專利名稱：：阿爾茨海默病早期診斷液相芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，具體的是涉及阿爾茨海默病早期診斷液相芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Alzheimerdisease,AD)是一種以認知功能減退、生活功能下降及精神行為異常為臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的典型病理特征是神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)，細胞外有老年斑(SP)沉積及神經(jīng)元數(shù)量減少。隨著老齡人口的增加，AD的患病率逐年增加。目前，全世界約有1800萬人罹患阿爾茨海默病，其中50%發(fā)生在發(fā)展中國家。另據(jù)WHO估計，到2050年，全世界患該病的人數(shù)將增加一倍，達到3400萬人。統(tǒng)計資料顯示，我國老年性癡呆患病率在65歲以上老人中所占的比例為6.6%，85歲以上老人為30%。老年性癡呆的患病率會隨著年齡的增長而上升，從而嚴重威脅著老年人的生命健康并給社會帶來了巨大的負擔(dān)。2001年有研究者預(yù)測，在美國對AD進行早期臨床確診，每年可節(jié)省約一千億美元的醫(yī)療費用。AD早期患者的生理和心理與正常衰老之間沒有明顯的界限，很難及時為患者確診，因此目前仍缺乏特異的診斷及有效的治療。而理想的診療應(yīng)在大量突觸和神經(jīng)元喪失以前，所以目前對于該病的研究重點轉(zhuǎn)移到了對于AD早期或極早期的診斷和治療上。然而，除了在患者死后通過大腦中衰老斑和神經(jīng)纖維混亂的出現(xiàn)這些指標進行疾病確認外還沒有公認的診斷標準。臨床診斷主要根據(jù)病人的病史，大腦影像學(xué)以及心理學(xué)，認知和神經(jīng)學(xué)測試。實驗室輔助診斷方法主要是檢測體液中含有的可溶性標志物。近年，眾多AD研究專家及機構(gòu)投入大量精力研究生物學(xué)檢測指標，并從AD患者的腦脊液或血液中發(fā)現(xiàn)一些具鑒別診斷意義的生化指標，如tau蛋白、e淀粉樣蛋白(Ae)、載脂蛋白E(ApoE)、Ae前體蛋白(APP)、早老素(PS-1，PS-2)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等。t-tau(總tau蛋白)，p-tau(磷酸化tau蛋白)和A3W2是用于AD輔助診斷的3種重要生物學(xué)標記物。在腦脊液中對這3種標記物及它們的亞型(p-tau231、p-taul81、p-tau404、p-tau396等)已經(jīng)有很多研究(彭丹濤，2005)。腦脊液中e淀粉樣蛋白的濃度可以部分反映腦組織中e淀粉樣蛋白的沉積與清除情況；而腦脊液中tau蛋白和磷酸化tau蛋白(p-tau蛋白)濃度能夠反映大腦神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的情況，作為神經(jīng)元和神經(jīng)軸變性的指標。(l)t-tau總tau蛋白存在于正常腦組織神經(jīng)元軸突中，參與微管交聯(lián)，又稱微管相關(guān)tau蛋白。腦脊液中tau蛋白可能來自死亡的或退化變性的神經(jīng)細胞。約85%的AD患者腦脊液中tau蛋白水平顯著升高，約為健康對照組及其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病對照組的3倍(李華芳，1999;薛海波，2007)。因此，監(jiān)測高危人群腦脊液tau蛋白濃度的變化，對早期明確阿爾茨海默病診斷大有裨益。升高的腦脊液t-tau可預(yù)示輕度認知功能障礙(MCI，一種介于老年癡呆和正常老年人認知功能減退的狀態(tài)，也是認知障礙進行預(yù)防性干預(yù)的最佳階段)患者中潛在的神經(jīng)軸索損傷和神經(jīng)變性。這一指標主要預(yù)示在許多不同疾病中全面神經(jīng)損傷。但tau蛋白過度磷酸化則導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)，是AD的主要病理特點之一。在幾個研究中，一個重要發(fā)現(xiàn)是這一改變也出現(xiàn)在早期癡呆中。因此腦脊液中t-tau可以鑒別AD和正常老化，平均敏感度75%，特異性85%。隨著年齡增加，沒有精神神經(jīng)疾病的人群也有t-tau增加。因此和年齡相關(guān)的腦脊液t-tau濃度水平應(yīng)被診斷采用。21-50歲，t-tau濃度小于300pg/ml;51-70歲，t-tau濃度小于450pg/ml;70-93歲，t-tau濃度小于500pg/ml(SjogrenM，2001)。腦脊液中t-tau在鑒別AD和其他疾病造成的癡呆有一定的局限性。該實驗的敏感性為81%，但特異性僅為57%(Parnetti，2001)。t-tau增加也出現(xiàn)在血管性癡呆(VD)、額顳葉癡呆(fron-totemporaldementia,FTD)、路易體癡呆(lewybodydisease,LBD)的一些病患中，某些語言性癡呆也出現(xiàn)t-tau增加(FabreF，2001;姚潔，2007)。因此，t-tau在鑒別AD的其他類型癡呆的特異性不高，不能被當作AD鑒別診斷的標志物。(2)異常磷酸化的tau蛋白(p-tau)正常tau蛋白是一種含磷蛋白質(zhì)，每摩爾tau蛋白中含磷酸23mo1。在AD患者中，tau蛋白被異常過度磷酸化。這種異常磷酸化的tau蛋白是AD患者腦神經(jīng)元中雙股螺旋絲的主要成分。采用免疫印跡定量測定，發(fā)現(xiàn)AD患者腦中正常tau蛋白含量明顯降低，而tau蛋白總量則顯著高于同齡正常人，且增加的tau蛋白中以異常過度磷酸化的形式為主。2001年多個國家學(xué)者聯(lián)合對570例AD患者腦脊液磷酸化tau監(jiān)測分析后，認為其是診斷AD的一個可靠生物標識。磷酸化的tau診斷阿爾茨海默病的靈敏度達85.2%，特異度達85%(LeclercS，2001)。因此，AD特異性磷酸化tau的含量是檢測AD的特異性生化指標。在人體中有6種tau蛋白異構(gòu)體和多于21種磷酸化位置的tau蛋白。用單克隆抗體可以檢出t-tau的磷酸化物及異構(gòu)體。p-tau蛋白的多個國際臨床研究中心的研究主要集中在tau蛋白不同的磷酸化位點tau蛋白在絲氨酸199磷酸化(p-taul99);在蘇氨酸231磷酸化(p-tau231);在蘇氨酸181磷酸化(p-taul81);在絲氨酸396和切4磷酸化(p-tau396/404)。不同的磷酸化位點檢測可以極大提高診斷的準確性。Augustinack等通過組織化學(xué)研究顯示，腦脊液tau蛋白的第231位的蘇氨酸磷酸化(p-tau231)在疾病早期甚至在成對螺旋絲形成之前就已出現(xiàn)，且敏感度可達85%(AugustinackJ，2002)。免疫學(xué)研究指出tau蛋白在蘇氨酸231磷酸化對于AD是特異的，并在疾病發(fā)展早期即可出現(xiàn)，甚至早于微管的形成。因此，p-tau231在當前被普遍認為是AD診斷的一個特異性生物學(xué)標志物。腦脊液P-tau231檢測在AD鑒別診斷中的作用在一個早期研究中，檢測腦脊液p-tau231對鑒別AD和0ND敏感性為85X，特異性為97%(總正確率為91%)(BuergerK，2006)。在一個192例病例的獨立研究中，發(fā)現(xiàn)腦脊液p-tau231在AD鑒別診斷中優(yōu)于總的tau蛋白。檢測腦脊液p-tau231水平，鑒別AD和其他非AD病例具有85%敏感性和75%特異性。特別是AD和FTD的鑒別，p-tau231特異性和t-tau均為90.2%，但敏感性從t-tau的57.7%增加到90.2%。最近發(fā)表的研究中，AD病人的腦脊液p-tau231水平相對于老年抑郁癥和健康對照有明顯增加。鑒別可能的AD與MD，腦脊液p-tau231檢測準確率達87%,輕度AD與MD鑒別，腦脊液p-tau231檢測準確率達78%。p-tau231濃度變化和AD嚴重程度相關(guān)。AD病程中p-tau231下降，可能隨著疾病進展，p-tau231變得難溶，難以進入腦脊液中，腦脊液中減少的p-tau231進入神經(jīng)纖維纏結(jié)中；而t-tau仍保持可溶性，腦脊液中無明顯變化。總之，這些數(shù)據(jù)顯示腦脊液p-tau231可能是AD早期診斷和鑒別診斷及反映疾病進展的有效工具。(3)腦脊液蘇氨酸181磷酸化tau蛋白(p-taul81)大量研究顯示，腦脊液p-taul81在AD中明顯增加，而對照和FTD無此變化。在鑒別AD和LBD中，特異性相同，而p-taul81檢測敏感性高于t-tau(HampelH，2004)。根據(jù)接受操作特點(receiveroperatingcharacteristics,ROC)曲線對AD和LBD正確分類可達80%。磷酸化tau蛋白反映tau蛋白磷酸化這一概念被證實，在嚴重創(chuàng)傷中，腦脊液t-tau增加，而p-taul81無變化。(4)腦脊液絲氨酸199磷酸化tau蛋白(p-taul99)在一項p-taul99研究中顯示，這項生物學(xué)標志檢測對AD及非AD患者優(yōu)于t-tau，p-taul99水平在AD組中升高，并和年齡、性別、認知狀態(tài)及ApoE4攜帶狀態(tài)無關(guān)。這項研究中，AD組和其他原因造成的癡呆及非癡呆病例，R0C分析顯示p-taul99檢測敏感性及特異性均達85X(IshiguroK，1999)。(5)P-淀粉樣蛋白(Ae)AD的主要病變之一是老年斑，其主要成分是淀粉樣e蛋白前體(APP)。APP主要為淀粉樣P蛋白40(APh。)，也有部分為A^—42,43。相對而言，A0H2'43更容易聚合形成淀粉樣沉積，現(xiàn)在認為APP產(chǎn)生或降解途徑受阻而使APP沉積是導(dǎo)致AD發(fā)生的重要機制。在疾病早期AP沉積增加，腦脊液中Ae增加，而疾病中、晚期，Ae大量沉積為老年斑，使得腦脊液中AP含量反而下降。因此，通過測定Ae水平可監(jiān)測AD進展情況并觀察藥物療效。研究數(shù)據(jù)顯示，腦脊液中APh2沐度大于500pg/ml應(yīng)作為鑒別AD和正常老化的分界線(SjogrenM，2001)。近30個研究顯示AD患者腦脊液中AP卜42濃度降低，在大多數(shù)研究中，敏感性和特異性都超過80%(姚潔，2007)。檢測腦脊液AeH2，鑒別AD和正常老化的敏感性為78%100%，特異性為47%81%(SquittiR，2006;AndreasenN，2003)。根據(jù)阿爾茨海默病的病理改變，凡腦組織中e-淀粉樣蛋白沉積性疾病如血管性癡呆、Lewy小體癡呆、進行性核上性麻痹及額葉癡呆患者，腦脊液AeH2濃度均呈不同程度降低。提示單純腦脊液APH2定量檢測的特異性較低，不能單獨作為阿爾茨海默病診斷的標準.但它對臨床高度懷疑為阿爾茨海默病的患者具有輔助診斷意義(李毅，2004)。在鑒別AD和其他臨床癡呆中，單獨檢測腦脊液A6h2或t-tau都是不充分的，多指標的聯(lián)合檢測可進一步提高AD診斷率特別是早期診斷率。Blennow指出在區(qū)別AD與健康老年人時，Aeh2，t-tau及p-tau這三種腦脊液生物學(xué)標記物平均敏感性和特異性分別為81%89%和89%91%。t-tau聯(lián)合p-tau的敏感性和特異性能達到96%和100%(Blen,K，2004)。Parnetti等的研究表明2種以上的腦脊液標記物的改變可以正確的預(yù)測MCI向AD的轉(zhuǎn)變(ParnettiL，2006)。Hansson等對180例MCI患者的研究，在基線狀態(tài)鑒別進展為AD的MCI患者，t-tau聯(lián)合A3h2的敏感性和特異性為95%和83%(Hasson0，2006)。在一個多樣本多中心的研究中，236例中有93例AD患者，33例非AD，56例其他神經(jīng)障礙，54例健康對照，應(yīng)用腦脊液A^-42和t-tau聯(lián)合檢測，AD的檢出率敏感性71X，特異性為83%。另一項研究中，AD和對照的鑒別敏感性為90X，特異性為80%。Galasko認為，在判斷早期阿爾茨海默病方面，APh2水平降低比tau蛋白水平升高更具臨床意義。提示早期阿爾茨海默病患者可能先出現(xiàn)腦脊液APh2濃度的降低；這種聯(lián)合定量檢測診斷早期阿爾茨海默病的敏感度為90.00%,特異度80.00%。由此可見，對腦脊液中相關(guān)生物學(xué)標志物進行聯(lián)合檢測，其診斷價值明顯優(yōu)于單一檢測方法。若同時檢測患者腦脊液中磷酸化tau蛋白濃度則可增加診斷的特異性。因為大多數(shù)額顳癡呆和Lewy體癡呆患者腦脊液中的磷酸化tau蛋白濃度均處于正常值范圍。因此，聯(lián)合檢測腦脊液tau蛋白、Ae卜42和磷酸化tau蛋白等生物學(xué)標志物濃度，可提高阿爾茨海默病診斷的特異性。而目前，檢測阿爾茨海默氏病的可溶性標志物基本上都采用酶聯(lián)免疫(ELISA)的方法或免疫印跡方法。然而，這些早期標志物在腦脊液中濃度很低，用ELISA法無法準確檢測其濃度。同時，ELISA法一次反應(yīng)只能檢測一個指標。如果要檢測多個指標，則需要多個反應(yīng)來完成，不僅浪費時間，同時還浪費標本，檢測成本相對較高。因此，應(yīng)用一次反應(yīng)同時檢測多個指標的技術(shù)平臺檢測阿爾茨海默病具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有阿爾茨海默病缺乏方便有效的早期診斷方法以及現(xiàn)有技術(shù)一次只能檢測一個神經(jīng)生化標志物的缺陷，提供一種可以五種標志物聯(lián)檢的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，該液相芯片為阿爾茨海默病的早期診斷提供一種高效，準確，簡便的臨床檢測手段。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，包括有1)包被微球含有分別包被了t-tau捕獲抗體的微球，包被了p-tau231捕獲抗體的微球，包被了p-taul81捕獲抗體的微球，包被了P-taul99捕獲抗體的微球，和包被了AP!—42捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及A^-42的檢測抗體；和3)鏈親和素藻紅蛋白。優(yōu)選為，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為110-140個爾l，更優(yōu)選為120個~1;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為1-3ug/ml，更優(yōu)選為2ug/ml。液相芯片技術(shù)也叫流式熒光技術(shù)，該技術(shù)由一種微球作為反應(yīng)載體，微球用聚苯乙烯材料制成，直徑5.6咖，表面有活性羧基可供化學(xué)偶連用，抗原、抗體等生物大分子可通過氨基與微球表面的羧基通過化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合(即包被過程)。在微球制造過程中加入紅外和遠紅外兩種熒光染料，根據(jù)兩種染料混合比例的不同將微球進行編碼，可區(qū)分出上百種不同編碼的微球。使用時，先將t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及AP1-42的捕獲抗體分別包被于不同顏色編碼的微球上，同時分別用生物素標記t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及Aei-42的檢測抗體。將包被好的五種微球混合，懸浮于液相，再加入待檢測標本，在懸液中微球上標記的捕獲抗體與標本中相應(yīng)的檢測物的某一個表位異性地結(jié)合，之后加入生物素標記的檢測抗體與標本中相應(yīng)檢測物的另一表位特異性結(jié)合，反應(yīng)完全后加入熒光物質(zhì)——藻紅蛋白標記的鏈親和素，由于鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE)可以與生物素高度特異性結(jié)合，因此反應(yīng)體系中最后形成"微球-捕獲抗體+待檢測物+生物素標記的檢測抗體+SA-PE"的五種復(fù)合物，以微球為載體，通過Luminex系列液相芯片分析儀器檢測，讀取微球的色彩編號及SA-PE的熒光值。微球色彩編號可辨別檢測項目，SA-PE熒光值與各檢測物濃度呈正相關(guān)，通過測定t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及AP1-42標準品在不同濃度下的熒光值，可以獲得各個檢測指標標準品濃度-熒光值標準曲線以及標準曲線方程。將待測腦脊液樣本檢測所得熒光值代入標準曲線方程即可分別求得待測樣本中的t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及AP1-42的量。由于所有反應(yīng)均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，使探針和被檢測物的反應(yīng)更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。本發(fā)明另一需要解決的技術(shù)問題是提供上述阿爾茨海默病早期診斷液相芯片的制備方法。一種阿爾茨海默病早期診斷液相芯片的制備方法，主要包括以下步驟(1)相應(yīng)的捕獲抗體包被微球陽將50pL微球活化后，215000卬m，離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280pL50mM的MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonicacid)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin，后將微球于^15000rpm，離心8—12min;重復(fù)該步驟；-吸棄上清，將微球重懸于100pL50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往懸浮的微球中加入相應(yīng)的0.8-1.2嗎抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550jiL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯(lián)了抗體后的微球以^12000g的速度，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸于50(HiLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;再于^12000g，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球^12000g，離心4一6min;重復(fù)該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于500-1000nLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)后置于2-8'C避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)微球的濃度均為120個爾1;(2)每種檢測抗體的生物素標記-依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積；-用DMSO(Dimethylsulfoxide)溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反應(yīng)液；-按摩爾比1:100于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應(yīng)液；-加入體積為目標體積的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25。C恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉(zhuǎn)速為800rpm-1000rpm;-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin;-使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合。所述活化微球的步驟如下--用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50pL微球離心8—10min;12-去掉上清夜，將微球重懸于100nL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約30s，^15000rpm離心l一2min;-吸棄上清，加入80pL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約lmin;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmin;-力口入10pL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應(yīng)約20min。本發(fā)明方法結(jié)合液相芯片平臺高通量多指標并行檢測的特性與雙抗體夾心法高靈敏度的特性，同步檢測5種神經(jīng)生化標志物，能提高阿爾茨海默病早期診斷的準確率，同時為阿爾茨海默病的病情監(jiān)測及預(yù)后判斷提供依據(jù)。本發(fā)明所公開的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片可一次反應(yīng)同時完成多種神經(jīng)生化標志物的定量檢測，從而達到對阿爾茨海默病的早期準確診斷。本發(fā)明所提供的阿爾茨海默病早期診斷檢測液相芯片還具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。另外，本發(fā)明的制備方法簡單易行，穩(wěn)定性好，其技術(shù)方案中的各種工藝參數(shù)如微球和抗體的量、反應(yīng)過程等均是在大量試驗基礎(chǔ)上得出的，為制備過程最佳的參數(shù)值。圖1是檢測t-tau的標準曲線示意圖；圖2是檢測p-tau231的標準曲線示意圖；圖3是檢測p-taul81的標準曲線示意圖；圖4是檢測p-taul99的標準曲線示意圖；圖5是檢測ew2的標準曲線示意圖。。具體實施方式實施例1阿爾茨海默病早期診斷液相芯片的制備及抗原的檢測本發(fā)明所述的捕獲抗體為分別能對應(yīng)與t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及AP匸42特異性結(jié)合的單克隆抗體；所述的檢測抗體為分別能與t-tau、p-tau231、p-taul81、p-tau199及APh2特異性結(jié)合的單克隆抗體或多克隆抗體。本實施例所用的t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及APh2的捕獲抗體與檢測抗體購自晶美生物工程有限公司。本實施例中，所述各種溶液的配方如下1.50mM的MES緩沖液(pH5.0)配方(250ml):<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.PBS配方<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>SodiumAzideSigmaS-80320.05%Azide500mg1.阿爾茨海默病早期診斷液相芯片試劑盒，包括有1)5-plex包被微球含有分別包被了t-tan捕獲抗體的20號微球，包被了p-tau231捕獲抗體的32號微球的偶聯(lián)體，包被了p-taul81捕獲抗體的34號微球，包被了p-taul99捕獲抗體的36號微球，包被了APH2捕獲抗體的38號微球。2)5-plex生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及A01-42的檢測抗體；3)鏈親和素藻紅蛋白(SA-PE，10ug/ml);還按照現(xiàn)有技術(shù)配套有4)分析緩沖液；5)5-plex標準品；6)質(zhì)控液I;7)質(zhì)控液II;8)基質(zhì)液；9)封口膜；10)濾板。2.制備上述液相芯片試劑盒，包括有如下步驟(1)按上述試劑盒的組成，每種捕獲抗體包被相應(yīng)的微球，制備方法相同-分別選取20號、32號、34號、36號、38號微球(美國Luminex公司)，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球，大約30s;-各取50pL微球于1.5ml的離心管中，15000rpm離心lOmin;-小心去掉上清夜，將微球重懸于lOO^L的雙蒸水中，渦漩振蕩約30s,超聲處理lmin;15000rpm離心10min;-吸棄上清，加入80nL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-加入10nL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmin;-力口入10nL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應(yīng)約20min;-活化后的微球，215000rpm，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸于250pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球^15000rpm，離心10min;重復(fù)該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于100pL50mM的MES(pH5.0)的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往懸浮的微球中加入l嗎抗體，用50mM的MES(pH5.0)溶液將總體積補至500pL;-用渦漩振蕩器混勻，25'C避光振蕩2hr(轉(zhuǎn)速900rpm);-偶聯(lián)抗體后的微球以^12000g的速度，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸于500pLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;-微球^12000g，離心10min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球上12000g，離心5min;重復(fù)該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于60(^LPBS-TBN溶液中；-包被好的微球通過luminex儀器計數(shù)；-包被好的微球置于2-8'C避光保存，每種抗體偶聯(lián)的微球單獨保存，使用時，依據(jù)檢測項目選擇等比例混合。(2)按上述試劑盒的組成，每種檢測抗體的生物素標記-依據(jù)蛋白濃度計算反應(yīng)體系；-依據(jù)蛋白濃度計算抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目標體積(V);國配置NHS-Biotin反應(yīng)液(用DMSO溶解，使其濃度為10mg/ml);-按摩爾比1:IOO于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin(10mg/ml)反應(yīng)液；-加入1A0目標體積的NaHC03(pH8.9)溶液；-加入PBS(pH7.4)補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25'C恒溫箱中避光孵育4h，轉(zhuǎn)速為900rpm;-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin;-測定蛋白濃度。3.用于檢測，包括如下步驟1)使用前先取出所有試劑，放置平衡至室溫。2)標準品的稀釋每個標準品設(shè)6個稀釋度，然后等比例混合，使各自得終濃度為所需的濃度。各管稀釋方法及理論濃度(同下表中的預(yù)期濃度)注意每個濃度標準品稀釋完后均必須用渦旋混合儀徹底混勻后才可用于下一濃度的稀釋?；靹蜻^程避免產(chǎn)生泡沫。3)設(shè)置96孔板布局，確定96孔板上標準品、質(zhì)控品、待測樣品及空白孔的位置?？紤]到儀器讀數(shù)的順序是按照從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序縱向讀數(shù)，在設(shè)置96孔板布局時應(yīng)遵循從第1列到第12列、從第A行到第H行的順序排列。4)按照設(shè)置好的96孔板布局，每孔加25pl分析緩沖液，再分別加入25ul標準品、質(zhì)控品到各自孔中，空白孔加25ul分析緩沖液。5)分別取出上述制備的針對五種神經(jīng)生化標志物檢測的捕獲抗體偶聯(lián)微球，用渦旋混合儀混勻30鈔，超聲處理30秒，按等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)的微球濃度均為120個&1。往每孔中加入的五種捕獲抗體偶聯(lián)微球的混合懸液25pl。包被微球應(yīng)在臨用前混勻，且混勻后應(yīng)立即使用，否則放置過久微球會再沉淀。6)用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96.孔板以避光，25。C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，孵育60分鐘。7)孵育完成后每孔加入25ul上述制備的生物素標記的檢測抗體的混合液(其中所述五種生物素標記的檢測抗體事先按等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到2ug/ml，搖勻)，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育60分鐘。8)孵育完成后每孔加入25ul鏈親和素藻紅蛋白，用封口膜封住所有加樣孔口，并用錫箔紙包住96孔板以避光，25'C放置在微孔板振蕩器上以600轉(zhuǎn)速度震蕩，再孵育30分鐘。9)于Luminex系列液相芯片分析儀上讀取結(jié)果。儀器可自動繪制標準曲線，并計算出待測樣品的測值。4.實驗結(jié)果分析請參見表1—表3和圖l一圖5。本發(fā)明所公開的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片只需25uL的腦脊液樣本即可一次反應(yīng)同時完成五種神經(jīng)生化標志物的定量檢測。同時，與放射免疫，化學(xué)發(fā)光檢測及酶聯(lián)免疫吸附等方法相比，液相芯片平臺檢測范圍更寬，靈敏度更高，重復(fù)性更好。由于所有反應(yīng)均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，使探針和被檢測物的反應(yīng)更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。通過對t-tau、p-tau231、p-taul81、p-taul99及APi-42捕獲抗體和檢測抗體的配對，我們找到了適用于這五種神經(jīng)生化標志物檢測的最優(yōu)抗體對。通過標準曲線的分析，可以看到本發(fā)明所提供的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片對神經(jīng)生化標志物的檢測具有很高的檢測靈敏度和特異性。其中，t-tau與APp42標準曲線的線性在9.77pg/ml10ng/ml的濃度范圍內(nèi)R2>0.99，最低檢測限可達9.77pg/ml。p-tau231，p-taul81及p-taul99的標準曲線在2.44pg/ml2.5ng/ml的濃度范圍內(nèi)R2>0.99,最低檢測限可達2.44pg/ml，且各個標準點的實測濃度與預(yù)期濃度的相對誤差不超過8%。因此，本發(fā)明提供的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片能對腦脊液中五種神經(jīng)生化標志物極微量的變化進行檢測，并且能一次性檢測五種具有早期診斷及不同鑒別診斷價值的祌經(jīng)生化標志物，從而提高阿爾茨海默病診斷的準確率，同時為阿爾茨海默病的病情監(jiān)測及預(yù)后判斷提供重要依據(jù)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>權(quán)利要求1.一種阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，其特征是，主要包括有1)包被微球含有分別包被了t-tau捕獲抗體的微球，包被了p-tau231捕獲抗體的微球，包被了p-tau181捕獲抗體的微球，包被了p-tau199捕獲抗體的微球，和包被了Aβ1-42捕獲抗體的微球，上述微球分別具有不同顏色編碼；2)生物素標記檢測抗體含有分別用生物素標記的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的檢測抗體；和3)鏈親和素藻紅蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，其特征是，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為110-140個/nl;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為l-3ug/m丄。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，其特征是，每種包被捕獲抗體的微球的使用濃度為120個&1;每種生物素標記檢測抗體的使用濃度為2ug/ml。4.一種制備權(quán)利要求1所述阿爾茨海默病早期診斷液相芯片的方法，主要包括以下步驟(1)每種相應(yīng)的捕獲抗體包被微球-將50^L微球活化后，^15000rpm，離心；-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280nL50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin，后將微球于^15000rpm，離心；重復(fù)該步驟；-吸棄上清，將微球重懸于lOO^L50mMpH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-往懸浮的微球屮加入相應(yīng)的0.8-1.2嗎抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550nL;-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr;-偶聯(lián)了抗體后的微球以^12000g的速度，離心8-12min;-吸棄上清，將微球重懸于500nLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;-室溫避光振蕩30min;再于^12000g，離心8—12min;-吸棄上清，將微球重懸于lmLPBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約30s，超聲處理lmin;微球^12000g，離心4一6min;重復(fù)該步驟一次；-吸棄上清，將微球重懸于500-1000nLPBS-TBN溶液中；-每種包被好的微球通過Iuminex儀器計數(shù)后置于2-8"C避光單獨保存，使用時，依據(jù)檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯(lián)微球的濃度均為110-140個爾l;(2)每種檢測抗體的生物素標記-依據(jù)檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至lmg/ml的體積，視為目f示體積；-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反應(yīng)液；-按摩爾比1:100于反應(yīng)管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應(yīng)液；-加入體積為目標體積的1/10的pH8.9的NaHC03溶液；-加入pH7.4的PBS補至目標體積；-包上鋁箔，將反應(yīng)管置于振蕩器上，于25'C恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉(zhuǎn)速為800rpm-1000rpm;-將反應(yīng)液轉(zhuǎn)至透析盒內(nèi)，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應(yīng)的NHS-Biotin;-使用時根據(jù)需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到l-3ug/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是所述活化微球的步驟如下-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；-取50^L微球離心8—10min;-去掉上清夜，將微球重懸于100pL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約30s，超聲處理lmin，蘭15000rpm離心8—12min;-吸棄上清，加入80pL的磷酸鹽緩沖液，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約lrain;-加入10pL50mg/mLSulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻，超聲處理lmin;-力口入10pL50mg/mLEDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；-室溫震蕩反應(yīng)約20min。全文摘要本發(fā)明公開了一種阿爾茨海默病早期診斷液相芯片，主要包括有包被微球含有分別包被了t-tau捕獲抗體的微球，包被了p-tau231捕獲抗體的微球，包被了p-tau181捕獲抗體的微球，包被了p-tau199捕獲抗體的微球，和包被了Aβ_1-42捕獲抗體的微球，上述微球具有不同顏色編碼；分別用生物素標記的檢測抗體；鏈親和素藻紅蛋白。本發(fā)明所提供的阿爾茨海默病早期診斷液相芯片具有檢測效率高，所需樣本量少，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。同時，各項神經(jīng)生化損傷標志物可自由組合，使用方便。同時，由于所有反應(yīng)均處在液相環(huán)境，更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，使探針和被檢測物的反應(yīng)更快更完全，因此檢測靈敏度和線性范圍均得到極大的提高。文檔編號G01N33/546GK101246164SQ20081002611公開日2008年8月20日申請日期2008年1月29日優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日發(fā)明者林一群,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司