定(以下均同)。
表1兩種方法分子量分布檢查結(jié)果對照

四批樣品分子量分布檢測結(jié)果均符合規(guī)定。兩種方法結(jié)果差異很小。
室溫留樣試驗(yàn)試驗(yàn)方法將060601、060602、060603香菇多糖原料藥，置于室溫環(huán)境中放置，分別在0、3個月取樣，檢測樣品穩(wěn)定性。
試驗(yàn)結(jié)果香菇多糖原料藥留樣結(jié)果表明(見表2)，在室溫條件下放置3個月后，分子量與分子量分布無明顯變化，與原方法得到的結(jié)論一致。按照GMP要求，此留樣檢查還在進(jìn)行中。
表2室溫留樣穩(wěn)定性結(jié)果

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)理論板數(shù)以葡萄糖峰計算理論板數(shù)為9282，符合系統(tǒng)適用性要求。用國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-032)-2004Z或原專利中最佳實(shí)施例(0.2mol/L磷酸鹽緩沖液)的方法，同樣色譜柱和色譜儀條件下，測定葡萄糖峰計算理論板數(shù)為8957，本發(fā)明中公開的方法在緩沖液濃度降低為0.09mol/L后，理論板數(shù)仍略高。本發(fā)明申請人利用背景技術(shù)中公開的專利，采用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液對同一批樣品進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明不能達(dá)到理想的理論板數(shù)，達(dá)不到本發(fā)明的效果。
溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在室溫放置24小時，測定重均分子量穩(wěn)定，M90略有下降，結(jié)果見表3表3溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

精密度實(shí)驗(yàn)對供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣六次，經(jīng)GPC軟件計算，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精密度較好。結(jié)果見表4。
表4精密度試驗(yàn)結(jié)果表

注本實(shí)施例的流動相在室溫下放置3～5日沒有長菌。
實(shí)施例2香菇多糖分子量與分子量分布的測定流動相0.09mol/L檸檬酸鹽緩沖液，加入少量疊氮鈉(每1000ml中加入25mg)流動相的配制精密稱取檸檬酸三鈉26.46和檸檬酸0.63g，疊氮鈉25mg溶于1000ml超純水中，抽濾，pH＝8。
流速0.5ml/min 示差折光檢測器溫度35℃柱溫室溫 進(jìn)樣量200ul供試品溶液制備取供試品2mg，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml使溶脹，研磨，溶解，再滴加0.5mol/L鹽酸溶液至pH試紙呈7～8，加水至2.0ml，搖勻，過濾。
標(biāo)準(zhǔn)曲線取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)200萬、13.38萬、8.44萬、4.11萬、2.14萬、1.00萬，分別用流動相配置為1.0mg/ml的溶液。注入液相色譜儀，記錄色譜圖，輸入各標(biāo)準(zhǔn)的重均分子量及k、α值(葡聚糖的k＝0.580，α＝0.338)，采用GCP專用軟件建立工作曲線。
理論板數(shù)按葡萄糖(0.1％葡萄糖的水溶液)峰計算，應(yīng)不小于2000；香菇多糖的分配系數(shù)(Kd)應(yīng)為0-1之間。標(biāo)樣為已知分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)，重均分子量為10000-2000000的系列組分組成(共6個)，分別用流動相配制成1mg/ml溶液，過濾，取200μl進(jìn)樣。
取供試品溶液200ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，輸入香菇多糖的k、α值(香菇多糖的k＝0.0539，α＝0.607)。采用GCP專用軟件處理，計算。
香菇多糖重均分子量(Mw)為40萬～80萬道爾頓，大于2萬道爾頓的組分大于等于90％。
理論板數(shù)以葡萄糖峰計算理論板數(shù)為8643，符合系統(tǒng)適用性要求。
供試品測定取050601、060601、060602、060603樣品，以上述方法檢查分子量和分子量分布，結(jié)果見表5。
表5分子量分布檢查結(jié)果

注本實(shí)施例中的流動相可以室溫下連續(xù)使用10日以上，不長菌，系統(tǒng)壓力不升高。
實(shí)施例3同實(shí)施例2，只是緩沖液的濃度改為0.05mol/L，防腐劑改為乙腈，乙腈的加入量為1％。
分子量分布檢查結(jié)果與實(shí)施例2接近，理論板數(shù)稍有下降。
以葡萄糖峰計算理論板數(shù)為4125，符合系統(tǒng)適用性要求。
供試品060601批分子量和分子量分布結(jié)果如下Mw＝511073，M90＝52784。
權(quán)利要求
1.一種利用HPGPC法測定香菇多糖分子量與分子量分布的方法，其特征在于色譜柱采用五根或五根以上適合多糖的分離范圍為2,000,000～10,000道爾頓的色譜柱組成；流動相選用檸檬酸鹽緩沖液、草酸鹽緩沖液、Tris緩沖液如Tris-鹽酸緩沖液或Tris-磷酸緩沖液、酒石酸鹽緩沖液之一，其濃度范圍為0.05mol/L～0.1mol/L；HPGPC的柱溫為室溫；流速為0.1ml/min～1ml/min；繪制HPGPC相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的物質(zhì)用葡聚糖。
2.權(quán)利要求1公開的方法，其中流動相為檸檬酸鹽緩沖液。
3.權(quán)利要求2公開的方法，其中檸檬酸鹽緩沖液為檸檬酸三鈉和檸檬酸的水溶液，其濃度為0.09mol/L，pH＝8。
4.權(quán)利要求1公開的方法，其中流速為0.5ml/min。
5.權(quán)利要求1公開的方法，其中香菇多糖用氫氧化鈉溶液完全溶解后，用鹽酸溶液調(diào)pH至7～8。
6.權(quán)利要求5公開的方法，，其中氫氧化鈉溶液的濃度為0.5mol/L，鹽酸溶液的濃度為0.5mol/L。
7.權(quán)利要求1公開的方法，其中流動相中可以加入防腐劑，防腐劑可以為疊氮鈉、甲醇、乙腈之一。
8.權(quán)利要求7公開的方法，其中防腐劑是疊氮鈉。
9.權(quán)利要求8公開的方法，其中疊氮鈉的用量為25mg/l。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香菇多糖分子量與分子量分布的測定方法，此方法利用較低濃度的緩沖液作為流動相，利用五根色譜柱進(jìn)行測定，克服了原有方法系統(tǒng)壓力高、需要恒定柱溫等缺點(diǎn)。
文檔編號G01N30/26GK1945313SQ20061013785
公開日2007年4月11日 申請日期2006年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月7日
發(fā)明者王冕 申請人:王冕