本發(fā)明涉及一種H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。

(二)發(fā)明背景

禽流感是由正黏病毒科中流感病毒屬的禽流感病毒所引起的危害禽類(lèi)養(yǎng)殖的一種重要傳染病。根據(jù)禽流感病毒的致病性強(qiáng)弱，可將禽流感病毒分為高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和無(wú)致病性禽流感病毒3種。根據(jù)表面抗原的鑒定結(jié)果，從禽類(lèi)分離到的流感病毒有17種不同的血凝素(HA)和10種不同的神經(jīng)氨酸酶(NA)，可組合產(chǎn)生眾多亞型。迄今為止已從禽類(lèi)體內(nèi)分離到上千種毒力各異的病毒株，不同亞型病毒株對(duì)宿主的致病力差異顯著。H6亞型AIV為低致病力病毒株，分布范圍廣，該亞型病毒可與其他病原微生物協(xié)同作用導(dǎo)致禽類(lèi)發(fā)病，目前，在我國(guó)及其他一些國(guó)家和地區(qū)的野鳥(niǎo)和家禽中已經(jīng)廣泛存在，近幾年來(lái)其流行和傳播呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。H6禽流感病毒感染后會(huì)出現(xiàn)輕微的呼吸道和消化道癥狀，死亡率較低；但是其以通過(guò)基因重排為能感染人的高致病性禽流感病毒提供基因，從而產(chǎn)生無(wú)法預(yù)測(cè)致病性和傳染性的新變異株，這將對(duì)禽類(lèi)和人類(lèi)健康存在很大的潛在威脅。近年來(lái)，也出現(xiàn)了H6禽流感病毒直接感染人的例子，它也成為人畜共患病的一個(gè)重要病原。

H6亞型禽流感傳播范圍廣，危害大，一個(gè)操作簡(jiǎn)單結(jié)果精確的快速檢測(cè)方法的建立就顯得尤為重要。雖然根據(jù)臨床癥狀以及病例變化能夠初步診斷，但是還是需要傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行確診。而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法又存在耗時(shí)較長(zhǎng)、敏感性低、不利于快速檢測(cè)等缺點(diǎn)?；诜肿由飳W(xué)技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，可快速、靈敏的實(shí)現(xiàn)病原核酸的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)疫病的及時(shí)診斷和防控。目前，分子檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在流感的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的H6亞型禽流感熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法迅速準(zhǔn)確，能極大縮短檢測(cè)周期，為疫病的發(fā)現(xiàn)和防控提供寶貴時(shí)間和技術(shù)保障，并能盡量避免檢測(cè)過(guò)程中可能造成的生物污染。

一種H6亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，其步驟如下：

1、引物設(shè)計(jì)

參照GenBank中公開(kāi)發(fā)表的H6亞型禽流感病毒HA基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了特異性引物序列：

2、病毒RNA提取

①取H6亞型禽流感病毒懸液200μL，加入600μL Trizol液，混勻；

②室溫放置5min，加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管，混勻器上震蕩離心管5秒，于4℃下12000g離心15min；

③取上層水相于一新的離心管，加入0.5ml異丙醇(-20℃預(yù)冷)，不吸出中間層，顛倒混勻；

④于4℃下12000g離心15min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，再加入600μL75％乙醇，顛倒洗滌；

⑤于4℃下12000g離心10min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上；

⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度；

⑦然后將RNA溶于無(wú)RNA酶水中5000g離心5s。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存須放置-70℃冰箱。

3、RT-PCR擴(kuò)增

①反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混勻后65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，緩慢混勻。30℃下反應(yīng)10min。然后95℃5min使酶失活。

②PCR擴(kuò)增：PCR總體系為25μl，其中10×Buffer 2.5μl，dNTPs 2μl，上、下游引物(H6F-1和H6R-1)各1μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用滅菌ddH₂O補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取6μl PCR產(chǎn)物于1％瓊脂凝膠中電泳。

4、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備

①確定陽(yáng)性質(zhì)粒：PCR產(chǎn)物在1％瓊脂凝膠中電泳后，使用膠回收試劑盒提取DNA，然后將目的片段與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于氨芐青霉素酶培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定挑取的陽(yáng)性質(zhì)粒，并進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)定的序列與Genebank上的標(biāo)準(zhǔn)毒株序列對(duì)比分析，確定陽(yáng)性質(zhì)粒。

②陽(yáng)性質(zhì)粒濃度的測(cè)定：將質(zhì)粒提取物使用超純水10×稀釋?zhuān)?60nm與280nm波長(zhǎng)下測(cè)定質(zhì)粒的含量，根據(jù)公式計(jì)算每微升液體中質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。

注：每個(gè)堿基的平均分子量為330

5、熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

將上述陽(yáng)性質(zhì)粒DNA做熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋(10⁷～10²copies/μL)用于熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制，擴(kuò)增反應(yīng)體系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上、下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超純水7.8μl。反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。所述的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品為含有位于HA基因上H6F-2和H6R-2之間的基因片段(1319～1468之間)、大小約為149bp的基因片段的質(zhì)粒。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

⑴靈敏度高：通過(guò)倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)得出檢測(cè)的最低濃度為35.84copies/reaction。

⑵特異性強(qiáng)：除H6亞型的毒株均能檢測(cè)到陽(yáng)性的熒光信號(hào)外，而其他亞型流感病毒H1、H3、H5、H7等均為陰性，新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、傳染性支氣管炎病毒等均為陰性。

⑶重復(fù)性好：選擇不同濃度的5個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在同一反應(yīng)條件下重復(fù)3次作為同一批次內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，然后在另一時(shí)間再重復(fù)一次作為不同批次間重復(fù)試驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算得出，批次內(nèi)變異系數(shù)的mean±S.D.為0.82±0.51％，批次間變異系數(shù)的mean±S.D.為1.15±0.26％。

附圖說(shuō)明：

圖1是H6亞型禽流感病毒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)

圖2是H6亞型禽流感病毒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖1、2說(shuō)明：本發(fā)明所建立的H6亞型禽流感病毒熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)靈敏度較高符合相關(guān)要求。

具體實(shí)施方式：

參照GenBank中公開(kāi)發(fā)表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列，設(shè)計(jì)了特異性引物序列：

實(shí)施例1：以已知H6亞型禽流感病毒為檢測(cè)材料，并以超純水為陰性對(duì)照。

1、H6亞型禽流感病毒RNA提取

①取H6亞型禽流感病毒懸液200μL，加入600μL Trizol液，混勻；

②室溫放置5min，加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管，混勻器上震蕩離心管5秒，于4℃下12000g離心15min；

③取上層水相于一新的離心管，加入0.5ml異丙醇(-20℃預(yù)冷)，不能吸出中間層，顛倒混勻；

④于4℃下12000g離心15min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，再加入600μL75％乙醇，顛倒洗滌，；

⑤于4℃下12000g離心10min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上；

⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度；

⑦然后將RNA溶于無(wú)RNA酶水中5000g離心5s。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存須放置-70℃冰箱。

2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反應(yīng)體系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混勻后65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，緩慢混勻。30℃下反應(yīng)10min。然后95℃5min使酶失活。

3、熒光定量PCR檢測(cè)

將上述陽(yáng)性質(zhì)粒DNA做熒光定量標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋(10⁷～10²copies/μL)用于熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制，擴(kuò)增反應(yīng)體系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超純水7.8μl。反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析被檢材料中的病毒核酸量(copies)。

結(jié)果說(shuō)明本方法能有效地檢測(cè)H6亞型禽流感病毒核酸量。

實(shí)施例2：待檢病料(病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子)中H6亞型禽流感病毒的熒光定量PCR檢測(cè)。

1、樣品制備：

病禽咽喉拭子和泄殖腔拭子在混合器上進(jìn)行充分混合，用滅菌鑷子將棉拭子中的液體擠出，室溫放置30min，取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mL Eppendorf管中，編號(hào)備用。

2、病毒RNA提取

①取樣品病毒懸液200μL，加入600μL Trizol液，混勻；

②室溫放置5min，加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管，混勻器上震蕩離心管5秒，于4℃下12000g離心15min；

③取上層水相于一新的離心管，加入0.5ml異丙醇(-20℃預(yù)冷)，不能吸出中間層，顛倒混勻；

④于4℃下12000g離心15min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，再加入600μL75％乙醇，顛倒洗滌，；

⑤于4℃下12000g離心10min，小心棄去上清液，倒置于吸水紙上；

⑥小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10min，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度；

⑦然后將RNA溶于無(wú)RNA酶水中5000g離心5s。提取的RNA須在2h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若需長(zhǎng)期保存須放置-70℃冰箱。

3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

反應(yīng)體系包括：Random 6mers 2μl，dNTP Mixture 1μl，Template RNA 3μl，Rnase free dH₂O 5μl，混勻后65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻；向其中加入5×PrimeScript Buffer 4μl，Rnase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript RTase 1μl，加Rnase free dH₂O定容至20μl，緩慢混勻。30℃下反應(yīng)10min。然后95℃5min使酶失活。

4、熒光定量PCR檢測(cè)

取上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，同時(shí)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，反應(yīng)體系20μl，其中Passive Reference Dye 0.4μl，上下游引物(H6F-2和H6R-2)各0.4μl，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix10μl，模板1μl，超純水7.8μl。反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃5s，60℃15s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析被檢材料中的病毒核酸量(copies)。

結(jié)果說(shuō)明本方法能敏感地檢測(cè)病料中H6亞型禽流感病毒核酸量。