專利名稱：一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物源性食品中藥物殘留的檢測方法及試劑盒，具體是一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
卩比喹酮(praziquantel),化學(xué)名稱為(apyrazinoisoquinoline derivative: (2- (cyclohexyl-carbonyl)-I, 2, 3, 6, 7, Ilbhexahydro-4H-pyrazino [2, l_a]
isoquinoline-4-one),是人工合成的雜環(huán)類驅(qū)蟲藥劑,可治療血吸蟲、肺吸蟲、華支睪吸蟲及絳蟲等感染，吡喹酮在國內(nèi)使用普遍，2002. 12. 24實施的農(nóng)業(yè)部公告第235號附件“動物性食品中獸藥最高殘留限量”規(guī)定吡喹酮可用于馬、山羊和非泌乳綿羊，我國至今尚未制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。而2006年已開始實施的“日本肯定列表”規(guī)定了 65種動物源性食品中吡喹酮的最低限量暫定標(biāo)準(zhǔn)，其中只有9種為0. 3 mg/Kg，其他均在0. 02-0. 05mg/Kg之間，歐盟規(guī)定牛肉、豬肉、雞肉、魚肉和其他動物可食用組織中的最高殘留限量彡0. 02mg/Kg。吡喹酮的檢測國外已經(jīng)高效液相色譜方法等儀器方法進行檢測，最低檢測限達(dá)到IOppb,但是這些方法需要儀昂貴，檢測時間長，耗材價格高，操作者技術(shù)要求高，有的方法廢棄物處理困難，不太適合基層對大量樣品的快速檢驗免疫學(xué)快速檢測(ELISA)法檢測吡喹酮目前國內(nèi)外未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述的技術(shù)問題而提供一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，該檢測試劑盒及檢測方法不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備，操作簡便，動物源性食品前處理簡單，檢測快速，檢測容量大，成本低廉等特點，適合大批量動物源性食品篩選的定性、定量檢測的優(yōu)點，并具有潛在的廣泛的應(yīng)用價值。本發(fā)明的技術(shù)原理
本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物源性食品中吡喹酮含量進行檢測的原理是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。即將吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品、待測動物源性食品的提取液及特異性抗血清進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)后，加入到用包被抗原包被的酶標(biāo)條中反特異性抗血清進行競爭性的結(jié)合，在吡喹酮優(yōu)先的原則下，吡喹酮含量與特異性抗血清結(jié)合的份額就多，剩余的特異性抗血清與包被抗原結(jié)合的份額就少，呈梯度變化，吡喹酮與特異性抗血清的結(jié)合物在反應(yīng)孔中呈游離狀態(tài)，而包被抗原與酶標(biāo)記特異性抗體結(jié)合物則附著在反應(yīng)孔的壁上，前者隨洗滌步驟而洗去，后者被底物顯色，呈藍(lán)色。包被抗原與特異性抗體結(jié)合的多少與半抗原的含量呈反比，半抗原含量越多，吸光度值(OD)越低，根據(jù)OD值的變化則可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找到相應(yīng)的位置，從而計算出動物源性食品中吡喹酮準(zhǔn)確的含量。本發(fā)明的技術(shù)方案一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，含有以下組分
(I)、吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液:250,125,31.3,20,7. 8,Ong/ml
由標(biāo)準(zhǔn)吡喹酮按不同比例定容于O. 01M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液溶液中即得到濃度分別為250、125、31. 3、20、7. 8、Ong/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2 )、辣根過物氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體溶液(HRP-IgG)
市售，濃度1:100 ;使用前用稀釋成1:5000 ；
(3)、吡喹酮抗血清1:100儲存液備用，使用前用稀釋成1:1500 ；
所述的吡喹酮抗血清通過如下方法制備，其制備過程具體包括如下步驟
①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl (鹽酸)中，油浴升溫至120°C回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻放置，待底部油狀物固化后，倒出上層水層，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取該水相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物；
②、將4-氨基環(huán)己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸餾水中，然后滴加芐氧基羰酰氯16mg，在室溫下劇烈攪拌3h至產(chǎn)生沉淀，以3號砂芯漏斗過濾分離出的沉淀，以乙醚洗滌3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O(shè). 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，過無水NaSO4柱脫水，50°C真空濃縮至干得白色粉末；
③、取步驟①所得的產(chǎn)物O.5mg與步驟②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入0.76mg環(huán)已基碳二亞胺(DCC)，0.39mg4- (N，N-二甲基氨基)卩比啶(DMAP)，常溫反應(yīng)過夜，反應(yīng)結(jié)束后生成白色固體，抽濾，所得的濾液用IOmllN HCl洗滌，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃色固體，用甲醇二氯甲烷為I :10的展開劑進行薄層板分離純化；
④、將步驟③所得的黃色固體經(jīng)薄層分離純化后的產(chǎn)物O.5mg，鈀碳O. 2mg，置于圓底燒瓶中，抽真空，充氫氣；加入15ml甲醇，常溫反應(yīng)2-3h，過濾去除鈀碳，以甲醇二氯甲烷為I : 10的展開劑進行薄層板分離純化得到吡喹酮氨，最后經(jīng)核磁氫譜鑒定后分裝，低溫保存?zhèn)溆茫?br> ⑤、免疫原和包被抗原的制備
稱取O. Olmg牛血清蛋白(BSA)和O. Olmg卵清蛋白(OVA)分別溶于1ml，濃度為IOOmM,pH 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，再分別加入O. Olmg 丁二酸酐，常溫反應(yīng)3h ；
上述常溫反應(yīng)3h后的產(chǎn)物分別用500ml*3，濃度為100mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，每4h更換緩沖液；
在上述透析后的產(chǎn)物中分別加入O. 004mg碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和O. 004mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，再分別加入步驟④所得的吡喹酮胺O. 008mg, 4V反應(yīng)3h ；
上述4°C反應(yīng)3h后的產(chǎn)物分別用含8mg氯化鈉的1000ml*3，濃度為10mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，再分別將透析好的產(chǎn)物分裝，冷凍保存，所得的吡喹酮胺-BSA即免疫原和吡喹酮胺-OVA即包被抗原；
⑥、吡喹酮抗血清制備
選用臨床健康，體重I. 5一2Kg的新西蘭雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐劑加Iml步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用Iml弗氏不完全佐劑加ImL步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，從第2次免疫后，每次免疫10天后耳緣靜脈采血作即吡喹酮抗血清效價測定，最后一次免疫后10天宰殺，采血，分離出血清即得吡喹酮抗血清，加等量甘油冷凍于_20°C保存；
(4)、濃縮洗滌液0.2M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液，使用前用蒸餾水稀釋20倍；
(5)、顯色液市售TMB，即3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺一H2O2溶液；
(6)、終止液2moI/LH2SO4 溶液；
(7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，即包 被酶標(biāo)條
將包被抗原即吡喹酮胺-OVA用O. 01mol/L pH為9. I的碳酸鹽緩沖液稀釋成工作濃度1:400,包被聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板,置4°C過夜,清洗后甩干拍凈置4°C備用；
(8)、空白聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板,即酶標(biāo)條。利用上述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物食品中吡喹酮的含量進行檢測，還需要配備以下儀器與設(shè)備
(1)酶標(biāo)檢測儀
(2),10-20ul、100-200ul、IOOOul微量移液器
(3)、振蕩器
(4)、離心機
(5)、分析天平
(6)、組織搗碎機。利用上述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物食品中吡喹酮的含量進行檢測的方法，具體包括如下步驟
(I )、待測動物源性食品前處理
取50mg待測動物源性食品用組織搗碎機搗碎成肉泥，準(zhǔn)確稱取動物源性食品的肉泥2mg于IOmL離心管中，加入4ml乙醇攪拌，10000r/min離心，取上清液，再用4ml乙醇提取沉淀物，合并兩次提取液吹干乙醇后，用標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至2ml,沸水水浴lmin, 10000r/min離心，0. 45 μ m膜過濾后得待測動物源性食品提取液；
所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液為試劑盒中的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后的所得的稀釋液；本發(fā)明的實施例中僅以牛肉、豬肉、雞肉和魚肉中的吡喹酮的含量測定進行舉例，但本發(fā)明的利用上述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物食品中吡喹酮的含量進行檢測的方法的適用范圍并不限于此，還可適用于其他類似的動物源性食品;
(2)、用試劑盒檢測吡喹酮殘留
①、準(zhǔn)備
分析前將試劑盒中的所有試劑平衡至室溫，分別按要求將所有試劑稀釋至使用濃度，分析后立即將所有試劑放回4一8°C冰箱；
②、板外抑制
取一塊空白聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，即酶標(biāo)條將步驟(I)所得的待測食品提取液及試劑盒中濃度分別為250、125、31· 3,15. 6,7. 8,Ong/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各60 μ I依次加入到聚苯乙烯微量反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振蕩器振蕩30s后置濕盒，即潮濕的盒子中37°C反應(yīng)30min后得反應(yīng)液；
③、競爭抑制在已包被的酶標(biāo)條即已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板中每孔加入上述O. Img步驟②所得的反應(yīng)液，37°C濕盒內(nèi)反應(yīng)I. 5h后，每孔再加O. 2mg步驟(I)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液清洗3次，每次間隔3min ；
④、二抗反應(yīng)
步驟③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG O. lmg，置37°C反應(yīng)Ih后拍干洗
凈；
⑤、顯色
步驟④拍干洗凈后再于每孔中加入顯色液O. lmg，于37°C反應(yīng)IOmin ； ⑥、終止
步驟⑤反應(yīng)結(jié)束后再于每孔中加入O. 05mg終止液，振蕩30s后靜置2min在450nm處，使用酶標(biāo)測定儀，以空氣為空白調(diào)零，測定吸光度，即吸收值；
⑦、檢測結(jié)果分析計算
a、限量法
若試樣孔，即加入待測動物源性食品提取液酶標(biāo)孔的吸光度值小于20ng/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值，超過限量值為陽性；
若試樣孔的吸光度值大于20ng/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收值，小于限量值為陰性；
b、定量法
吡喹酮濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以不同濃度的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值為縱坐標(biāo)，以濃度(ng/ml)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，用半對數(shù)紙繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測動物源性食品提取液的吸收值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的吡喹酮濃度，然后通過如下公式計算出待測動物源性食品中吡喹酮的含量；
待測動物源性食品中吡喹酮的含量即X (mg/Kg)，計算公式如下
V
.X:-
P M
c一根據(jù)吸收值從吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找得到的待測動物源性食品提取液中吡喹酮濃度(ng/ml)；
V—待測動物源性食品提取液體積(ml)；
N—待測動物源性食品濃縮的倍數(shù)；
M—待測動物源性食品質(zhì)量(g)。上述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用注意事項
測定后零標(biāo)準(zhǔn)孔的吸收值最高，當(dāng)其吸收值低于O. 6時，試劑盒失效；
在重復(fù)條件下，獲得的兩次獨立測試結(jié)果相對差值不大于15% ；
不同批號的試劑盒不能混用；
保質(zhì)期3個月(4-8°C);
回收率:80-120% ；
線性范圍7. 8-250ng/ml。本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，通過改進國外相關(guān)技術(shù)，在吡喹酮分子結(jié)構(gòu)中成功引入氨基合成了吡喹酮胺，再以丁二酸酐作橋用碳二亞胺鹽酸鹽法與BSA或OVA偶聯(lián)成免疫原或包被抗原，以此免疫原免疫實驗兔獲得了高效價特異性抗體，并通過篩選出豬肉、牛肉、雞肉、魚肉中吡喹酮的簡便樣品前處理方法，基本消除待測基質(zhì)的影響，有利于基層單位的使用。進一步的，本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測線性范圍為250ng — 7.8ng/g(ml)，檢測底線為7. 8ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)大于O. 99與結(jié)構(gòu)類似化合物喹稀酮、吡蚜酮無交叉反應(yīng)，與液相色譜-質(zhì)譜測定方法(SN/T1979-2007)進行比較，其檢測方法可靠。進一步的，本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒操作簡便，且一次測定周期僅為4h，且又由于使用了 48或96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板，因此2-3h即可完成20-30份樣品的測定，大大提高檢測效率。另外，本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒由于在30°C穩(wěn)定放置7天，4°C放置3個月后，仍良好，因此有利于試劑盒的運輸、攜帶和、貯存。


圖1，實施例2中不同濃度的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值及對應(yīng)濃度的半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線中吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值為縱坐標(biāo)，濃度(ng/ml)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)。
具體實施例方式下面通過實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步闡述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明的實施例中利用一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物源性食品中吡喹酮含量進行檢測，配備的儀器與設(shè)備的型號及生產(chǎn)廠家等信息如下，請給出
(1)酶標(biāo)檢測儀，DG3022國營華東電子管廠；
(2)、10—20111、100-200111、1000111微量移液器 FINNPIPEFFE 芬蘭；
(3)、振蕩器，MH-5海門其林貝爾儀器制造有限公司；
(4)、離心機，H-2050K長沙湘儀離心機儀器制造有限公司；
(5)、分析天平，AL204梅特勒、BL-2200H日本島津；
(6)薄層板分離純化所用的設(shè)備，復(fù)華紫外分析器。實施例I
一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，含有以下組分
(I)、吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液:250,125,31.3,15. 6,7. 8,Ong/ml
由標(biāo)準(zhǔn)吡喹酮按不同比例定容于O. 01M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液溶液中即得到濃度分別為250、125、31. 3、15. 6、7. 8、Ong/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2 )、辣根過物氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體溶液(HRP-IgG)
市售，濃度1:100 ；
(3)、吡喹酮抗血清
所述的吡喹酮抗血清通過如下方法制備，其制備過程具體包括如下步驟
①、IOmg吡喹酮加入O. 15ml IN HCl (鹽酸)中，油浴升溫至120°C回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻放置，待底部油狀物固化后，倒出上層水層，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取該水相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物；
②、將4-氨基環(huán)己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸餾水中，然后滴加芐氧基羰酰氯16mg，在室溫下劇烈攪拌3h至產(chǎn)生沉淀，以3號砂芯漏斗過濾分離出的沉淀，以乙醚洗滌3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O(shè). 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 501111、501111、501111洗3次，過無水似304柱脫水，501真空濃縮至干得白色粉末；
③、取步驟①所得的產(chǎn)物O.5mg與步驟②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入0.7611^環(huán)已基碳二亞胺(00)，0.3911^4- (N，N-二甲基氨基)卩比啶(DMAP)，常溫反應(yīng)過夜,反應(yīng)結(jié)束后生成白色固體,抽濾；
所得的濾液用IOmllN HCl洗滌，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃色固體，用以薄層板分離純化(展開劑甲醇二氯甲烷為I : 10)，產(chǎn)率60%;
④、將步驟③所得的黃色固體經(jīng)薄層分離純化后的產(chǎn)物O.5mg，鈀碳O. 2mg，置于圓底燒瓶中，抽真空，充氫氣；加入15ml甲醇，常溫反應(yīng)2-3h，過濾去除鈀碳，以薄層板分離純化得到吡喹酮氨(展開劑為甲醇二氯甲烷為I :10)，產(chǎn)率65%，最后經(jīng)核磁氫譜鑒定后分裝，低溫保存?zhèn)溆茫?br> ⑤、免疫原和包被抗原的制備
稱取O. Olmg牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分別溶于1ml，濃度為IOOmM,pH 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，再分別加入O. Olmg 丁二酸酐，常溫反應(yīng)3h ；
上述常溫反應(yīng)3h后的產(chǎn)物分別用500ml*3，濃度為100mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透
析；
在上述透析后的產(chǎn)物中分別加入O. 004mg碳二亞胺鹽酸鹽(DCE)和O. 004mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，再分別加入步驟④所得的吡喹酮胺O. 008mg，4°C反應(yīng)3h ；
上述4°C反應(yīng)3h后的產(chǎn)物分別用含8mg氯化鈉的1000ml*3，濃度為10mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，將透析好的產(chǎn)物分別分裝，冷凍保存，所得的吡喹酮胺-BSA即免疫原，所得的吡喹酮胺-OVA即包被抗原；
⑥、吡喹酮抗血清制備
選用臨床健康，體重I. 5一2Kg的新西蘭雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐劑加Iml步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用Iml弗氏不完全佐劑加ImL步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，從第2次免疫后，每次免疫10天后耳緣靜脈采血作即吡喹酮抗血清效價測定，最后一次免疫后10天宰殺，采血，分離即得吡喹酮抗血清，加甘油冷凍于-20°C保存；
(4)、濃縮洗滌液0.2M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液，使用前用蒸餾水稀釋20倍；
(5)、顯色液市售3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺一H2O2(TMB)溶液；
(6)、終止液2mol/LH2SO4 溶液；
(7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，即已包被的酶標(biāo)條
將吡喹酮包被抗原(吡喹酮胺-0VA)用稀釋后的濃縮洗滌液稀釋成工作濃度I :400，包被聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，置4°C過夜，清洗后甩干拍凈置4°C備用；(8)、空白聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板,即酶標(biāo)條。 實施例2
利用實施例I所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物源性食品牛肉、豬肉、雞肉及魚肉中吡喹酮的含量進行檢測的方法，具體包括如下步驟
(1)、待測動物源性食品牛肉、豬肉、雞肉、魚肉前處理
分別取50mg牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品用組織搗碎機搗碎成肉泥，分別準(zhǔn)確稱取肉泥2mg于IOmL離心管中，分別加入4ml乙醇攪拌，10000r/min離心，取上清液，再分別用4ml乙醇提取沉淀物，分別合并兩次提取液吹干乙醇后，分別用稀釋后的濃縮洗滌液定容至2ml，沸水水浴Imin分鐘，10000r/min離心，O. 45 μ m膜過濾后分別得牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品提取液；
標(biāo)準(zhǔn)溶液為PBST空白稀釋液；
(2)、檢測吡喹酮含量
①、準(zhǔn)備
分析前將動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒中的平衡至室溫，分別按要求將所有試劑稀釋至使用濃度，分析后立即將所有試劑放回4 8°C冰箱；
②、板外抑制
取一塊空白48或96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板將步驟(I)所得的牛肉、豬肉、雞肉、魚肉食品提取液及試劑盒中濃度分別為 250ng/ml、125ng/ml、31. 3ng/ml、15. 6ng/ml、7. 8ng/ml、Ong/ml的卩比喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各60 μ I依次加入到聚苯乙烯微量48或96反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振蕩器振蕩30s后置濕盒中37°C反應(yīng)30min后得反應(yīng)液；
③、競爭抑制
在已包被的酶標(biāo)條，即在已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板中每孔加入0. Img步驟②所得的反應(yīng)液,37°C濕盒內(nèi)反應(yīng)I. 5h后，每孔再加0. 2mg標(biāo)準(zhǔn)溶液即PBST空白稀釋液清洗3次，每次間隔3min ；
④、二抗反應(yīng)
步驟③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG 0. lmg，置37°C反應(yīng)Ih后拍干洗
凈；
⑤、顯色
步驟④拍干洗凈后再于每孔中加入顯色液0. Img,于37°C濕盒反應(yīng)IOmin ；
⑥、終止
步驟⑤濕盒反應(yīng)結(jié)束后再于每孔中加入0. 05mg終止液，振湯30s后靜直2min在450nm處，使用酶標(biāo)測定儀，以空氣為空白調(diào)零，測定吸光度，即吸收值；
以濃度分別為 250ng/ml、125ng/ml、31. 3ng/ml、15. 6ng/ml、7. 8ng/ml>Ong/ml 的卩比喹酮標(biāo)準(zhǔn)品的吸收值為縱坐標(biāo)，濃度(ng/ml)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，用半對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的曲線如圖I所示，從圖I中可以得出，曲線在7. 8— 250 μ g/L范圍內(nèi)成線性；
根據(jù)測得的牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品提取液吸光度，通過圖I所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品提取液中吡喹酮濃度，然后通過如下公式計算出牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品中吡喹酮的含量；牛肉、豬肉、雞肉、魚肉待測食品提取液樣品中吡喹酮的含量即X (mg/Kg)，計算公式如
下
權(quán)利要求
1.一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于含有以下組分 (1)、吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液 (2)、辣根過物氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體溶液； (3)、吡喹酮抗血清； (4)、濃縮洗滌液； (5)、顯色液； (6)、終止液； (7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反應(yīng)板； (8)、空白聚苯乙烯微量反應(yīng)板。
2.如權(quán)利要求I所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的吡喹酮抗血清通過如下方法制備，其制備過程具體包括如下步驟 ①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl中，油浴升溫至120°C回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻放置，待底部油狀物固化后，倒出上層水層，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取該水相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物； ②、將4-氨基環(huán)己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸餾水中，然后滴加芐氧基羰酰氯16mg，在室溫下劇烈攪拌3h至產(chǎn)生沉淀，以3號砂芯漏斗過濾分離出的沉淀，以乙醚洗滌3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O(shè). 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，過無水NaSO4柱脫水，50°C真空濃縮至干得白色粉末； ③、取步驟①所得的產(chǎn)物O.5mg與步驟②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入O. 76mg環(huán)已基碳二亞胺,0. 39mg4- (N, N-二甲基氨基)卩比唳，常溫反應(yīng)過夜,反應(yīng)結(jié)束后生成白色固體，抽濾，所得的濾液用IOmllN HCl洗滌，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃色固體，用甲醇二氯甲烷為I :10的展開劑進行薄層板分離純化； ④、將步驟③所得的黃色固體經(jīng)薄層分離純化后的產(chǎn)物O.5mg，鈀碳O. 2mg，置于圓底燒瓶中，抽真空，充氫氣；加入15ml甲醇，常溫反應(yīng)2-3h，過濾去除鈀碳，以甲醇二氯甲烷為I : 10的展開劑進行薄層板分離純化得到吡喹酮氨； ⑤、免疫原的制備 稱取O. Olmg BSA溶于1ml，濃度為100mM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，再加入O. Olmg丁二酸酐，常溫反應(yīng)3h; 上述常溫反應(yīng)3h后的產(chǎn)物分別用500ml*3，濃度為100mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，每4h更換緩沖液； 在上述透析后的產(chǎn)物中加入O. 004mg碳二亞胺鹽酸鹽和O. 004mgN-羥基琥珀酰亞胺，再加入步驟④所得的吡喹酮胺O. 008mg，4°C反應(yīng)3h ； 上述4°C反應(yīng)3h后的產(chǎn)物用含8mg氯化鈉的1000ml*3，濃度為10mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，透析好的產(chǎn)物即為免疫原即吡喹酮胺-BSA ； ⑥、吡喹酮抗血清制備 選用臨床健康，體重I. 5一2Kg的新西蘭雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐劑加Iml步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮內(nèi)多點注射，此后每間隔四周用Iml弗氏不完全佐劑加ImL步驟⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，最后一次免疫后10天宰殺，采血，分離出血清即得吡喹酮抗血清。
3.如權(quán)利要求2所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為250，125，31. 3,20,7. 8，0ng/ml。
4.如權(quán)利要求3所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒， 其特征在于所述的濃縮洗滌液為O. 2M/L磷酸鹽-吐溫20緩沖液。
5.如權(quán)利要求4所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的顯色液為3，3，5，5四甲基聯(lián)苯胺一H2O2溶液。
6.如權(quán)利要求5所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的終止液為2mol/LH2S04溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒， 其特征在于所述的已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反應(yīng)板的 制備方法如下 將包被抗原即吡喹酮胺-OVA用O. 01mol/L pH為9. I的碳酸鹽緩沖液稀釋成工作濃度1:400，包被聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，置4°C過夜，清洗后甩干拍凈即得已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反應(yīng)板； 其中所述的包被抗原即吡喹酮胺-OVA的制備方法包括如下步驟 ①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl中，油浴升溫至120°C回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻放置，待底部油狀物固化后，倒出上層水層，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取該水相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物； ②、將4-氨基環(huán)己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸餾水中，然后滴加芐氧基羰酰氯16mg，在室溫下劇烈攪拌3h至產(chǎn)生沉淀，以3號砂芯漏斗過濾分離出的沉淀，以乙醚洗滌3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O(shè). 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，過無水NaSO4柱脫水，50°C真空濃縮至干得白色粉末； ③、取步驟①所得的產(chǎn)物O.5mg與步驟②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入O. 76mg環(huán)已基碳二亞胺,0. 39mg4- (N, N-二甲基氨基)卩比唳，常溫反應(yīng)過夜,反應(yīng)結(jié)束后生成白色固體，抽濾，所得的濾液用IOmllN HCl洗滌，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得黃色固體，用甲醇二氯甲烷為I :10的展開劑進行薄層板分離純化； ④、將步驟③所得的黃色固體經(jīng)薄層分離純化后的產(chǎn)物O.5mg，鈀碳O. 2mg，置于圓底燒瓶中，抽真空，充氫氣；加入15ml甲醇，常溫反應(yīng)2-3h，過濾去除鈀碳，以甲醇二氯甲烷為I : 10的展開劑進行薄層板分離純化得到吡喹酮氨； ⑤、包被抗原的制備 稱取O. OlmgOVA溶于1ml，濃度為lOOmM，pH 7. O的磷酸鹽緩沖溶液中，再加入0. Olmg丁二酸酐，常溫反應(yīng)3h; 上述常溫反應(yīng)3h后的產(chǎn)物用500ml*3，濃度為lOOmM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，每4h更換緩沖液； 在上述透析后的產(chǎn)物中加入0. 004mg碳二亞胺鹽酸鹽和0. 004mgN-羥基琥珀酰亞胺，再加入步驟④所得的吡喹酮胺0. 008mg，4°C反應(yīng)3h ；上述4°C反應(yīng)3h后的產(chǎn)物用含8mg氯化鈉的1000ml*3，濃度為10mM，pH7. O的磷酸鹽緩沖溶液透析3天，透析好的產(chǎn)物即為包被抗原即吡喹酮胺-OVA。
8.利用一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物源性食品中吡喹酮的含量進行檢測的方法，其特征在于具體包括如下步驟 (I )、待測動物源性食品前處理 取50mg待測動物源性食品用組織搗碎機搗碎成肉泥，準(zhǔn)確稱取動物源性食品的肉泥2mg于IOmL離心管中，加入4ml乙醇攪拌，10000r/min離心，取上清液，再用4ml乙醇提取沉淀物，合并兩次提取液吹干乙醇后，用標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至2ml,沸水水浴lmin, 10000r/min離心，O. 45 μ m膜過濾后得待測動物源性食品提取液； 所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液為試劑盒中的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后的所得的稀釋液； (2)、用試劑盒檢測吡喹酮殘留①、準(zhǔn)備 分析前將試劑盒中的所有試劑平衡至室溫，分別按要求將所有試劑稀釋至使用濃度，分析后立即將所有試劑放回4一8°C冰箱； ②、板外抑制 取一塊空白聚苯乙烯微量48或96孔反應(yīng)板，即酶標(biāo)條將步驟(I)所得的待測動物源性食品提取液及試劑盒中濃度分別為250、125、31. 3、15. 6,7. 8、0ng/ml的吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)溶液各60μ I依次加入到聚苯乙烯微量反應(yīng)板的反應(yīng)孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振湯器振湯30s后直37 C濕盒中反應(yīng)30min后得反應(yīng)液； ③、競爭抑制 在已包被的酶標(biāo)條即已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板中每孔加入上述O. Img步驟②所得的反應(yīng)液，37°C濕盒內(nèi)反應(yīng)I. 5h后，每孔再加O.2mg步驟(I)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液清洗3次，每次間隔3min ； ④、二抗反應(yīng) 步驟③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG 0. lmg，置37°C反應(yīng)Ih后拍干洗凈； ⑤、顯色 步驟④拍干洗凈后再于每孔中加入顯色液0. lmg，于37°C反應(yīng)IOmin ； ⑥、終止 步驟⑤反應(yīng)結(jié)束后再于每孔中加入0. 05mg終止液，振蕩30s后靜置2min在450nm處，使用酶標(biāo)測定儀，以空氣為空白調(diào)零，測定吸光度，即吸收值； ⑦、檢測結(jié)果分析計算，最終得到動物源性食品中吡喹酮的含量。
9.如權(quán)利要求8所述的利用一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對動物源性食品中吡喹酮的含量進行檢測的方法，其特征在于所述的動物源性食品為牛肉、豬肉、雞肉或魚肉。
全文摘要
本發(fā)明公開一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑及其檢測方法。即將已知系列濃度吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品和吡喹酮抗血清進行抗原抗體反應(yīng)，得出吸光度值，制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時將待測動物源性食品的提取液及吡喹酮抗血清進行抗原抗體結(jié)合反應(yīng)后，根據(jù)吸光度值在吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找到相應(yīng)的位置，從而計算出動物源性食品中吡喹酮準(zhǔn)確的含量。本發(fā)明的一種動物源性食品中吡喹酮含量的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測線性范圍為250ng-7.8ng/g(ml),與結(jié)構(gòu)類似化合物喹稀酮、吡蚜酮無交叉反應(yīng)，檢測方法可靠、操作簡便、檢測效率高，穩(wěn)定性能好，有利于基層單位的使用。
文檔編號G01N33/545GK102854309SQ20121030459
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者李平, 肖震, 周成林, 周洪斌, 吳小華 申請人:鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術(shù)中心