專利名稱：用于分析液相和固相之間的生物反應(yīng)的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及(例如)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷中用于進(jìn)行免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞
化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析的專用方法和裝置，其中，
將結(jié)合于固相的反應(yīng)配偶子(reaction partner)和溶解在液體中的反應(yīng)物一起溫育。為此，將固相底物設(shè)置在目標(biāo)物保持件(object holder)的長(zhǎng)形的附著表面上，并且使該固相底物與試劑保持件的通道(其與所述附著表面準(zhǔn)確地相對(duì))中的液體接觸，特定的實(shí)施方案包括強(qiáng)制使溶解于所述液體中的反應(yīng)配偶子實(shí)現(xiàn)紊流對(duì)流，以使反應(yīng)物在溫育的過程中混合；與可通過現(xiàn)有技術(shù)獲得的效果相比，通過本發(fā)明，反應(yīng)進(jìn)行更加迅速，信號(hào)變得更強(qiáng)并且各個(gè)底物的反應(yīng)性在整個(gè)表面上變得更加均勻。當(dāng)彼此并排分析多個(gè)樣品時(shí)，所述設(shè)置方式防止了在溫育的過程中相鄰樣品液彼此混合。在溫育結(jié)束時(shí)，將目標(biāo)物保持件與試劑保持件分開并評(píng)價(jià)結(jié)果。應(yīng)用本發(fā)明的例子為通過間接免疫熒光法或免疫印跡法來(lái)測(cè)定懷疑患有自身免疫性或傳染性疾病和過敏癥的患者的血清中的抗體，以及借助于微陣列對(duì)患者樣品進(jìn)行基因分型。
背景技術(shù)：
針對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域，通過醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷的例子——用于檢測(cè)患者血清中的抗體的"間接免疫熒光試驗(yàn)"(參見圖1)來(lái)說(shuō)明背景技術(shù)。使待分析的血清或其稀釋液與底物接觸并且溫育特定長(zhǎng)的時(shí)間，所述底物與目標(biāo)物保持件牢固相連，并且包括與待測(cè)定的抗體相對(duì)應(yīng)的抗原。有用的底物包括下列物質(zhì)和諸如此類的物質(zhì)生物組織的薄切片、細(xì)菌涂片、細(xì)胞、或者以溶液形式、干燥形式、或偶聯(lián)形式施用的抗原滴(antigendrop)。在陽(yáng)性樣品的情況下，患者血清的特異性抗體立即與底物的相應(yīng)的抗原結(jié)合，例如與組織切片的細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。特別是，在患有紅斑狼瘡病的患者中確定抗DNA抗體的存在。 在第一溫育步驟后，使用緩沖液將過量的未結(jié)合的抗體洗掉。立即將底物進(jìn)行第二次溫育，這次是和熒光素標(biāo)記的針對(duì)人免疫球蛋白的抗人抗體(例如，其是通過使用人免疫球蛋白免疫山羊來(lái)獲得的) 一起進(jìn)行溫育。在陽(yáng)性的情況下，在第二步驟中，標(biāo)記的抗體與患者血清中的已經(jīng)結(jié)合的抗體結(jié)合。在進(jìn)一步的洗滌步驟中，過量的未結(jié)合的抗體再次被除去。此后，滴加封固劑，加載蓋玻片，并且使用熒光顯微鏡檢查準(zhǔn)備好的溫育過的底物。在陽(yáng)性樣品的情況下，當(dāng)在顯微鏡下使用波長(zhǎng)為約488納米的(藍(lán))光照射底物的細(xì)胞核時(shí)，它們發(fā)出綠色熒光。在陰性結(jié)果的情況下，細(xì)胞核保持黑暗。蓋玻片產(chǎn)生了平行于底物并且平坦地位于所述底物上的光滑表面，這對(duì)于產(chǎn)生完美的圖像而言是必需的，并且這還防止了顯微鏡透鏡接觸底物。封固劑填充底物和蓋玻片之間的空間，由此確保無(wú)散射的光路；封固劑含有這樣的物質(zhì)，該物質(zhì)用于削弱對(duì)熒光的漂白作用；封固劑的PH被設(shè)定為產(chǎn)生最大的熒光效率。 世界上每年為了分析數(shù)百萬(wàn)患者血清中的自身抗體或傳染性抗體而在實(shí)驗(yàn)室診斷中使用間接免疫熒光法。為了更好地管理試驗(yàn)的數(shù)量，人們嘗試將各操作順序結(jié)合并使過程自動(dòng)化。因此，根據(jù)常規(guī)的現(xiàn)有技術(shù)，診斷實(shí)驗(yàn)室中采用具有多個(gè)反應(yīng)區(qū)域的目標(biāo)物保持件來(lái)對(duì)數(shù)位患者進(jìn)行平行測(cè)試。如果處理不小心，則該合理化步驟蘊(yùn)藏著下列風(fēng)險(xiǎn)彼此相鄰設(shè)置的血清混合，因而目標(biāo)物保持件上的相鄰位置的血清的診斷結(jié)果被錯(cuò)誤地發(fā)給某些患者。 1979年以前本應(yīng)用領(lǐng)域中的分析技術(shù)的狀態(tài)在專利文獻(xiàn)EP 00184351中有所描述。該文獻(xiàn)還公開了一種用于間接免疫熒光的新的溫育方法，其中，患者血清和試劑不是像此前的常規(guī)方法那樣直接滴加到目標(biāo)物保持件，而是滴加到平坦的試劑保持件的多個(gè)親水性反應(yīng)區(qū)域，該親水性反應(yīng)區(qū)域的周圍環(huán)境是疏水性的。目標(biāo)物保持件在同樣的多個(gè)親水性反應(yīng)區(qū)域上均含有底物，并且所述底物位于試劑保持件上方的規(guī)定的距離處，從而使得底物浸入與之相關(guān)的液滴中，這樣，一個(gè)目標(biāo)物保持件的所有區(qū)域同時(shí)開始反應(yīng)。每個(gè)目標(biāo)物保持件可測(cè)試的血清稀釋液的數(shù)量對(duì)應(yīng)于其反應(yīng)區(qū)域的數(shù)量。這種技術(shù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是液滴不會(huì)再輕易地彼此混合。液滴的高度是固定不變的，在將目標(biāo)物保持件置于預(yù)先移液的液滴上的同時(shí)，反應(yīng)開始；結(jié)果，不同的測(cè)試所經(jīng)歷的反應(yīng)之間具有更好的可比性。蒸發(fā)被延遲了，而且不利的非特異性有色沉積物在底物中的聚集水平大大降低了，原因在于它們?cè)跍赜^程是沿相反方向沉積的。 同時(shí)，通過特異性片段技術(shù)(specific fragmenting technique)，間接免疫熒光法已經(jīng)得到了進(jìn)一步發(fā)展(參見專利文獻(xiàn)EP 0117262)2，在該專利文獻(xiàn)中，底物(例如冷凍切片、接種細(xì)胞或細(xì)胞涂片、偶聯(lián)分離的抗原等)并不是直接施加到目標(biāo)物保持件，而是首先施加到厚度(例如)為O. 15mm的薄的載玻片。此后，這些載玻片和粘附于其上的底物一起被分為任意尺寸的片段(生物芯片)，并且僅僅將這些片段(例如)通過粘附結(jié)合而固定到目標(biāo)物保持件上。與制備許多小的組織切片、然后直接將它們?cè)O(shè)置在目標(biāo)物保持件上的方式相比，制備稍大一些的組織切片、然后將其分為小的生物芯片這種方式明顯更加容易也更快，因此片段技術(shù)特別適用于底物的大規(guī)模生產(chǎn)。對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物底物或細(xì)胞涂片、或者對(duì)于覆蓋有規(guī)定的抗原的表面而言，生產(chǎn)率的提高甚至變得更加明顯。另外，可以從不同底物構(gòu)成任意程度的嵌合體(mosaics)，從而使得使用同一滴血清稀釋液或試劑溶液就可以測(cè)試多種抗體譜3'4'5。目前世界上正在使用該方法?；旧献詣?dòng)制造這種目標(biāo)物保持件的裝置和方法在歐洲專利申請(qǐng)PCT/EP/2005/000974(2005)6中有所描述。
現(xiàn)有技術(shù)所具有的主要缺陷在于在溫育過程中無(wú)法確保在液相中實(shí)現(xiàn)有效持久的對(duì)流。樣品或試劑液直接與含有抗原的結(jié)構(gòu)接觸。相應(yīng)的抗體與目標(biāo)抗原相結(jié)合，并且它們?cè)诰o鄰抗原的環(huán)境中的濃度降低，而在距離1毫米或2毫米遠(yuǎn)的地方仍然存在高的抗體濃度。僅靠擴(kuò)散作用無(wú)法消除測(cè)試過程中的梯度，因而，在此引用的專利文獻(xiàn)EP 0018435中提出的用于產(chǎn)生對(duì)流的方案(目標(biāo)物保持件和試劑保持件之間的距離周期性地變化，以使保持于兩者之間的圓形液滴變形)無(wú)疑是十分有效的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是找到一種在(例如)用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷的免疫學(xué)分析、組織化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析中將結(jié)合于固相的反應(yīng)配偶子和溶解于液體中的反應(yīng)物一起溫育的方式，其中，所述液體以這樣的方式被提供給所述固相使所述液體不能從側(cè)面流掉，并且使相鄰樣品在溫育過程或洗滌循環(huán)過程中不會(huì)彼
5此接觸，而且為了在溫育過程中使反應(yīng)物混合或者為了有效地洗滌，能夠在液體中強(qiáng)制實(shí)現(xiàn)紊流對(duì)流或強(qiáng)對(duì)流。 所述目的通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置和根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的實(shí)施方案形成各從屬權(quán)利要求的主題。 據(jù)設(shè)計(jì)，用于進(jìn)行免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析的裝置包括具有一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)形的附著表面(例如為條帶形)的目標(biāo)物保持件；和具有一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)形的通道的試劑保持件。目標(biāo)物保持件能夠與試劑保持件可拆卸式連接，使得每個(gè)所述的長(zhǎng)形的附著表面分別面向一個(gè)所述的通道或者被設(shè)置成與一個(gè)所述的通道相對(duì)、并且平行或基本上平行于該通道延伸，并且，當(dāng)與固相結(jié)合的反應(yīng)配偶子被設(shè)置在長(zhǎng)形的附著表面上、且溶解于液體中的反應(yīng)物存在于通道中時(shí)，反應(yīng)配偶子和反應(yīng)物接觸。設(shè)置有用于防止所述液體由一個(gè)通道流到相鄰?fù)ǖ赖臋C(jī)構(gòu)。優(yōu)選的是，目標(biāo)物保持件和試劑保持件具有這樣的機(jī)構(gòu)，該機(jī)構(gòu)可以使目標(biāo)物保持件和試劑保持件在連接狀態(tài)下相對(duì)于對(duì)方處于規(guī)定的位置處，即，建立規(guī)定的橫向位置和/或規(guī)定的距離。例如，這種機(jī)構(gòu)可以是凸起和凹陷、封閉或鎖定元件、和/或連接彼此的接合結(jié)構(gòu)。此外，當(dāng)目標(biāo)物保持件和/或試劑保持件具有可以導(dǎo)致可拆卸式連接的機(jī)構(gòu)時(shí)可能是有利的。 通過防止液體在分析過程中在通道之間穿行，可有利地在一個(gè)目標(biāo)物保持件上同時(shí)分析位于不同通道中的彼此相鄰的數(shù)個(gè)樣品，而不會(huì)產(chǎn)生任何在溫育過程中相鄰的樣品液彼此混合的風(fēng)險(xiǎn)。 附著表面可以以這樣的方式被設(shè)置在目標(biāo)物保持件的表面上使附著表面與目標(biāo)物保持件的表面在同一平面，或者使附著表面與目標(biāo)物保持件的表面齊平。可供選擇的是，可在相鄰的附著表面之間設(shè)置從附著表面縱向上的一端平行延伸至另一端的凹槽、長(zhǎng)形的凹陷或臺(tái)階。這以有利的方式獲得了下列效果各附著表面彼此彌補(bǔ)(Offset)或形成對(duì)照，并且分別設(shè)置在專用的、分開的、長(zhǎng)形的凸起上，即(例如)有效地突出設(shè)置在目標(biāo)物保持件的表面上。 優(yōu)選的是，試劑保持件的通道沿設(shè)置于試劑保持件表面上的長(zhǎng)形的凸起延伸，其中相鄰?fù)ǖ赖耐蛊鸨舜朔珠_。例如，可通過位于通道之間并且從通道縱向上的一端至另一端平行于通道延伸的凹陷、或者通過特定的臺(tái)階狀輪廓而使各凸起偏移或分開，由此使通道偏移或分開。 在優(yōu)選的構(gòu)造中，通道的側(cè)面邊緣或邊界在頂部是漸縮的，或者設(shè)置有陡沿，這樣，在目標(biāo)物保持件和試劑保持件連接的狀態(tài)下，能夠防止液體從通道的側(cè)面溢出。例如，借助于所述漸縮的邊緣或邊界，由于目標(biāo)物保持件與附著表面間的距離較小，使得液體被保持在預(yù)期的位置，由此，可通過液體上面和下面的粘附力而防止液體自側(cè)面溢出。這實(shí)際上是一種"兩側(cè)具有狹縫的毛細(xì)管"，空氣可以從側(cè)面溢出而液體不會(huì)。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通道的內(nèi)表面設(shè)置有用于在所述通道內(nèi)沿縱向引導(dǎo)或引領(lǐng)所述液體的圖案或輪廓。這種圖案或輪廓可包括(例如)沿縱向在通道的底部延伸的凹槽。
優(yōu)選的是，為了提高儲(chǔ)液功能并且出于防漏的目的，所述試劑保持件的所述通道在長(zhǎng)度上延伸超出所述目標(biāo)物保持件的所述附著表面的縱向上的端部。換句話說(shuō)，通道比附著表面長(zhǎng)，這樣，在目標(biāo)物保持件和試劑保持件連接的狀態(tài)下，通道在附著表面的一端或優(yōu)選在兩端都超出該附著表面。就此而言，為了形成容納過量液體的杯形貯液器，在所述通道的這些延伸超出所述附著表面的部分中，使該通道的邊緣或邊界相對(duì)于該通道的剩余部分而向上延伸或提高可以是特別有利的。 為了可以更容易地將液體引入通道，試劑保持件的通道可有利地為親水化的。為此，優(yōu)選將不干擾后續(xù)反應(yīng)的親水性物質(zhì)加入通道中。 在優(yōu)選的構(gòu)造中，在所述目標(biāo)物保持件的各個(gè)附著表面周圍設(shè)置環(huán)形邊沿，所述
環(huán)形邊沿相對(duì)于所述附著表面凸出。該邊沿可以是附著表面的一部分，并且形成附著表面
的邊沿，或者可以設(shè)置在附著表面的外側(cè)。以下情況是有利的邊沿所具有的尺寸使得該邊
沿凸出超過其上結(jié)合有反應(yīng)配偶子的固相底物，其中所述反應(yīng)配偶子針對(duì)的是溶解于通道
液體中并且將被固定到用于分析的附著表面上的反應(yīng)物；優(yōu)選僅僅凸出較小的程度，使得
在稍后通過將蓋玻片置于目標(biāo)物保持件上而進(jìn)行評(píng)價(jià)的過程中，沒有直接的機(jī)械壓力施加
在固相底物上。而且，在任何情況下，所述邊沿都會(huì)防止封固劑不利的泄漏。目標(biāo)物保持件和試劑保持件優(yōu)選被構(gòu)造為使得在目標(biāo)物保持件和試劑保持件連
接的狀態(tài)下，附著表面浸入通道中，并且其在接觸區(qū)域中位于通道邊緣或邊界的高度處，或
者位于通道邊緣或邊界以上，而且在與附著表面接觸前或接觸過程中，通道中的液體突出
于通道邊緣或邊界或者形成超出通道邊緣或邊界的圓頂。 為了可靠地在顯微鏡觀察中鑒定目標(biāo)物保持件，并且為了在溫育開始時(shí)可靠地分配試劑保持件，目標(biāo)物保持件和試劑保持件可有利地設(shè)置有機(jī)器可讀取的代碼。
在有利的構(gòu)造中，在通道的表面或內(nèi)表面上設(shè)置阻礙物或障礙物。如下文所述，處于連接狀態(tài)的目標(biāo)物保持件和試劑保持件在分析或溫育過程中優(yōu)選以這樣的方式移動(dòng)使通道中的液體沿通道的縱向交替地來(lái)回移動(dòng)。在所述液體這樣移動(dòng)時(shí)，該液體會(huì)從阻礙物或障礙物上流過，在這些擾動(dòng)處，液體中會(huì)形成旋渦或漩渦，這確保了液體更好地混合。
在分析過程中，結(jié)合有反應(yīng)配偶子(其針對(duì)溶解于通道液體中的反應(yīng)物)的固相底物或固相優(yōu)選被設(shè)置在附著表面上。這些固相底物可在制備目標(biāo)物保持件的過程中設(shè)置，或者直到即將進(jìn)行分析之前才設(shè)置。固相底物優(yōu)選包括選自下列物質(zhì)中的生物材料a)生物組織的薄切片；b)細(xì)胞培養(yǎng)物或聯(lián)合細(xì)胞結(jié)構(gòu)(united cell structure)的細(xì)胞涂片；C)細(xì)菌涂片；d)病毒、原生動(dòng)物和寄生蟲；e)以溶液形式、干燥形式、或偶聯(lián)形式施用的抗原滴；f)與表面偶聯(lián)的其他抗原；和/或g)任意的核苷酸序列。 這種裝置可有利地用在用于進(jìn)行免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析的方法中，其中目標(biāo)物保持件與試劑保持件以上述方式連接，使得每個(gè)所述長(zhǎng)形的附著表面分別面向一個(gè)通道或被設(shè)置成與一個(gè)通道相對(duì)，其中溶解有反應(yīng)物的液體被引入所述通道，使得結(jié)合有反應(yīng)配偶子并設(shè)置在所述附著表面上的固相底物接觸所述液體，并且使所述目標(biāo)物保持件和所述試劑保持件一起移動(dòng)，其移動(dòng)的方式為使所述液體交替地沿所述通道的兩個(gè)縱向方向移動(dòng)。在將反應(yīng)配偶子和反應(yīng)物以這種方式溫育后，隨后分析或評(píng)價(jià)它們之間是否發(fā)生了反應(yīng)，如果反應(yīng)，反應(yīng)到何種程度。 優(yōu)選這樣進(jìn)行移動(dòng)、或者目標(biāo)物保持件和試劑保持件優(yōu)選被構(gòu)造為這樣使得在通道中，反應(yīng)過程中的分析制劑液體和洗滌循環(huán)過程中的洗滌液沿切線方向通過或流過附著表面的下方。
在所述方法的優(yōu)選構(gòu)造中，通過以下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)上文所述的移動(dòng)過程中所進(jìn)行的各個(gè)單獨(dú)的分析制劑(即一個(gè)通道中的液體)的連續(xù)混合，所述方式為使試劑保持件和位于其上的目標(biāo)物保持件一起周期性地轉(zhuǎn)動(dòng)，使得通道的縱向方向充分離開水平面而達(dá)到使液體沿通道的縱向在(例如)通道的兩端之間來(lái)回流動(dòng)的程度。 優(yōu)選的是，在上述移動(dòng)中，借助于在每次從試劑保持件通道的縱向上的一端移動(dòng)到另一端這樣的半個(gè)循環(huán)中所移動(dòng)的液體的體積大于附著表面下的液體的體積，而實(shí)現(xiàn)各通道中的液體的混合——優(yōu)選連續(xù)和完全的混合。這樣，在各個(gè)通道的兩端處的液體都參與了混合或持久交換過程。 此外有利的是，通過限定通道深度來(lái)使通道的容積與具體的分析操作所需的體積相匹配或相適合。 在所述方法的情況中，可以以有利的方式針對(duì)每種分析制劑使用一種固相底物
(單獨(dú)測(cè)試)，或者針對(duì)每種分析制劑使用多種固相底物(嵌合體測(cè)試)。 所述方法可用于在自身免疫性或傳染性疾病、過敏癥和腫瘤的診斷中測(cè)定抗體，
所述抗體可優(yōu)選為a)自身抗體；b)針對(duì)傳染病原體(細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、酵母菌和寄
生蟲)的抗體；C)免疫球蛋白類IgE和IgG的過敏原_特異性抗體；d)針對(duì)腫瘤抗原的抗體。 所述抗體可有利地通過下列技術(shù)來(lái)檢測(cè)a)直接或間接免疫熒光技術(shù)；b)免疫印跡技術(shù)，包括使用基于印跡膜的微陣列；或c)發(fā)光技術(shù)。 另外，借助于微陣列，在使用本發(fā)明的條件下，所述方法可以以有利的方式用于對(duì)患者樣品或其他樣品進(jìn)行基因分型。 所述方法可以優(yōu)選為自動(dòng)或半自動(dòng)地進(jìn)行。在該情況下，優(yōu)選的是，a)將預(yù)定測(cè)試個(gè)數(shù)的試劑保持件置于回轉(zhuǎn)工作臺(tái)上的規(guī)定位置處，b)按照分析操作，根據(jù)溫育方案，將相應(yīng)類型和數(shù)量的目標(biāo)物保持件置于所述試劑保持件上，c)制備合適的樣品稀釋液并將其引入試劑保持件的預(yù)定通道中，d)根據(jù)所述的方案，實(shí)施一個(gè)或多個(gè)溫育步驟，在該過程中，回轉(zhuǎn)工作臺(tái)被設(shè)定為運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)，從而使各個(gè)制劑產(chǎn)生有效的混合，e)在各個(gè)溫育步驟之間插入洗滌循環(huán)，在洗滌過程中，洗滌液被引入到通道的一側(cè)上并在另一側(cè)被吸出，在此過程中，無(wú)需從試劑保持件上移開目標(biāo)物保持件，以及f)相應(yīng)地評(píng)價(jià)特定試驗(yàn)變量的結(jié)果。本發(fā)明的裝置優(yōu)選與自動(dòng)或半自動(dòng)用途相適應(yīng)。


下面將參照附圖對(duì)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。 圖1是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)患者血清中的抗體的"間接免疫熒光試驗(yàn)"的示意圖。 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物保持件和試劑保持件的示例性實(shí)施方案。 圖3示出了根據(jù)圖2的示例性實(shí)施方案的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物保持件和試劑保持件的另外的示例性實(shí)施方案。 圖5示出了根據(jù)本發(fā)明的試劑保持件的另外的示例性實(shí)施方案。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供具有一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)形的附著表面(2)的目標(biāo)物保持件(1)，固相底物(3)被固定到所述目標(biāo)物保持件。每個(gè)附著表面(1)可與目標(biāo)物保持件的表面位于同一平面，或者在本發(fā)明的優(yōu)選方案中是凸出的，并且通過凹槽(4)與相鄰附著表面分開，所述凹槽(4)從附著表面縱向上的一端平行延伸至另一端，以將相鄰的反應(yīng)制劑彼此區(qū)分開。為了溫育，將目標(biāo)物保持件以附著表面面向下方的方式置于具有長(zhǎng)形通道(6)的試劑保持件(5)上，并將它們臨時(shí)結(jié)合在一起而形成"組件"。通道在準(zhǔn)確限定的位置處對(duì)著目標(biāo)物保持件的附著表面，并在指定的時(shí)刻填充樣品液或液體試劑。它們向上凸起(在特定的實(shí)施方案中為臺(tái)階的形式)并且按特定的輪廓向兩側(cè)偏移。例如，除了通道以外，試劑保持件可具有凹陷(7)，所述凹陷(7)從縱向上的一端平行延伸至另一端，以將相鄰的反應(yīng)制劑彼此區(qū)分開。通道中的液體向著目標(biāo)物保持件的附著表面隆起，從而形成"兩側(cè)具有狹縫的毛細(xì)管"，空氣可從中溢出，但是液體由于其上面和下面的的粘附力而保留在預(yù)期的位置處。為了防止液體溢出到兩側(cè)，通道的邊緣或邊界可在頂部是漸縮的，或者可設(shè)置有陡沿。在特定的實(shí)施方案中，液體可從通道的突出部流到附著表面的縱向端部的毛細(xì)管中，或者使液體自該處流出。 可以在通道填充液體前，就將目標(biāo)物保持件置于被設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行溫育的位置處，或者可以在已經(jīng)將液體引入通道后，才將目標(biāo)物保持件置于通道上；在這種情況下，當(dāng)目標(biāo)物保持件置于通道上時(shí)，所有的反應(yīng)同時(shí)開始。各組件的幾何形狀是相適應(yīng)的，從而使得固相底物與通道所容納的液體接觸。在一些實(shí)施方案中，為了該目的，將附著區(qū)域浸入通道中；在其他實(shí)施方案中，附著區(qū)域在通道邊界的高度處；此外在其他實(shí)施方案中，附著區(qū)域的位置更高，并且所述液體在通道邊界的上方形成圓頂。根據(jù)特定分析所需要的體積，制備具有不同通道深度的試劑保持件。同樣，可以使附著表面和通道的寬度適應(yīng)所述要求。
這時(shí)，由目標(biāo)物保持件和試劑保持件構(gòu)成的組合結(jié)構(gòu)(組件)可以以這樣的方式通過任意頻率的秋千或搖擺運(yùn)動(dòng)來(lái)有節(jié)奏地傾斜，所述方式為使液體從附著表面和通道的縱向上的一端流向另一端，然后再流回來(lái)。在溫育結(jié)束時(shí)，將目標(biāo)物保持件與試劑保持件分開，并對(duì)反應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在間接免疫熒光試驗(yàn)的情況下，使封固劑與附著表面上的抗原底物接觸，每個(gè)目標(biāo)物保持件上放置一個(gè)蓋玻片，然后在顯微鏡下觀察。 各附著表面可具有沿周向延伸的邊沿(8)，其僅僅稍微突出超過底物，但是滿足三個(gè)重要的功能首先，所述邊沿有利于具有底物的玻璃片段(生物芯片)的定位，所述玻璃片段(例如)在粘附結(jié)合的過程中不會(huì)再輕易地滑動(dòng)。其次，所述邊沿保護(hù)底物使最后放置的蓋玻片與組織切片或細(xì)胞保持較小的規(guī)定距離，因此可以使它們受損的程度更低，這種受損在蓋玻片直接與覆蓋有封固劑的生物材料鄰接的常規(guī)技術(shù)中是常見的情況。第三，封固劑牢固地保持在附著表面和蓋玻片之間，并且不能漏出底物不會(huì)變干(變干會(huì)使它們不能使用)，并且顯微鏡的機(jī)械臺(tái)不會(huì)受到污染。環(huán)形邊沿(8)僅使蓋玻片升高這樣的程度所述程度不會(huì)超過標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡透鏡從前透鏡到組織切片或細(xì)胞所處平面之間的工作距離。目標(biāo)物保持件的表面可設(shè)置有凹陷(凹陷的外邊緣9)，可以將蓋玻片固定在所述凹陷中，從而使其在顯微鏡觀察的過程中不會(huì)滑到側(cè)面。 與已經(jīng)引用的專利文獻(xiàn)EP 0018435(其中，為了將液體相對(duì)于固相底物進(jìn)行定位，目標(biāo)物保持件和試劑保持件都需要位于疏水性環(huán)境中的親水性區(qū)域)相比，本發(fā)明不需要目標(biāo)物保持件或試劑保持件的親水性/疏水性涂層。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了可以更容易地引入液體，使試劑保持件的通道親水化是有用的；例如，這可通過噴射施加親水性物質(zhì)(其不干擾稍后的反應(yīng))來(lái)實(shí)現(xiàn)，可任選的是，可以允許所述親水性物質(zhì)部分干燥。為了 在使用樣品液或試劑填充的過程中以及在秋千或搖擺操作的過程中有利地影響流動(dòng)行為， 所述通道可裝配有合適的輪廓或圖案以引導(dǎo)液體，例如在通道的底部有一個(gè)或多個(gè)溝槽 (10)。為了促進(jìn)對(duì)流并由此加速混合操作，在通道的表面中還可設(shè)置阻礙物或障礙物，當(dāng)液 體從其上方流過時(shí)會(huì)形成阻礙物湍流或障礙物湍流。 所述通道優(yōu)選在縱向兩端具有用于液體的貯液器——例如它們被構(gòu)造為比目標(biāo) 物保持件的附著表面長(zhǎng)的貯液器(11)。于是，在秋千或搖擺運(yùn)動(dòng)過程中，液體流動(dòng)超出附 著表面的端部(12)，并且在整個(gè)溫育過程中所需要的樣品的混合甚至變得更加有效，特別 是當(dāng)通道在凸出超過目標(biāo)物保持件兩端的部分中的液體體積在每一側(cè)都被設(shè)計(jì)成大于在 附著表面的區(qū)域中的所述兩部分之間的體積時(shí)更是如此。通道的凸出部分還起到容納過量 液體的貯液器的作用，以保護(hù)系統(tǒng)免受由于移液不準(zhǔn)而導(dǎo)致的故障。此外，在將目標(biāo)物保持 件置于試劑保持件上的同時(shí)，在該位置處將樣品、試劑和洗滌液加入并吸出。因此，與整個(gè) 現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)相比，本發(fā)明特別適合于自動(dòng)處理大的分析系列。特別是，其能夠在各個(gè)溫育 步驟后使制劑得到有效地洗滌，而不用移開目標(biāo)物保持件在縱向上的一端加入洗滌液，同 時(shí)在另一端吸出。在此過程中，液體沿切線方向流過固相底物，這是特別有效的，并且既縮 短了洗滌循環(huán)又節(jié)省了大量的洗滌液?？梢蚤g歇地進(jìn)行洗滌，或以其他方式連續(xù)進(jìn)行洗滌。 在連續(xù)工藝的洗滌過程中，由試劑保持件和目標(biāo)物保持件構(gòu)成的組件沿流動(dòng)方向或與流動(dòng) 方向相反的方向主要以斜角的方式傾斜。 迄今為止，在人工進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)的情況中，通常使用大股的洗滌液將樣 品或試劑從目標(biāo)物保持件上沖洗掉，然后在各情況下依次將目標(biāo)物保持件置于兩個(gè)或三個(gè) 裝有新鮮洗滌液的試管中，之后將它們?nèi)〕霾⒎磻?yīng)區(qū)域周圍和背部干燥，最后手工滴加 試劑或封固劑。本發(fā)明的目標(biāo)物保持件不再需要整體洗滌，其僅在附著表面的區(qū)域中與具 有潛在傳染性的液體接觸。最后蓋玻片被放置在附著表面上，從而使得在顯微鏡觀察的過 程中很少有受到目標(biāo)物保持件傳染的風(fēng)險(xiǎn)。 如果試劑保持件的通道凸出超過目標(biāo)物保持件(11)，則其邊界可向上延伸以形成 所謂的"杯"(13)，以提高端部的貯液功能并防止液體溢出以及甚至可能流到相鄰的反應(yīng)制 劑上。作為具有相同目的的預(yù)防措施，也可在目標(biāo)物保持件的邊界處的附著表面之間設(shè)置 凹口 (14)。另外，也可在目標(biāo)物保持件上的附著表面區(qū)域的外部設(shè)置與試劑保持件上的各 配對(duì)物(16)相對(duì)應(yīng)的凹槽或凸起(15)。這能夠確保目標(biāo)物保持件以正確的取向和排列方 式放置?？梢栽谀繕?biāo)物保持件的端部的上端或下端設(shè)置編碼，以在開始溫育時(shí)或在使用顯 微鏡觀察的過程中，在目標(biāo)物保持件定位于試劑保持件中時(shí)用于可靠地鑒別。在目標(biāo)物保 持件的底側(cè)上可以設(shè)置平坦的薄條，即使曾經(jīng)受到油或封固劑的污染，該目標(biāo)物保持件在 顯微鏡觀察的過程中仍會(huì)在所述薄條上滑動(dòng)，而不會(huì)像以往的技術(shù)中那樣，目標(biāo)物保持件 保持粘附在機(jī)械臺(tái)上。目標(biāo)物保持件在底側(cè)上的端部位置處可傾斜成一定的角度當(dāng)使用 手指從上面施加較小的壓力時(shí)，目標(biāo)物保持件可以傾斜，從而從顯微鏡的實(shí)驗(yàn)臺(tái)或機(jī)械臺(tái) 稍微抬起。 已發(fā)現(xiàn)，使用根據(jù)本發(fā)明溫育的組織切片或細(xì)胞底物，間接免疫熒光的反應(yīng)具有 明顯的重現(xiàn)性，這與常規(guī)技術(shù)完全相反在常規(guī)目標(biāo)物保持件的情況下，或多或少的圓形液 滴位于底物(例如組織切片)的頂部。在區(qū)域的中間，液滴通常比外側(cè)高，在這種情況下由于在中間處存在更多的抗體，因此在此處觀察到更強(qiáng)的反應(yīng)。然而，有時(shí)發(fā)現(xiàn)相反的情 況如果液滴凸出超過組織切片的邊緣，則另外的反應(yīng)配偶子可用于外部的抗原。經(jīng)?？梢?觀察到進(jìn)一步嚴(yán)重的效果由于在液滴邊緣處表面的曲率更大，所以液體在該處比中間處 明顯更快地蒸發(fā)；液體連續(xù)向外流動(dòng)，從而使抗體產(chǎn)生相當(dāng)大的濃度梯度——在該情況下， 組織切片的邊緣較中間明顯反應(yīng)更加強(qiáng)烈，由此，在一些情況下模擬出抗體濃度高達(dá)10倍 (這種現(xiàn)象也可以在日常生活中在任何時(shí)刻觀察到在光滑表面上，咖啡液滴的干燥物產(chǎn) 生污點(diǎn)，該污點(diǎn)在內(nèi)部非常淺，但是在邊緣處幾乎是黑色的)。在根據(jù)本發(fā)明溫育的組織切 片的情況下，制劑的各個(gè)點(diǎn)處的組織結(jié)構(gòu)表明了相同強(qiáng)度的反應(yīng)。這種進(jìn)步是通過在溫育 的過程中使液體中的反應(yīng)物持久有效地混合而獲得的——這是本發(fā)明的特別的優(yōu)點(diǎn)，并且 是進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的免疫熒光診斷的一個(gè)先決條件。 由于溶解的反應(yīng)配偶子的強(qiáng)制對(duì)流和各種分析制劑的連續(xù)完全的混合，所以相對(duì)
于靜止的體系，本發(fā)明還獲得了明顯更強(qiáng)的信號(hào)，這是因?yàn)榕c固相底物相鄰的一直是存在
于液體中的最大濃度的反應(yīng)物，即使是由于距離過長(zhǎng)而在溫育的過程中不可能僅僅通過擴(kuò)
散而接觸的那些液體中的反應(yīng)物，也會(huì)與固相底物的反應(yīng)配偶子相接觸。最后，相對(duì)于現(xiàn)有
技術(shù)，在根據(jù)本發(fā)明溫育的情況下能夠更加迅速地達(dá)到反應(yīng)的飽和限度，因此例如用于間
接熒光免疫法時(shí)，溫育的時(shí)間可以縮短三分之一。 實(shí)施例 新發(fā)明的一個(gè)重要的應(yīng)用是在實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)中通過間接熒光免疫法來(lái)對(duì)抗體進(jìn)行 血清學(xué)診斷。然而，新的方法和對(duì)應(yīng)的裝置(例如)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷中對(duì)于進(jìn)行許多其他 的免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其 他分析也是合適的，其中將結(jié)合于固相的反應(yīng)配偶子和溶解于液體中的反應(yīng)物一起溫育。 相同的情況適用于直接免疫熒光法。 實(shí)施例1 :在韋格納肉芽腫病的診斷中通過間接熒光免疫法來(lái)檢測(cè)針對(duì)粒細(xì)胞的 自身抗體 為了單獨(dú)分析，目標(biāo)物保持件的各附著表面均設(shè)置有一個(gè)底物。為此，在該情況 下，將分離的粒細(xì)胞在蓋玻片上劃線，并且室溫下在96%的乙醇中固定10分鐘。此后，使用 金剛石玻璃刀將蓋玻片分為lxl毫米級(jí)的片段。這些片段中的每一個(gè)分別與目標(biāo)物保持件 的IO個(gè)附著表面中的一個(gè)粘附結(jié)合(粘合劑存在于附著表面和生物芯片的底側(cè)之間；粒細(xì) 胞暴露在表面處)。以生物芯片面向下方的方式將目標(biāo)物保持件放置在具有IO個(gè)通道的試 劑保持件上，所述通道被設(shè)置成與附著表面相對(duì)。目標(biāo)物保持件的寬度為26毫米，附著表 面的長(zhǎng)度為24毫米。通道在附著表面的兩個(gè)縱向末端處均突出IO毫米。
這時(shí)，手工使用移液管將100微升來(lái)自IO個(gè)不同患者的血清(其以PBS(使用磷 酸鹽將PH緩沖至7. 4的生理鹽水水溶液)按照1 : 10的比例稀釋)分別加入10個(gè)通道 中的一個(gè)。通道的尺寸為使得液體立即與粒細(xì)胞接觸。然后將試劑保持件和位于其上的目 標(biāo)物保持件共同以通道的縱向與水平方向成30°角的方式周期性地傾斜，使得液體從一端 至另一端來(lái)回流動(dòng)，每個(gè)循環(huán)的循環(huán)時(shí)間為15秒。在每種情況下，附著表面區(qū)域中的體積 為20微升；將每半個(gè)循環(huán)中移動(dòng)的體積設(shè)計(jì)成明顯更大，此處為30微升，結(jié)果在各試驗(yàn)試 劑通道的兩端處的液體都處于持久交換中，并且每種樣品的全部制劑都發(fā)生了劇烈和快速 的持久混合。在溫育的過程中，為了使液體不過快蒸發(fā)以及使分析試劑不干燥，將由試劑保持件和目標(biāo)物保持件構(gòu)成的組件蓋上罩。 在30分鐘后，從通道的一端吸出血清稀釋液，并且從另一端(優(yōu)選但不是排他性 的)吸入PBS以進(jìn)行洗滌——在5分鐘內(nèi)每個(gè)通道總共用10毫升。然后將通道吸干，加入 100微升合適的來(lái)自山羊的熒光素標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的稀釋液(此處不僅可以想象到 還有許多其他的抗體源或抗體類反應(yīng)物，而且還可想象到許多其他的標(biāo)記物質(zhì))。在該過程 中，試劑再次與附著表面和固定在附著表面上的抗原底物接觸。使試劑保持件和目標(biāo)物保 持件所構(gòu)成的組件另外進(jìn)行半小時(shí)的秋千或搖擺運(yùn)動(dòng)，然后按照相同的方式再次洗滌。最 后，再次將通道吸干，將目標(biāo)物保持件從試劑保持件上移開，向各附著表面滴加15微升封 固劑(使用PBS將1 : 10甘油的pH緩沖至8.4，添加有0. 1%疊氮化鈉和2%的1，4-二疊 氮雙環(huán)[2. 2. 2]辛烷作為抗漂白劑)，然后放置蓋玻片，所述蓋玻片固定在目標(biāo)物保持件的 邊沿處的相應(yīng)凹陷中。在熒光顯微鏡下評(píng)價(jià)反應(yīng)。 實(shí)施例2 :在多種風(fēng)濕性疾病的診斷中通過間接熒光免疫法來(lái)檢測(cè)針對(duì)細(xì)胞核、 線粒體和平滑肌的自身抗體 將使用下列底物按照與第一實(shí)施例類似的方式涂覆的玻璃片段(生物芯片)分別 與根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物保持件(例如標(biāo)準(zhǔn)尺寸76x26毫米)的10個(gè)附著表面中的每一個(gè)粘 附結(jié)合，不同之處在于此處為"嵌合體"，所述底物為丙酮固定的來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的人上皮 細(xì)胞；乙醇固定的血鞭毛蟲屬短膜蟲綠蠅(haemoflagellate Crithidialuciliae)涂片； 下列小鼠器官的未固定的冷凍切片肝臟、腎臟、胃；以及使用下列單一一種抗原在整個(gè)表 面或在特定點(diǎn)涂覆的生物芯片(根據(jù)Proost等人.7):雙鏈DNA、組蛋白H1、另外的細(xì)胞核 抗原Sm、 RNP、 SS-A、 SS_B、 Scl_70和核小體；以及細(xì)胞質(zhì)抗原Jo_l——每個(gè)附著表面總共 有15種不同的抗原底物。按照與實(shí)施例1相同的方式對(duì)10個(gè)患者的目標(biāo)物保持件進(jìn)行平 行溫育和評(píng)價(jià)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，由光譜確定在各患者的血清中是否存在至少15種不同的自 身抗體中的一種或多種。底物在附著表面上的布置以及和試劑保持件的通道共同進(jìn)行的溫 育允許對(duì)IO個(gè)患者平行進(jìn)行多個(gè)參數(shù)的操作；在一個(gè)單獨(dú)的目標(biāo)物保持件上進(jìn)行150個(gè)單 獨(dú)分析！由于液體不能在相鄰樣品之間流動(dòng)，所以事實(shí)上排除了無(wú)意進(jìn)行的彼此交叉反應(yīng) 以及相應(yīng)的誤診。 每個(gè)尖端的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室都對(duì)能夠測(cè)試自身抗體譜感興趣。存在許多臨床問題，針 對(duì)這些問題就不同的診斷而言可取的是一方面，在一些臨床綜合征的情況下，可能分別有 數(shù)種自身免疫性疾病(在腎炎(腎臟炎癥)的情況下，例如有古德帕斯丘綜合征、韋格內(nèi)氏 肉芽腫癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡或急進(jìn)型腎小球腎炎)；另一方面，一些自身抗體可能與特定的 自身免疫性疾病相關(guān)(例如對(duì)于原發(fā)性膽汁性肝硬化而言，相關(guān)的是針對(duì)線粒體或核點(diǎn)、 gp210和PML的抗體；對(duì)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡而言，相關(guān)的是針對(duì)nDNA、 Sm、組蛋白、核糖體P 蛋白、擴(kuò)展細(xì)胞的核抗原、心磷脂、P-2-糖蛋白等抗體；對(duì)于自身免疫性甲狀腺炎而言，相 關(guān)的是針對(duì)甲狀腺過氧化物酶、甲狀腺球蛋白、TSH受體和胃壁細(xì)胞的抗體)。本發(fā)明特別 適用于生成抗體譜。這不限于自身免疫性診斷；還存在許多其他應(yīng)用領(lǐng)域，包括對(duì)融合上清 液中的單克隆抗體(例如針對(duì)與腫瘤有關(guān)的抗原的抗體)進(jìn)行篩選8，或者與下列示出的類 似的例子一樣用于傳染性血清學(xué)。 實(shí)施例3 :通過間接熒光免疫法來(lái)平行溫育50個(gè)目標(biāo)物保持件(其具有10個(gè)附 著表面)以分別檢測(cè)針對(duì)細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、酵母菌和寄生蟲的人抗體——每個(gè)患者40
12個(gè)參數(shù) 按照與實(shí)施例2類似的方式制備具有固相底物的目標(biāo)物保持件，不同之處在于此 處使用具有下列傳染性抗原底物的玻璃片段感染有麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹和任意其他病毒的 細(xì)胞培養(yǎng)物；各種類型的細(xì)菌或真菌的涂片；棘球絳蟲幼蟲的冷凍切片、剛地弓形蟲涂片， 各玻璃片段的表面同樣地具有所指明的抗原，有些是用生物化學(xué)的方式分離的純凈程度或 高或低的抗原，有些是用重組技術(shù)制備的抗原。使用機(jī)器來(lái)進(jìn)行溫育，其中所述機(jī)器稀釋患 者血清，在規(guī)定的時(shí)刻將血清稀釋液和試劑加入試劑保持件的通道，以及借助于梳狀的10 通道移液管和吸管來(lái)平行進(jìn)行洗滌操作。 在溫育的過程中以及在某些情況下還在洗滌的過程中，使試劑保持件和它們相應(yīng) 的目標(biāo)物保持件所構(gòu)成的所有組件從"分裂的毛細(xì)管"的縱向上的一端至另一端有節(jié)奏地 來(lái)回傾斜，以確保所需的對(duì)流。(僅僅)對(duì)那些正在進(jìn)行移液或洗滌操作的組件，可任選地 使之停止傾斜運(yùn)動(dòng)。這確?；旌喜僮髟谡麄€(gè)操作中不需要被經(jīng)常打斷。同樣可以想象到， 將包括移液系統(tǒng)在內(nèi)的整個(gè)裝置設(shè)置在大的傾斜臺(tái)上，使得即使其中正在進(jìn)行移液和洗滌 操作的那些組件也不需要間斷進(jìn)行秋千或搖擺運(yùn)動(dòng)。人工進(jìn)行封固(目前仍是這樣)，通過 顯微鏡目視觀察(目前仍是這樣)。 實(shí)施例4 :在過敏癥診斷中使用基于印跡膜的微陣列來(lái)測(cè)試特異性IgE或IgG抗 體 在免疫印跡技術(shù)中，將蛋白或其他抗原固定在硝化纖維素膜、尼龍膜、或其他膜
上，然后依次與患者樣品、或其他樣品、酶標(biāo)記的抗體、和著色劑一起溫育。在膜條上陽(yáng)性反
應(yīng)表現(xiàn)為有色的沉淀，這可目視評(píng)價(jià)或使用掃描儀或照相機(jī)系統(tǒng)自動(dòng)評(píng)價(jià)9'1。。 將3x26平方的膜芯片(邊緣長(zhǎng)度為1毫米)與根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物保持件的10
個(gè)附著表面中的每一個(gè)粘附結(jié)合成平行的三行。每個(gè)膜芯片含有規(guī)定的膜偶聯(lián)的過敏原
(樺樹花粉、胡蜂毒液等)。按照與上述例子中類似的方式進(jìn)行溫育，但是，在第二溫育步驟
中，使用酶標(biāo)記的抗人IgE抗體，其中第二溫育步驟之后進(jìn)行洗滌步驟和指示劑反應(yīng)。在陽(yáng)
性情況下，在膜芯片上形成染色沉淀。 在76cmx26cm的單一一個(gè)目標(biāo)物保持件上，針對(duì)10個(gè)患者中的每一個(gè)都獲得了一 個(gè)具有78個(gè)參數(shù)的過敏癥譜。根據(jù)本發(fā)明的膜芯片的應(yīng)用并不僅限于過敏癥診斷。
實(shí)施例5 :借助于微陣列對(duì)患者樣品進(jìn)行基因分型 數(shù)個(gè)具有特定的核苷酸序列的微陣列，例如5個(gè)微陣列(其分別具有50個(gè)不同的
寡核苷酸位點(diǎn))"'、均固定到根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)物保持件的附著表面上。從10個(gè)患者的白
血細(xì)胞中提取DNA。通過多重PCR，由此擴(kuò)增預(yù)定的目標(biāo)序列，并以基因類型特異性的方式
進(jìn)行標(biāo)記。為了進(jìn)行雜化，將它們加入根據(jù)本發(fā)明的試劑保持件的通道中，并接觸目標(biāo)物保
持件的附著表面上的微陣列。最后，使用專用的微陣列掃描儀來(lái)評(píng)價(jià)反應(yīng)。 為了分子生物學(xué)的目的而使用微陣列來(lái)特異性地檢測(cè)非常少量的核酸，這需要反
應(yīng)是清楚、可重現(xiàn)且非常敏感的，這一點(diǎn)尤其是通過反應(yīng)液在溫育的過程中產(chǎn)生持久有效
的混合(主要是由于強(qiáng)制對(duì)流)而得以保證的。在此，就較短的溫育時(shí)間而言，診斷也受益
于本發(fā)明。 本發(fā)明的自動(dòng)化 迄今為止，實(shí)驗(yàn)室操作中的間接熒光免疫法屬于單獨(dú)人工處理和視覺評(píng)價(jià)的領(lǐng)域。在該領(lǐng)域中分析技術(shù)的現(xiàn)狀不能提供具有高的樣品處理量的自動(dòng)化方案，例如用于臨 床化學(xué)的方案。這種兩難的情況可通過市場(chǎng)上可獲得的兩種系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行說(shuō)明DAS srl公 司(羅馬，意大利)提供一種自動(dòng)溫育器(AP16IF Plus)，同樣Menarini srl公司(佛羅倫 薩，意大利)也提供一種溫育器(Zenit SP Plus)。這兩種系統(tǒng)都直接移取溫育液到目標(biāo)物 保持件的區(qū)域上。相鄰區(qū)域中的這些液滴的合并或一起流動(dòng)可導(dǎo)致誤診，在第一洗滌步驟 后當(dāng)目標(biāo)物保持件的表面在反應(yīng)區(qū)域外部被弄濕時(shí)尤其是如此——在本發(fā)明中，相反，相 鄰樣品可靠地彼此分開。相對(duì)于現(xiàn)有的系統(tǒng)(其中由于容易產(chǎn)生錯(cuò)誤，因而必須經(jīng)常觀察 移液和洗滌操作)，本發(fā)明提供了用于自動(dòng)化的更好的先決條件。 另外，在這兩種設(shè)備中，直接將液體移取到目標(biāo)物保持件的區(qū)域上；在調(diào)節(jié)不佳的 情況下，可能會(huì)由于插管而對(duì)底物造成損害——在本發(fā)明中，這點(diǎn)被排除，原因在于固相底 物不能與插管接觸液體被加入目標(biāo)物保持件以外的通道中，另外通道是對(duì)著底物的。
"AP 16IF Plus"使用雙插管系統(tǒng)來(lái)分開洗滌各區(qū)域。 一個(gè)插管分配規(guī)定體積的 洗滌液(其為液滴形式)到待洗滌的區(qū)域上，另一個(gè)插管此后又直接吸取該液滴。重復(fù)該 操作數(shù)次。可供選擇的是，還提供連續(xù)洗滌，即在規(guī)定的時(shí)間同時(shí)分配和吸取。這兩種變體 方式都蘊(yùn)藏著插管和底物接觸的風(fēng)險(xiǎn)。另外，該系統(tǒng)使用不必要的大量的洗滌緩沖液，因?yàn)?大部分沖洗液只流過底物并且無(wú)論如何都不與它們接觸——本發(fā)明與之相反，全部洗滌液 不可避免地被引導(dǎo)通過狹窄的縫隙而直接穿過底物。在各洗滌步驟后，在"AP16IF Plus" 中，在底物上殘留大量殘余體積的洗滌緩沖液，一個(gè)原因是吸管不得不與底物保持安全的 距離。結(jié)果，試液以不可預(yù)測(cè)的方式被稀釋，有時(shí)稀釋多有時(shí)稀釋少，這對(duì)精確分析具有不 利的影響。 "Zenit SP Plus"的洗滌方法有意地接受了交叉污染各目標(biāo)物保持件都存在于 盤的隔室中。首先，在進(jìn)行洗滌之前，使用多個(gè)插管(插管條)同時(shí)從各目標(biāo)物保持件的反 應(yīng)區(qū)域中吸走樣品液或試劑。隨后，使用洗滌緩沖液填充全部隔室，使得在類似于試管中洗 滌的方式下進(jìn)行洗滌(該過程是危險(xiǎn)的一些高滴度和反應(yīng)性的抗體無(wú)法被第一洗滌填充 液所充分稀釋，并且在這些情況下可在相鄰反應(yīng)區(qū)域中引起假陽(yáng)性反應(yīng))。最后，又使用插 管將隔室吸空。此處，也存在插管對(duì)組織切片造成損害的風(fēng)險(xiǎn)。由于目標(biāo)物保持件的全部 表面都接觸洗滌液，因此更多殘余的水分殘留在目標(biāo)物保持件上，這以無(wú)法控制的方式促 進(jìn)了相鄰反應(yīng)區(qū)域中的液滴流到一起，其中所述液滴是在隨后的溫育步驟中施加的(在與 由血清蛋白構(gòu)成的溶液接觸后，目標(biāo)物保持件涂層的親水性喪失)。此處，第二步驟中施加 的試劑溶液也被殘余洗滌液過度地稀釋了 。 相反，本發(fā)明能夠高效率高質(zhì)量地進(jìn)行節(jié)省液體的自動(dòng)洗滌操作，并且還避免了 上述兩種設(shè)備中所存在的風(fēng)險(xiǎn)。固相底物的設(shè)置方法及其在試劑保持件的通道中進(jìn)行溫育 的方法能夠在彼此嚴(yán)格分開的條件下平行洗滌多個(gè)區(qū)域。當(dāng)通過試劑保持件的通道加入洗 滌液并將其吸走時(shí)，插管不與組織切片接觸。另外，在洗滌過程中只有目標(biāo)物保持件的附著 表面被潤(rùn)濕，而目標(biāo)物保持件的剩余表面區(qū)域并沒有被潤(rùn)濕，這附加地降低了相鄰區(qū)域中 的液體流到一起的風(fēng)險(xiǎn)。由于所述的通道形式，在吸取后洗滌緩沖液的殘余體積可以降至 最小，結(jié)果試液不會(huì)不必要地被稀釋并且多個(gè)樣品不會(huì)被稀釋至不同程度，而這些問題存 在于現(xiàn)有技術(shù)的兩種機(jī)器中。
文獻(xiàn)
1. StSckerW. Vorricht皿g zur Durchf他r皿g von Mikroanalysen.歐洲I專禾UEP 0018435和美國(guó)專利US 4339241(1979)。 2. St6cker, W. Verfahren und Vorrichtungen fiir Untersuchungen a醒beweglich gemachtem biologischem Material.歐洲l專利EP 0117262禾口美國(guó)專利US 4647543(1983)。 3. StGeker W， Scriba PC. Die Anwendung einer neuen， rationellenlmmunf1 uoreszenztechnik in der klinischen Routinediagnostik. In :Schatz， H. ， Doniach， D. (Eds.) : Autoimmunit&t bei Schilddriisenerkrankungen. Georg-Thieme-Verlag Stuttgart 157-174(1984)。 4. St6cker W.Rationelle Histochemie mit einer neuen Mikroanalysemethode. Acta Histochem Suppl 31 :269-281(1985)。 5. St6ckerW，0tte M，Ulrich S，Normann D，F(xiàn)inkbeiner H， St6cker K， Jantschek G， Scriba PC. Autoimmunity to pancreatic juice in Crohn' sdisease. Results of an autoantibody screening in patients with chronicinflammatory bowel diseases. Scand J Gastroenterol Suppl. 139 :41-52(1987)。6. St6cker W， Rateike M， Morrin M. Verfahren zur HerstellimgFestphasen_ge
bundener Bioreagenzien.歐洲專利申請(qǐng)PCT/EP/2005/000974 (2005)。 7. Proost S， Schl咖berger W， Meyer W， DShnrich C， Miiller-Kunert E，
Sonnenberg K， StGeker W. EUR0PLUS_Eine biochip—Kombination ausGewebeschnitten
皿d Einzelantigenen fiir die indirekte Imm皿fluoreszenz :Endomysi咖/Gliadin，AMA/
M2皿d Parietalzellen/Intrinsic-Faktor. J LabMed 20 :670(1996)。8. St。cker W， Poschmann A， Seitz C， Heise R， Hornof B， B。cker
W. Rationelles Screening von Fusionsiiberstanden z咖 histochemischenNachweis
monoklonaler Antik6rper gegen Tumor-assoziierte 皿d andereantigene. Verh Dtsch
Ges Path 70:393-395(1986)。 9. Meyer W， Sch印er T， Lehmann H， 服eker W. EUROIMM誦edizinische Labordiagnostika AG. Selbstklebende Blotmembra體.登記的德國(guó)實(shí)用新型DE 20215268. 5(2003)。 10. Meyer W， Sch印er T， Stoker W. EUR0I誦N MedizinischeLabordiagnostika AG. Vorricht皿g zur Antik6rperdiagnosemitkombinierten Membra體.登記的德國(guó)實(shí)用 新型DE 20215270. 7(2003)。 ll.Pfeiffer T， Gruber R， K麗W， Plischke H， Kirsch S， KGmer D， ZiesenissS， Schattenkirchner M， StGeker W， Steller U.Diagnostic microarray assayfor SNP_typing of the gene enco ding the drug metabolising enzymearylamine N_acetyltransferase 2(NAT2). Conference handbook for theDECHEMA status seminar about chip technologies 90(2007)。 12. Steller U， Stacker W. Verfahren zur Erzeugung perfekter Macro—皿dMicroarrays durch Kombinieren vorselektierter beschichteterFestphas en-Fragmente (BMBF).德國(guó)和歐洲專利申請(qǐng)(公開說(shuō)明書)DE1020006027517. 9和PCT/EP2007/004641或W02007140889(2007)
權(quán)利要求
一種用于進(jìn)行免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析的裝置，其中所述裝置包括目標(biāo)物保持件，其具有一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)形的附著表面；和試劑保持件，其具有一個(gè)或多個(gè)通道；其中，所述目標(biāo)物保持件能夠以使得每個(gè)所述長(zhǎng)形的附著表面面向相應(yīng)的一個(gè)所述通道的方式，與所述試劑保持件可拆卸地連接，并且，當(dāng)與固相結(jié)合的反應(yīng)配偶子被設(shè)置在所述長(zhǎng)形的附著表面上、且溶解于液體中的反應(yīng)物存在于所述通道中時(shí)，所述反應(yīng)配偶子和所述反應(yīng)物接觸，其中設(shè)置有用以防止所述液體從一個(gè)通道流到相鄰?fù)ǖ赖臋C(jī)構(gòu)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的裝置，其中在相鄰附著表面之間設(shè)置有凹槽(4)或臺(tái)階，該凹槽或臺(tái)階從所述附著表面的縱向上的一端平行延伸至縱向上的另一端。
3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中所述試劑保持件的所述通道沿設(shè)置于所述試劑保持件的所述表面上的長(zhǎng)形的凸起延伸，其中相鄰?fù)ǖ赖乃鐾蛊鸨舜朔珠_。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中所述通道的側(cè)面邊緣在頂部是漸縮的，并且在所述目標(biāo)物保持件和所述試劑保持件連接的狀態(tài)下防止所述液體從所述通道的側(cè)面流出。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中所述通道的內(nèi)表面設(shè)置有圖案，該圖案用于在所述通道內(nèi)沿縱向引導(dǎo)所述的液體。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中為了提高儲(chǔ)存所述液體的功能和防止泄漏的目的，所述試劑保持件的所述通道在長(zhǎng)度上延伸超出所述目標(biāo)物保持件的所述附著表面的縱向上的端部(10)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其中為了形成容納過量液體的杯形貯液器(13)，在所述通道延伸超出所述附著表面的部分中，該通道的邊緣向上延伸。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中在所述目標(biāo)物保持件的各個(gè)附著表面周圍設(shè)置沿周向延伸的邊沿(8)，該邊沿相對(duì)于所述附著表面突出。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中在所述通道的表面中設(shè)置障礙物，當(dāng)液體在所述障礙物上流過時(shí)，在所述障礙物的位置處形成障礙物湍流。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的裝置，其中結(jié)合有反應(yīng)配偶子的固相底物與所述附著表面附接。
11. 根據(jù)權(quán)利要求io所述的裝置，其中所述固相底物包括選自下列物質(zhì)中的生物材料a) 生物組織的薄切片，b) 細(xì)胞培養(yǎng)物或聯(lián)合細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞涂片，c) 細(xì)菌涂片，d) 病毒、原生動(dòng)物和寄生蟲，e) 以溶液形式、干燥形式、或偶聯(lián)形式施用的抗原滴，f) 與表面偶聯(lián)的其他抗原，和/或g) 任意的核苷酸序列。
12. —種利用根據(jù)權(quán)利要求1至11中任意一項(xiàng)所述的裝置來(lái)進(jìn)行免疫學(xué)分析、組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)分析、分子生物學(xué)分析、酶學(xué)分析、臨床化學(xué)分析和其他分析的方法，其中將所述目標(biāo)物保持件以每個(gè)所述長(zhǎng)形的附著表面分別面向一個(gè)所述通道的方式與所述試劑 保持件連接，將其中溶解有反應(yīng)物的液體引入所述通道，使得結(jié)合有反應(yīng)配偶子并設(shè)置在 所述附著表面上的固相底物接觸所述液體，并且使所述目標(biāo)物保持件和所述試劑保持件一 起移動(dòng)，所述移動(dòng)使得所述液體交替地沿所述通道的兩個(gè)縱向方向移動(dòng)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中各個(gè)單獨(dú)的分析制劑通過以下方式實(shí)現(xiàn)連續(xù)的混合使所述試劑保持件和位于其上的所述目標(biāo)物保持件一起周期性地轉(zhuǎn)動(dòng)，使得所述通 道的縱向方向離開水平面而達(dá)到使所述液體在所述通道的兩端之間來(lái)回流動(dòng)的程度。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中通過使所述液體在每半個(gè)循環(huán)中移動(dòng)的體 積大于在所述附著表面下的所述液體的體積，而實(shí)現(xiàn)各通道中的所述液體的混合，由此使 得各個(gè)通道的兩端的所述液體也參與混合，其中半個(gè)循環(huán)是所述液體從所述試劑保持件的 所述通道的縱向上的一端移動(dòng)至縱向上的另一端。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12至14中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于反應(yīng)過程中的分析制劑 液和洗滌循環(huán)過程中的洗滌液均沿切線方向通過所述附著表面的下方。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于分析液相和固相之間的生物反應(yīng)的方法和裝置。該裝置包括具有一個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)形的附著表面的目標(biāo)物保持件和具有一個(gè)或多個(gè)通道的試劑保持件；其中，所述目標(biāo)物保持件能夠與所述試劑保持件可拆卸式連接，使得每個(gè)所述長(zhǎng)形的附著表面分別面向一個(gè)所述通道，并且，當(dāng)與固相結(jié)合的反應(yīng)配偶子被設(shè)置在所述長(zhǎng)形的附著表面上、且溶解于液體中的反應(yīng)物存在于所述通道中時(shí)，所述反應(yīng)配偶子和所述反應(yīng)物接觸，其中設(shè)置有用以防止所述液體從一個(gè)通道流到相鄰?fù)ǖ赖臋C(jī)構(gòu)。通過本發(fā)明，反應(yīng)進(jìn)行更加迅速，信號(hào)變得更強(qiáng)并且各個(gè)底物的反應(yīng)性在整個(gè)表面上變得更加均勻，本發(fā)明還能夠防止在溫育的過程中相鄰樣品液彼此混合。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101738465SQ200910222938
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者拉斯穆斯·貝林, 比安卡·馬爾察恩, 溫弗里德·施托克爾, 馬丁·拉泰克 申請(qǐng)人:歐蒙醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司