專利名稱：：分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)作為免疫測試中的結(jié)合配偶體的用途的制作方法分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)作為免疫測試中的結(jié)合配偶體的用途本申請是申請?zhí)枮?1819885.6申請的分案申請，申請?zhí)枮?1819885.6申請的申請曰是2001年11月27曰。申請人是霍夫曼-拉羅奇有限公司。本發(fā)明涉及分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)的用途，特別是來自HIV的分子內(nèi)共價交聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄酶作為免疫測試中免疫結(jié)合配偶體(Bindepartner)的用途，其中使用分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)作為結(jié)合配偶體的檢測樣品中分析物的免疫測試方法，涉及來自HIV的分子內(nèi)共價交聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄酶和這種逆轉(zhuǎn)錄酶的制備方法。蛋白質(zhì)作為用于在免疫診斷試驗方法中檢測分析物的結(jié)合配偶體的用途已經(jīng)公知了很長時間了，在所有的常規(guī)免疫測試中，樣品與一種或多種對該分析物特異性的結(jié)合配偶體溫育。這一種或多種結(jié)合配偶體特異性結(jié)合要檢測的分析物。在抗體試驗的情況下，例如在HCV感染情況下，要檢測的樣品例如與特異性結(jié)合要測定的抗-HCV-抗體的HCV抗原接觸。在例如為了檢測腫瘤標(biāo)記物前列腺特異性抗原(PSA)的抗原試驗中，樣品與特異性結(jié)合樣品中PSA的抗體接觸。接著在所有的免疫測試中檢測分析物?？梢岳缤ㄟ^結(jié)合并且接著檢測另一種結(jié)合配偶體來進(jìn)行，所述結(jié)合配偶體帶有與分析物和免疫結(jié)合配偶體形成的復(fù)合體結(jié)合的可檢測標(biāo)記。免疫測試一般以異源或同源試驗形式進(jìn)行。異源試驗形式常常以夾心或橋式試驗進(jìn)行。竟?fàn)幏椒ㄊ枪模渲型ㄟ^例如加入標(biāo)記的分析物類似物從分析物和特異性結(jié)合配偶體的復(fù)合體置換分析物或者特異性結(jié)合配偶體。在所有的免疫測試方法中，用作特異性免疫結(jié)合配偶體的反應(yīng)物以穩(wěn)定形式存在并且它們不會被例如因為不適宜的貯存條件破壞這一點是重要的。特別是當(dāng)用作特異性結(jié)合配偶體的蛋白質(zhì)由幾個亞基(Untereinheiten)構(gòu)成時才出現(xiàn)這種危險。所述亞基可以通過共價鍵，例如通過二硫橋，或非共價鍵，例如通過氬橋，相反電荷和/或疏水性相互作用連接在一起。在某些情況下，免疫測試需要的材料(例如作為液體試劑)在為試驗制備的工作溶液中在貯存條件下或者在免疫反應(yīng)期間本身可能變得不穩(wěn)定并變性。結(jié)果蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)可以以這樣一種方式變化，使得該物質(zhì)不再能夠在免疫測試中使用。可以在不適宜的條件下彼此分開用作特異性結(jié)合配偶體對的蛋白質(zhì)的亞基成分。在天然共價橋的情況下，可以例如通過普通緩沖液添加劑例如DTT將二硫橋還原以引起亞基的離解。但是，通過電荷或疏水性作用結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)的非共價連接亞基的離解的危險甚至更大。這樣的蛋白質(zhì)的亞基即使通過普通緩沖添加劑，例如鹽或去污劑或者不適宜的pH-和溫度變化都非常容易離解。因此各個的在一定程度上沒有保護(hù)的亞基也容易變性。這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)或者各個亞基的大的變化。這也意味著免疫學(xué)性質(zhì)，例如重要表位的可接近性變化到這樣的程度，使得在免疫測試中用作結(jié)合配偶體的蛋白質(zhì)不再被免疫識別，即不再特異性結(jié)合。亞基離解的另一個危險是帶有不同的標(biāo)記基團(tuán)的亞基由于化學(xué)平衡調(diào)節(jié)而再次離解。在一個具體的情況下，在橋式試驗形式中在抗體試驗中使用的兩個亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)一方面為了使用普遍適用的固相而被衍生化，另一方面，相同的蛋白質(zhì)也被用作產(chǎn)生信號的成分，并且為了這個目的與標(biāo)記物(例如酶，熒光素或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記)偶聯(lián)，所以可能發(fā)生下面的情況最初由陽性樣品(含有分析物的樣品)產(chǎn)生的校正曲線隨著時間的進(jìn)程而變平。陰性樣品(空白值)信號增加并且越來越增加接近上面的陽性樣品值使得不再可能區(qū)分沒有分析物和含有分析物的樣品的差異。德國專利申請DE2615349中描述了通過與醍反應(yīng)而化學(xué)修飾酶的方法。這些修飾作用提高了導(dǎo)致提高的酶活性的穩(wěn)定性。指明了酶分子可以彼此交聯(lián)，即分子間和分子內(nèi)交聯(lián)。在這種情況下免疫反應(yīng)表位的保留不起任何作用。沒有描述在免疫診斷方法中使用用醌修飾的酶。Debyser和DeClercq(ProteinScience1996，5,278-286頁)描述了利用suberimidate二甲酯交聯(lián)HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的兩個亞基，這樣，賴氨酸側(cè)鏈彼此連接。交聯(lián)的目的是研究兩個RT亞基的二聚作用。只有二聚RT才是酶學(xué)活性的。這兩個亞基在各種抑制劑的存4在下共價交聯(lián)?；瘜W(xué)交聯(lián)反應(yīng)之后形成取決于抑制劑效力而較強(qiáng)或較弱交聯(lián)的RT分子和多聚體。交聯(lián)對免疫相關(guān)表位的作用或者免疫測試中交聯(lián)分子的使用是不重要的。EP-A-0331068中公開了在免疫測試中使用分子間交聯(lián)的免疫球蛋白。這意味著數(shù)個免疫球蛋白分子或者其片段彼此共價連接在一起?？贵w及其片段的多聚體被用作減少干擾的試劑。交聯(lián)免疫球蛋白及其片段是為了消除針對免疫球蛋白的人血清中的干擾因子?，F(xiàn)有技術(shù)描述的在天然條件下由數(shù)個亞基構(gòu)成的交聯(lián)蛋白用作抗原或免疫結(jié)合配偶體是不適合的或者只有有限的適合性，因為一般形成數(shù)個蛋白質(zhì)分子組成的分子間多聚體。這些多聚體對于免疫測試只有有限用途，因為它們通常不具有確定的大小。因此多聚體只具有隨機(jī)大小分布，即單體，二聚體，三聚體，四聚體等共同存在于一個混合物中。不確定的交聯(lián)可以屏蔽表位。結(jié)果例如要檢測的樣品抗體可能不能與被屏蔽的抗原表位結(jié)合，因此會獲得假陰性結(jié)果。使用多聚體作為免疫結(jié)合配偶體的另一個問題是這樣的事實，即干擾因子與樣品中存在的多聚體蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的危險增加。干擾因子，例如類風(fēng)濕病因子經(jīng)常具有數(shù)個低親合力結(jié)合位點。那么如果多聚體蛋白質(zhì)被用作免疫結(jié)合配偶體，則可能會具有特別是干擾因子會發(fā)現(xiàn)很多靶點，即多聚體蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點。因此這可能導(dǎo)致假陽性試驗結(jié)果，而且免疫測試的特異性總體上就大大降低。因此本發(fā)明的目的是提供可以在免疫測試中用作結(jié)合配偶體的具有改善的穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。以這種方式改進(jìn)的蛋白質(zhì)應(yīng)該具有好的表位可接觸性，并且應(yīng)該保留其中使用該蛋白質(zhì)的免疫測試方法的特異性。根據(jù)獨立權(quán)利要求所述的發(fā)明達(dá)到本發(fā)明的這個目的。從屬權(quán)利要求代表優(yōu)選的實施方案。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)能夠制備幾乎專一地分子內(nèi)交聯(lián)的蛋白質(zhì)而且不損失它們的免疫學(xué)特性，并且這些蛋白質(zhì)可以作為免疫結(jié)合配偶體以有利方式在免疫測試程序中使用。這樣基本上避免了蛋白質(zhì)沒有交聯(lián)時存在的穩(wěn)定性問題。因此本發(fā)明涉及在免疫測試程序中使用分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)作為免疫結(jié)合配偶體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的免疫測試方法中要求的所有的蛋白質(zhì)可以5用所有的由于其折疊，即其三級或四級結(jié)構(gòu)可傾向于在免疫測試的條件下?lián)p失其折疊，變性或在其各種亞基中離解的多肽。當(dāng)發(fā)生這樣的結(jié)構(gòu)變化時，存在著免疫學(xué)重要的表位以這樣一種方式改變使得例如它們不再被抗體特異性結(jié)合這樣的危險。在最壞的情況下，這意味著免疫測試結(jié)果是陰性的，即沒有指明存在要檢測的抗體，因為用作結(jié)合配偶體的蛋白質(zhì)變性了。通過使用根據(jù)本發(fā)明的分子內(nèi)共價交聯(lián)的蛋白質(zhì)基本上避免了這些缺點。特別地，使用天然由數(shù)個亞基構(gòu)成的那些分子內(nèi)共價交聯(lián)的蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用DNA-或RNA-聚合酶，特別優(yōu)選來自HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶，非常特別優(yōu)選來自HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶。蛋白質(zhì)的來源可以是任意天然的。要使用的蛋白質(zhì)可以從自然來源，即例如生物體或病毒分離。但是使用遺傳工程制備的重組蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。非常特別優(yōu)選使用由例如Miiller等，J.Biol.Chem.264/24:13975-13978(1989)中描述的表達(dá)克隆表達(dá)的重組制備的純化RT。對于分子內(nèi)共價交聯(lián)的蛋白質(zhì)來說，交聯(lián)不改變免疫識別重要的表位或只是稍微改變使得另外的免疫結(jié)合配偶體在測試中和沒有交聯(lián)的蛋白質(zhì)一樣好地精確地良好地識別并且特異性結(jié)合交聯(lián)蛋白這一點是重要的。因此交聯(lián)應(yīng)該不產(chǎn)生任何有可能使得測試結(jié)果失真的免疫學(xué)相關(guān)制品。術(shù)語蛋白質(zhì)指由至少大約50個氨基酸，優(yōu)選至少IOO個氨基酸組成的所有的多肽。術(shù)語蛋白質(zhì)還包括修飾的蛋白質(zhì)，例如與糖基，唾液酸或脂質(zhì)結(jié)構(gòu)連接的蛋白質(zhì)。術(shù)語"分子內(nèi)共價交聯(lián)"指其多肽鏈以這樣一種方式通過化學(xué)修飾連接在一起使得其不再解折疊，即它不再喪失其三級結(jié)構(gòu)并且因此易于接近重要的表位的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)由數(shù)個亞基組成的情況下，分子內(nèi)共價交聯(lián)保留了三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。修飾作用阻止各種多肽鏈彼此離散。共價鍵只是在蛋白質(zhì)分子內(nèi)存在這一點是重要的。在蛋白質(zhì)只是由一個多肽鏈組成和因此在自然條件下只有一個亞基組成情況下，連接多肽鏈內(nèi)至少兩個位點。因此分子內(nèi)共價交聯(lián)不形成數(shù)種蛋白質(zhì)構(gòu)成的低聚物。這樣的低聚物在下文中也稱為聚合物或多聚體。因此只有化學(xué)連接物質(zhì)在蛋白質(zhì)中共價連接并且總質(zhì)量因此稍微提高的話，分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)的分子量才增加。在由數(shù)個亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)的情況下，根據(jù)本發(fā)明的連接只存在于也天然形成完整的蛋白質(zhì)分子的那些亞基之間，這意味著根據(jù)本發(fā)明的分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)的大小和分子量只是因為交聯(lián)化學(xué)物質(zhì)而稍有提高。幾乎不排除數(shù)個蛋白質(zhì)分子內(nèi)的連接，這樣形成蛋白質(zhì)的低聚物或甚至聚合物。根據(jù)本發(fā)明，在交聯(lián)之前或之后可以用其它修飾基團(tuán)提供給交聯(lián)蛋白質(zhì)，該其它修飾基團(tuán)例如是用作標(biāo)記的抗原或者為了使交聯(lián)蛋白質(zhì)結(jié)合到固相所需要的。這里例如提及與生物素或鏈霉抗生物素蛋白或者產(chǎn)生信號的標(biāo)記基團(tuán)例如酶，熒光素或化學(xué)發(fā)光團(tuán)的連接。這樣的修飾作用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些修飾作用應(yīng)該不改變根據(jù)本發(fā)明的分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)的免疫學(xué)性質(zhì)，或者只是改變至這樣一種程度使得仍然保證免疫測試中特異性結(jié)合配偶體的識別作用。例如利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)接著用考馬斯藍(lán)染色能夠檢測蛋白質(zhì)基本上專一的分子內(nèi)鍵合，特別是在蛋白質(zhì)具有四級結(jié)構(gòu)的情況下。蛋白質(zhì)根據(jù)本發(fā)明交聯(lián)之后，應(yīng)該不可能用肉眼檢查到在SDS-PAGE凝膠中大于蛋白質(zhì)天然分子量的任何分子量。如果例如使用8-25%聚丙烯酰胺商售小型化SDS-聚丙烯酰胺梯度凝膠(從Pharmacia公司獲得的Phast系統(tǒng))，則每條泳道(Spur)使用的蛋白質(zhì)的量是大約500ng。在該量下根據(jù)本發(fā)明在該系統(tǒng)中用肉眼不能覺察大于天然分子量的分子量。在天然具有數(shù)個亞基，即數(shù)個多肽鏈的蛋白質(zhì)情況下，交聯(lián)后泳帶分子量應(yīng)該不超過亞基分子量的總和。具有相當(dāng)于亞基分子量總和的分子量的凝膠上的蛋白質(zhì)泳帶可以被認(rèn)為是具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的成功分子內(nèi)交聯(lián)的檢驗。因此SDS-PAGE可以被用來檢驗一方面由數(shù)個亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)并且另一方面沒有多聚體的成功的分子內(nèi)交聯(lián)。檢測多聚體不存在的另一種方法是利用凝膠滲透色譜法，也稱之為凝膠排阻色譜法，可以例如使用商售HPLC儀器進(jìn)行。具有相當(dāng)于各個蛋白質(zhì)的多聚體的分子量的復(fù)合體遠(yuǎn)早于單獨存在的蛋白質(zhì)被洗脫出來。根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)該只有極低百分?jǐn)?shù)的這樣的多聚體存在。如果以HPLC色譜的積分測量，則意味著相對于根據(jù)本發(fā)明的只有分子內(nèi)交7聯(lián)的蛋白質(zhì)的洗脫峰(積分)應(yīng)該存在最高大約5%的多聚體。免疫結(jié)合配偶體指在免疫測試條件下能與其它分子特異性結(jié)合的所有的分子。特別地，免疫結(jié)合配偶體應(yīng)該能夠特異性結(jié)合分析物或者與分析物結(jié)合的物質(zhì)。常見典型構(gòu)象是抗體與抗原的特異性結(jié)合，例如抗-PSA抗體與PSA的結(jié)合?？贵w和抗原是免疫結(jié)合配偶體。根據(jù)本發(fā)明，分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)在免疫測試中被用作免疫結(jié)合配偶體。當(dāng)意在檢測針對這些抗原的抗體時，抗原優(yōu)選被用作免疫結(jié)合配偶體。在這種情況下，利用根據(jù)本發(fā)明交聯(lián)的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶檢測抗-HIV-RT-抗體是優(yōu)選的并且在下面的段落中描述。本發(fā)明還涉及在樣品中檢測分析物的免疫測試方法。該方法特征在于分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)被用作免疫結(jié)合配偶體。發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)共價交聯(lián)蛋白質(zhì)，特別是天然由數(shù)個亞基構(gòu)成的那些，在免疫測試條件下比沒有交聯(lián)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定得多。免疫測試的各種形式和實施方案以及各種檢測方法，例如利用酶反應(yīng)，熒光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，因此不需要在這里具體描述。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選異源測試形式，其中在免疫反應(yīng)完成之后分離固相和液相。所述方法優(yōu)選是診斷HIV感染的免疫測試。如果患者有HIV感染，可以以抵抗血液，血清或血漿樣品中病毒的某些抗原而產(chǎn)生的抗體為基礎(chǔ)進(jìn)行檢測。經(jīng)常還可以檢測HIV病毒抗原本身，例如HIV-1的p24抗原。這要求使用特異性的抗HIV-抗原-這里抗p24定向的抗體。經(jīng)常以組合式抗原和抗體檢測試驗進(jìn)行樣品中HIV感染的檢測。這些試驗也稱作組合式試驗。這樣一種組合式試驗在W098/40744中有描述。這里，不僅是HIV-抗原，即HIV-1或HIV-1亞型0的p24抗原和相應(yīng)的HIV-2的p26抗原借助特異性抗體被檢測，而且抗HIV定向的對病原體的包膜蛋白，例如HIV-1的gpl60，gpl20，gp41和HIV-2的gpl40，gpl10，gp36的抗體也可以。另外，在才艮據(jù)W098/40744的組合式試驗中也檢測抗HIV-RT抗體。為此目的，使用重組產(chǎn)生的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶作為免疫結(jié)合配偶體，然而其不是分子內(nèi)共價交聯(lián)的。根據(jù)本發(fā)明，在檢測樣品中HIV感染的組合式試驗中優(yōu)選使用來自HIV的分子內(nèi)共價交聯(lián)RT，特別是來自HIV-1的RT。本發(fā)明的另一個主題是來自HIV的分子內(nèi)共價交聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄酶，8這是一種天然存在的有兩種亞基的酶。HIVRT在天然條件下作為異二聚體存在。HIV-1RT由一個51kDa的亞基和一個66kDa的亞基組成。重組形式可以例如從表達(dá)克隆獲得(例如，Mfiller等，J.Biol.Chem.264/24:13975-13978)。由于氨基酸水平大約60%,—些片段中甚至100%的同源度，一般也可以使用HIV-1RT來檢測抗HIV-2RT的抗體。術(shù)語HIV包括HIV-1和HIV-2和病毒的所有的亞型和亞類，例如HIV-1亞型0。優(yōu)選分子內(nèi)共價交聯(lián)形式的HIV-1RT。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)分子內(nèi)共價交聯(lián)HIVRT在免疫測試條件下比沒有交聯(lián)的形式穩(wěn)定得多。根據(jù)本發(fā)明的RT比沒有交聯(lián)的形式好得多，即使負(fù)載以溫度例如更長更不合適貯存或即使在測試條件下。根據(jù)本發(fā)明的分子內(nèi)共價交聯(lián)RT特征在于兩個亞基彼此共價連接在一起，其中沒有數(shù)個分子的分子間連接。例如用如已經(jīng)闡明的通過使用凝膠排阻色譜法或用SDS-PAGE分析檢測不存在數(shù)個RT分子的低聚物。優(yōu)選使用同-和異-雙官能連接劑(Linker)作為交聯(lián)劑。特別地，優(yōu)選使用下面的物質(zhì)將RT分子內(nèi)交聯(lián)MHS(3-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯)，EDC(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺)，DSS(二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，HSAB(N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯)，磺基-SANPAH(磺基琥珀酰亞胺基-6(4，-酰氨基-2，-硝基苯基酰胺基)己酸酯)。如已經(jīng)闡明的，交聯(lián)連接劑的化學(xué)反應(yīng)Py、分子之間的彼此交聯(lián)這一點是重要的。另外，該化學(xué)反應(yīng)不破壞免疫相關(guān)表位這一點是重要的。本發(fā)明的另一個主題是制備分子內(nèi)交聯(lián)HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，該方法包括下面的步驟-提供溶解形式的RT-任選地使RT與SH基團(tuán)的封閉劑(Blockierungsreagenz)反應(yīng)—用含水緩沖液透析混合物-激活的RT與下列交聯(lián)試劑之一反應(yīng)MHS(3-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)，EDC(l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺)，DSS(二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，HSAB(N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯)，磺基-SANPAH(磺基琥珀酰亞胺基-6(4，-酰胺基-2，-硝基苯基酰胺基)己酸酯)-任選地終止反應(yīng)—通過透析從反應(yīng)產(chǎn)物分離過量的反應(yīng)物—任選地用UV光照射透析過的反應(yīng)產(chǎn)物。RT與交聯(lián)劑的優(yōu)選化學(xué)計量是大約1:l至l:20。選擇反應(yīng)物比例，使得數(shù)個RT分子彼此之間沒有低聚作用或者只有可忽略的低聚作用。圖1說明交聯(lián)后獲得的RT的分子量借助凝膠滲透色譜的分析。通過下面的實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。實施例1HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的分子內(nèi)交聯(lián)a)用MHS交聯(lián)在50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl，1mMDTT，1mMEDTA中溶解HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(10毫克/毫升)。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至6.4。通過加入適當(dāng)?shù)确莸膌MN固(N-甲基馬來酰亞胺)的DMSO溶液將混合物調(diào)節(jié)至5mMNMM，并且接著在攪拌下在25C下培育60分鐘。接著用50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl透析。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至7.0。在DMSO中制備MHS(3-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯)貯備溶液(5毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于1:8(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/MHS摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25"C下再培育60分鐘。通過以lOmM終濃度向反應(yīng)混合物加入賴氨酸終止反應(yīng)，并且再培育30分鐘。通過用10mM磷酸鉀緩沖液，pH6.0，50mMNaCl，lmMEDTA透析分離過量的反應(yīng)物。透析之后，通過加入lMK2HP04溶液將pH調(diào)節(jié)至7.4，加入半胱氨酸至2mM終濃度之前，混合物在攪拌下在25t:下再培育4小時。又培育30分鐘之后，加入N固(終濃度5mM)終止反應(yīng)?；旌衔镉?0mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl透析。b)用EDC交聯(lián)在50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl，1mMDTT，1mMEDTA中溶解HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(10毫克/毫升)。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至6.4。通過加入適當(dāng)?shù)确莸?MNMM(N-甲基馬來酰亞胺)的DMS0溶液使混合物達(dá)到5mMNMM，并且接著在攪拌下在25X2下培育60分鐘。接著用lOmM磷酸鉀緩沖液，pH7.0,50mMNaCl透析。在DMS0中制備EDC(l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺)貯備溶液(2毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于1:10(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/EDC摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25r下再培育60分鐘。通過用25mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0，50mMNaCl透析分離過量的反應(yīng)物。c)用DSS交聯(lián)在50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl，1mMDTT，1mMEDTA中溶解HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶(10毫克/毫升)。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至6.4。通過加入適當(dāng)?shù)确莸?MNMM(N-甲基馬來酰亞胺)的DMSO溶液使混合物達(dá)到5mMN固，并且接著在攪拌下在251C下培育60分鐘。接著用lOmM磷酸鉀緩沖液，pH8.0，25mMNaCl透析。在DMSO中制備DSS(二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)貯備溶液(2毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于1:10(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/DSS摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25t:下再培育60分鐘。通過用25mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0，50mMNaCl透析分離過量的反應(yīng)物。d)用HSAB交聯(lián)在50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl，1mMDTT，1mMEDTA中溶解HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶(10毫克/毫升)。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至6.4。通過加入適當(dāng)?shù)确莸?MN醒(N-甲基馬來酰亞胺)的DMSO溶液使混合物達(dá)到5mMN腦，并且接著在攪拌下在25t:下培育60分鐘。接著用10mM磷酸鉀緩沖液，pH8.0，25mMNaCl透析。在DMSO中制備HSAB(N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯)貯備溶液(2毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于l:5(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/HSAB摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25"C下再培育60分鐘。通過用25mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0，50mMNaClii透析分離過量的反應(yīng)物。接著用UV燈照射混合物7分鐘。e)用磺基-SANPAH交聯(lián)在50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl，1mMDTT，1mMEDTA中溶解HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(10毫克/毫升)。通過加入1MKH2P04溶液將pH調(diào)節(jié)至6.4。通過加入適當(dāng)?shù)确莸?MNMM(N-甲基馬來酰亞胺)的DMSO溶液使混合物達(dá)到5mMN醒，并且接著在攪拌下在25t:下培育60分鐘。接著用lOmM磷酸鉀緩沖液，pH8.0，25mMNaCl透析。在DMSO中制備磺基-SANPAH(磺基琥珀酰亞胺基-6(4，-酰胺基-2，-硝基苯基酰胺基)己酸酯)貯備溶液(4毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于1:5(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/磺基-SANPAH摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25t:下再培育60分鐘。通過用25mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0，50mMNaCl透析分離過量的反應(yīng)物。接著用UV燈照射混合物7分鐘。實施例2HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶專一分子內(nèi)交聯(lián)的檢測a)SDS凝膠電泳在Phast-凝膠-儀器(Pharmacia)上根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)說明在SDS存在下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析分子內(nèi)交聯(lián)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的等份。沒有交聯(lián)的對照物只有相當(dāng)于逆轉(zhuǎn)錄酶亞基的66kD和51kD分子量泳帶。分子內(nèi)交聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)110-120kD分子量泳帶，證明亞基之間成功的交聯(lián)。檢測不到較大的蛋白質(zhì)復(fù)合體，即根據(jù)本發(fā)明交聯(lián)方法不發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄酶數(shù)個分子的分子間橋接。b)分析凝膠滲透色譜法使用商售HPLC儀器根據(jù)生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)說明在TSK3000柱(TosoHaas)上通過凝膠滲透色譜法分析分子內(nèi)交聯(lián)HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶的等份。分子內(nèi)交聯(lián)逆轉(zhuǎn)錄酶從柱子上洗脫出來，保留時間相當(dāng)于具有100-130kD分子量的球狀蛋白(在這種情況下是7.5分鐘)。檢測不到在色譜法中有較短保留時間的較大蛋白質(zhì)復(fù)合體，即根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)方法不會導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶數(shù)個分子之間橋接形成低聚物或聚合物結(jié)構(gòu)。12圖1說明色譜法。實施例3使用生物素標(biāo)記物作為例子對分子內(nèi)交聯(lián)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的衍生化作用分子內(nèi)交聯(lián)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶(參見實施例1)存在于二乙醇胺或磷酸鉀緩沖液中。作為對照用N-甲基馬來酰亞胺處理沒有交聯(lián)的RT,并且用二乙醇胺透析。如果需要，通過加入氫氧化鈉在所有的RT混合物中將pH調(diào)節(jié)至8.6-8.8。在DMS0中制備生物素-DDS(生物素基-二氨基二氧雜辛烷-二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)貯備溶液(6毫克/毫升)。向混合物中加入相當(dāng)于1:4(逆轉(zhuǎn)錄酶摩爾數(shù)/生物素-DDS摩爾數(shù))量的最初化學(xué)計量的該溶液，然后在攪拌下在25t!下再培育60分鐘。通過以10mM終濃度向反應(yīng)混合物加入賴氨酸終止反應(yīng)，并且再培育30分鐘。通過用50mM二乙醇胺，pH8.8，25mMNaCl透析分離過量的反應(yīng)物。實施例4功能試驗中穩(wěn)定性檢測在從RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim公司購得的Elecsys上進(jìn)行免疫測試，來檢查HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性。除了不含有抗-RT-抗體的陰性對照(NK)和含有抗-RT-抗體的陽性對照(PK)之外，分別還檢測具有抗-RT-活性的兩種HIV-陽性人血清。為此，371C下45微升樣品與55微升試劑1(生物素化RT)和55微升試劑2(釕-標(biāo)記的RT)培育9分鐘。接著加入鏈霉抗生物素蛋白-包被的磁珠，再將混合物培育9分鐘。然后通過磁性捕獲磁珠，并且定量測定電化學(xué)發(fā)光信號。為了比較檢測根據(jù)本發(fā)明交聯(lián)形式的和沒有交聯(lián)形式的生物素化逆轉(zhuǎn)錄酶的穩(wěn)定性，在進(jìn)行試驗之前，試劑1(生物素化RT)在421C下被培育18小時。同時制備的并且在4r下保存的試劑1用作參照物。分別新鮮制備所有的其他試劑用于實驗。通過信號動力學(xué)評估，即測定所得信號和各種陰性對照的商。信號動力學(xué)數(shù)值越大，HIV抗體-陽性和陰性樣品之間差異越大。因此期望大的信號動力學(xué)范圍。利用各個值之間的相互關(guān)系比較負(fù)栽的RT和沒有負(fù)載的RT。結(jié)果在表l中給出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>顯示即使在升溫下負(fù)載數(shù)小時之后，使用根據(jù)本發(fā)明交聯(lián)的RT在免疫測試中信號的動力學(xué)范圍與沒有負(fù)載的RT相比仍然至少是79。/。并且優(yōu)選至少90%,而以陰性對照為基礎(chǔ)的動力學(xué)范圍在沒有交聯(lián)的RT下最多是大約30%,有時大大小于30%，或甚至低于20%。當(dāng)使用沒有交聯(lián)的RT時，信號降至陰性血清水平，而根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的RT保持其免疫學(xué)功能。因此樣品抗體識別的RT表位基本上保留，即使有熱負(fù)栽。這意味著根據(jù)本發(fā)明的交聯(lián)的RT比沒有交聯(lián)的RT穩(wěn)定得多。權(quán)利要求1.分子內(nèi)共價交聯(lián)的抗原作為免疫測試方法中免疫結(jié)合配偶體的用途。2.權(quán)利要求l的用途，其特征在于使用由數(shù)個亞基構(gòu)成的抗原。3.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于使用DNA聚合酶或RNA聚合酶作為抗原。4.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于使用HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶作為抗原。5.權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于分子內(nèi)共價交聯(lián)的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶用作抗原，其中只有逆轉(zhuǎn)錄酶的兩個亞基彼此共價交聯(lián)，并且沒有數(shù)個逆轉(zhuǎn)錄酶分子之間的彼此連接存在。6.權(quán)利要求5的用途，其特征在使用3-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯，l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺，二琥珀酰亞胺基辛二酸酯，N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮基苯甲酸酯或磺基琥珀酰亞胺基-6(4，-酰胺基-2，-硝基苯基酰胺基)己酸酯用作用于所述交聯(lián)的交聯(lián)劑。全文摘要本發(fā)明涉及分子內(nèi)共價交聯(lián)的抗原作為免疫測試方法中免疫結(jié)合配偶體的用途。文檔編號G01N33/573GK101509918SQ20091000230公開日2009年8月19日申請日期2001年11月27日優(yōu)先權(quán)日2000年11月30日發(fā)明者B·烏普梅爾,D·施利珀,F·多尼申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司