專(zhuān)利名稱(chēng)：化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre－S1試劑盒及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物物質(zhì)的測(cè)試和分析方法及所用物質(zhì)，尤其涉及生物物質(zhì)的檢測(cè)方法及其所用試劑盒，特別涉及生物物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法及其所用試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種流行廣、難治愈的傳染性疾病。作為乙肝病毒復(fù)制的標(biāo)志物有HBeAg、Pre-S1、HBcAg、DNA多聚酶。由于HBcAg、DNA多聚酶的檢測(cè)步驟繁瑣，往往不便作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。HBeAg是臨床上應(yīng)用于了解病毒傳染性以及病毒復(fù)制的一項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)，Pre-S1則正在逐漸成為常規(guī)檢測(cè)的一項(xiàng)指標(biāo)。
Pre-S1是HBV外膜蛋白中大蛋白的一部分，它含有肝細(xì)胞受體，在HBV感染細(xì)胞和機(jī)體免疫應(yīng)答方面起重要作用。在病毒感染機(jī)體的整個(gè)周期中，其能夠較充分的反應(yīng)機(jī)體的病毒感染和體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)歸過(guò)程。在臨床上出現(xiàn)HBeAg缺陷的HBV血清型中，檢測(cè)Pre-S1能較為準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制狀況。
關(guān)于Pre-S1的現(xiàn)有知識(shí)以及應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)已有豐富的積累，如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)02159941公開(kāi)了一種基因重組乙肝病毒表面抗原的基因修飾序列及其產(chǎn)物，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)01127973公開(kāi)了一種抗乙型肝炎病毒Pre-S1抗原的人源單鏈抗體，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)00123612公開(kāi)了一種高效表達(dá)乙肝表面S(主蛋白)和S1(大蛋白)融合抗原的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，中國(guó)專(zhuān)利ZL01113087公開(kāi)了一種乙型肝炎DNA疫苗；美國(guó)專(zhuān)利US6004561，美國(guó)專(zhuān)利US6077691以及歐洲專(zhuān)利EP0637631則各公開(kāi)了一種帶乙肝病毒修飾Pre-S1抗原的多肽的高效表達(dá)。
技術(shù)的發(fā)展，提出了進(jìn)行Pre-S1檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需求，理由是首先，檢測(cè)Pre-S1可以彌補(bǔ)和加強(qiáng)乙肝五項(xiàng)檢測(cè)的不足1、Pre-S1出現(xiàn)在急性乙型肝炎感染的早期，在轉(zhuǎn)氨酶升高前即可查出，提示可作為早期診斷乙肝病毒感染的指標(biāo)。2、急性乙型肝炎患者Pre-S1陰轉(zhuǎn)越早，預(yù)后越好，是病毒清除的最早跡象。反之，Pre-S1持續(xù)陽(yáng)性，將發(fā)展至慢性肝炎，此指標(biāo)比HBeAg陰轉(zhuǎn)、HBsAb陽(yáng)轉(zhuǎn)指標(biāo)提示要早。3、HbeAb陽(yáng)性的慢性乙型肝炎患者約占慢性乙肝患者的30％-50％，提示乙肝病毒在機(jī)體內(nèi)仍然繼續(xù)復(fù)制，此類(lèi)患者更容易演變?yōu)楦斡不蚋伟?。檢測(cè)Pre-S1，彌補(bǔ)了因HBeAg缺失造成的診斷和治療困難。4、在HBV無(wú)癥狀攜帶者中，有一定比例的HbeAb陽(yáng)性患者，Pre-S1陽(yáng)性提示病毒在體內(nèi)還較活躍。病毒并沒(méi)有清除，肝臟還有潛在的病理?yè)p傷的可能。5、抗病毒治療乙型肝炎時(shí)，檢測(cè)Pre-S1指標(biāo)可作為治療前的患者篩查和治療后的療效判斷依據(jù)，尤其對(duì)HbeAb陽(yáng)性的慢性肝炎患者抗病毒治療的排查也起到重要作用。
其次，現(xiàn)有常規(guī)的HbeAg檢測(cè)不能替代Pre-S1的檢測(cè)對(duì)于HbeAb(+)的HBV感染者，檢測(cè)Pre-S1尤為重要。在中國(guó)近3千萬(wàn)人的慢性乙型肝炎患者中，其中約有30％左右的患者，抗HBe陽(yáng)轉(zhuǎn)后，病毒在體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制，病情較重，其中部分可以演變?yōu)楦斡不蚋伟?，自然好轉(zhuǎn)率非常低。同樣，HBeAb(+)的HBV無(wú)癥狀攜帶者也占有一定的比例。這一部分HBeAb(+)的慢性肝炎和HBV無(wú)癥狀攜帶者，往往是因?yàn)椴《净蜃儺愃?，其所攜帶的HBV變異毒株大多數(shù)表現(xiàn)為在病毒基因組前C區(qū)末端1896位發(fā)生G-A點(diǎn)突變，產(chǎn)生一個(gè)新的終止密碼子(TAG)，阻斷了HBeAg的形成，導(dǎo)致在臨床上出現(xiàn)HBeAg缺陷的HBV血清型，因此HBeAg的缺失，造成診斷和治療的困難。此時(shí)，檢測(cè)Pre-S1既能較為準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制狀況，又能診斷疾病的轉(zhuǎn)歸和了解是否攜帶HBV變異毒株。充分顯示了Pre-S1的臨床價(jià)值。所以抗HBeAb(+)的HBV感染者中，檢測(cè)Pre-S1是非常必要的。
再則，現(xiàn)有的檢測(cè)HBV-DNA不能替代檢測(cè)Pre-S11、Pre-S1是乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白中大蛋白的主要部分，它含有肝細(xì)胞受體，在HBV感染細(xì)胞和機(jī)體免疫應(yīng)答方面起重要作用。在病毒感染機(jī)體的整個(gè)周期中，Pre-S1的獨(dú)特功能，使其能夠較充分的反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)歸過(guò)程，如早期診斷，急性肝炎Pre-S1陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，反之疾病將發(fā)展至慢性肝炎，這是單一測(cè)定HBV-DNA所不能做到的。2、免疫測(cè)定技術(shù)因其有效、直接、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已經(jīng)在臨床診斷應(yīng)用上占主導(dǎo)地位。Pre-S1的檢測(cè)與基因測(cè)定HBV-DNA在治療方面能夠相互補(bǔ)充和加強(qiáng)，就像HBV-DNA不能替代乙肝五項(xiàng)的檢測(cè)一樣，同樣HBV-DNA也不能替代Pre-S1的檢測(cè)。3、HBV DNA-PCR技術(shù)要求精密、所需要的條件高，易發(fā)生污染和假陽(yáng)性，不適于做常規(guī)檢測(cè)，前S1抗原測(cè)定與之相互補(bǔ)充和加強(qiáng)，使結(jié)果特異，準(zhǔn)確無(wú)誤，進(jìn)而提高臨床大夫的診斷和治療水平。
技術(shù)的發(fā)展，更進(jìn)一步地提出了進(jìn)行Pre-S1定量檢測(cè)的現(xiàn)實(shí)需求，理由是乙肝病人的病理生理，決定于病毒與機(jī)體免疫狀態(tài)，兩者的相互作用使感染者表現(xiàn)為病毒攜帶者、黃疸性肝炎、無(wú)黃疸性肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、重癥肝炎。目前治療肝炎尚無(wú)特效藥，在肝炎的診療過(guò)程中，需要觀察病情、判斷預(yù)后、考核療效、修訂治療方案，測(cè)定乙肝病毒復(fù)制增加或減少是必不可少的。
在乙肝病程中機(jī)體HBV的量會(huì)隨著治療與機(jī)體的免疫狀況變化而變化，由于s區(qū)較c區(qū)保守，突變少，檢測(cè)Pre-S1能準(zhǔn)確的檢測(cè)病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制狀況，在病情好轉(zhuǎn)、治療有效、病毒復(fù)制減少時(shí)，Pre-S1減少或消失，反之則增加、持續(xù)存在。Pre-S1則隨著HBV的量發(fā)生變化，HBV增加，Pre-S1增加；HBV減少，Pre-S1減少；HBV消失，Pre-S1消失。Pre-S1的變化趨勢(shì)向臨床醫(yī)生提供了治療是否有效、是否需要修改治療方案等的重要信息，測(cè)定變化趨勢(shì)是以定量為基礎(chǔ)的，準(zhǔn)確定量就可以及時(shí)捕捉HBV復(fù)制變化的信息。
免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是感染病原檢測(cè)的首選方法，簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確率也較高。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理很簡(jiǎn)單，外來(lái)致病微生物的特異性蛋白為抗原，人體針對(duì)這種抗原的特異性免疫球蛋白為抗體?？乖贵w在體內(nèi)會(huì)發(fā)生對(duì)應(yīng)的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室可以用嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，在體外模擬這種免疫反應(yīng)。如果抗原抗體中一種是已知的，就可以檢測(cè)另一種是否存在。在體外用乙型肝炎病毒特異抗體檢測(cè)病人血清，如果發(fā)生了免疫反應(yīng)，便可以通過(guò)指示反應(yīng)指示出來(lái)，最終說(shuō)明病人受到了乙肝病毒感染。
免疫標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)方法是指用酶、化學(xué)(或生物)發(fā)光劑、熒光素、放射性核素、鐵蛋白及膠體金等作為示蹤物，對(duì)抗體或抗原標(biāo)記后進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，藉助于酶標(biāo)檢測(cè)儀、發(fā)光測(cè)定儀、熒光顯微鏡、射線(xiàn)測(cè)量?jī)x等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定，可用于測(cè)定蛋白質(zhì)、激素、抗生素、藥物、病原體等多種抗原和抗體。常用的固相免疫檢測(cè)方法有酶標(biāo)記免疫檢測(cè)方法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法和時(shí)間分辨熒光免疫分析法等。
一方面，針對(duì)Pre-S1的酶標(biāo)記免疫檢測(cè)方法，現(xiàn)有技術(shù)已有所體現(xiàn)，如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)02157663公開(kāi)了一種乙肝病毒前S1抗原酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒及制備方法，這是一種定性的方法。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)02151727公開(kāi)了一種定量法乙肝病毒前S1抗原酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒及制備方法。這項(xiàng)專(zhuān)利采用酶聯(lián)免疫測(cè)定方法，靈敏度低，線(xiàn)性范圍窄，Pre-S1高濃度時(shí)需要進(jìn)行多管稀釋?zhuān)黾恿瞬僮髡`差所帶來(lái)的定量不準(zhǔn)確及操作的復(fù)雜程度。在基因工程制備抗原，提示用到21-47aa和1-199aa兩種片段。在關(guān)于定量所用的標(biāo)準(zhǔn)品的說(shuō)明中，是通過(guò)測(cè)量乙肝病毒的DNA含量來(lái)標(biāo)定，而實(shí)際上Pre-S1抗原為蛋白，由于機(jī)體的免疫反應(yīng)和試劑盒中抗原與抗體反應(yīng)的差異，用定量的HBV DNA做標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定蛋白誤差會(huì)較大。再，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)過(guò)程用到有高傳染性的物質(zhì)，有出現(xiàn)生物制品事故的隱患。
另一方面，由于化學(xué)發(fā)光試劑已廣泛應(yīng)用于甲狀腺功能、垂體功能、腫瘤標(biāo)志物、過(guò)敏原、骨代謝、心臟病、藥物代謝等臨床指標(biāo)多種測(cè)定，是目前放射免疫診斷試劑的換代產(chǎn)品。
可見(jiàn)，如何把化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法應(yīng)用于乙肝病毒復(fù)制的標(biāo)志物Pre-S1，尤其是定量檢測(cè)，并基于這種方法制備出常規(guī)試劑來(lái)判斷乙肝病人病情、了解預(yù)后、考核治療效果，使更廣大的患者受益，現(xiàn)有技術(shù)并沒(méi)有提供現(xiàn)成的解決方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，提高檢測(cè)的靈敏度、線(xiàn)性范圍和定量的準(zhǔn)確性，并提高檢測(cè)效率。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上目的所采用的具體技術(shù)方案包括，生產(chǎn)制造一種化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，包括用Pre-S1抗體預(yù)包被的板/條，標(biāo)記結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物以及至少六種含量不同的作為定量標(biāo)尺的Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。
所述標(biāo)記結(jié)合物指用發(fā)光劑、辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶所標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物。
當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指堿性磷酸酶標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是單組分含發(fā)光劑的溶液；當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指發(fā)光劑標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是單組分含H2O2的堿性溶液；當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記了的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是雙組分含H2O2的組分A和含發(fā)光劑的組分B。
所述Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑為基因工程表達(dá)的Pre-S1蛋白純品。
所述至少六種含量不同的作為定量標(biāo)尺的Pre-S1的抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑中，包括0濃度值和線(xiàn)性范圍高值，其它不同含量為線(xiàn)性范圍近等分值。
所述線(xiàn)性范圍高值指Pre-S1抗原含量為500-2000ng/ml。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上目的所采用的具體技術(shù)方案還包括，提出一種化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備方法，包括以下步驟采用重組Pre-S1 11-119aa制備Pre-S1的抗原；采用所述Pre-S1抗原制備Pre-S1包被抗體或標(biāo)記抗體；并采用所述Pre-S1抗原制備Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。
所述Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑為基因工程表達(dá)的Pre-S1蛋白純品。
所述制備Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑的步驟中，設(shè)置至少六種含量不同的定量標(biāo)尺，包括0濃度值和線(xiàn)性范圍高值，其它不同含量為線(xiàn)性范圍近等分值。
所述線(xiàn)性范圍高值指Pre-S1的重組表達(dá)抗原含量為500-2000ng/ml。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒PRE-S1試劑盒及其制備方法，可提高檢測(cè)的靈敏度、線(xiàn)性范圍和定量的準(zhǔn)確性，并可提高檢測(cè)效率。
發(fā)明內(nèi)容

圖1為本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明予以詳盡說(shuō)明。
本發(fā)明所用的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1抗原的反應(yīng)原理是采用雙抗體夾心法，將抗Pre-S1包被抗體包被于反應(yīng)板上，加入標(biāo)本，標(biāo)本中的Pre-S1抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)，洗去游離部分，加入標(biāo)記抗體，與Pre-S1抗原反應(yīng)后，分離未反應(yīng)的標(biāo)記物，加入底物，底物與發(fā)光劑反應(yīng)或酶作用于底物，產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的光子與被測(cè)物呈線(xiàn)性正相關(guān)，光子被儀器采集測(cè)定后，數(shù)據(jù)自動(dòng)生成并處理。
化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)是測(cè)定技術(shù)繼酶聯(lián)免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、熒光免疫測(cè)定、時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測(cè)定技術(shù)，具有熒光的特異性，不需要激發(fā)光，沒(méi)有放射免疫測(cè)定那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，凡具有抗原性的物質(zhì)都可用CLIA，試劑穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，無(wú)放射污染，為當(dāng)今最為敏感的微量免疫測(cè)定法。
化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定線(xiàn)性范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)，儀器測(cè)定范圍大，測(cè)定Pre-S1時(shí)無(wú)需將標(biāo)本稀釋?zhuān)且环N優(yōu)秀的定量分析方法。
Pre-S1多肽上有多個(gè)抗原決定簇，若僅用21-47氨基酸單個(gè)位點(diǎn)的合成短肽或表達(dá)的串聯(lián)短肽抗原制備的抗體，則抗體只能與抗原上較少位點(diǎn)結(jié)合，在基因突變時(shí)，某一抗原決定簇結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，作為包被的抗體就不能識(shí)別，導(dǎo)致漏檢造成假陰性。我們產(chǎn)品中的Pre-S1采用11-119aa Pre-S1克隆抗原，既包含了Pre-S1全段的抗原位點(diǎn)又利于高表達(dá)，用其制備的多克隆抗體，提高了試劑的靈敏度，減少了假陰性的發(fā)生。
本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒及其制備的技術(shù)路線(xiàn)是克隆Pre-S1基因(HBV2881-3204)，用帶有6-His的表達(dá)載體表達(dá)Pre-S1蛋白，Ni-親和柱純化，免疫動(dòng)物制備多抗和單抗，DE-52離子交換柱純化，檢測(cè)。制備預(yù)包被板、標(biāo)記結(jié)合物，標(biāo)準(zhǔn)品，化學(xué)發(fā)光底物后，進(jìn)行產(chǎn)品組裝。
制備Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑的步驟中線(xiàn)性范圍高值確定的理論依據(jù)用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定Pre-S1時(shí)，由于抗體選擇模式及試劑反應(yīng)選擇模式不同，線(xiàn)性范圍會(huì)有所不同，為0.05-0.1ng---50-100ng/ml，化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法線(xiàn)性范圍較酶聯(lián)免疫方法提高10倍以上，因此線(xiàn)性范圍高值500-2000ng/ml。
1、制備Pre-S1多抗或單抗1.1、制備Pre-S1多抗合成Pre-S1基因片斷的引物--＞克隆Pre-S1基因(HBV2881-3204)--＞測(cè)序--＞酶切--＞與表達(dá)載體連接--＞轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞--＞選擇克隆--＞酶切及測(cè)序鑒定--＞原核表達(dá)Pre-S1--＞純化Pre-S1--＞加福氏完全佐劑免疫兔--＞4周左右抽血測(cè)效價(jià)--＞純化的Pre-S1加福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1-3次--＞檢測(cè)--＞抽血--＞離心制備多抗血清--＞硫酸胺沉淀后用離子交換層析純化多抗。
1.2、制備Pre-S1單抗純化Pre-S1--＞加福氏完全佐劑免疫Balb/C小鼠→陽(yáng)性鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合→篩選陽(yáng)性克隆→鑒定→細(xì)胞株保存、復(fù)蘇、培養(yǎng)→打腹水→硫酸胺沉淀后用離子交換層析純化。
2、制備預(yù)包被板檢測(cè)Pre-S1多抗或單抗做包被--＞加入包被液--＞加入反應(yīng)板--＞4度過(guò)夜--＞拍干--＞加入蛋白穩(wěn)定液--＞4度過(guò)夜--＞拍干--＞干燥--＞裝袋3、制備酶標(biāo)記物檢測(cè)純化的Pre-S1單抗或多抗或HbsAg單抗→與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶或發(fā)光標(biāo)記物偶聯(lián)→檢測(cè)標(biāo)記抗體--＞加入相應(yīng)稀釋液和蛋白穩(wěn)定液--＞檢測(cè)--＞分裝3、制備標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)Pre-S1--＞定量--＞加入基質(zhì)液及穩(wěn)定劑--＞檢測(cè)--＞分裝4、發(fā)光底物堿性磷酸酶為單組分，辣根過(guò)氧化物酶為雙組分購(gòu)買(mǎi)進(jìn)口的發(fā)光底物或自行配制底物，檢測(cè)--＞分裝本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品結(jié)構(gòu)檢測(cè)試劑的人份數(shù)48或96人份預(yù)包被板 1塊，結(jié)合物 1瓶，標(biāo)準(zhǔn)品 1套6瓶或8瓶清洗液 1瓶化學(xué)發(fā)光底物 1瓶或2瓶密封袋 1個(gè)干燥劑 1包說(shuō)明書(shū) 1份5、抗體選擇模式包被抗體是抗Pre-S1單抗，則標(biāo)記結(jié)合物抗體是抗Pre-S1多抗或抗HbsAg單抗，包被抗體是抗Pre-S1多抗，則標(biāo)記結(jié)合物抗體是抗Pre-S1單抗或抗HbsAg單抗。
6、試劑反應(yīng)選擇模式A.一步法樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加樣50ul/孔，標(biāo)記抗體加樣50ul/孔，混勻，37℃溫育20-60分鐘。
B.二步法樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加樣100ul/孔，37℃溫育20-60分鐘，標(biāo)記抗體加樣100ul/孔，混勻，37℃溫育20-60分鐘。
實(shí)施例一Pre-S1抗原制備Pre-S1 11-119aa基因序列atggggacaa atcttgctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac2941 cctgcattca aagccaactc agacaatcca gattgggacc tcaacacgca caaggactac3001 tggccggacg catggaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat3061 gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcctac tcacaactgt gccagcagct3121 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct
3181 ctaagagaca ctcatccaca ggcc1、擴(kuò)增帶有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的Pre-S1基因片段50ul反應(yīng)體積，HBV陽(yáng)性(大三陽(yáng))血清煮10分鐘，吸1ul做模板，P1、P2引物各0.5umol/L(R5’-CG GAA TTC ATGGGG ACA AAT CTT GCT-3’L5’-AAA GGA TTC GGC CTG AGG ATG ACT GT-3’)，Taq DNA聚合酶1U，10mmol/L dNTP貯備液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L)，PCR緩沖液(50mmol KCl、4mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl、pH8.5)，加入H2O至50ul反應(yīng)體積，加入50μl石蠟油，將反應(yīng)管置PCR擴(kuò)增儀上，95℃變性1min，循環(huán)參數(shù)為95℃45s，60℃45s，72℃45s循環(huán)30次，最后72℃延伸2min。
2、酶切基因片段和酶切PrsetA0.2ug純化的Pre-S1基因片段，2u EcoR I和2u BamH I，1ul 10x緩沖液，10ul反應(yīng)體積，37℃10min。B0.5ug pRSET載體，2u EcoR I和2u BamHI，1ul 10x緩沖液，10ul反應(yīng)體積，37℃10min。
3、酶切基因片段與pRSET載體連接，1u T4DNA連接酶，1ul 10x連接緩沖液，0.1ug酶切基因片段+1/2摩爾的酶切pRSET載體，16℃12hr。
4、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，表達(dá)Pre-S1蛋白及純化見(jiàn)Invitrogen Corporation的Xpress SystemProtein Expression pRSET和Protein Purification。
實(shí)施例二制備抗體過(guò)程，參見(jiàn)現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(ISBN 7-532-2093-2)，P25-53。
多抗制備純化的Pre-S1 2mg加生理鹽水1ml，加等量的福氏完全佐劑免疫新西蘭兔，背部及后腿肌肉、皮下多點(diǎn)注射，4周左右抽血測(cè)效價(jià)，純化的Pre-S1加福氏不完全佐劑按前述方法加強(qiáng)免疫1-3次，抽血測(cè)效價(jià)，抽血，離心制備多抗血清，30％飽和硫酸胺沉淀，用DE52離子交換層析純化多抗。
單抗制備純化的Pre-S1抗原，免疫Balb/C小鼠；培養(yǎng)Sp2-0骨髓瘤細(xì)胞，制備懸液細(xì)胞。制備小鼠脾細(xì)胞懸液，與骨髓瘤細(xì)胞混合，PEG融合，接種于飼養(yǎng)細(xì)胞孔中，HAT選擇培養(yǎng)，分裝于培養(yǎng)板中37℃，5％CO2溫箱過(guò)夜，篩選，陽(yáng)性孔細(xì)胞克隆、培養(yǎng)與克隆的篩選，陽(yáng)性細(xì)胞凍存。陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)與再克隆，凍存，獲得穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株，凍存，檢查雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性。雜交瘤培養(yǎng)上清或誘生腹水，飽和硫酸胺沉淀，用離子交換層析純化。
實(shí)施例三魯米諾標(biāo)記抗體底物為含0.05％H2O2、PH10的0.2M NaOH辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶所標(biāo)記抗體發(fā)光底物的選擇購(gòu)買(mǎi)Pierce或Amasham公司的化學(xué)發(fā)光底物。辣根過(guò)氧化酶發(fā)光底物也可自行制備，魯米諾4mg溶解于DMSO 1ml，p-Iodophenol 1mg溶解于DMSO 1ml，1M Tris-Hcl，PH7.5，0.6ml，30％H2O25ul，H2O 7.5ml。
實(shí)施例四標(biāo)記物的制備參見(jiàn)現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(ISBN 7-532-2093-2)，操作步驟1、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的制備有過(guò)碘酸鈉法和戊二醛交聯(lián)法，以過(guò)碘酸鈉法為例取5mgHRP溶于1ml 0.3mol/L，PH8.1NaHCO3，加入1％DNFB無(wú)水乙醇溶液0.1ml，室溫下輕微攪拌作用1h；加1ml 0.06mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪30min，溶液呈黃綠色；加1ml0.16mol/L乙二醇，室溫下輕攪1h，終止氧化反應(yīng)；裝入透析袋，對(duì)0.01mol/L，pH9.5碳酸鹽緩沖液1000ml，4℃透析過(guò)夜，換液3次；于3ml醛化HRP溶液中加入含5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫避光輕攪下結(jié)合2～3h；加入5mg NaHB4，放4℃3h或過(guò)夜(亦可加0.2ml2mol/L，pH9.5乙醇胺，4℃度放置7h)；裝入透析袋，對(duì)0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析24h，換液3次；3000r/min離心30min，除去沉淀物。上清液通過(guò)Sephadex G-200凝膠柱層析，PBS洗脫。最后在結(jié)合物內(nèi)加入BSA至蛋白濃度為10mg/ml。小量分裝，低溫保存?zhèn)溆谩?br> 2、堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記抗體的制備取抗體IgG(2～5mg/ml)1ml，加入AP5mg溶解。裝入透析袋，用0.01mol/l，pH7.2PBS 4℃透析18h，換液3次；加入2.5％戊二醛20ul，室溫放置2h。4℃對(duì)PBS透析過(guò)夜，換液3次；再移入0.05mol/L，pH8.0Tris-HCL緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，換液3次；取出標(biāo)記抗體，用含1％BSA和0.02％NaN3的Tris-HCL緩沖液稀釋至4ml，即為酶標(biāo)記物原液。加入1/3甘油，小量(0.1ml)分裝。
3、發(fā)光劑標(biāo)記抗體，發(fā)光劑可選擇魯米諾及其衍生物、吖啶酯類(lèi)等，以魯米諾標(biāo)記為例。
按IgG、魯米諾和NaNO2，進(jìn)行重氮化反應(yīng)。另將IgG溶于0.1mol/L的碳酸鹽(pH9.5)緩沖液1ml中，冷卻后，再將重氮化試劑加入到IgG溶液中，每次加5ul，邊加邊用1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值至9.5，共加65ul，置冰箱(4℃)過(guò)夜。次日用40mmol/L硼酸緩沖液淋洗、自動(dòng)分部收集，每份測(cè)280nm及347nm波長(zhǎng)的光密度，同時(shí)取少量測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。以E347＝7100計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度高峰管的魯米諾含量，以E280＝13計(jì)算IgG含量，收集高峰部分于-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 吖啶脂類(lèi)標(biāo)記可采用N-羥基琥珀酰亞胺活化法。
實(shí)施例五試劑盒配制1、包被板包被抗體0.1-10ug/ml加入PH9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液中，在微孔板中每孔加入100ul，4℃過(guò)夜甩去，再加入100ul/孔的1-3％BSA的PBS室溫封閉4小時(shí)，甩干，37℃干燥；2、標(biāo)記物(以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體為例)標(biāo)記抗體以合適的濃度加入稀釋液中。稀釋液配制，25％小牛血清的PBS加入0.05％T-20，0.02％硫柳汞；3、標(biāo)準(zhǔn)品Pre-S1表達(dá)蛋白每個(gè)按終濃度0，50pg，500pg，5ng，50ng，500ng，1000ng/ml加入1％BSA的PBS中稀釋配制，加入0.02％硫柳汞，分裝；4、底物Amasham公司的化學(xué)發(fā)光底物，組分1和2分裝；5、濃縮洗滌液10xTris_HCl加5％T-20。
實(shí)施例六試劑盒使用1、取所需量的板條，每孔加入50ul樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，50ul標(biāo)記抗體，混勻，37℃溫育30分鐘；2、洗板，甩去板中液體，加入工作洗滌液300ul/孔，放置20秒甩去；如此共洗五遍。
3、加底物，50ul/孔發(fā)光底物A，50ul/孔發(fā)光底物B，混勻后測(cè)定。
以上所述之最佳實(shí)施例意在具體說(shuō)明本發(fā)明的思路采用化學(xué)發(fā)光法多標(biāo)準(zhǔn)含量試劑進(jìn)行Pre-S1測(cè)量。本發(fā)明之實(shí)施，并不限于以上最佳實(shí)施例所公開(kāi)的方式，凡基于本發(fā)明之設(shè)計(jì)思路，進(jìn)行簡(jiǎn)單推演與替換，都屬于本發(fā)明之實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于，包括用Pre-S1抗體預(yù)包被的板/條，標(biāo)記結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物以及至少六種含量不同的作為定量標(biāo)尺的Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。
2.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于所述標(biāo)記結(jié)合物指用發(fā)光劑、辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物。
3.如權(quán)利要求2所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指堿性磷酸酶標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是單組分含發(fā)光劑的溶液；當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指發(fā)光劑標(biāo)記的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是單組分含H2O2的堿性溶液；當(dāng)所述標(biāo)記結(jié)合物指辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記了的Pre-S1抗體結(jié)合物時(shí)，所述化學(xué)發(fā)光底物是雙組分含H2O2的組分A和含發(fā)光劑的組分B。
4.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于所述Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑為基因工程表達(dá)的Pre-S1蛋白純品。
5.如權(quán)利要求4所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于所述至少六種含量不同的作為定量標(biāo)尺的Pre-S1的抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑中，包括O濃度值和線(xiàn)性范圍高值，其它不同含量為線(xiàn)性范圍近等分值。
6.如權(quán)利要求5所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒，其特征在于所述線(xiàn)性范圍高值指Pre-S1抗原含量為500-2000ng/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備，其特征在于，包括以下步驟采用重組Pre-S1 11-119aa制備Pre-S1的抗原；采用所述Pre-S1抗原制備Pre-S1包被抗體或標(biāo)記抗體；并采用所述Pre-S1抗原制備Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。
8.如權(quán)利要求7所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備，其特征在于所述Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑為基因工程表達(dá)的Pre-S1蛋白純品。
9.如權(quán)利要求8所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備，其特征在于所述制備Pre-S1的重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑的步驟中，設(shè)置至少六種含量不同的定量標(biāo)尺，包括0濃度值和線(xiàn)性范圍高值，其它不同含量為線(xiàn)性范圍近等分值。
10.如權(quán)利要求9所述的化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre-S1試劑盒的制備，其特征在于所述線(xiàn)性范圍高值指Pre-S1的重組表達(dá)抗原含量為500-2000ng/ml。
全文摘要
一種化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)乙肝病毒Pre－S1試劑盒，包括用Pre－S1抗體預(yù)包被的板/條，標(biāo)記結(jié)合物，化學(xué)發(fā)光底物以及至少六種含量不同的作為定量標(biāo)尺的Pre－S1重組表達(dá)抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。所述抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑為基因工程表達(dá)的Pre－S1蛋白純品，而作為定量標(biāo)尺的Pre－S1抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑中，包括0濃度值和線(xiàn)性范圍高值，其它不同含量為線(xiàn)性范圍近等分值。所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟采用重組Pre－S1 11－119aa制備Pre－S1的抗原；采用所述Pre－S1抗原制備Pre－S1包被抗體或標(biāo)記抗體；并采用所述Pre－S1抗原制備Pre－S1抗原標(biāo)準(zhǔn)試劑。采用本試劑盒及其制備方法，可提高檢測(cè)的靈敏度、線(xiàn)性范圍和定量的準(zhǔn)確性，并可提高檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1828302SQ20051003341
公開(kāi)日2006年9月6日 申請(qǐng)日期2005年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日
發(fā)明者曹雯雯, 梁培華, 丁野青, 杜綱國(guó), 魏球英 申請(qǐng)人:深圳依諾金生物科技有限公司