基于巢式rt-pcr檢測h4亞型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測領域，涉及一種基于巢式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 禽流感（AvianInfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感病毒 (AIV)引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，主要引起禽類的全身或呼吸系統(tǒng)疾病[塞 弗.禽病學[M].北京：中國農業(yè)出版社，2005. ]。AIV亞型眾多，根據(jù)表面糖蛋白血凝素 (Hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶（Neuraminidase,NA)的抗原性差異，已鑒別出16種HA 亞型（H1-H16)和9種NA(N1-N9)亞型YMSaif.禽病學（第十二版）[M].北京：中國農 業(yè)出版社，2012 :176-178.];根據(jù)AIV致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒（Highly PathogenicAvianInfluenzaVirus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒（LowlyPathogenic AvianInfluenzaVirus,LPAIV)[塞弗·禽病學[Μ]·北京：中國農業(yè)出版社，2005·]JPAIV 引起家禽的AI以全身感染、高發(fā)病率和高死亡率為特征。LPAIV引起家禽AI的臨床癥狀表 現(xiàn)溫和，死亡率不高，但影響家禽的生長發(fā)育和生產性能。
[0003]H4亞型AIV屬于LPAIV，能隱性感染各種家禽及野生鳥類[唐秀英，田國斌，趙 傳珊，等.中國禽流感流行株的分離鑒定[J].中國畜禽傳染病，1998,20(1) :1-5.]，宿 主范圍比較廣，包括雞、火雞、鴨、野鴨、野鳥、鴕鳥、鸚鵡等，還可以跨種傳播，感染哺乳動 物[CallanRJ,EarlyG,KidaH,etal.TheappearanceofH3influenzavirusesin seals[J].JGenVirol, 1995, 76:199-203·]。薛峰等[薛峰，陳浩，彭宜，等·鹽城國家級 珍禽自然保護區(qū)野鴨、天鵝、丹頂鶴禽流感監(jiān)測分析[J].中國人獸共患病，2006,22(6): 565-567.]報道，在江蘇鹽城國家級自然保護區(qū)對野鴨、丹頂鶴等野禽AIV檢測中，H4亞型 AIV分離率最高（38. 5% )。雖然絕大多數(shù)LPAIV致病力低，但LPAIV可能為感染人類的AIV 提供基因[薛峰，顧敏，彭宜，等.H4亞型家養(yǎng)水禽流感病毒分離株的表面膜蛋白基因的序 列測定和遺傳進化分析[J].畜牧獸醫(yī)學報，2006, 37 (12)，1334-1339.]，潛在危害性不容 忽視。因此，我們應加強對H4亞型AIV的監(jiān)測。
[0004] 目前，國內建立的快速檢測方法多數(shù)都是針對其他亞型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、 H9亞型，而針對H4亞型AIV的快速檢測方法的未見報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于巢式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的引物 組。
[0006] 本發(fā)明所提供基于巢式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的引物組，具體由一個外 引物對和一個內引物對組成；所述外引物對具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條 單鏈DNA組成的引物對；所述內引物對具體為由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈 DNA組成的引物對。
[0007] 其中，序列1由25個核苷酸組成；序列2由25個核苷酸組成；序列3由23個核苷 酸組成；序列4由25個核苷酸組成。
[0008] 在所述引物對組中，所述外引物和所述內引物中每條引物既可以分別單獨包裝， 也可以將所述外引物中的兩條引物等摩爾混合包裝于包裝1中，將所述內引物中的兩條引 物等摩爾混合包裝于包裝2中。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種基于巢式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試 劑。
[0010] 本發(fā)明所提供的基于巢式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑，包括所述的引 物組和PCR擴增緩沖液。
[0011] 所述PCR擴增緩沖液中具體含有dNTPs、Mg2+和DNA聚合酶。所述PCR擴增緩沖液 為2XTapPCRMix(內含dNTPs、Mg2+和TapDNA聚合酶，大連寶生物工程有限公司，產品目 錄號：RR901A)。當然，使用其他公司的類似產品也可以。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定H4亞型禽流感病毒的試劑 盒。
[0013] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定H4亞型禽流感病毒的試劑盒，可含有下述 a)和b):
[0014]a)作為陽性對照的H4亞型禽流感病毒cDNA;和/或作為陰性對照的水；
[0015]b)所述引物對組，或所述試劑。
[0016] 所述試劑盒中還含有說明書；所述說明書中記載有檢測或輔助檢測待測樣品中是 否含有H4亞型禽流感病毒的方法；
[0017] 所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有H4亞型禽流感病毒的方法具體可包括 如下步驟：
[0018] (1)從所述待測樣品中提取總RNA，反轉錄得到待測cDNA;
[0019] (2)以所述待測cDNA作為模板，用所述外引物對進行第一輪PCR反應，獲得PCR產 物1 ;
[0020] (3)以所述PCR產物1作為模板，用所述內引物對進行第二輪PCR反應，獲得PCR 產物2;
[0021] (4)根據(jù)所述PCR產物2的大小按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有H4亞 型禽流感病毒：若所述PCR產物2中含有大小為199bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有 或候選含有H4亞型禽流感病毒，反之則所述待測樣品中不含有或候選不含有H4亞型禽流 感病毒。
[0022] 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有H4亞型禽流感病毒的非疾病診斷治療方法 也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023] 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有H4亞型禽流感病毒的非疾病診斷治療方 法，具體可包括如上所述的步驟（1)-(4)。
[0024] 進一步，所述大小為199bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5的第 54-252位所示。
[0025] 在本發(fā)明中，所述進行第一輪PCR反應的退火溫度具體為55°C;所述進行第二輪 PCR反應的退火溫度具體為56°C。
[0026] 進一步，所述進行第一輪PCR反應的程序具體可為：95°C5min;95°C50s、 55°C40s、72°Clmin，21個循環(huán)；72°C延伸10min，12°C結束。所述進行第二輪PCR反應的程 序具體可為：95°C5min;95°C50s、56°C40s、72°Clmin，21 個循環(huán)；72°C延伸lOmin，12°C結 束。
[0027] 在本發(fā)明中，所述進行第一輪PCR反應和所述進行第二輪PCR反應時，所述引物對 組中的每條引物在反應體系中的終濃度均可為0. 2pmol/μL。
[0028] 進一步，所述進行第一輪PCR反應時的反應體系為：2XTapPCRMix12.5μL， 2μLcDNA，上下游引物各0. 2μL(每條引物在PCR反應體系中的終濃度均為0. 2pmol/ μL)，加水補足至25μL。所述進行第二輪PCR反應時的反應體系為：2XTapPCRMix 12. 5μL，2μL第一輪PCR產物的100倍稀釋液，上下游引物各0. 2μL(每條引物在PCR反 應體系中的終濃度均為〇.2pmol/yL)，加水補足至25yL。其中，2XTapPCRMix(內含 dNTPs、Mg2+和TapDNA聚合酶）為大連寶生物工程有限公司產品，產品目錄號：RR901A。
[0029] 本發(fā)明的第四個目的是提供所述引物對組的制備方法。
[0030] 本發(fā)明所提供的所述制備方法，包括將所述引物對組中各引物對的所述兩條單鏈 DNA分別單獨包裝的步驟。
[0031] 本發(fā)明的第五個目的是提供如下c)或d)的應用：
[0032] c)所述引物對組在制備所述試劑，或所述試劑盒中的應用；
[0033] d)所述引物對組、或所述試劑，或所述試劑盒，在制備檢測或輔助檢測待測樣品中 是否含有H4亞型禽流感病毒的產品中的應用。
[0034] 在d)所述應用中，所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有H4亞型禽流感病毒 時，按照如上所述說明書中記載的步驟（1)-(4)進行。
[0035] 在本發(fā)明中，以上所有的所述H4亞型禽流感病毒均可為H4N2亞型禽流感病毒 或H4N5亞型禽流感病毒。在本發(fā)明的一個實施例中，所述H4亞型禽流感病毒具體為H4N2 亞型禽流感病毒A/duck/Guangxi/12roi7/2012(H4N2)株、H4N5亞型禽流感病毒A/Duck/ HK/668/79 (H4N5)株或H4亞型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/027D/09 (H4)株。
[0036] 在本發(fā)明中，以上所有的所述待測樣品均可為健康的動物或死亡的動物，具體為 采自于活禽的咽喉拭子或泄殖腔拭子。
[0037] 本發(fā)明針對H4亞型禽流感病毒HA基因保守序列，設計并篩選出2對特異性引物， 通過優(yōu)化反應條件,建立了H4亞型禽流感病毒巢式RT-PCR檢測方法。特異性試驗結果顯 示該法可特異性擴增出H4亞型禽流感病毒，不擴增其他常見禽病病原體；敏感性試驗結果 顯示該法對H4亞型禽流感病毒檢測下限為360fg/μL;最后用該法對106份臨床樣品進行 檢測，臨床樣品檢測結果與病毒分離結果一致。本發(fā)明建立的巢式RT-PCR方法為Η4亞型 禽流感病毒的早期診斷及有效防制提供了快速、特異和敏感的檢測方法。
【附圖說明】
[0038]圖1為巢式RT-PCR優(yōu)化結果。M :100bp DNA Ladder ;1 :第1輪PCR產物；2 :第1 輪PCR陰性對照；3 :第2輪PCR產物；4 :第2輪PCR陰性對照。
[0039] 圖2為巢式RT-PCR的特異性試驗結果。M:100bpDNALadder;1~5:5株不同 的H4亞型禽流感病毒；6~11 :分別為H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型禽流感病毒；12:NDV;13 : IBV;14:ILTV;15:MG;16:ARV;17 :陰性對照。
[0040]圖 3 為常規(guī)RT-PCR的敏感性試驗結果。M:100bpDNALadder:1 :3. 6ng/μLRNA; 2 ：360pg/μLRNA；3 ：36pg/μLRNA；4 ：3. 6pg/μLRNA；5 ：360fg/μLRNA；6 ：36fg/μL RNA;7 :3. 6fg/yL;8 :陰性對