專利名稱：一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯(lián)免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯(lián)免疫檢測 方法，屬于免疫分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
頭孢類抗生素屬于P -內(nèi)酰胺類抗生素。在畜類動物飼養(yǎng)中，P -內(nèi)酰胺類抗 生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但 由于其使用方法不當或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘 留，給人類健康帶來嚴重危害，如產(chǎn)生過敏反應、破壞胃腸道菌群平衡和增強 細菌耐藥性等。因此其在乳制品中的殘留也越來越引起了國內(nèi)外的重視。其中 頭孢類抗生素由于具有抗菌譜廣等優(yōu)點被廣泛用于人畜疾病的防治。且頭孢類 抗生素種類繁多，現(xiàn)有的微生物檢測法和儀器檢測法很難實現(xiàn)對所有頭孢類抗 生素進行快速、準確的檢測，有必要研究快速、便攜的多殘留免疫檢測技術(shù)。
其中酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)(ELISA)是目前能夠滿足上述檢測要求的用于定量的免 疫檢測技術(shù)，且有望用本實驗室所獲得的具有簇特異性的抗頭孢類抗生素的多 克隆抗體實現(xiàn)對至少三種頭孢類抗生素的多殘留檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯(lián) 免疫檢測方法，在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，滿足對多種抗生素進行快速篩選的 要求，提供一種快速，靈敏度高，檢測成本低廉的檢測動物源食品中頭孢類抗 生素的酶聯(lián)免疫檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種檢測動物源食品中頭孢類抗生素的酶聯(lián)免疫試劑 盒，由試劑組和包被板構(gòu)成； 試劑組的組成為
(1) 緩沖液為pH7.4磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按l : IO稀釋；
(2) 顯色液A:檸檬酸0.933g，磷酸氫二鈉3.68g， 18pL雙氧水，用蒸餾 水定容至lOOmL;
(3) 顯色液B: 60mg3,3，，5,5，-四甲基對二氨基聯(lián)苯TMB溶于100mL乙二 醇溶液；
(4) 洗滌液為含有5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按l:
IO稀釋；
(5) 終止液為2mol/L的硫酸；(6) 凍干封閉液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.4，加入0.2%的明膠；
(7) 頭孢氨芐標準液頭孢氨芐標準溶液濃度為10mg/mL，使用時用磷酸 鹽緩沖液稀釋至100ng/mL，再稀釋至40ng/mL， 10ng/mL， 2ng/mL， 0.1 ng/mL， 0.01ng/mL五個梯度；
(8) 酶標記抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體，使用時按照 1 : 5000倍稀釋；
(9) 基質(zhì)掩蔽劑含0.5%酪蛋白、pH9.0-9.5、 0.01M的磷酸鹽緩沖液；
包被板的構(gòu)成為
包被板為96孔或48孔酶標板，采用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖 液，用包被緩沖液將頭孢氨芐-BSA偶聯(lián)物稀釋至1/6400mg/mL作為包被液，在 酶標板的每孔中加入100pL包被液，37"C烘箱放置2h或4'C過夜，用稀釋后的 洗滌液洗滌三次，每次在吸水紙上拍干，然后加入凍干封閉液37'C烘箱放置2h， 取出用稀釋后的洗滌液洗滌四次后，凍干，4"C保存。
所述定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒的檢測方法，其特 征在于檢測步驟為
(1) 用3-5匸低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；
(2) 分別將各種濃度的頭孢氨芐標準溶液和樣品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要雙孔平行加樣，然后在各微孔中加入酶標記的羊抗兔抗體即酶標 二抗，混勻后37。C反應l-2h;
(3) 酶標板取出后用稀釋后的洗滌液洗滌3-5次，最后一次洗滌后將酶標 板在吸水紙上拍干，加入顯色液A與顯色液B的混合液，37'C反應20-40min; 混合液中顯色液A與顯色液B的體積比為5:1;
(4) 取出后向各微孔中加入100^iL終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光 度值，根據(jù)不同濃度頭孢氨芐標準液的吸光值繪制頭孢氨芐的濃度-吸光值標準 曲線圖，對照該標準曲線圖計算得到樣品中頭孢類抗生素的含量。
通過實驗確定其他種頭孢類抗生素的含量與頭孢氨芐標準品的含量的對應 值，給出校準因子，從而實現(xiàn)對于其他種頭孢類抗生素的檢測。
所述的樣品前處理樣品為動物組織，將樣品用勻漿器搗碎，均質(zhì)，取適 量均質(zhì)后樣品加入萃取液，3-5。C低溫離心，取上清液用基質(zhì)掩蔽劑稀釋；牛奶
樣品脫脂牛奶直接檢測，對于全酯牛奶則離心出去脂肪后進行檢測。
所用的萃取液為pH 7-8的磷酸鹽緩沖液。
檢測動物源食品中頭孢氨類抗生素含量的試劑盒所用的酶聯(lián)免疫檢測方法 采用間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法。
檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒，酶標板中包被的包被原為 新霉素與BSA的偶聯(lián)物;頭孢氨芐與BSA的偶聯(lián)物是將頭孢氨芐與載體蛋白用戊二醛法偶聯(lián)得到；
檢測動物源食品中頭孢氨類抗生素含量的試劑盒，所用的抗頭孢類抗生素
的具有簇特異性的多克隆抗體是用戊二醛兩步法將頭孢氨芐與KLH偶聯(lián)的偶聯(lián) 物作為免疫原，免疫純種新西蘭大白兔得到的抗體。四次加強后的效價達到最 好，同時對頭孢氨芐、頭孢羥氨芐等頭孢類藥物都有強的抑制作用，與多種頭 孢類抗生素有交叉反應。四次加強10天后進行心臟采血，經(jīng)離心處理后收集全 部血清，用proteinG蛋白親和柱進行純化，所得抗體加入0.1%的疊氮鈉后4°C 保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用假間接競爭酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)制備檢 測頭孢類抗生素的試劑盒，具有前處理簡單，靈敏度高，精確度高等優(yōu)點。且 通過使用具有簇特異性的多克隆抗體，并通過實驗得出各藥物與標準品的校正 因子，有望實現(xiàn)對頭孢類藥物的多殘留檢測。為實現(xiàn)酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的多殘 留檢測提供了一種思路，從而滿足當前對多批量藥物的篩選的需要。


圖1所采用多克隆抗體對頭孢氨芐的抑制率曲線。 圖2頭孢氨節(jié)標準曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡明本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1: 一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒的制備步 驟如下-
(1) 制備頭孢氨芐-KLH免疫原；
(2) 制備抗頭孢類抗生素的多克隆抗體；
(3) 制備頭孢氨芐-BSA包被原；
(4) 制備包被板；
(5) 配制試劑組。
其中(l)制備頭孢氨芐-KLH免疫原
稱取36.5mg的頭孢氮芐溶于8mL 0.01mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS) 中，攪拌下緩慢加入4(HiL 25%的戊二醛溶液，室溫下攪拌反應30min，然后將 15mgKLH的PBS溶液逐滴加入，室溫下攪拌反應3h，然后4'C、在PBS中透 析72h。然后用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。4'C保存?zhèn)溆谩?br> (2) 制備抗頭孢類抗生素的多克隆抗體 免疫新西蘭大白兔制備抗頭孢類抗生素的多克隆抗體。
(3) 制備頭孢氨芐-BSA包被原
頭孢氨芐-BSA包被原的合成采用上述戊二醛法合成，將KLH換成BSA即可。
(4) 包被板的制備
包被板為96孔或48孔酶標板并在微孔中包被頭孢氨芐-BSA偶聯(lián)物，采用 pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液稀釋頭孢氨芐-BSA偶聯(lián)物，然后加入包被板 的每個孔中，37'C烘箱放置2h或4'C過夜，用洗滌液洗滌，每次在吸水紙上拍 干，重復三次。然后加入凍干封閉液37。C烘箱放置2h，取出用上述洗滌液洗滌 四次后，凍干，4'C保存。
(5) 試劑組的組成
a) 緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時用蒸餾水按l : IO稀釋；
b) 底物A:為含有雙氧水的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液；
c) 底物B:為含有3， 3'，5，5，-四甲基對二氨基聯(lián)苯(TMB)的乙二醇溶液；
d) 洗滌液為含有5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按l : 10 稀釋；
e) 終止液為2mol/L的硫酸；
f) 凍干液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)PH7.4，加入蔗糖、乳糖、牛血 清蛋白及抗壞血酸；
g) 頭孢氨芐標準液其頭孢氨芐標準溶液濃度為10mg/ml,使用時用磷酸鹽 緩沖液稀釋至100ng/ml，再稀釋至40ng/ml， 10ng/ml， 2ng/ml， 0.1 ng/ml， 0.01 ng/ml五個梯度；
h) 酶標記抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體，使用時按照1
:5000倍稀釋。
定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒的檢測方法的步驟是
(1) 用3-5。C低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；
(2) 分別將各種濃度的頭孢氨芐標準溶液和樣品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要雙孔平行加樣，然后在各微孔中加入酶標記的羊抗兔抗體即酶標 二抗，混勻后37'C反應l-2h;
(3) 酶標板取出后用洗滌液洗滌3-5次，最后一次洗滌后將酶標板在吸水 紙上拍干，加入底物A與底物B (5 : 1V/V)的混合液，37。C反應20-40min;
(4) 取出后向各微孔中加入終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光度值， 根據(jù)不同濃度頭孢氨芐標準液的吸光值繪制頭孢氨芐的濃度-吸光值標準曲線 圖，對照該標準曲線圖計算得到樣品中頭孢類抗生素的含量。
實施例2:下面通過一具體實例，進一步說明本發(fā)明的具體應用。 檢測牛奶中頭孢類抗生素的含量，以頭孢氨節(jié)為例 (1)樣品前處理對于脫脂奶直接可以用于檢測，對于全脂牛奶則要離心
后出去脂肪層后進行檢測。(2) 取出包被板，分別將lOOul頭孢氨芐梯度稀釋的標準溶液和100ul處 理后的牛奶樣品雙孔平行加樣加入到包被板各自的微孔中，然后再在頭孢氨芐 標準液和樣品提取液各自的微孔中各加入lOOull:lO萬倍稀釋的多克隆抗體， 37。C放置lh;
(3) 用稀釋后的洗滌液洗板3次，然后在頭孢氨芐標準液和樣品提取液各 自的微孔中加入100ul顯色液A與顯色液B以1:5混合的顯色液，37'C放置0.5h;
(4) 然后向頭孢氨芐標準液和樣品提取液各自的微孔中加入100ul終止液， 終止反應，用酶標儀測定450nm處各微孔的吸光度值，繪制頭孢氨芐的標準曲 線圖，對照頭孢氨芐的標準曲線圖得到樣品中頭孢氨芐的含量。
(5) 結(jié)果計算
a. 計算抑制率值
按公式(1)計算不同濃度頭孢氨芐對抗原抗體結(jié)合反應的抑制率
IC%= (1— ~品—4白〕X100........................... (1)
A對照—A空白
式中
IC%——頭孢氨芐對抗原抗體結(jié)合反應的抑制率； A樣品——牛奶樣本的平均吸光值；
A m——不加酶標羊抗兔及頭孢氨芐標準品或樣品的平均吸光值； A自——只加酶標羊抗兔不加頭孢氨芐標準液的平均吸光值。
b. 繪制標準曲線
以抑制率為縱坐標，頭孢氨芐濃度對數(shù)值為橫坐標繪制標準曲線，每次實 驗均應重新繪制標準曲線，見圖2。
c. 結(jié)果計算
從圖2繪制的標準曲線上讀取樣液抑制率所對應的頭孢氨芐濃度。根據(jù)公 式以下公式(2)計算樣本中頭孢氨芐的殘留量
Y=0.2199x+0.511.......................................... (2)
加標試驗
在加標試驗中，分別向樣品中添加0.1ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL之間不同濃 度的頭孢氨芐標準溶液，將加標樣品充分混勻，在對牛奶樣品的檢測中,在 0.1ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL三個水平的加標回收試驗，其回收率分別為75%、 80%、 85%。
權(quán)利要求
1.一種檢測動物源食品中頭孢類抗生素的酶聯(lián)免疫試劑盒，由試劑組和包被板構(gòu)成，其特征在于試劑組的組成為(1)緩沖液為pH 7.4磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按1∶10稀釋；(2)顯色液A檸檬酸0.933g，磷酸氫二鈉3.68g，18μL雙氧水，用蒸餾水定容至100mL；(3)顯色液B60mg 3，3’，5，5’-四甲基對二氨基聯(lián)苯TMB溶于100mL乙二醇溶液；(4)洗滌液為含有5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，使用時用蒸餾水按1∶10稀釋；(5)終止液為2mol/L的硫酸；(6)凍干封閉液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.4，加入0.2％的明膠；(7)頭孢氨芐標準液頭孢氨芐標準溶液濃度為10mg/mL，使用時用磷酸鹽緩沖液稀釋至100ng/mL，再稀釋至40ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL五個梯度；(8)酶標記抗抗體為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗抗體，使用時按照1∶5000倍稀釋；(9)基質(zhì)掩蔽劑含0.5％酪蛋白、pH 9.0-9.5、0.01M的磷酸鹽緩沖液；包被板的構(gòu)成為包被板為96孔或48孔酶標板，采用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將頭孢氨芐-BSA偶聯(lián)物稀釋至1/6400mg/mL作為包被液，在酶標板的每孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃過夜，用稀釋后的洗滌液洗滌三次，每次在吸水紙上拍干，然后加入凍干封閉液37℃烘箱放置2h，取出用稀釋后的洗滌液洗滌四次后，凍干，4℃保存。
2、 用權(quán)利要求1所述定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的試劑盒的 檢測方法，其特征在于檢測步驟為(1) 用3-5i:低溫離心進行樣品前處理，得到樣品提取液；(2) 分別將各種濃度的頭孢氨節(jié)標準溶液和樣品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要雙孔平行加樣，然后在各微孔中加入酶標記的羊抗兔抗體即酶標 二抗，混勻后37"C反應l-2h;(3) 酶標板取出后用稀釋后的洗滌液洗滌3-5次，最后一次洗滌后將酶標 板在吸水紙上拍干，加入顯色液A與顯色液B的混合液，37。C反應20-40min; 混合液中顯色液A與顯色液B的體積比為5:1;(4)取出后向各微孔中加入10(^L終止液以終止反應，用酶標儀讀取吸光 度值，根據(jù)不同濃度頭孢氨芐標準液的吸光值繪制頭孢氨芐的濃度-吸光值標準 曲線圖，對照該標準曲線圖計算得到樣品中頭孢類抗生素的含量。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于通過實驗確定其他種頭孢類抗生素的含量與頭孢氨芐標準品的含量的對應值，給出校準因子，從而實 現(xiàn)對于其他種頭孢類抗生素的檢測。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的樣品前處理樣 品為動物組織，將樣品用勻漿器搗碎，均質(zhì)，取適量均質(zhì)后樣品加入萃取液， 3-5t:低溫離心，取上清液用基質(zhì)掩蔽劑稀釋；牛奶樣品脫脂牛奶直接檢測， 對于全酯牛奶則離心出去脂肪后進行檢測。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于所用的萃取液為pH7-8的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
一種定量檢測動物源食品中頭孢類抗生素含量的酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于免疫分析領(lǐng)域。本發(fā)明采用具有簇特異性的抗頭孢類抗生素的多克隆抗體作為檢測試劑，制備酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，以頭孢氨芐為標準品，通過實驗測定不同種頭孢類抗生素濃度與頭孢氨芐標準品的相對值，給出測定校正因子，有望實現(xiàn)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的多殘留檢測。本發(fā)明具有前處理簡單，靈敏度高，精確度高等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK101315372SQ20081002203
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者胡擁明, 胥傳來, 媛 袁, 謝會玲, 趙金山 申請人:江南大學