專利名稱：雌二醇化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外臨床檢驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于雌二醇 (E2)定量檢測(cè)試劑盒及相關(guān)制備方法和使用方式。
背景技術(shù)：
雌二醇(estradiol，E2)是一種A環(huán)為苯環(huán)的18碳類固醇激素，分子量272. 4Da, 為人體雌激素(estrogen)的主要組成部分。血中70%雌二醇與性激素結(jié)合球蛋白(SHBG) 結(jié)合，25%與血漿白蛋白結(jié)合，其余為游離型。E2主要由卵巢濾泡、黃體及妊娠時(shí)胎盤產(chǎn)生， 極少量由睪丸合成或?yàn)椴G酮的代謝物，并成為男性雌激素的主要來源。雌激素的另一組成 成分雌三醇(estriol，E3)，除孕期胎盤可直接分泌外，均為E2在肝臟中降解的代謝產(chǎn)物。 雌激素中除了 E2和E3外，還包括雌酮(estrone)，但三者以E2的活性最強(qiáng)，雌酮的活性僅 為E2的20%，E3活性最低。雌二醇的合成呈周期性變化，能夠促進(jìn)女性生殖器官的形成及發(fā)育，第二性征的 出現(xiàn)及維持，并與孕激素協(xié)同形成月經(jīng)周期。此外，還具有廣泛的代謝調(diào)劑作用。正常妊娠 E2輕度升高，胎盤娩出后急劇下降。異常妊娠時(shí)，E2大都升高，如雙胎或多胎妊娠以及糖 尿病孕婦；若E2降低，則可能為妊娠高血壓綜合征重癥、胎兒宮內(nèi)死亡或葡萄胎等情況，宜 結(jié)合其它檢查予以確定，以便及時(shí)處理。此外，引起E2升高的病理性原因還可能為卵巢癌 (如卵巢顆粒層細(xì)胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪樣細(xì)胞瘤等)、心臟病(如心肌梗塞、心絞痛、冠 狀動(dòng)脈狹窄)以及其他疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝硬化、男性肥胖癥等)。病理性E2降低的 因素較多，如卵巢發(fā)育低下、原發(fā)性卵巢衰竭、垂體性閉經(jīng)或不孕、柯興氏綜合征、阿狄森氏 病、惡性腫瘤、較大范圍的感染、腎功能不全、腦及垂體的局灶性病變等。由此可見，E2對(duì)于 臨床疾病的診斷具有廣泛的意義，是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年問世， 1985年第一代化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒研制成功并投放市場(chǎng)。上世紀(jì)70年代中期Arakawe首 次報(bào)道用發(fā)光信號(hào)進(jìn)行酶免疫分析，利用發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)分析超微量物質(zhì)，特別是用于臨 床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)。目前，這一技術(shù)已從實(shí)驗(yàn)室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī) 學(xué)的常規(guī)檢測(cè)手段?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合， 用于檢測(cè)微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。其檢測(cè)原理與放射免疫(RIA)和 酶免疫(EIA)相似，不同之處是以發(fā)光物質(zhì)作為底物，并藉助其自身的發(fā)光強(qiáng)度直接進(jìn)行 測(cè)定?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常 用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物一acridinium ester (AE)，是有效的發(fā)光標(biāo)記 物，其通過起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)作用而發(fā)光，強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成，為快 速的閃爍發(fā)光。還有以三聯(lián)吡啶釕(Ru(byp)32+)標(biāo)記物為發(fā)光底物，用另一反應(yīng)物三丙胺 (TPA)來激發(fā)光反應(yīng)，在電極表面反復(fù)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)從而產(chǎn)生高效穩(wěn)定連續(xù)發(fā)光的電 化學(xué)發(fā)光免疫分析。這些免疫分析方法都需要高精度復(fù)雜的自動(dòng)測(cè)量?jī)x器，目前在國(guó)內(nèi)還難以實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析是以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)(如酶標(biāo)記的抗原或抗體)進(jìn)行免 疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號(hào)試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號(hào)測(cè) 定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們 有各自的發(fā)光底物。HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰胼，luminol)或其衍生 物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰胼)等，魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，在過氧 化物酶及活性氧的存在下，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，其波長(zhǎng)為425nm。發(fā)光 強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。如果不使用增強(qiáng)劑，魯米諾體系的發(fā)光基本上為閃 光型且信號(hào)弱，通過加入某些特殊的增強(qiáng)劑可增強(qiáng)發(fā)光的信號(hào)并可大大延長(zhǎng)發(fā)光的持續(xù)時(shí) 間?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度(檢測(cè)限度可達(dá)10_15 10_18mol/ L)，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作，且測(cè)試中不使用有害的試 劑。試劑保持期長(zhǎng)，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷工作，成為非放射性免疫分析 法中最有前途的方法之一。但是，國(guó)外的自動(dòng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析儀及與之相匹配的試劑 盒多采用封閉體系配合使用，價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，在國(guó)內(nèi)不易推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，提供了一種能夠定量檢測(cè)E2的 試齊U盒。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種雌二醇化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品， 質(zhì)控品，濃縮洗滌液，所述的反應(yīng)板包被有雌二醇抗體。所述的校準(zhǔn)品以雌二醇純品配制，濃度優(yōu)選為0、25、100、250、500、1000pg/ml。所述的質(zhì)控品以雌二醇純品配制，由質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì)控品I 的濃度為3-M0pg/ml，質(zhì)控品II的濃度為255-950pg/ml。所述的質(zhì)控品I的濃度優(yōu)選為85. 6pg/ml，質(zhì)控品II的濃度優(yōu)選為917. 5pg/ml。所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的雌二醇抗原，所述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明的聚苯 乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是 pH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。本發(fā)明提供的試劑盒具有開放性系統(tǒng)，可以應(yīng)用于多種不同公司的化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 儀器，無需昂貴的專用配套儀器，并具有簡(jiǎn)便，快速，穩(wěn)定的檢測(cè)能力，易于在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)推
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1 :E2定量檢測(cè)試劑盒的制備
(1)抗E2的抗體包被板制備a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去離子水 定容至IOOOml即成10倍包被液，臨用前稀釋十倍，加入適量抗E2單抗(購(gòu)買自Meridian lifescience)混勻，然后加入到微孔板板孔中，100 μ 1/孔，4°C 16小時(shí)；b.封閉棄去包被液，在吸水紙紙上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐劑 (Procl in 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小時(shí)；c.封袋棄去封閉液，在吸水紙上拍干，室溫下于真空干燥箱中抽5小時(shí)，立即進(jìn) 行真空封袋，檢查有無漏氣，如有重新封袋，貼上標(biāo)簽后于2-8°C保存。(2)酶標(biāo)記物的制備用含有2. 5% BSA、1.5%的脫脂奶粉和0.05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽 緩沖液(pH 7.4)配制緩沖系統(tǒng)。E2(購(gòu)買自Meridian lifescience)用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶交聯(lián)。(3) E2校準(zhǔn)品的制備用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)配制 緩沖系統(tǒng)。用E2純品配制校準(zhǔn)品工作液(E2純品購(gòu)買自Meridian lifescience)，分別為 0、25、100、250、500、1000pg/ml 共 6 個(gè)濃度。(4) E2質(zhì)控品的制備小牛血清與去離子水6 4混合，并添加0. 05%防腐劑(Proclin 300)，配制成 質(zhì)控品緩沖液。用E2純品制備質(zhì)控品工作液(E2純品購(gòu)買自Meridian lifescience)分裝 85. 6pg/ml、917. 5pg/ml。(5)化學(xué)發(fā)光底物液的制備使用 PIERCE 公司的SuperSignaf ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作為配套檢測(cè)液。A液、B液各1瓶。(6) 20 X濃縮洗滌液制備取NaCl 170g吐溫-20 IOml加水定容至IL即成，臨用前稀釋20倍。(7)半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝后即為半成品。抽檢合格后組裝成試劑盒成品，成品還需 抽檢，合格后才能出廠。實(shí)施例2 :E2定量檢測(cè)試劑盒的使用方法1.試劑和樣本準(zhǔn)備(1)試劑準(zhǔn)備a.將試劑盒置室溫(1816°C )平衡20分鐘。b.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1 20稀釋后加入洗板機(jī)的洗液 瓶中。(2)樣本準(zhǔn)備使用前將待測(cè)的合格血清或血漿置室溫(1846°C )平衡20分鐘。2.操作步驟a.取出所需的E2抗體包被微孔板置于微孔架上
b.加入校準(zhǔn)品1-6、質(zhì)控品1-2和待測(cè)樣本，每孔20 μ 1。c.加入酶標(biāo)記物100 μ 1/孔。d.輕柔震蕩混勻。e.室溫孵育35分鐘。f.棄去孔內(nèi)廢液。手工洗滌棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔、靜置5秒，甩干，重復(fù)5次后拍干；洗板機(jī)洗滌每孔350 μ 1，重復(fù)4次，洗滌后拍干。g.加發(fā)光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化學(xué)發(fā)光儀中檢測(cè)信號(hào)值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算可以采用作圖法或計(jì)算法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算作圖法以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為橫坐標(biāo)⑴，以其對(duì)應(yīng)的信號(hào)值為縱坐標(biāo)⑴ 繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)檢測(cè)樣本測(cè)得的信號(hào)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的抗原含量Ig 值，再計(jì)算出抗原含量。計(jì)算法以標(biāo)準(zhǔn)品抗原含量的Ig值為自變量(X)，以其對(duì)應(yīng)的信號(hào)值為因變量 (Y)，求出回歸方程，將待測(cè)標(biāo)本的信號(hào)值帶入回歸方程，求得相應(yīng)的抗原含量。
權(quán)利要求
1.一種雌二醇化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括反應(yīng)板，酶結(jié)合物，發(fā)光底 物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液，所述的反應(yīng)板包被有雌二醇抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的校準(zhǔn)品以雌二醇純品配制，濃度為 0、25、100、250、500、1000pg/ml。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品以雌二醇純品配制，由 質(zhì)控品I和質(zhì)控品II兩部分組成，質(zhì)控品I的濃度為3-M0pg/ml，質(zhì)控品II的濃度為 255-950pg/mlo
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品I的濃度為85.6pg/ml，質(zhì) 控品II的濃度為917. 5pg/ml。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶結(jié)合物為HRP標(biāo)記的雌二醇，所 述的反應(yīng)板材質(zhì)是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發(fā)光底物為魯米諾、異魯米諾或其 衍生物，所述的濃縮洗滌液是pH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雌二醇化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括雌二醇檢測(cè)反應(yīng)板，反應(yīng)板包被有雌二醇抗體。雌二醇定量檢測(cè)試劑盒，還包括酶結(jié)合物，發(fā)光底物，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，濃縮洗滌液。本發(fā)明可以專一的定量檢測(cè)出病人血清雌二醇的含量，用于輔助診斷卵巢發(fā)育低下、原發(fā)性卵巢衰竭、垂體性閉經(jīng)或不孕、柯興氏綜合征、阿狄森氏病、惡性腫瘤、腦及垂體的局灶性病變等疾病。與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比，本發(fā)明不僅保留了ELISA技術(shù)的高度特異性，檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和操作的簡(jiǎn)便性，同時(shí)采用的化學(xué)發(fā)光法能提高檢測(cè)的靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/74GK102095880SQ20091020039
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者汪寧梅, 王通, 穆宇豪, 穆海東 申請(qǐng)人:上海裕隆生物科技有限公司