一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子及其制備方法，它是將居里溫度為48～90℃的錳鋅鐵氧體Mn1-xZnxFe2O4（0.1≤x≤0.9）表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆層表面接枝環(huán)氧基，通過環(huán)氧基開環(huán)直接共價偶聯(lián)抗體的氨基端而成。本發(fā)明用硅酸四乙酯包覆二氧化硅的方法對磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面進(jìn)行改性，從而可使磁性合金納米粒子良好地單分散于水中，并保持長期不沉淀、不析出。然后，再用3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行處理，使二氧化硅包覆層表面接枝環(huán)氧基，并通過環(huán)氧基開環(huán)直接共價偶聯(lián)抗體的氨基端，從而獲得可用于人體腫瘤主動靶向性磁流體熱療的水溶性的自動控溫的對腫瘤細(xì)胞有主動靶向性的液態(tài)磁流體加熱介質(zhì)。
【專利說明】一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鐵氧體納米粒子的制備方法，應(yīng)用于磁流體熱療【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]由于人口老齡化、環(huán)境污染、工作壓力、不良生活方式和社會無序競爭帶來的精神壓力等因素日益加重，癌癥的患病人數(shù)和死亡人數(shù)在世界范圍都在不斷增長。手術(shù)、化療、放療依然是目前最主要的三種腫瘤治療手段，但手術(shù)治療的損傷和風(fēng)險以及放化療的巨大毒副作用嚴(yán)重影響了腫瘤患者的生存質(zhì)量和存活率。因此，研究、開發(fā)新的具有靶向性的、更加有效、更加安全、低副作用的、無創(chuàng)或微創(chuàng)的腫瘤治療方法勢在必行。
[0003]磁流體熱療(magnetic fluid hyperthermia, MFH)是一項通過對腫瘤組織進(jìn)行加熱、高溫殺傷腫瘤細(xì)胞，從而治療腫瘤的新方法。MFH是基于交變磁場(alternatingmagnetic field, AMF)下磁性介質(zhì)感應(yīng)產(chǎn)熱的物理學(xué)原理,利用磁性物質(zhì)能在交變磁場中升溫的物理特性,對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療的一項技術(shù),其優(yōu)點在于合金磁性MFH介質(zhì)可通過居里溫度(Curie temperature)現(xiàn)象實現(xiàn)自動控溫，治療過程中無需測溫；治療采用的鐵磁性介質(zhì)生物安全性及組織相容性良好，且治療后可保留在體內(nèi)，因此可實現(xiàn)介質(zhì)一次植入后多次重復(fù)熱療。與傳統(tǒng)的熱療技術(shù)如紅外熱療、超聲熱療、微波熱療和射頻電磁波熱療相t匕，磁流體熱療技術(shù)具有可高效治療深層腫瘤、副作用小、微創(chuàng)甚至無創(chuàng)的特點。
[0004]常用的磁性元素是Fe、Ni和Co。但磁性純金屬的居里溫度一般都比較高，F(xiàn)e的居里溫度為770°C，Ni的居里溫度為358°C，Co的居里溫度為1130°C。用于人體腫瘤的磁流體熱療溫度都太高。為了降低居里點，可摻入一些非磁性元素，例如:Mn、Zn等把居里溫度降到熱療所需的溫度范圍，從而在磁流體熱療中起到自動控溫的作用。
`[0005]研究通過用SiO2包覆金屬納米粒子,可在金屬納米粒子表面形成親水的娃羥基(S1-OH)，從而可使金屬納米粒子單分散于水中，獲得良好的水溶性。同時，硅羥基還可為后期接枝有機(jī)分子提供親水的羥基表面基團(tuán)。
[0006]以往的研究表明腫瘤細(xì)胞表面常常高表達(dá)細(xì)胞因子，如皮膚和粘膜的鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)和C-Met。最近的研究發(fā)現(xiàn)引起腫瘤發(fā)生的、存在于腫瘤組織內(nèi)的、被稱為“腫瘤干細(xì)胞”(caner stem cells, CSC)的腫瘤細(xì)胞亞群(subpopulation)常常在細(xì)胞表面高表達(dá)一些特異的細(xì)胞因子，如頭頸的鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá)CD44、CD133。這些腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá)的各種細(xì)胞因子可以作為腫瘤靶向治療的靶標(biāo)，水溶性的共價偶聯(lián)抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)抗體的納米粒子能夠通過靜脈注射、主動靶向定位到各個部位相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞表面，甚至能主動靶向于發(fā)生遠(yuǎn)位轉(zhuǎn)移的相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞表面，從而實現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的主動靶向性磁流體熱療。
[0007]理想的用于人體腫瘤磁流體熱療的加熱磁流體介質(zhì)應(yīng)是能通過共價偶聯(lián)的抗體主動靶向腫瘤細(xì)胞、通過居里溫度現(xiàn)象實現(xiàn)自動控溫、并具有優(yōu)良的水溶性的超順磁性液態(tài)流體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子及其制備方法。
[0009]本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0010]一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子，它是將居里溫度為48~90°C的錳鋅鐵氧體MrvxZnxFe2O4 (0.1 ^ x ^ 0.9)表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆層表面接枝環(huán)氧基，通過環(huán)氧基開環(huán)直接共價偶聯(lián)抗體的氨基端而成。
[0011]一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，包括步驟如下:
[0012](I)錳鋅鐵氧體的制備:將 MnCl2.4H20、ZnCl2、FeCl3.6H20 按照 Mn1xZnxFe2O4,0.l≤x≤0.9的比例稱取配成混合溶液，然后放入水浴中加熱并攪拌，將NaOH溶液滴加到攪拌中的混合溶液中，加完后使水浴升溫至70~80°C，保溫I~2h，然后降溫冷卻至室溫并靜置，倒去上清液，洗滌、抽濾，固體放入干燥箱中干燥，將試樣研磨、過篩，得到錳鋅鐵氧體(MrvxZnxFe2O4)粉體；
[0013](2)用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體:將錳鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，超聲震蕩使其分散均勻，置于60~70°C水浴中，并加入少量氨水調(diào)pH=8~10，然后將硅酸四乙酯加入其中，持續(xù)攪拌4~6h，冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末；
[0014](3)磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:先用無水乙醇和去離子水交替清洗錳鋅鐵氧體納米粒子粉體，并在氮?dú)庵懈稍?，然后置于等離子清洗器中處理使硅片表面生成一層活性的羥基，將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到3~縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，并置于37±2°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)24~48h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末；
[0015](4)環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:將表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液中，置于4±2°C放置12~24h，就可獲得共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子磁流體。
[0016]上述制備方法中:步驟(1)所述的MnCl2.4H20、ZnCl2, FeCl3.6H20、NaOH的用量比例按摩爾比l-x:x:2:8，0.1≤X≤0.9;氫氧化鈉溶液的濃度lmol/L;氯化鹽混合溶液總濃度為lmol/L。
[0017]步驟(2)中無水乙醇和蒸餾水組成醇水體系，醇水體系中的乙醇、水體積比為50:1 ;錳鋅鐵氧體的用量為每毫升醇水體系中含有0.3~0.5mg ;硅酸四乙酯為每升醇水體系中加正硅酸乙酯0.026~0.0432mol ;氨的摩爾濃度為每升醇水體系中含有氨0.38~0.45mol ο
[0018]步驟(3)中二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基二甲氧基硅烷的乙醇溶液用0.3~0.5mg ;3_縮水甘油釀氧基丙基二甲氧基硅烷的乙醇溶液體積濃度為5~10%。[0019]步驟(4)所述的抗體稀釋溶液濃度為10 μ g/mL ;表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.3~0.5mg0
[0020]本發(fā)明采用新的工藝制備摻入錳(Mn)和鋅(Zn)的四氧化二鐵(Fe2O4)錳鋅鐵氧體納米粒子，通過調(diào)整錳和鋅的含量控制磁流體的居里溫度，考慮到體內(nèi)磁流體熱療時血流循環(huán)和向癌旁周圍組織的散熱因素，制備了居里溫度約為48~90°C的錳鋅鐵氧體納米粒子。
[0021] 納米顆粒在未經(jīng)表面修飾的情況下一般會發(fā)生相互聚集，而達(dá)到能量最低，不能發(fā)揮納米粒子的小尺寸效應(yīng)，同時發(fā)生聚集沉淀的納米粒子也無法用于靜脈注射靶向腫瘤細(xì)胞。為使磁性合金納米粒子獲得優(yōu)良的水溶性，本發(fā)明用硅酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TEOS)包覆二氧化娃的方法對磁性猛鋅鐵氧體納米粒子表面進(jìn)行改性，由于二氧化硅包覆層表面有親水性的硅羥基，從而可使磁性合金納米粒子良好地單分散于水中，并保持長期不沉淀、不析出。然后，本發(fā)明又用3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane, GPTMS)處理二氧化娃包覆的磁性猛鋅鐵氧體納米粒子，在二氧化娃包覆層表面接枝環(huán)氧基，通過環(huán)氧基開環(huán)直接共價偶聯(lián)抗體的氨基端，同時環(huán)氧基團(tuán)偶聯(lián)氨基開環(huán)之后會生成一個電中性的親水羥基，共價偶聯(lián)抗體的納米粒子仍然能保持良好的水溶性。從而獲得可用于人體腫瘤主動靶向性磁流體熱療的水溶性的自動控溫的對腫瘤細(xì)胞有主動靶向性的液態(tài)磁流體加熱介質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為摻入各種錳(Mn)和鋅(Zn)含量的四氧化二鐵(Fe2O4)錳鋅鐵氧體納米粒子的居里溫度分析圖;a~f分別代表X=0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 ;
[0023]圖2為摻入各種錳(Mn)和鋅(Zn)含量的四氧化二鐵(Fe2O4)錳鋅鐵氧體納米粒子的超順磁性分析圖;a~f分別代表X=O、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 ;
[0024]圖3為摻入各種錳(Mn)和鋅(Zn)含量的四氧化二鐵(Fe2O4)錳鋅鐵氧體納米粒子的 X 射線衍射(X-ray diffraction, XRD)分析圖；A ~F 分別代表 Χ=0、0.1、0.3、0.5、0.7、
0.9的錳鋅鐵氧體納米粒子，圖3a為原圖譜，圖3b中每曲線依次增加200 ；
[0025]圖4為X=0.3的錳鋅鐵氧體納米粒子試樣的透射電鏡TEM照片；圖4a為放大200000倍，圖4b為放大400000倍；
[0026]圖5為X=0.5的錳鋅鐵氧體納米粒子試樣的TEM照片；圖5a為放大200000倍，圖5b為放大400000倍；
[0027]圖6為X=0.3的錳鋅鐵氧體納米粒子包覆SiO2后的TEM照片，a、b分別是用Y=2和4的硅酸四乙酯TEOS包覆SiO2的錳鋅鐵氧體納米粒子TEM照片；
[0028]圖7為包覆了 SiO2的與未包覆SiO2的錳鋅鐵氧體納米粒子水溶液經(jīng)超聲混勻后常溫靜置I周后的對比照片；右瓶為包覆了 SiO2的錳鋅鐵氧體納米粒子水溶液，呈現(xiàn)為均勻的棕色溶液，左瓶為未包覆SiO2的錳鋅鐵氧體納米粒子，在水中完全沉淀于容器底部；
[0029]圖8為磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面二氧化硅接枝的環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氣基端不意圖；
[0030]圖9為加入共價偶聯(lián)抗EGFR抗體的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子培養(yǎng)的部分細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)色染色(圖9a),而對照細(xì)胞均無藍(lán)色染色(圖9b)?！揪唧w實施方式】
[0031 ] 下面結(jié)合優(yōu)選實施例進(jìn)一步說明。
[0032]實施例1
[0033]1.磁性錳鋅鐵氧體的制備:
[0034]反應(yīng)方程式:
[0035](1-x) Mn2++xZn2++2Fe3++80r=Mn1_xZnxFe204+4H20
[0036]組分設(shè)計:設(shè)計x=0.1,0.3,0.5,0.7、0.9 樣品，進(jìn)行材料制備。MnCl2.4H20、ZnCl2、FeCl3.6H20、Na0H的用量比例按分組為1-χ:χ:2:8;氫氧化鈉溶液的濃度lmol/L;氯化鹽混合溶液總濃度為lmol/L。以分析純的MnCl2.4H20、ZnCl2, FeCl3.6H20、NaOH為原料制備不同配比的錳鋅鐵氧體。首先，按計算結(jié)果稱取一定量的MnCl2.4H20、ZnCl2、FeCl3.6H20,并加入燒杯中配制成一定量的混合溶液；其次，稱取相應(yīng)量的NaOH，配制成溶液；然后，將混合溶液加入到三口燒瓶中，放入水浴中加熱并以一定速度進(jìn)行機(jī)械攪拌，將NaOH溶液加到三口瓶中，使水浴升溫至80°C，保溫一小時，然后降溫冷卻至室溫并靜置5h，倒去上清液，洗滌、抽濾至PH接近7，再放入干燥箱中干燥10h。最后將試樣研磨、過篩，得到錳鋅鐵氧體(MrvxZnxFe2O4)粉體。
[0037]從附圖1可以看出，在x=0.3附近居里溫度取得最小值，大約為322.06K，即48.91°C。當(dāng)x=0時，居里溫度為417.15K，即144°C ;而當(dāng)x=0.7時，居里溫度為362.96K，即89.Sl0C ;其他成分的樣品，居里溫度處于二者之間。這表明我們已經(jīng)制備了居里溫度在48.91°C~89.81 °C之間可調(diào)的納米鐵氧體粉末。
[0038]從附圖2可以看出，從x=0.1到x=0.9,飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度先增大后減小,在x=0.1時取得最大值；在x=0.0~0.5范圍內(nèi)，飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度均較大，而當(dāng)X值更大時，飽和磁感應(yīng)強(qiáng)度很小。所得錳鋅鐵氧體的磁滯回線基本完全重合，這表明所得錳鋅鐵氧體基本處于超順磁狀態(tài)。
[0039]2.用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體納米粒子:
[0040]以上述步驟制得的錳鋅鐵氧體為原料進(jìn)行表面SiO2包覆，二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有
0.3mg ;娃酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TE0S)的量為Y mL, Y取2。首先將一定量猛鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，加到1000mL燒杯中，然后超聲震蕩30min使其分散均勻。將燒杯放入60°C水浴中，并加入少量氨水(5~10mL，pH8~10)，然后將YmL TEOS加入到燒杯中，持續(xù)攪拌4h。冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末。
[0041]3.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:
[0042]先用無水乙醇和去離子水交替清洗上述步驟制得的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體3次，并干燥，然后置于等離子清洗器中處理2min(電壓600V，氧氣流量800mL/min),使二氧化硅包覆層表面生成一層活性的羥基(接觸角〈5° )。等離子處理后的二氧化硅表面應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)的表面化學(xué)修飾，因為這些活性的羥基是不穩(wěn)定的，在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵。按每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.3 二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體的濃度要求；將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到5%( φ，體積分?jǐn)?shù))3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidy loxypropy ltrimethoxy si lane, GPTMS, 97%)的乙醇溶液中，并置于37°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)24h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗5次，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末。
[0043]4.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面二氧化硅接枝的環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:
[0044]將上述步驟制得的表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液(10 μ g/mL，0.5~1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.3mg，置于4°C放置12h，就可獲得共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子磁流體?？垢鞣N腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體，根據(jù)不同腫瘤的性質(zhì)可以聯(lián)合加入，也可以單獨(dú)加入。
[0045]實施例2
[0046]1.磁性錳鋅鐵氧體的制備:同實施例1 ;
[0047]2.用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體納米粒子:
[0048]以上述步驟制得的錳鋅鐵氧體為原料進(jìn)行表面SiO2包覆，二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有
0.5mg ;娃酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TE0S)的量為Y mL, Y取3。首先將一定量猛鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，加到1000mL燒杯中，然后超聲震蕩30min使其分散均勻。將燒杯放入60°C水浴中，并加入少量氨水(5~10mL，pH8~10)，然后將YmL TEOS加入到燒杯中，持續(xù)攪拌6h。冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末。
[0049]3.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:
[0050]先用無水乙醇和去離子水交替清洗上述步驟制得的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體3次，并干燥，然后置于等離子清洗器中處理5min(電壓600V，氧氣流量800mL/min),使二氧化硅包覆層表面生成一層活性的羥基(接觸角〈5° )。等離子處理后的二氧化硅表面應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)的表面化學(xué)修飾，因為這些活性的羥基是不穩(wěn)定的，在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵。按每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.5mg 二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體的濃度要求；將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到10%( φ，體積分?jǐn)?shù))3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidy loxypropy ltrimethoxy si lane, GPTMS, 97%)的乙醇溶液中，并置于37°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)48h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗5次，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末。
[0051]4.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面二氧化硅接枝的環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:
[0052]將上述步驟制得的表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液(5 μ g/mL, 0.5~1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.5mg,置于4°C放置24h，就可獲得共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子磁流體?？垢鞣N腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體，根據(jù)不同腫瘤的性質(zhì)可以聯(lián)合加入，也可以單獨(dú)加入。
[0053]實施例3
[0054]1.磁性錳鋅鐵氧體的制備:同實施例1 ;
[0055]2.用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體納米粒子:
[0056]以上述步驟制得的錳鋅鐵氧體為原料進(jìn)行表面SiO2包覆，二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有
0.4mg ;娃酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TE0S)的量為Y mL, Y取4。首先將一定量猛鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，加到1000mL燒杯中，然后超聲震蕩30min使其分散均勻。將燒杯放入60°C水浴中，并加入少量氨水(5~10mL，pH8~10)，然后將YmL TEOS加入到燒杯中，持續(xù)攪拌5h。冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末。
[0057]3. 磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:
[0058]先用無水乙醇和去離子水交替清洗上述步驟制得的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體3次，并干燥，然后置于等離子清洗器中處理4min(電壓600V，氧氣流量800mL/min),使二氧化硅包覆層表面生成一層活性的羥基(接觸角〈5° )。等離子處理后的二氧化硅表面應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)的表面化學(xué)修飾，因為這些活性的羥基是不穩(wěn)定的，在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵。按每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.4mg 二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體的濃度要求；將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到7%( Φ，體積分?jǐn)?shù))3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidy loxypropy ltrimethoxy si lane, GPTMS, 97%)的乙醇溶液中，并置于37°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)30h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗5次，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末。
[0059]4.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面二氧化硅接枝的環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:
[0060]將上述步驟制得的表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液(15 μ g/mL，0.5~1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.3~0.5mg,置于4°C放置20h，就可獲得共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子磁流體。抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體，根據(jù)不同腫瘤的性質(zhì)可以聯(lián)合加入，也可以單獨(dú)加入。
[0061]實施例4
[0062]1.磁性錳鋅鐵氧體的制備:同實施例1 ;
[0063]2.用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體納米粒子:
[0064]以上述步驟制得的錳鋅鐵氧體為原料進(jìn)行表面SiO2包覆，二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有
0.5mg ;娃酸四乙酯(tetraethylorthosilicate, TE0S)的量為Y mL, Y取5。首先將一定量猛鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，加到1000mL燒杯中，然后超聲震蕩30min使其分散均勻。將燒杯放入60°C水浴中，并加入少量氨水(5~10mL，pH8~10)，然后將YmL TEOS加入到燒杯中，持續(xù)攪拌6h。冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末。
[0065]3.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:
[0066]先用無水乙醇和去離子水交替清洗上述步驟制得的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體3次，并干燥，然后置于等離子清洗器中處理5min(電壓600V，氧氣流量800mL/min),使二氧化硅包覆層表面生成一層活性的羥基(接觸角〈5° )。等離子處理后的二氧化硅表面應(yīng)立即進(jìn)行后續(xù)的表面化學(xué)修飾，因為這些活性的羥基是不穩(wěn)定的，在空氣中容易再次交聯(lián)形成硅氧橋鍵。按每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液含有0.3mg 二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體的濃度要求；將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到8%(:φ，體積分?jǐn)?shù))3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(3-Glycidy loxypropy ltrimethoxy si lane, GPTMS, 97%)的乙醇溶液中，并置于37°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)26h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗5次，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末。
[0067]4.磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面二氧化硅接枝的環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:
[0068]將上述步驟制得的表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液(8 μ g/mL, 0.5~1.0%(w)海藻糖，PBS溶液)中，表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.5mg,置于4°C放置20h，就可獲得共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子磁流體?？垢鞣N腫瘤細(xì) 胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體，根據(jù)不同腫瘤的性質(zhì)可以聯(lián)合加入，也可以單獨(dú)加入。
[0069]共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫錳鋅鐵氧體納米粒子主動靶向定位腫瘤細(xì)胞實驗:
[0070]將抗人表皮生長因子受體(epithelialgrowth factor receptor, EGFR)單克隆抗體共價偶聯(lián)至二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子表面。用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μ g/mL鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基在含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Tca8113人舌癌細(xì)胞至貼壁處于對數(shù)生長期，按40~60 μ L/mL濃度將上述共價偶聯(lián)抗EGFR抗體的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4~6h后，用4%戊二醛固定細(xì)胞，清洗3次，用含2%普魯斯蘭(氰亞鐵酸鉀)、6%HC1的PBS溶液避光染色30min，清洗3次，用顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。普魯斯蘭染色可將鐵復(fù)合物染為藍(lán)色，結(jié)果如附圖9，加入上述步驟制得的共價偶聯(lián)抗EGFR抗體的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子培養(yǎng)的部分細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)色染色(圖9a)，而加入未偶聯(lián)抗EGFR抗體的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子培養(yǎng)的對照細(xì)胞均無藍(lán)色染色(圖％)，說明共價偶聯(lián)抗EGFR抗體的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子可以靶向人舌癌細(xì)胞，而且還可以內(nèi)化進(jìn)入人舌癌細(xì)胞內(nèi)。
[0071]上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子，它是將錳鋅鐵氧體MrvxZnxFe2O4表面包覆二氧化硅，再在二氧化硅包覆層表面接枝環(huán)氧基，通過環(huán)氧基開環(huán)直接共價偶聯(lián)抗體的氨基端而成，其中0.X < 0.9。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子，其特征是，所述錳鋅鐵氧體居里溫度為48°C~90°C。
3.一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，其特征是，包括步驟如下: Cl)錳鋅鐵氧體的制備:將 MnCl2.4H20、ZnCl2' FeCl3.6H20 按照 Mn1^xZnxFe2O4,0.l^x^0.9的比例稱取配成混合溶液，然后放入水浴中加熱并攪拌，將NaOH溶液滴加到攪拌中的混合溶液中，加完后使水浴升溫至70~80°C，保溫I~2h，然后降溫冷卻至室溫并靜置，倒去上清液，洗滌、抽濾，固體放入干燥箱中干燥，將試樣研磨、過篩，得到錳鋅鐵氧體粉體； (2)用二氧化硅包覆磁性錳鋅鐵氧體:將錳鋅鐵氧體與適量蒸餾水和無水乙醇制成混合液，超聲震蕩使其分散均勻，置于60~70°C水浴中，并加入少量氨水調(diào)pH=8~10，然后將硅酸四乙酯加入其中，持續(xù)攪拌4~6h，冷卻降溫，進(jìn)行抽濾、洗滌、干燥得到表面包覆有SiO2的錳鋅鐵氧體粉末； (3)磁性錳鋅鐵氧體納米粒子表面的二氧化硅接枝環(huán)氧基:先用無水乙醇和去離子水交替清洗錳鋅鐵氧體納米粒子粉體，并在氮?dú)庵懈稍?，然后置于等離子清洗器中處理使二氧化硅表面生成一層活性的羥基，將等離子體處理好的二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子粉體迅速加入到3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，并置于37±2°C氣浴恒溫振蕩器反應(yīng)24~48h，反應(yīng)完成后用無水乙醇清洗，并在37°C氮?dú)庵懈稍?，得到表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末； (4)環(huán)氧基開環(huán)共價偶聯(lián)抗體氨基端:將表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末加入到相應(yīng)的抗各種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞靶標(biāo)的抗體稀釋溶液中，置于4±2°C放置12 ~24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，其特征是:步驟(1)所述的MnCl2.4H20、ZnCl2、FeCl3.6H20、Na0H的用量比例按摩爾比l-x:x:2:8,0.1<X<0.9;氫氧化鈉溶液的濃度lmol/L;氯化鹽混合溶液中氯化鹽總濃度為lmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，其特征是:步驟(2)中無水乙醇和蒸餾水組成醇水體系，醇水體系中的乙醇、水體積比為50: I ;錳鋅鐵氧體的用量為每毫升醇水體系中含有0.3~0.5mg;硅酸四乙酯為每升醇水體系中加正硅酸乙酯0.026~0.0432mol。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，其特征是:步驟(3)中二氧化硅包覆的錳鋅鐵氧體納米粒子的用量為每毫升3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液用0.3~0.5mg ；3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液體積濃度為5~10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種共價偶聯(lián)抗體的水溶性自動控溫鐵氧體納米粒子的制備方法，其特征是，步驟(4)所述的抗體稀釋溶液濃度為5~15μ g/mL ;表面環(huán)氧基化的磁性錳鋅鐵氧體納米粒子粉末的用量為每毫升抗體稀釋溶液中含有0.3~0.5mg 。
【文檔編號】A61P35/00GK103479999SQ201310422816
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】高振南, 李愛民, 王旭霞, 劉端芹, 張平平 申請人:山東大學(xué)