專利名稱：H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種鑒定病毒，特別是鑒定禽流感H9亞型病毒的檢測方法。
背景技術：
禽流感(Avian influenza, AI)是由A型流感病毒引起的家禽及野生禽 類感染或疾病的綜合征，其病原禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬 正粘病毒科，A型流感病毒屬。根據AIV表面糖蛋白血凝素(HA)和神經 氨酸酶(NA)的抗原關系可分為不同的亞型，依據AIV對禽類致病性的不 同，又可將AIV分為高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Mildly pathogenic avian influenza virus, MP AIV)。
H9亞型AIV屬于MPAIV，最早報道于1966年。20世紀90年代初，該 亞型病毒在野鳥和家禽中的分離率還相對較低，沒有造成大面積的流行。但 自20世紀90年代后期以來，家禽(特別是雞)的H9亞型AIV感染在亞洲 和世界其它地區(qū)頻繁報道。該病不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經濟損失，也給 人類公共衛(wèi)生構成潛在的威脅，急需加強H9亞型禽流感防治新技術研究工 作。
在H9亞型禽流感疫情防控工作中，現(xiàn)場診斷主要依靠發(fā)病史、臨床癥 狀、病理變化和流行病學調査綜合判定，這給廣大獸醫(yī)工作人員帶來了超負 荷的工作，耗時費力費錢?，F(xiàn)場診斷工作中急需快速準確的篩檢診斷方法， 以利于現(xiàn)場疫情的確認。因此，禽流感疫情現(xiàn)場快速確認，對于釆取果斷有 效的撲滅和防控措施十分關鍵。在實驗室確診工作中，世界動物衛(wèi)生組織 (OIE)規(guī)定的經典方法是病毒的分離、鑒定和血清學分型試驗，這種方法 報告結果時間長，工作量大。而目前普遍采用的聚合酶鏈反應(PCR)技術 需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程繁瑣的缺點。而熒光實
時定量聚合酶鏈反應(real time PCR)技術雖然較好地解決了交叉污染的問 題，并簡化了操作過程，但需要更復雜的定量測定儀器，因此不適于現(xiàn)場快 速檢測，同時由于檢測成本較高，也加大了推廣應用的難度。環(huán)介導等溫擴 增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)技術具有特異性強、靈 敏度高、快速且成本低等優(yōu)點，其特點是對靶基因的6個部位設定4種引物， 利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。另外，由于實行的是等溫擴增， 反應在恒溫水浴箱內便可完成，不僅節(jié)約儀器成本，而且是操作方法更簡單， 適于現(xiàn)場快速檢測。但目前還未見有應用LAMP檢測H9亞型禽流感病毒的 方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于為人們提供一種能快速鑒定出樣本是否為H9亞型禽流 感病毒的快速檢測方法。
本發(fā)明采用Trizol kit提取樣本基因RNA，然后進行RT-LAMP擴增病毒 基質蛋白基因的特定區(qū)域，最后加入顯色液鑒定，如果顏色變?yōu)榫G色，則待 檢樣品為H9N2亞型禽流感病毒，如果顏色為黃色，則待檢樣品不是H9N2 亞型禽流感病毒。
其中，
采 用 上 游 內 引 物 (FIP ) 為 GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC ;
下游 內 引 物 ( BIP ) 為
TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA; 上游外引物(F3)為ACATTCCATGGAGCAAAGGA; 下游外引物(B3)為TGCCTGATTAGTGGGTTGGT。
在現(xiàn)有的關于LAMP技術的公開文獻中，沒有將LAMP用于H9亞型禽 流感病毒檢測的報道。本發(fā)明通過使用特異性引物，利用LAMP技術擴增耙 基因的特定區(qū)域，從分子水平對H9亞型禽流感病毒進行快速檢測。本發(fā)明
較經典方法的病毒分離、鑒定和血清學分型試驗方法以及目前普遍采用的 PCR方法快速、準確。
具體實施例方式
一、 引物的設計
根據GenBank庫中已發(fā)表的H9亞型禽流感病毒基質蛋白(MP)基因序 列設計特異性引物，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。
上 游 內 引 物( FIP ) 為
GGTCACCGTTCCCATTCGGTTGCAGTTACTCAACTGGTGCGC
下游 內 引 物 ( BIP ) 為
TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTCGCCATCTGTCTGTGAGA 上游外引物(F3)為ACATTCCATGGAGCAAAGGA 下游外引物(B3)為TGCCTGATTAGTGGGTTGGT
二、 RT-LAMP:
1) 病毒的擴增將禽流感病毒接種于10日齡SPF雞胚的尿囊腔中，36-72 小時后收集死亡雞胚的尿囊液，并檢測其血凝價；為了能夠定量該體系的靈 敏度，還測定該尿囊液的SPF雞胚半數致死量(ELD5。=1(T85)。
2) 病毒RNA的提取按照Trizol kit說明書提取禽流感病毒的RNA(注 在RNA沉淀時要加入糖元8-10ug，它能夠和RNA共沉淀，用DEPC處理 的水進行溶解)。
具體步驟如下
① 在200 u L被檢測液中加入lmLTrizol液后，劇烈搖勻，室溫放置5-10 分鐘；
② 加入200"L氯仿，劇烈搖勻，室溫放置3-5分鐘；
③ 12， OOOxg離心15分鐘；
吸取上清，加入糖元8-10 u g混勻2分鐘后加入異丙醇500li L，混 勻，室溫放置10分鐘；
12， 000xg離心10分鐘，去上清，可見沉淀，用75%乙醇洗滌，緩
慢混勻后靜置2分鐘；
◎ 7， 500xg離心5分鐘，完全去除乙醇，在超凈臺內用風吹5分鐘后 加入8pL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解。 3) RT-LAMP:
(禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶Catalog存M5101 from promega; Bst DNA 聚合酶(大片段)Catalog#M0275S from New England)
腦A2.0|iL
AMV反轉錄酶(8U/|iL)l.O(iL
核酸酶抑制劑(40U/iiL)0,25|iL
BstDNA聚合酶(8U/pL)l攀
Bst DNA聚合酶緩沖液2早
甜菜堿(5mol/L)5.0fiL
硫酸鎂(100mmol/L)1.5|aL
dNTP (lOmmol/L)l早
上游內引物(FIP) (20|amol/L)2.0)iL
下游內引物(BIP) (20|imol/L)2.0|_iL
上游外引物(F3) (10拜ol/L)0.5pL
下游外引物(B3) (10—/L)0.5
DEPC處理水5.25(iL
總體積25|iL
然后65'C水浴90分鐘，同時以DEPC處理水為陰性對照。
三、RT-LAMP擴增產物的鑒定
在反應管中加入14 10% SYBR Greenl顯色液(lOOOOx)(熒光染料 SYBR Green I Catalog# S7563 from Invitrogen)(用電泳緩沖液將10000x的熒 光染料SYBR Green I稀釋IOOO倍，即為10% SYBR Green I顯色液)，混勻， 直接肉眼觀察顏色變化，如果顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品為H9N2亞型禽 流感病毒，如果顏色為黃色，說明待檢樣品不是H9N2亞型禽流感病毒。 <110〉揚州大學
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<160>4
<210>1
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據119亞型禽流感病毒基質蛋白(MP)基因序列設計 <400>1
ggtcaccgtt cccattcggt tgcagttact c犯ctggtgc gc
<210>2 <211>41 <212>DNA <213>人工序列
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<223>根據119亞型禽流感病毒基質蛋白(MP)基因序列設計 <400>2
tggctcttgg cctagtatgt gctcgccatc tgtctgtgag a
<210>3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
〈223〉根據H9亞型禽流感病毒基質蛋白(MP)基因序列設計 <400>3
acattccatg gagc3肌gga
<210>4 <211>20 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<223>根據119亞型禽流感病毒基質蛋白(MP)基因序列設計 <400>4
tgcctgatta gtgggttggt
權利要求
1、H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法，其特征在于用Trizol kit提取樣本基因RNA，然后進行RT-LAMP擴增病毒基質蛋白基因的特定區(qū)域，最后加入顯色液鑒定，如果顏色變?yōu)榫G色，則待檢樣品為H9N2亞型禽流感病毒，如果顏色為黃色，則待檢樣品不是H9N2亞型禽流感病毒。
2、 根據權利要求1所述H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法，其特征在 于所述的特異性引物上 游 內 引 物 FIP 為 下 游 內 引 物 BIP 為 TGGCTCTTGGCCTAGTATGTGCTTTTTCGCCATCTGTCTGTGAGA 上游外弓I物F3為ACATTCCATGGAGCAAAGGA 下游外弓I物B3為TGCCTGATTAGTGGGTTGGT 。
全文摘要
H9亞型禽流感病毒的快速檢測方法，公開了一種鑒定病毒，特別是鑒定禽流感H9亞型病毒的檢測方法。采用Trizol kit提取樣本基因RNA，然后進行RT-LAMP擴增病毒基質蛋白基因的特定區(qū)域，最后加入顯色液鑒定，如果顏色變?yōu)榫G色，則待檢樣品為H9N2亞型禽流感病毒，如果顏色為黃色，則待檢樣品不是H9N2亞型禽流感病毒。本發(fā)明較經典方法的病毒分離、鑒定和血清學分型試驗方法以及目前普遍采用的PCR方法快速、準確。
文檔編號G01N21/77GK101196476SQ200710302589
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月27日 優(yōu)先權日2007年12月27日
發(fā)明者林 孫, 磊 張, 潘志明, 焦新安, 耿士忠, 祥 陳 申請人:揚州大學