專利名稱：定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素b含量試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中 新霉素B含量試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
新霉素屬于氨基糖苷類藥物，由鏈霉菌產(chǎn)生，可分離出A、 B、 C三種 主要成分，新霉素B是主要成分；A和C的活性比B低，但B的抗菌作用 比C強(qiáng)2 4倍，因此新霉素B是新霉素殘留的標(biāo)識(shí)物。新霉素抗菌譜廣， 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和結(jié)核桿菌均有良好的抑制作用。在獸醫(yī)臨床上，新霉素 主要用于治療畜禽細(xì)菌性腸炎，另外，新霉素還被廣泛用于治療畜禽乳腺 炎、角膜炎、結(jié)膜炎、耳炎、皮炎、外傷感染以及足腐爛等疾??；在畜禽 養(yǎng)殖上，新霉素可提高飼料利用率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。新霉素因其抗菌活力 強(qiáng)、作用范圍廣泛、用量少、價(jià)格低、口服安全性能高等優(yōu)點(diǎn)而作為一種 常用獸藥及具有發(fā)展前景的詞料添加藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣為使用。但是 其吸收毒性強(qiáng)，有較大的耳毒性、腎毒性，并可通過(guò)藥物破壞溶酶體而引 起磷脂尿、腎小管細(xì)胞壞死和急性小管壞死引起的蛋白尿、管型尿，抗生 素后效應(yīng)較強(qiáng)，其強(qiáng)度與藥物濃度成正比，具有藥物依賴效應(yīng)。所以新霉 素在動(dòng)物性食品中的殘留對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生較大的潛在危害，對(duì)食品衛(wèi)生和公 共健康產(chǎn)生了威脅。
伴隨著新霉素在獸醫(yī)臨床的大量使用，特別是在飼料中大量添加所導(dǎo)致 的動(dòng)物性食品中新霉素殘留量增加，誘發(fā)繼發(fā)性耐藥性問(wèn)題倍受關(guān)注。日本 要求調(diào)整動(dòng)物產(chǎn)品中抗生素新霉素的最大殘留限量，分別為肝臟、肌肉、脂 肪500pg/kg，腎臟10000pg/kg，牛奶500pg/kg和雞蛋暫定標(biāo)準(zhǔn)是500昭/kg。 歐盟對(duì)新霉素建立了最大殘留檢測(cè)限，規(guī)定肝臟、肌肉、脂肪500pg/kg，腎 臟5000jxg/kg，牛奶1500嗎/kg和雞蛋500嗎/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定 的新霉素最高殘留限量為肌肉、脂肪、肝500 pg/kg，腎臟10000(ig/kg，牛 奶500 pg/kg和雞蛋500嗎/kg。
目前新霉素B的測(cè)定方法有多種，如薄層層析法(TLC)、微生物法、 比色法和高效液相色譜法(HPLC)等方法。其中，國(guó)內(nèi)外研究與應(yīng)用較多 的是HPLC法，但是這種方法前處理過(guò)程繁瑣，操作復(fù)雜，而且通常需要 專業(yè)人員進(jìn)行操作，儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)且費(fèi)用較高，不適于大
量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA)由于其特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性 好，操作簡(jiǎn)便，適于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們的青睞。雖 然很多科研機(jī)構(gòu)和大專院校的科研人員對(duì)新霉素B酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)方法 進(jìn)行了研究，但是檢測(cè)的靈敏度和試劑盒的穩(wěn)定性方面離實(shí)際應(yīng)用還有一 定的距離。
酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)的基本原理是將酶與抗原或抗體用 交聯(lián)劑結(jié)合起來(lái)，此種酶標(biāo)記抗原或抗體與待測(cè)樣品中相應(yīng)抗體或抗原發(fā) 生特異反應(yīng)，并牢固結(jié)合，在加入相應(yīng)的酶的底物時(shí)，底物被酶催化生成 呈色產(chǎn)物，可根據(jù)呈色物的有無(wú)和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技 術(shù)是建立在抗原抗體反應(yīng)和酶的高效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有 檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈 敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低且采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)定量 檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒，由試劑組和包被
板構(gòu)成，其中試劑組的組成為
(1) .緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH7.3 7.5，使用時(shí)用二次水按1:5稀
釋；
(2) .底物A:為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；
(3) .底物B:為含3,3',5,5'-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯的二甲基亞砜溶液； (4X洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)用二次水按照1:5
稀釋；
(5) .終止液為1.25 mol/L硫酸；
(6) .凍干液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH7.3 7.5，加入蔗糖、 乳糖、牛血清蛋白及抗壞血酸；
(7) .新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液其新霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10mg/L，使用時(shí)用 磷酸鹽緩沖液稀釋至100 pg/L后，再按1:5稀釋六個(gè)梯度；
(8) .酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過(guò)氧化物酶的連接物 新霉素B-HRP，使用時(shí)用緩沖液按照1:10萬(wàn)倍稀釋；
(9) .基質(zhì)掩蔽劑0.5 %BSA/PBS溶液，且其pH9.0 9.5; 包被板的構(gòu)成為
包被板為96孔或48孔微孔板并在微孔中包被新霉素B多克隆抗體，
采用Na2C03 — NaHC03的緩沖液將多克隆新霉素B抗體稀釋為包被液， 向包被板中每孔各加入包被液，室溫放置過(guò)夜或者35 40 'C恒溫溫育2 3小時(shí)，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干液封閉0.8 1.2小時(shí)，洗 滌液洗滌四次后，凍干，3 5'C保存。
而且，所述的新霉素B多克隆抗體是選用雄性日本大耳白兔進(jìn)行六次 免疫，三次免疫后IO天由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清進(jìn)行效 價(jià)檢測(cè)，末次免疫后采用股動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集 全部血清，采取免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.in/。(W/V) 的疊氮鈉后于4'C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 一種定量撿測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒的檢測(cè)方法，其 檢測(cè)方法的步驟是
(1) .用3 5。C低溫離心進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液；
(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，要雙孔平行加樣，然后再在各種濃度新 霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中分別加入酶標(biāo)記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5 10min,室溫反應(yīng)1 2小時(shí)；
(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體鬼掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí);
(4) .向各微孔中加入終止液以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，根據(jù) 不同濃度新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制新霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，對(duì)照新 霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
而且，所述的酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液的制備方法是-
(1) .將辣根過(guò)氧化物酶HRP用磷酸鹽緩沖液PBS溶解，再將此酶溶 液逐滴加入到新霉素B中，形成混合液；
(2) .將1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶于雙蒸水中，逐滴加 入到新霉素b和酶的混合液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.8 1.2小時(shí)，然后放于3 5'C連續(xù)攪拌過(guò)夜，形成反應(yīng)液；
(3) .將反應(yīng)液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析90 100小時(shí)；
(4) .精確量取酶偶聯(lián)物溶液的體積并測(cè)定濃度，加入硫柳汞后3 5 °C 保存。
而且，所述的底物A和底物B的混合液的配比為14.6: 0.45。 而且，所述的樣品前處理為將樣品攪碎成均質(zhì)，放于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?取樣品加入萃取液，低溫離心，取部分上清液用基質(zhì)掩蔽劑稀釋。 而且，所述的萃取液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9。 本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)是
1. 本發(fā)明的試劑盒具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、 檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，而且適用范圍較廣，主要適用于動(dòng)物源性食品中新霉
素B含量的定量檢測(cè)，其抗體具有良好的廣譜性和靈敏度，所得抗體和酶 標(biāo)抗原穩(wěn)定，具有常溫保藏時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)。
2. 本發(fā)明的快速檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速，完成全部檢測(cè)操作過(guò)程只需 幾小時(shí)，檢測(cè)的精確度可達(dá)90%以上，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到pg/kg級(jí)非常適 合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。由于抗體和酶標(biāo)抗原在常溫下可以保藏l周，抗體包 被的酶標(biāo)板在4 'C下可以保藏6個(gè)月以上，從而為進(jìn)行大規(guī)模樣品的集中 檢測(cè)，提供了極大的方便。
3. 本發(fā)明成本低廉、檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便，既有經(jīng)濟(jì)效益又有社會(huì)效 益，是一種創(chuàng)新性較高的具有良好的應(yīng)用前景的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中 新霉素B含量試劑盒及其檢測(cè)方法。


圖1本發(fā)明新霉素B-直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限 定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒的制備包括以下
步驟
(1) .制備新霉素B-KLH抗原；
(2) .制備新霉素B多克隆抗體；
(3) .制備酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液；
(4) .制備包被板；
(5) .配制試劑組。
其中-
(1).新霉素B-KLH抗原的制備
稱取10mg大分子蛋白匙孔血蘭蛋白(KLH)(以下簡(jiǎn)稱KLH)， 用1 mLO.Ol mol/L磷酸鹽緩沖液PBS (緩沖液，以下簡(jiǎn)稱PBS) pH 7.4 溶解，取46.7mg新霉素B溶于該蛋白溶液中，再取400mgEDC (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)溶于雙蒸水中，逐滴加入到新霉素B 和蛋白的混合溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)，然后放于3 5'C連續(xù)攪拌 過(guò)夜，最后將反應(yīng)液裝入透析袋，在PBS中透析72小時(shí)，然后精確量 取蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液的體積并測(cè)定濃度，加入疊氮鈉后4 "C保存。新霉素 B是一種小分子半抗原，只有反應(yīng)原性而無(wú)免疫原性，需要與載體蛋白偶 聯(lián)后才能使動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，本發(fā)明以合成的新霉素B-KLH作為免疫
原進(jìn)行動(dòng)物免疫。
(2) .新霉素B多克隆抗體的制備
免疫動(dòng)物選擇日本大耳白兔3只，月齡3個(gè)月，體重1.5公斤左右，分 別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)。免疫采取皮下和肌肉注射法共同進(jìn)行。
免疫程序初次免疫為提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐劑乳
化的免疫原，劑量為1 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏完 全佐劑混合進(jìn)行乳化。加強(qiáng)免疫初次免疫后第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，劑量 為0.5 mg，溶于1 mL 0.9%的NaCl，再與1 mL的弗氏不完全佐劑混合進(jìn)行 乳化。以后每隔30天加強(qiáng)免疫一次，共免疫6次。從第2次加強(qiáng)免疫開(kāi)始， 每次免疫IO天后對(duì)動(dòng)物試采血進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定和親和力測(cè)定。末次免疫 后采用頸動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理后收集全部血清，采取免 疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1%(w/v)的疊氮鈉后于4 °C 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> (3) .酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液的制備
① .稱取5mg辣根過(guò)氧化物酶(HRP)溶解在500 pLPBS中，逐滴 加入到1.5mg新霉素B中，形成混合液；
② .取60 mgEDC( l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺)溶于200 雙蒸水中，逐滴加入到新霉素B和酶的混合液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)l小時(shí)， 然后放于4"C連續(xù)攪拌過(guò)夜，形成反應(yīng)液；
③ .將反應(yīng)液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析96小時(shí)；
④ .精確量取酶偶聯(lián)物溶液的體積并測(cè)定濃度，加入硫柳汞后4 "C保存。
(4) .包被板的制備
新霉素B多克隆抗體包被于微孔板中，用pH 9.6 Na2C03—-NaHC03的 緩沖液將新霉素b多克隆抗體稀釋為0.5 pg/lOO mL作為包被液，96孔微孔 板每孔各加入100 室溫放置過(guò)夜或者37 。C恒溫溫育2 3小時(shí)，洗滌 液洗滌三次除去包被液，加入200ioL凍干液封閉1小時(shí)，洗滌液洗滌四次 后，凍干，4'C保存。
(5) .試劑組的組成
① .緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH7.4，使用時(shí)用二次水按1:5稀釋；
② .底物A:為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；
③ .底物B:為含3,3'，5，5'-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯(TMB)的二甲基亞砜 溶液；
.洗滌液為含2.5%吐溫的磷酸鹽緩沖液；使用時(shí)用二次水按照1:5 稀釋；
(D.終止液為1.25mol/L硫酸；
⑥ .凍干液Tris溶于100mL雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.4，加入蔗 糖、乳糖、牛血清蛋白和抗壞血酸；
⑦ .新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液其新霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10mg/L,使用時(shí) 用磷酸鹽緩沖液(pH8.5)稀釋至100ng/L后，再按1:5稀釋六個(gè)梯度；
⑧ .酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過(guò)氧化物酶連接物 (新霉素B-HRP)，使用時(shí)用緩沖液按照1:10萬(wàn)倍稀釋。
⑨ .基質(zhì)掩蔽劑0.5 %BSA/PBS溶液(pH 9.0 9.5)。 一種應(yīng)用上述試劑盒定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量的檢測(cè)
方法該檢測(cè)方法的步驟為
a).用4x:低溫離心進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液；該樣品前處理 是將樣品攪碎成均質(zhì)，放于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆?，取樣品加入萃取液，該萃?液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9;然后低溫離心，取部分上清液用基質(zhì) 掩蔽劑稀釋。
(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將不同濃度的新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，并且雙孔平行加樣，然后再在不同濃度 新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中加入酶標(biāo)記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5min，室溫反應(yīng)1 2小時(shí)；
(3) .用洗滌液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，該底物A和底物B的混合液的配比為14.6:0.45， 室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí)；
(4) .向各微孔中加入終止液，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，根據(jù) 不同濃度新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制新霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，對(duì)照新 霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
下面通過(guò)一具體實(shí)例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的先進(jìn)性。 檢測(cè)雞肉樣品中新霉素B的含量
(1) .樣品前處理將雞肉經(jīng)勻槳機(jī)充分?jǐn)囁槌删|(zhì)，于-2(TC儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?分別取雞肉樣品各1 g，加入10mL萃取液(PBS， pH8.5)，漩渦震蕩l 2min，低溫離心，取部分上清液用基質(zhì)掩蔽劑5倍稀釋；
(2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將100 新霉素B梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn) 液和100pL樣品提取液雙孔平行加樣加入到包被板各自的微孔中，然后再 在新霉素b標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中各加入100 mL 1:10萬(wàn)倍稀釋 的酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液，室溫反應(yīng)1小時(shí)；
(3) .用洗漆液洗板3次；在每孔中加入150 底物A和底物B的混合 液，室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)；
(4) .向樣品提取液和新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液各自的微孔中加入50 nL終止液， 進(jìn)行終止反應(yīng)，在雙波長(zhǎng)方式(450 650nm)下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，繪 制新霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，對(duì)照新霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到樣品提取液中 新霉素B的含量。
(5) .結(jié)果的計(jì)算 ①.計(jì)算抑制率值
按公式(A)計(jì)算不同濃度新霉素B對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率-
IC%:
^樣品-^空白
v4對(duì)照-^空白
x100 .................................... (A)
式中-
IC%——新霉素B對(duì)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率；
A——450 nm吸光值與650 nm吸光值的差值；
A樣品——加入酶標(biāo)及新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液或樣液的平均吸光度值；
A空白——不加入酶標(biāo)及新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。
A對(duì)照——只加入酶標(biāo)不加入新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液的平均吸光度值。
② .繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
以抑制率為縱坐標(biāo)，新霉素濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制校正曲線。每次試驗(yàn) 均應(yīng)重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖l。
③ .結(jié)果計(jì)算
從圖1繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣液抑制率所對(duì)應(yīng)的新霉素B濃度(C)， 按公式(B)計(jì)算試樣中的新霉素B殘留量
X=CxR .................................... (B)
式中
X——試樣中新霉素B殘留量，單位為微克每千克(pg/kg);
C—根據(jù)樣品孔的抑制率査得試樣中新霉素B濃度，單位為微克每
升
R——換算系數(shù)，例如雞肉為50。 加標(biāo)試驗(yàn)
在加標(biāo)試驗(yàn)中，分別向樣品中添加不同濃度的新霉素B，將加標(biāo)樣品
充分混勻，室溫靜置過(guò)夜。其余處理過(guò)程同上。在對(duì)樣品雞肉的檢測(cè)中，
分別在25iig/kg、 100lig/kg和500 pg/kg水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收 率為75%和80%和85%。
權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒，由試劑組和包被板構(gòu)成，其特征在于其試劑組的組成為(1).緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH 7.3～7.5，使用時(shí)用二次水按1∶5稀釋；(2).底物A為含過(guò)氧化氫脲的醋酸鈉緩沖液；(3).底物B為含3，3′，5，5′-四甲基對(duì)二氨基聯(lián)苯的二甲基亞砜溶液；(4).洗滌液為含2.5％吐溫的磷酸鹽緩沖液，使用時(shí)用二次水按照1∶5稀釋；(5).終止液為1.25mol/L硫酸；(6).凍干液Tris溶于雙蒸水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.3～7.5，加入蔗糖、乳糖、牛血清蛋白及抗壞血酸；(7).新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液其新霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10mg/L，使用時(shí)用磷酸鹽緩沖液稀釋至100μg/L后，再按1∶5稀釋六個(gè)梯度；(8).酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液為新霉素B-辣根過(guò)氧化物酶的連接物新霉素B-HRP，使用時(shí)用緩沖液按照1∶10萬(wàn)倍稀釋；(9).基質(zhì)掩蔽劑0.5％BSA/PBS溶液，且其pH 9.0～9.5；其包被板的構(gòu)成為包被板為96孔或48孔微孔板并在微孔中包被新霉素B多克隆抗體，采用Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將多克隆新霉素B抗體稀釋為包被液，向包被板中每孔各加入包被液，室溫放置過(guò)夜或者35～40℃恒溫溫育2～3小時(shí)，洗滌液洗滌三次除去包被液，加入凍干液封閉0.8～1.2小時(shí)，洗滌液洗滌四次后，凍干，3～5℃保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑 盒，其特征在于所述的新霉素B多克隆抗體是選用雄性日本大耳白兔進(jìn) 行六次免疫，三次免疫后IO天由兔子的耳緣靜脈采集血液離心獲得抗血清 進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，末次免疫后采用股動(dòng)脈采血法對(duì)動(dòng)物采全血，經(jīng)離心處理 后收集全部血清，采取免疫親合層析法進(jìn)行抗體純化，所得抗體添加0.1%(W/V)的疊氮鈉后于4"C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 3. —種采用如根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素 B含量試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)方法的步驟是(1).用3 5 'C低溫離心進(jìn)行樣品前處理，得到樣品提取液； (2) .打開(kāi)試劑盒取出包被板，分別將各種濃度的新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品 提取液加入到包被板各自的微孔中，要雙孔平行加樣，然后再在各種濃度新 霉素B標(biāo)準(zhǔn)液和樣品提取液各自的微孔中分別加入酶標(biāo)記新霉素B抗原溶 液，震蕩混勻5 10min，室溫反應(yīng)1 2小時(shí)；(3) .用洗漆液洗包被板3 4次，將孔內(nèi)液體甩掉，用吸水紙扣干，加入 底物A和底物B的混合液，室溫下反應(yīng)0.4 0.6小時(shí)；(4) .向各微孔中加入終止液以終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，根據(jù) 不同濃度新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值繪制新霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，對(duì)照新 霉素B的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到樣品提取液中新霉素B的含量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液的制備方 法是(1) .將辣根過(guò)氧化物酶HRP用磷酸鹽緩沖液PBS溶解，再將此酶溶 液逐滴加入到新霉素B中，形成混合液；(2) .將1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺溶于雙蒸水中，逐滴加 入到新霉素B和酶的混合液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.8 1.2小時(shí)，然后放于3 5"C連續(xù)攪拌過(guò)夜，形成反應(yīng)液；(3) .將反應(yīng)液裝入透析袋，在緩沖液PBS中透析90 100小時(shí)；(4) .精確量取酶偶聯(lián)物溶液的體積并測(cè)定濃度，加入硫柳汞后3 5 °C 保存。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的底物A和底物B的混合液的配比為 14.6: 0.45。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的樣品前處理為將樣品攪碎成均質(zhì)，放 于-20'C儲(chǔ)存?zhèn)溆?，取樣品加入萃取液，低溫離心，取部分上清液用基質(zhì) 掩蔽劑稀釋。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑 盒的檢測(cè)方法，其特征在于所述的萃取液為磷酸緩沖液PBS，其pH8 9。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域的一種定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒由包被板和試劑組構(gòu)成，其中該試劑組的組成為緩沖液、底物A、底物B、洗滌液、終止液、凍干液、新霉素B標(biāo)準(zhǔn)液、酶標(biāo)記新霉素B抗原溶液、基質(zhì)掩蔽劑。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，而且適用范圍較廣，既有經(jīng)濟(jì)效益又有社會(huì)效益，是一種創(chuàng)新性較高且具有良好的應(yīng)用前景的定量檢測(cè)動(dòng)物源性食品中新霉素B含量試劑盒及其檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101169412SQ20071015058
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者燕 張, 蓓 徐, 碩 王, 王忠斌 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)