專利名稱：測定多重分析物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用分析物特異的結合配偶體測定多重分析物的方法，其中該結合配偶體地使用不同結合配偶體時更少不同標記物標記。此外，本發(fā)明涉及包含不同標記的結合配偶體的物質組合物和該組合物用于測定多重分析物的用途以及適合的試劑盒。
背景技術：
測定樣品中的一種分析物，特別是在衛(wèi)生保健、營養(yǎng)學和生態(tài)學領域已經變得尤為重要。根據分析物可使用不同的測定方法。如金屬離子、糖類單體、氨基酸的小分子經常利用其化學或物理特性進行測定。如蛋白質和核酸多聚體的具有高分子量的分析物也可以利用與其具有特異親和性的結合配偶體進行測定。有用的結合配偶體對是抗體-抗原、底物-酶、核酸-互補核酸、糖類-凝集素。在想要測定一種已知呈現(xiàn)抗原特性的特定蛋白質的情況下，可以使用特異的抗體進行測定。對于特定核酸序列的測定，可以使用具有互補序列的核酸探針。這些結合鑒定和適合的方案在本領域是公知的，并在文獻中有充分的說明，例如參見Sambrook等，1985，分子克隆-實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；核酸雜交(B.D.Hames and S.J.Higgins，eds.1984)和酶學的系列方法(Academic Press，Inc.)。
為了容許測定特異的結合配偶體-分析物復合物，標記結合配偶體是很普遍的，其中可以利用與標記物結合的附加試劑(例如使用能通過抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶共軛物和適合的酶-底物反應進行測定的生物素作為標記物)直接或間接的測定這些標記物。適合的標記物是本領域公知的。
在許多情況下，特別在診斷領域，測定兩種或多種分析物以獲得特殊情形的完整了解是很必要的。例如對于一名可能的沙眼衣原體感染患者，通常醫(yī)生不僅要檢查沙眼衣原體而且要檢查淋病奈瑟球菌感染。當建立患者的人白細胞抗原HLA模型時，也需要測定幾個不同的HLA基因座的等位基因。
當進行多重分析物的結合鑒定時，必須注意使用的標記物。在最初的情況下，對所有的不同結合配偶體使用相同的標記物。此時這樣兩種可供選擇的形式必須區(qū)別開來。如果所有的結合反應都在一個反應中一起進行，則陽性結果只能顯示樣品中至少存在一種分析物，但是不能顯示是哪一種。作為選擇，通過進行順序反應或采用平行反應的形式就能區(qū)分每個結合反應。適合的形式有例如微量滴定板鑒定或點雜交鑒定。利用這種形式的方法是本領域公知的。這種形式耗費時間并需要大量處理步驟，還會導致成本增加和污染風險。使用生物芯片的方法更先進但很昂貴，并且特別是在核酸擴增領域涉及到污染就很難處理。
為了容許只在一個結合和/或檢測反應中分別測定幾種分析物，可以將不同的特異結合配偶體用不同的并且是分別檢測的標記物標記。這些標記物和進行檢測的方法是本領域公知的。例如使用通過光學發(fā)射光譜檢測的標記物，借此每個標記物都具有不同發(fā)射光譜。但是必須注意到這種檢測事實上只限于很少種類的分析物的測定，因為不存在無限多具有高靈敏性和足夠穩(wěn)定性的分別測定的適合標記物。使用適宜的稀土金屬標記物時，用于時間-分辨熒光測定法的昂貴和高度先進的檢測器是必需的。涉及到均相檢測方法時這些限制尤為重要。這些形式通常由于缺少洗滌步驟沒有去除未特異附著于分析物的結合配偶體，造成較高的信號背景而受到損害，這也使得很難正確地解讀多重檢測信號。
將多重標記與具有多個光通道的檢測器結合已被許多研究者采用。例如，Vet等人(PNAS96，6394-6399(1999))使用的方法中，用4種不同的報告染料標記互補于4種不同靶物的4種特異探針(分子信標)，一種染料標記一種探針。每種染料的完整熒光光譜儲存到計算機中以用來解讀復雜的多重結果。這就需要非常先進的軟件以滿足借助光學供量分析分辨共感染的需求。包括針對每種特定染料(光通道)基于最大增益對分別來自不同染料的熒光信號進行歸一化，即不是參照染料跨躍不同的光通道，而是相關于相應平臺的通道特異性增長曲線的歸一化，以使得能夠基于共同的基礎分析信號分布。其它例子包括Josephsson等人(J.Clin.Microbiol.37/3，490-496(1999)；每個檢測中多至3種不同標記的分子信標對應于多至3種靶物)和Mercier等人(J.Virol.Methods 77，1-9(1999)；每個檢測中2種不同標記的探針對應于2種靶物)。
為了在標記物數量一定時增加被測分析物的種數，也使用標記結合配偶體的組合標記物。除了已附著一種特定標記物的結合配偶體外，也使用與兩種或多種標記物偶聯(lián)的結合配偶體，且所使用的標記物與也與單標記結合配偶體偶聯(lián)的標記物是相同類型的。例如使用3種不同標記物的7種組合標記物就可以檢測7種不同的分析物。原位雜交方法中就使用了類似原理，參見T.Ried等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，卷89，第1388-1392頁(1992)。在Samiotaki等，AnalyticalBiochemistry卷253，第156-161頁(1997)中描述了利用PCR和隨后的探針雜交檢測確定一個樣品中7種不同的人乳頭狀瘤病毒類型的相似方法。為此，寡核苷酸的5’末端用多個螯合物部分修飾。各個螯合物單元隨后用同一種類型的稀土金屬離子或最多3種稀土金屬離子的精配混合物填補。這樣，在通過絡合作用多于一種的離子被固定的情況下，多重熒光稀土金屬螯合物(“染料混合物”)就偶聯(lián)于同一種探針分子。這種探針不易合成，并在均相擴增/檢測形式中應用效果很差(既使有的話)。
還有很多其他組合標記的技術途徑。Ballard等(US5,759,781)，Speicher等(Nat.Genetics12，368-375(1996))和Ried等(PNAS89，1388-1392(1992))已開發(fā)了這樣的檢測形式，其中每個特異探針由其標記特征而表征，因為給定探針的所有拷貝以組合的形式帶上一個或多個獨特的熒光團。標記通過切口平移的方式進行，從引入每個探針分子上的標記物數目而言，它不如寡核苷酸的化學合成法準確，即該方法不能精確的分析離散分布。因此專家不會在核酸擴增方法，尤其在均相擴增方法中使用這樣的探針。
Tong等人(Nat.Biotechnology19，756-759(2001))描述的所謂CFET探針具有完全不同的設計和使用模式。1至3種染料偶聯(lián)到每個探針分子的5’末端，其間散插有準確調節(jié)數目的間隔物單元。寡核苷酸部分跟隨在朝向3’末端的最后一個染料或間隔物之后。這就如Ballard等人描述的不同探針類型的混合物。間隔物的功能是作為電泳遷移率和共振強度的調節(jié)體。后者影響特定探針的熒光特征。探針在共同的波長被激發(fā)，通過毛細電泳圖的位置并且通過在該特定位置覆蓋整個發(fā)射光譜并直接以數字比率的形式計算來自標記物組各個成分的相對貢獻，由此分辨記錄的信號。同樣，該方法沒有經過校正和歸一化的信號自身的信號分布分析，沒有沿反應坐標動態(tài)分析，沒有“相同序列/不同標記物”的寡核苷酸設計，也沒有由改變探針構型或構造的生化反應帶來的信號形成。
以每個結合配偶體分子攜帶多于一種標記物的方式來標記結合配偶體是有一些缺陷的。這些多重標記的結合配偶體在合成上相當苛求(昂貴的)并可能對標記物產生空間位阻，導致結合配偶體與其分析物的結合效率或附著的標記物的檢測效率降低。結合配偶體附著的標記物之間也可能發(fā)生相互作用而導致錯誤的結果。例如當使用光學標記物時就很相關。當利用熒光能量轉移標記物進行均相檢測方法，如TaqMan檢測(US5210015，EP0543942)中所用的標記物，這當然是至關重要的。
因此本發(fā)明的目的是改進測定多重分析物的方法，避免現(xiàn)有方法全部或部分的缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明的主要方面涉及使用少于被測分析物的標記物測定多重分析物的方法。針對一些靶物用特定的染料標記整套特異探針分子，同時對于其他一些靶物用給定的染料標記該套特異探針分子的一部分，而該套特異探針分子的其余部分用不同的染料(相同序列/不同標記寡核苷酸混合物)標記。優(yōu)選通過均相(溶液相)實時擴增檢測(例如PCR或TMA)，對所有類型的相關噪音校正結果信號，以參考染料歸一化來自不同標記物的信號，以多通道檢測器收集的處理信號的分布推導靶物。為此使用組合標記物。
例如測定3種分析物時，只需兩種不同的可檢測標記物。第一種標記物附著到特異于第一分析物的第一結合配偶體上。第二種標記物附著到特異于第二分析物的第二結合配偶體上。對于標記特異于第三分析物的第三結合配偶體可使用與已經偶聯(lián)到第一和第二結合配偶體上相同種類的標記物。一部分含量的第三結合配偶體偶聯(lián)于第一標記物。在有三種分析物的情況下，優(yōu)選以此方式標記一半第三結合配偶體。另一部分含量的第三結合配偶體偶聯(lián)于第二標記物，如果是在有三種分析物的情況下，優(yōu)選它是那剩余的一半第三結合配偶體。因此每個特異于該分析物的結合配偶體含有第一或第二標記物。這導致標記的每個結合配偶體分子只含有一種標記物，優(yōu)選實現(xiàn)多色分析以分辨基于源自生化反應的信號產生的多重結果，該信號產生提供了動態(tài)響應記錄手段，同時實現(xiàn)簡單的探針設計和先進的檢測儀器。與此不同的探針是文獻中描述的在一個探針分子上結合多個標記物的探針(Samiotaki，M.等，Analytical Biochemistry 253，156-161(1997))，這樣的探針比本發(fā)明的結合配偶體的合成要難的多。
附著于第三結合配偶體的不同標記物可能造成的不同檢測效率可用2種方式補償。在第一標記物信號輸出高于第二標記物的情況下，可將偶聯(lián)于第一標記物的第三結合配偶體和偶聯(lián)于第二標記物的第三結合配偶體以規(guī)定的非1∶1的比率混來化學調節(jié)這一差別，或將輸出信號經給定的選擇作為標準的標記物進行歸一化而按數學方式調節(jié)差別。這種檢測效率的差別可能歸咎于標記物的內在特性，如吸收率或量子場，不過也可能歸咎于不同的偶聯(lián)效率或對溶劑影響的敏感性。在后者的情況中，偶聯(lián)反應后混合不同含量的第三結合配偶體提供了良好的適應這種差異的可能性。
避免了當兩種或多種可檢測探針附著到一種結合配偶體分子上時可能發(fā)生的另外干擾。因此，本發(fā)明的結合配偶體適合較寬光譜的標記物，該標記物包含熒光團和熒光團組合，如經典的Frster型標記物(Styer and Haugland，Proc Natl.Acad.Sci.USA 98，719(1967))，可用于如測定低濃縮核酸分析物的TaqMan法的均相檢驗測定。
必須注意到也可以利用三種甚至更多的標記物以如上面兩種標記物所顯示的相同的方式組合起來測定更多數目的分析物。當使用三種標記物時可測定多達七種的分析物。如果單個、雙重、三重和四重組合都應用得同樣好，使用四種不同的標記物甚至可測定15種分析物。如果只應用單個或雙重組合(從實用觀點來說可能很有益處)，使用一套4種標記物就可鑒別多達10種不同的分析物。
因此本發(fā)明涉及一種測定至少3種分析物的方法，包括步驟a)提供含有至少3種分析物或懷疑含有一種或多種分析物，和至少3種不同的結合配偶體的樣品混合物，在容許該結合配偶體與所述分析物特異結合的條件下，其中-至少3種結合配偶體中的第一結合配偶體特異于至少3種分析物中的第一分析物，并且與第一標記物偶聯(lián)，
-至少3種結合配偶體中的第二結合配偶體特異于至少3種分析物中的第二分析物，并與第二標記物偶聯(lián)，且該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可以單獨檢測出來的，以及-至少3種結合配偶體中的第三結合配偶體特異于至少3種分析物中的第三分析物，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，b)檢測指示第一和第二標記物的信號強度，c)利用步驟b)中測得的信號強度確定樣品中存在的分析物。
優(yōu)選的分析物是可利用序列特異性探針進行測定的核酸分析物。該核酸分析物也可以是利用本領域公知的一種或幾種核酸擴增方法擴增的核酸，如LCR(美國專利5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP0320308B1；WO90/01069；WO89/12696和WO89/09835)，循環(huán)探針技術(美國專利5,011,769、5,403,711、5,660,988和4,876,187，以及PCT公開的申請WO95/05480，WO95/1416和WO95/00667)，InvaderTM技術(美國專利5,846,717、5,614,402、5,719,028、5,541,311和5,843,669)，Q-Beta復制酶技術(美國專利4,786,600)，NASBA(美國專利5,409,818、EP0329822)，TMA(美國專利5,399,491、5,888,779、5,705,365、5,710,029)，SDA(美國專利5,455,166和5,130,238)和PCR(US-A-4,683,202)，其中PCR法是最優(yōu)選的。
本發(fā)明也涉及一種物質組合物包含-特異于第一分析物，偶聯(lián)于第一標記物的第一結合配偶體，-特異于第二分析物，偶聯(lián)于第二標記物的第二結合配偶體，其中該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的記物是可以單獨檢測出來的，和-特異于第三分析物的第三結合配偶體，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)。
以及該組合物用于測定樣品中的至少3種分析物的用途。
本發(fā)明進一步涉及測定至少3種分析物的試劑盒。
附圖簡述

圖1顯示了利用所描述的測定方法進行多重分析物自動化檢測分析的可能的數據處理流程圖解。見實施例2。
發(fā)明詳述根據本發(fā)明的分析物是可通過本領域公知的結合檢測法測定的分析物。該分析物優(yōu)選為醫(yī)學診斷或其他生物學分析樣品的成分，即特別是例如抗原、抗體、細胞或核酸的機體構成成分。這樣的檢測可被用于比如測定傳染性媒介，例如衣原體、奈瑟球菌和分枝桿菌的細菌，以及如HBV，HCV和HIV的病毒。根據檢測目的可確定樣品中存在的一種分析物的含量以及分析物的構型，例如對核酸分析物可分析其等位基因形式或患者是否攜帶其突變形式。
本發(fā)明的樣品含有待測定的分析物。就醫(yī)學診斷而言，分離自人或動物的樣品是優(yōu)選的，例如可使用全血、組織切片、尿、唾液、血清、血漿、血沉棕黃層和涂片。根據分析物和樣品有必要對樣品進行預處理以容許進行分析物測定，例如對于大多數樣品需要在第一步進行核酸提取。這些預處理的樣品也是本發(fā)明的樣品。
根據本發(fā)明至少3種分析物被測定。例如患者的傳染性媒介的模式，如病毒HIV，HBV和HCV，必須測試血庫中的每個血液樣品。另一個例子是測定由幾個基因座和獨特的等位基因型組成的組織相容性抗原基因座模式。
分析物與特異的結合配偶體結合。必須根據分析物選擇特異的結合配偶體。具有抗原性質的分析物可用特異的抗體結合。樣品中的抗體可通過使用特異的抗原作為結合配偶體進行測定。如果必須測定核酸分析物，可使用與分析物互補的核酸序列作為特異的探針。其它特異的結合對如底物-酶或糖類-凝集素是本領域公知的，也可用于所述的方法。
核酸分析物通常要經過不同方法之一處理原始樣品才能成為適用的形式。包括例如pH的變化(堿性的)，加熱，溫度的循環(huán)變化(凍/融)，生理生長條件的變化，去污劑、離液鹽或酶(如蛋白酶或脂酶)的單獨或組合使用。例如可以使用能夠在特定條件下結合核酸的磁性玻璃顆粒。適合的顆粒和方案在WO96/41811和WO01/37291中有描述。
選擇促進結合配偶體與分析物特異結合的反應條件是很重要的，該條件容許特異結合復合物的產生但使結合配偶體與不相關反應和樣品成分的結合最小化，以免導致背景信號增強。這樣的反應條件和適合的方案是本領域公知的。
用于測定核酸分析物或擴增的核酸分析物的特異核酸結合配偶體，也稱為探針，優(yōu)選為寡核苷酸，但也可以使用例如肽骨架替代了天然的磷酸酯-糖酯骨架的類似物(PNA，WO92/20702)。為了容許探針與分析物的特異結合，探針優(yōu)選長于10個核苷酸，更優(yōu)選長度為10至40個核苷酸。進一步要求探針與分析物序列充分互補。因此探針優(yōu)選至少80％的互補性，更優(yōu)選至少90％的互補性。在最優(yōu)選的情況下探針與分析物完全互補。對互補性和同源性的精確測定可使用如FastA(Person和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA卷85，第2444-2448頁(88))的計算機程序進行測定。
根據核酸分析物的最初濃度，有必要擴增分析物以進行測定。為此的幾種擴增方法是本領域公知的(參見上文)。特別當使用基于引物的擴增方法時，對核酸分析物的特異擴增是可能的。在與探針結合檢測法的組合使用時可獲得增強的檢測特異性。使用標記的引物以測定分析物的方法如LCR是本領域公知的。根據本發(fā)明這些方法也可進行修飾。
本發(fā)明的引物是可被延伸或修飾的分子，優(yōu)選用酶，更優(yōu)選在與核酸模板雜交時使用原核生物來源的聚合酶。當用到PCR方法學時，耐熱的聚合酶如水生棲熱菌(T.Aquaticus)或嗜熱棲熱菌(T.Thermophilus)DNA聚合酶是優(yōu)選的。引物延伸是通過將來自三磷酸單脫氧核糖核苷的單核苷酸單位加至所述引物的3’-OH末端進行的。引物的全長和堿基序列取決于所需的擴增反應的特異性。優(yōu)選的進行PCR的引物長度是10至40，最優(yōu)選15至30個含有選自單核苷酸和/或核酸類似單體的亞單位的堿基。一般，這一長度的引物也可用于其他擴增方法。如果擴增中使用了多于一種的引物，例如當利用PCR或在一個反應中擴增多個靶核酸時，優(yōu)選使用相互間不會雜交的引物，因為它們不含有任何多于5個連續(xù)互補堿基的序列段。
通常本領域的技術人員知道哪一類標記物是可檢測的或可制備成可檢測的以用于測定分析物的存在。眾所周知的標記物是如熒光素和鑭系螯合物的熒光標記物，如釕系絡合物的電化學發(fā)光標記物，或能被其他分子實體識別的部分，如能通過與抗體隆起反應而識別的半抗原，或可被固定的部分，如可以與涂有鏈酶親和素的固相如珠或管結合的生物素。特別是從均相形式出發(fā)，最優(yōu)選的標記物是生色團。這些生色團可單獨使用或與其他生色團或例如與非熒光淬滅劑組合使用。
在使用均相檢測形式的情況下，特別是用于核酸分析物測定的幾種形式是本領域公知的。如TaqMan檢測(美國專利5,210,015和5,487,972)和相吻探針-檢測的方法是基于熒光染料(FET，Styer和Haughl的Proc.Natl.Acad.Sci.USA卷98，第719-(67))的熒光能量轉移。當相互之間緊密鄰近時，第一熒光團會與第二熒光團或非熒光淬滅劑相互作用。例如，電磁發(fā)射或振動激發(fā)第一熒光染料可能引起第二熒光染料的共振。根據使用的形式可以檢測例如第一熒光染料降低的光發(fā)射或第二熒光染料增加的光發(fā)射，以作為一種分析物存在的指示。以此為目的的熒光染料的組合使用是本領域公知的。具體實例是如五甲炔-吲哚二羰花青(Cy5)組合6-羧基熒光素(6-FAM)的適于Forster型共振能量轉移的經典染料。
本文的標記物指在本發(fā)明的方法被檢測的信號生成實體。涉及所述的均相形式，可使用相互產生共振，并且在這些方法中以單獨的檢測信號被檢測到的成對熒光色素。盡管包括了例如兩種熒光色素的兩種不同的分子，它們還是起一個單獨標記物的作用。此外，術語標記應被理解為它也指一種特定標記物的多于一個標記分子偶聯(lián)到結合配偶體分子上。
根據使用的標記物必須使用不同的探測器檢測標記物信號。除其他儀器外，尤其是熒光計被廣泛使用。熒光標記與均相PCR協(xié)同使用是最有益的，因為與酶或化學發(fā)光標記技術相比不必加入化學觸發(fā)試劑以形成信號。這就容許封閉管方法，是避免與擴增物質交叉污染的最有效方式。當測定多重標記物信號時，每個信號之間能相互區(qū)別是很重要的。為避免交叉干擾，當使用光標記物時優(yōu)選每個標記物具有不同的發(fā)射和/或消光光譜。但是在多重分析物檢測中使用多數商業(yè)上購買的標記物時至少一些交叉干擾是不能避免的。當只測定少數分析物時這種交叉干擾可通過用計算機程序處理測得的信號或使用更貴的光譜熒光計代替基于濾光片熒光計而加以補償。涉及均相形式特別是使用基于熒光能量轉移的方法時，必須使用附加生色團更增加了干擾的可能性。因此實際上多重分析中一起使用的適合標記物的數目是受限的。
根據本發(fā)明至少所使用的一種結合配偶體偶聯(lián)于可探測標記物的組合，其中每個結合配偶體分子只偶聯(lián)一種可探測標記物。與此相反，Samiotaki等人(參考上文)描述的探針是用多重標記物標記的(例如每個寡核苷酸5’末端偶聯(lián)10-20個)。由于偶聯(lián)到相同探針分子上的可檢測標記物緊密鄰近，標記物之間相互干擾的風險很高，并且不是所有類型的標記物尤其熒光染料都可使用。
本發(fā)明的方法可被用于在多重分析物檢測中測定更多數目的分析物，并且適合較寬范圍的標記物。
通過減少多重分析中所需標記物的數目可避免引入外來標記物的需要，并且可使用如基于濾光片的熒光計的較便宜的探測器以代替昂貴得多的光譜熒光計。這進一步容許在商業(yè)診斷檢測中使用污染風險有限且處理步驟較少的均相形式，這些是尤為重要的。
如上所述，按不同方式組合的三種標記物可偶聯(lián)于多達七種的不同的特異結合配偶體而容許六種不同分析物的分別測定。這在下表中呈現(xiàn)出來。P代表參量＝分析物，通道相應于光道，它是優(yōu)化捕捉特定檢測的標記物信號的探測器的一部分。表格顯示了對所有三個通道的信號的預期百分數分布，并通過化學或數學方法進行歸一化。設想的情況是P1至P7的分析物中同一時刻只有一種分析物存在于樣品中。不同結合配偶體的標記是類型P1-標記物1(通道1的信號)，P2-標記物2(通道2的信號)，P3-標記物3(通道3的信號)，P4-半含量標記物1，半含量標記物2，P5-半含量標記物1，半含量標記物3，P6-半含量標記物2，半含量標記物3以及P7-1/3含量標記物1，1/3含量標記物2，1/3含量標記物3。
如果只能在一個通道中測量到一種信號，就清楚說明存在參量1，2或3中的一種分析物(見表)。如果信號以50∶50的比率出現(xiàn)于兩個通道，就如表中所指示的，強烈說明存在參量4，5或6中的一種分析物。比率為33∶33∶33的信號說明樣品中存在分析物P7。但這只反映了一種理想化的情況。實際信號可能偏離并必須進行歸一化以便補償例如標記物，背景和交叉干擾信號的不同檢測效率。
50∶50的信號比可能在存在兩種分析物的情況下發(fā)生。但這可能是極為罕見的，因為這種發(fā)生依賴于從起始分子數目而言發(fā)生了1∶1的共感染并且提取/擴增/檢測效率相同而使50∶50的信號生成于2個通道中，或者起始分子的數目不同但同時提取/擴增/檢測效率精確地抵消了滴定度的差別并且也服從50∶50的分布。因此2個參量的共感染使用單獨的標記探針分別指示，例如P1和P2，結果應為不均等的＞＞50∶＜＜50∶0或＜＜50∶＞＞50∶0分布，而與例如以50∶50∶0的均等分布顯示的P4區(qū)別開來。但這種結果也可得自被例如P4和P1的兩種試劑共感染的樣品。
為了進一步減少不明確結果的風險和檢測信號解讀中的可能錯誤，可以如實施例1中所說明，以兩個或多個通道產生的信號可明確地指定為樣品中一種可能的分析物分布的方式安排參量。另外，特別為檢測可能存在于樣品中的剩余分析物的分布，可以進行一個附加的檢測。該順序型方法很經濟，容許在第一次檢測中測定多數樣品中一種單獨的分析物的分布，同時不明確的樣品可通過比如分析物數目減少的多重分析物檢測(其中確定的一個標記對應一個結合配偶體的組合應是可能的)在第二次檢測中進行再評價。另外，對于核酸分析物和擴增的核酸分析物，可以測定例如分析物-探針雜交復合物或擴增的核酸復合物的熔融曲線，從而區(qū)別不同的分析物并得到明確的結果測定至少3種分析物的試劑盒也是本發(fā)明的主題。該試劑盒在一個或多個容器中包含-特異于第一分析物，偶聯(lián)于第一標記物的第一結合配偶體，-特異于第二分析物，偶聯(lián)于第二標記物的第二結合配偶體，其中該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可以獨立檢測的，和-特異于第三分析物的第三結合配偶體，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，此外該試劑盒也包含使該結合配偶體與其分析物特異結合的工具，包括緩沖液，封閉反應劑和其他本領域公知的反應成分。測定核酸分析物的試劑盒也可包含如上所述的用于核酸擴增方法的反應成分。例如PCR反應試劑盒也可包含聚合酶、緩沖液、三磷酸核苷酸和/或引物。
本發(fā)明用以下實施例舉例說明實施例實施例1根據本發(fā)明的多色分析可通過使用建立在“經典的”熒光色素化合物和“經典的”共振能量轉移原理基礎上的Roche Cobas Taqman擴增/檢測技術和5’-核酸酶檢測技術(EP0543942和US5210015)進行。Roche Cobas Taqman儀器裝備了多達4對濾光片(見EP0953379，EP0953837，US6134000和US6084669)。一套推定指示劑可由4種報告染料和優(yōu)選1或2種任選的非熒光淬滅劑組成?？缭紺obas Taqman檢測器設置的光譜范圍，即約420nm-約710nm的候選化合物可包括-在紅光有寬波段吸收的淬滅(Q)染料，如聚甲炔-花青染料(例如n＝5，即4個共軛烯本體構成內消旋結構)，或與參與共軛外消旋π-e(-)系統(tǒng)的不飽和N-雜環(huán)部分在側面對稱稠合的若丹明衍生物，都可優(yōu)選作為非熒光的硝基苯衍生物。
-報告(R)染料熒光分子，如香豆素染料，如FAM或氯化衍生物的熒光素型染料，若丹明型染料，噁嗪或鄰聯(lián)吡啶型化合物。三種這樣的染料被用于靶參量，一種用于監(jiān)測IC。
通常對于候選染料的相關要求包括在儲液中的良好化學穩(wěn)定性和在主要混合試劑中居于作為有效成份的使用水平；在合成、純化和試劑盒生產過程中當受到周圍環(huán)境中光照時穩(wěn)定；在PCR中當受到多個加熱/冷卻循環(huán)(如n＝60)時穩(wěn)定；足夠的光譜疊加和相應RQ共振對之間有效的能量轉移；高消光系數(即吸光率)；以及尤其對于報告染料在水溶液和Taqman-PCR使用的pH范圍(如pH7-8.5)中的高量子產率。
新方案容許檢測3種報告染料及其二元組合在相應的3個CobasTaqman光通道范圍內的交叉干擾和背景校正歸一化信號，而非固定指配特定染料(代表特定的檢測參量)和相應的通道。該原理將提供對6-參量多重檢測獲得的陽性結果的完整解析(通過報告染料R1，R2，R3，R1+2，R1+3，R2+3)，并考慮到最大極限的復雜性。
理論上來說，在使用單標記物的情況下，在給定的通道中得到100％的各自的處理信號；在使用二元標記物的情況下，處理信號將平均分布于2個相應的通道(50％+50％)。
對陽性/陰性集合體(捐贈物)的辨別將基于檢測極限循環(huán)的優(yōu)化運算法則(ct值，即反應坐標上熒光信號強度顯著突出于背景水平的點)進行，以指示信號時間曲線的斜率分布圖。
對感染類型的分辨(檢測參量，即產生可檢測產物的病原體種類，)可通過分析信號/時間曲線(AUC)下的總面積或總的標準化平臺信號強度的通道特異性貢獻進行。就這些判據而言，沒有嚴格的劑量響應關系，不必如血液篩選需要強制進行定性檢測。
適合的6-參量(P1至P6)多重檢測包含以下探針(Q＝淬滅劑，R＝報告染料以及Ni＝四種核苷酸之一)參量1-探針＝5’-Q-(Ni)g-R1-(Ni)h-3’-PO4+5’-Q-(Ni)g-R2-(Ni)h-3’-PO4
各5pmol/100μl反應混合物參量2-探針＝5’-Q-(Ni)a-R1-(Ni)b-3’-PO410pmol/100μl反應混合物參量3-探針＝5’-Q-(Ni)c-R2-(Ni)d-3’-PO410pmol/100μl反應混合物參量4-探針＝5’-Q-(Ni)e-R3-(Ni)f-3’-PO410pmol/100μl反應混合物參量5-探針＝5’-Q-(Ni)k-R1-(Ni)l-3’-PO4+5’-Q-(Ni)k-R3-(Ni)l-3’-PO4各5pmol/100μl反應混合物參量6-探針＝5’-Q-(Ni)n-R2-(Ni)m-3’-PO4+5’-Q-(Ni)n-R3-(Ni)m-3’-PO4各5pmol/100μl反應混合物換句話說在2-4的情況下，每個參量有大約1*612個均一標記的探針分子(相同的寡核苷酸/相同的報告染料)將被引入PCR；在1，5和6的情況下，每個參量又有大約1*612個均一標記的探針分子將被引入PCR，大約1/2*612個分子具有一種標簽，而大約1/2*612個分子具有另一種標簽(相同的寡核苷酸/不同的報告染料)，它們將按統(tǒng)計平均的方式消耗；在所有的情況中，都存在著10pmol的參量特異性探針。
考慮到不明確結果的風險，并只關注一元標記物和其二元組合的使用，有人可能會說，不明確結果在由單個標記探針分別指示的2個參量共感染的情況下可能是極為少見的，例如P2R1+P4R3。起始分子按照1∶1的數目共感染并且提取/擴增/檢測效率相同而在2個通道中產生50∶50的信號分布，或者起始分子共感染的數目不同而同時提取/擴增/檢測效率精確地抵消了滴定度的差別并且再次產生50∶50分布的可能性被認為是低得可忽略不計。因此＞(＞)50∶＜(＜)50∶0或＜(＜)50∶＞(＞)50∶0的不均等分布將產生(情況I)，而與例如以50∶0∶50的均等分布顯示的P5R1R3區(qū)別開來。
以2個雙重標記的探針的1∶1混合物指示的2個參量的共感染(情況II)，例如P1R1R2和P5R1R3，也由于信號分布于3個通道應該是明顯的(例如假定相等的提取/擴增/檢測效率，約為50∶25∶25)。
2個參量的共感染，一個參量用一種報告染料表示，另一種用兩種報告染料表示，可通過信號分布于3個通道而被識別≈33∶33∶33(情況III，例如R1R2+R3)，或產生≈75∶≈25∶0的模式(情況IV，例如R1R2+R1)，再次假定相等的提取物/擴增/檢測效率。對于情況II和III，共同的特征是沒有靶物相關的光通道并且基本上為“零信號”。換句話說，將“零+X”的閾值區(qū)別于“實零”是很重要的。情況IV可能是最關鍵的一種情況，其分辨的確依賴于檢測的總體效率，后者決定了結果分布是完全區(qū)別于50∶50的情形，還是沒有區(qū)別。最可能的，尤其是在后一種情形中必須考慮到附加的數學判據以解析不明確結果。有益的是實時Taqman-PCR提供了這樣的“輔助算法”。下面就一些細節(jié)說明該主題。
不明確結果的低發(fā)生，即共感染中發(fā)生50∶50信號分布的情形，可進一步通過將極少發(fā)現(xiàn)的和低擴增效率的參量指定于單標記的探針而被最小化，考慮到地域分布，它有可能得到補償。
報告染料(R＝標記物)的推定指定和檢測HIV-1-M，HIV-1-O，HIV-2，HCV，HBV和HAV的測定法如下所示P1HIV-1-MR1/R2擴增和檢測效率高P2HIV-1-OR1 低P3HIV-2 R2 低P4HCVR3 高P5HBVR1/R3高P6HAVR2/R3中IC(內參)R4為了安全原因和尤其涉及到商業(yè)檢測，也可以加入內參，該內參可以通過例如偶聯(lián)于第四種標記物(R4)的探針被檢測到。
這里，HIV-1-O和HIV-2的共感染是非常不可能的，兩者都很少見并且地域上是分離的(但是可能隨時間改變)，即使在這樣非預期情況下總體結果也可以是“HIV陽性”。
另一方面，根據現(xiàn)有的擴增效率(HIV-1-O和HIV-2很低)，HIV-1-O和HCV或HIV-2和HCV的共感染不會導致50∶0∶50或0∶50∶50的相等分布，并且不會被誤認為HBV或HAV各自的單感染。因此可以使用標準的四通道熒光計進行包括一個單獨測定的內參的六參量檢測，該檢測可用于例如Roche Cobas TaqMan設備。
因此，根據檢測參量的6參量多重測定的完全分辨的理念就成為相比于現(xiàn)有化學系統(tǒng)和設備平臺的必要而適中的附加成果。同樣如下所示，對于更先進的分析軟件的要求就不是很苛求。在一些細節(jié)上包括-3種探針的雙重對數跡線(相同的寡核苷酸，不同的熒光標簽)-標準化程序以建立來自單標簽探針的各個報告染料的信號輸出和歸一化因子(考慮來自各個寡核苷酸序列環(huán)境，以例如Em(R/Q)比率指示的純化級別，與波長有關的含能量和CTM ASICS光譜靈敏度的影響)-最可靠輸出判據或成套判據的詳細說明，以100％有效分布模式變差的測定，以及預期值的容許范圍邊界的設定-軟件算法的開發(fā)，用于分析3個靶物通道中校正歸一化信號的分布，該算法引入了所有前述的參量。
實施例2針對用于如Roche Cobas TaqManTM儀器的自動化測試設備的檢測方案，適合的方法流程如下所示(也見圖1)。
由于使用了給定的新試劑，自動化檢測主要的數據收集和數據處理的流程如下所示-數據收集 狀態(tài)1.暗均值(＝儀器噪音) DM 已完成2.暗漂移(＝f(t)漂移校正因子) DD 已完成3.交叉干擾和預設校正因子 XT 已完成4.報告染料的信號輸出歸一化因子 NFRi另外進行(＝校正量子場，微環(huán)境效應，光譜靈敏度，...的預設因子)5.背景強度(＝化學噪音，累積自混合物中所有的探針) BG已完成6.隨時間推移測量的總信號 TFI 完成優(yōu)選就Cobas Taqman儀器上光通道1，2，3和4而言，所有步驟都獨立進行。
-數據處理1)對于每個通道，并且作為信號一時間圖，計算{TFIf(t)-{(DM*DDf(t)+BG]}*XT*NFRi＝NFI，即通道特異性歸一化校正熒光強度2)如果通道1，2，3相應于報告染料，而通道4相應于IC染料，則NFI4＝100％IC響應強度NFI1+2+3＝100％靶物響應強度，3)根據這些通道中的分布進行分析，即通道1中x％，通道2中y％，和通道3中z％。
所得的信號分布數將與上述的預先計算的值進行比較，并且被測病原體的同一性通過光通道特異性增益和相應的報告染料的相關性，加上輔助因子而推導出來。
因此換句話說，該檢測不是相對于靶物的滴定度校準(即其仍是定性的篩選檢測，在例如血庫篩選應用中產生陽性/陰性的結果)，而是相對于給定濃度下參量特異性探針的信號輸出校準(為了鑒別多重擴增陽性結果的緣由)。
單個樣品的分析可如圖1的指示進行。
為了理解這個處理算法的邏輯性，讓我們來考慮下面的檢測原理。
在5’-核酸酶技術中(Taqman-PCR，在此作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方案闡述)各自的擴增和檢測反應是緊密交叉的。為此，具有2個特定化學修飾的檢測探針被加入到PCR主混合物中。一種修飾是將熒光報告基團(R，例如6-羧基-熒光素的衍生物)共價連接到探針的骨架上，另一種修飾是能夠吸收報告染料的熒光并淬滅之(淬滅劑，Q)的染料(例如聚甲炔-花青衍生物)。淬滅劑典型的連接到探針的5’末端骨架上，其中報告染料定位在寡序列中，與淬滅劑間隔一定數目的核苷酸結構單元。探針結合到靶核酸上(有義或反義鏈)靠近引物的3’末端(反向或正向)。當引物退火形成靶物上，并且DNA聚合酶結合到引物靶物雜交體上，延伸開始。由于酶的5’核酸酶活性，在拷貝鏈合成的同時，當聚合酶到達探針結合位點，探針斷開，報告染料和淬滅劑分開，就可檢測到熒光信號。該過程在每個循環(huán)中重復，越來越多的熒光報告染料在溶液中累積直至在反應終點試劑耗盡。因此在信號一時間曲線圖中，就形成了S形增長曲線。任意熒光強度(AFI，也被稱為相對光單位，RLU)可從背景信號中顯著區(qū)分出來時的時間軸上的點被稱為閾值循環(huán)(ct)。ct是分析物滴定度的衡量標準ct值越小，起始分子的數目越多和/或提取或擴增/檢測的效率越高。ct值可通過不同的數學算式計算。例如，可使用截點逼近(平均背景信號強度乘以常量因子產生截點信號強度以從陽性中辨別陰性結果)，或在曲線擬合后自動檢測信號一時間曲線(即斜度或斜率分布型)第一或第二導數最大值的位置的方法。斜率分布型方法不同于信號閾值的方法，其基本上不依賴背景強度水平，因此考慮到來自反應混合物中存在的所有探針的累積背景，該方法在多重檢測中更有吸引力。
基于這些原理并根據上述的處理流程，可以使用不同的方式產生初級結果(即陽性或陰性？)，和次級結果(即何種感染致使樣品陽性？)。
與使用一種共同標記物進行多重分析相比較，由于信號分散于幾個光通道中造成靈敏度的潛在損失，因此減少了特定通道中特異信號的增長曲線。因此為了形成初級結果，可任選使用復合的信號一時間曲線。通過這種方式，全部的特異信號產量都被收集入一個信號一時間曲線，該曲線隨后被用于確定閾值循環(huán)(ct)和樣品的主狀態(tài)(陽性/陰性)。利用斜率分布型方法，背景強度的加入不會有害，反而可以充分利用自動檢測特異信號增益的更為顯著的增長特性的潛在優(yōu)點。
另一方面，為了形成次級結果，可參考歸一化信號的通道特異性分布(NFI強度)，并通過將結果分布模式與上述的預先計算的矩陣模式比較推導出感染的種類。此外，為了增強鑒別能力，也可以考慮非歸一化的特異信號強度以分析歸一化信號約50∶約50或約75∶約25的分布，即真正關鍵的那些。
-在以1∶1的探針混合物表示單感染的情況下，非歸一化但背景校正的信號R1/R2的比率仍將在整個的擴增/檢測過程中恒定，例如為40/50。這必須與得自相等含量的純化染料的歸一化因子(0，80)的值準確相當，因為兩類的標記探針(相同的寡核苷酸序列！)都要以同樣的速率斷裂。背景(BG)校正是必需的，因為根據于此提供的概念解析6參量多重分析，每個通道特異性背景由用相同標記物標簽的3種不同探針的信號輸出組成。因此BG強度不僅是標記物光特性的函數也是探針結構特性的函數，即線性或發(fā)夾式結構，或(更普遍的)通過自我補償程度的，和測量過程中影響二級結構構象平衡的溫度的函數。因此相對于BG強度，必須考慮非雜交探針的二級結構，并且必須基于特異性熒光強度SFI進行輔助計算，其中SFI＝TFIf(t)-[(DM*DDf(t))+BG]*XTi＝AFI-BG相比較而言，特異性信號依賴于探針與靶物基本完全的雜交，即探針寡核苷酸的線性化以聚合酶的5’-核酸酶活性的方式形成，因此基本上不依賴探針的結構。這也適用于由于Tm(熔化溫度)隨之下降在從靶鏈斷裂并解離后的截短探針。剩余探針寡體之間短的內雜交在PCR退火/延伸使用的高溫下是不穩(wěn)定的。為補償量子產率或溶劑影響易感性的差別而進行歸一化后，通道1和2的信號分布將是50∶50。發(fā)現(xiàn)NFI和SFI比率如預期一樣是單感染的雙重證據。
-在經2種特異探針分別標記的R1和R2指示的雙重感染的情況下(情況I)，很可能信號動態(tài)(即增長隨時間的函數)在2種不同的檢測中有差別，不管是最初的分析物滴定度，或整個的檢測效率，或兩者都可能不同。因此，除了NFI水平的＞50∶＜50情形的可能性外，反應的極早期、中期和晚期中的R1/R2的SFI比率也必定不同，即SFI比率是變化的。該比率會有一定的趨勢，并且與得自純化染料，優(yōu)選偶聯(lián)于模型探針(為了說明無法避免的微環(huán)境因子，例如連接物，局部電荷)的等效混合物的各自的歸一化因子不同，例如不會通過其結構構型調節(jié)信號輸出的T3-R-T16寡核苷酸。
-在經R1+R1R2表示的雙重感染以及就2種檢測而言基本上不同的總體回收的情況下(情況IV)，可能在通道1和2中觀察到與50∶50差別不大，如55∶45的歸一化信號分布。根據非歸一化信號強度，比率R1/R2將是例如44/50(0，88)，即大于歸一化因子。因此，歸一化和非歸一化水平的“大于預期”的雙重偏離指示了雙重感染。更甚者，例如經AUC示蹤的比率R1/R2，很可能在整個檢測中并不恒定，這是由于不同的擴增效率導致信號動態(tài)差別，這會增強辨別力。
-如果是在雙重感染，用R1+R2或R1+R1R2標記的情況下(情況I或情況IV？)，兩個檢測具有大約相等的效率并且起始于顯著不同或大約相等的分析物滴定度，75∶25∶0的NFI模式是近似的或甚至超過之。于此，情況IV和強偏離情況I型共感染之間的識別可能通過絕對特異信號強度(R1強度在情況I的情形中必是很低的)或任選校正的通道特異SFI值的絕對差的方式獲得。在一些情況中結果可能完全不明確。
除此以外，對復合的AFI/t曲線可考慮其曲線形狀的特性加以分析。在單感染的情況中，期望只有一個回折點的單S型曲線。但是在雙重感染的情況中，從提取自2種傳染劑的2種類型的核酸靶物中各自形成2種增長曲線，很可能其ct(即曲線向上彎曲并從背景和漂移水平線突出時在時間軸上的點)，形狀，和特異性信號強度都不相同。因此，可能形成具有2個回折點的雙S型曲線形狀。所以單或雙S型曲線可以在檢查中指示樣品中存在單或雙感染。但是在不利的情況中，2或更多曲線的重疊可能導致不規(guī)則形狀，沒有清楚的斜率最大值，并且噪音(即曲線的粗糙度)增加。另一可能性是當2個幾乎同樣的曲線重疊時復合曲線只有一個回折點。
概括起來，有很多數學方法適用于獲得陽性多重分析的解析，得到的是感梁類型。這些包括，但不只限于此基本方法-在靶物相關的光通道2或3中信號強度顯著的情形下，參考NFI分布模式和偏差類型。來自參考模式的容許偏差范圍可通過基于精確數據的絕對值，與各自NFI值相關的帶百分率或它們的組合進行設置。
輔助方法-共同偏離下特定光通道相關的NFI和SFI比率的分析；作為循環(huán)數函數的NFI或SFI比率的分析，即沿反應坐標(恒定或變化的)是動態(tài)的；NFI比率和相應絕對SFI值的關系，或任何2個光通道之間的絕對SFI差(任選通過相關標準劑量差校正)，其中應考慮檢查中不同感染劑已知的檢測特異性總體效率(提取/擴增/檢測)；復合的AFI一時間曲線形狀的分析(如果適用)這套標準的推定應用模式在圖1+2中闡明。
更甚者，為了監(jiān)測整個過程，可在所有樣品中加入優(yōu)選包裹(封殼)于修飾的病毒顆粒的與天然靶物共提取并共擴增的人工核酸結構體。該內參(IC)的特征在于具有針對IC檢測探針的獨特的探針結合域，該IC檢測探針通過攜帶區(qū)別性發(fā)射特征的不同報告基團而區(qū)別于靶物特異性探針。因此IC信號可以從靶物信號中辨別出來，并且既然已知IC存在于樣品中，它就可以用作監(jiān)測試劑。如果沒有IC響應，必須認為各自的反應是無效的，然后重復之。
除了將共提取/擴增/檢測內參(IC)加入每個被處理樣品(即未知物和外加的對照或校準物)并以R4指示外，外加的陽性對照也將是檢測的一部分。這些是已知物并且相對于未知物必須是顯示陽性的，還可被設計為在所有的靶物相關光通道都給出信號的混合對照樣品。結合內參，除了整個提取/擴增/檢測處理的功能性以外，整個光系統(tǒng)的效用都可被監(jiān)測。對于血庫中以核酸為基礎的篩選應用，只要技術可行就需要利用例如高靈敏度卻是定性的檢測識別每個陽性捐贈物。因此外加陽性對照的滴定度要設置在低范圍濃度。
實施例3基于實施例1給出的參量列表分析下面所示的信號分布。對于被測6參量中的每個參量，都有分配給靶物檢測的3個光通道中的信號分布參考模型。每個參考模型用伴隨的容許范圍補足，例如，
NFI參考模型
假定10％/20％偏移帶相關于100％和50％平均值，以及5倍值幾乎為零，其轉化成參考模型如下面所示的容許范圍
偏差的容許范圍是可計算的，例如作為百分值(％)、絕對值，簡單標準偏差的倍數或其組合。對于每個樣品(參量)，通道1(報告染料R1)，通道2(報告染料R2)和通道3(報告染料R3)的信號分布通過基于每個6倍測定值的6個平行的模擬數據組給出，如表(右側)所示。表左側顯示了評估信號數據的隨后步驟。
模擬分布
平均值(算術)根據參考模型(偏離)
三倍標準偏差根據參考模型(偏離)
NFI參考模型
10％/20％偏移帶相關于100％和50％的平均值，因子5相關于0％的值，即參考模型的容許范圍模擬數據組Ch1Ch2Ch3總值P152 48 0 10049 48 3 10047 52 1 10050 46 4 10048 49 3 10050 50 0 100P298 0 2 10097,5 0 2,510099 0 1 1001000 0 10096 2 2 1001000 0 100P31 96 3 1002 96 2 1002 97 1 1001 99 0 1000 99 0 1002,595 2,5100P40 0 1001000 0 1001003 1 96 1001 0 99 1000 0 1001001 1 98 100P546 6 48 10050 1 49 10045 0 55 10052 0 48 10049 1 50 10047 2 51 100P60 50 50 1001 49 50 1001 53 46 1002 47 51 1003 52 45 1000 51 49 100對于P5，發(fā)現(xiàn)Ch1∶Ch2∶Ch3的分布接近50∶0∶50，平均值和分散值都在容許范圍內。這導致“P5-陽性”結果，意味著HBV單感染。
實施例4如以上實施例1和2描述的主要考慮方面，50∶50的分布并不總是單感染的有效指示。盡管已提到在幾種應用中這些不明確結果不會發(fā)生，在許多其它情況下尤其是診斷應用中經常需要進一步的分析。為了容許進一步的分析，可使用例如從均相擴增方法中獲得的附加曲線特性。這在圖5所示的流程中反應出來，其中用到附加曲線特性如Ry染料的絕對SFI水平和NFI跡線特性(NFI比率恒定/變化；終分布的早期/晚期近似；偏移＜1/＞1；等)來解析感染參量。
很顯然在該實施例中分辨率會通過動態(tài)分析沿反應坐標的實時檢測數據，而不是只考慮終點條件而顯著增強。尤其對于樣品S4-S6，單純的終點分析只會造成診斷出單感染的風險，而全套的分析工具容許更準確的指定。例如在S5的情況中，終點NFI的分布類似HBV單感染，如實施例3，其中通過動態(tài)分析沿反應坐標的NFI分布，就可輕易的將錯誤指定“HBV單感染”排除，而以正確的指定“共感染，HIV-1-O+HCV”代替之，因為被有效擴增并以R3表示的HCV比擴增不如其有效并以R1表示的HIV-1-O更早得多給出了特異熒光強度(SFI)。因此，R1/R3圖像迅速跌落低于50∶50的基線，繼續(xù)伴以陽性偏移，同時R1的產生有一些延遲，接近終分布。
實施例5HBV單感染的實驗數據基因組靶物(HBV亞型A)，劑量為25-5000拷貝/ml，利用PCT/EP00/11459中描述的磁性玻璃珠技術從血漿樣品中提取內參結構體。洗提的核酸在AmpliLink2.1版(Roche Molecular System)下操作的COBAS TaqManTM儀器上經均相實時Taqman-PCR進行特異擴增和檢測。對于這里報告的基礎研究，HBV特異性探針(編號JW144)的使用量為7.5pmol/100μl，以FAM標記(λEX≈494nm；λEM≈518nm)，和7.5pmol/100μl，以JA274標記(λEX≈580nm；λEM≈609nm)。根據本發(fā)明結果被輸出到MS Excel7.0版進行進一步的數據分析(例如計算特異信號增益的有效循環(huán)范圍[SFI＞＞AFI-BG噪音]，歸一化信號強度，NFI比率和沿反應坐標的NFI跡線，NFI跡線圖分類為恒定/偏移/正斜率變化/負斜率變化，以及結果的圖像化表示)。
均相多重PCR反應利用特異于HIV-1M，HIV-10，HIV2，HCV和HBV的引物對和探針在標準的PCR條件下進行。
如圖3，a-d2所示，根據本發(fā)明的概念在同一個生化反應中(即HBV-DNA的提取和擴增)形成的FAM和JA274信號表現(xiàn)為偶聯(lián)的方式，即只要SFI水平顯著突出于背景之上該信號就回擺于50∶50的分布線。HBV劑量越高，越早產生該現(xiàn)象，并且保持恒定直至反應終點。這是最值得注意的，因為FAM和JA274在COBAS TaqManTM上測得的信號輸出是非常不同的，就導入約11.5∶1的歸一化因子NF(JA274/FAM)。通過與FAM指示的相似反應相比，這進而會導致JA274指示的反應增強的分析靈敏度，即使用該染料對在可測HBV劑量的下限獲得50∶50的NFI分布是很關鍵的(最差情況模型)！利用實驗建立的NF(JA274/FAM)將SFI轉化為NFI，這些以由共同的生化反應生成的方式偶聯(lián)的染料服從具有相當精確度的50∶50的分布(見圖4，b)。
實施例6不同共感染的實驗數據(類型I和類型IV)步驟和試劑組如實施例5中所描述的，除了在此根據提取自共感染樣品的靶物，在擴增/檢測反應中消耗特異于HBV，HCV或HIV-1-O的探針。HBV探針以等量的FAM或JA274標記的寡核苷酸混合物被使用，HCV探針全部以FAM標記，而HIV-1-O探針全部以JA274標記。HBV+HCV陽性血漿樣品和HBV+HIV-1-O陽性血漿樣品是類型IV的共感染，HCV+HIV-1-O陽性是類型I的共感染。注意對于HIV-1-O，由X倍稀釋的培養(yǎng)物上清液給出滴定度；對于其他參量，精確定量[cp/ml]和標準化的材料都是可獲得的。
從圖4，a-d2的標繪可以看出，NFI分布本身和沿反應坐標的NFI跡線與來自單感染的的結果是非常不同的。例如，圖4，a中的反應#1-12顯示HBV(擴增得很好；未包括逆轉錄步驟)和HCV(擴增得好，比HBV稍慢，經過逆轉錄PCR；HCV靶物由于顯著的二級結構而不易進入)具有低且接近相等的滴定度。因此，在特異反應開始之后很快SFI(FAM)和SFI(JA274)經HBV反應大量產生，并且NFI(JA274/FAM)比率趨向于接近50∶50的分布線(＝1)。隨著循環(huán)進行，HCV稍延遲起反應，附加的SFI(FAM)形成，使NFI(JA274/FAM)比率在平衡線以下且圖像具有負斜率。圖4，a的反應#13-24顯示低劑量HBV感染加上HCV劑量100倍過量的特征，導致有效循環(huán)范圍的轉移提前開始，NFI(JA274/FAM)比率圖像急速沖下平衡線然后緩慢以正斜率上升，隨之高劑量HCV反應形成的SFI(FAM)超過低劑量HBV反應的SFI(FAM)和SFI(JA274)的“偶聯(lián)”形成，這使得NFI(JA274/FAM)比率逐漸升高。
因此，以圖1+2所說明的有序方式應用來自實施例2(第25-26頁)的標準，分析將產生“共感染HBV+HCV”。這甚至在大多數利用高劑量HBV和低劑量HCV(高水平的SFI(FAM)和SFI(JA274)加少量附加的單獨的SFI(FAM)，見圖4，d)或高劑量HBV和低劑量HIV-1-O(高水平的SFI(FAM)和SFI(JA274)加極少量附加的單獨的SFI(JA274)，見圖4，c；反應#7-24)的組合的反應中保持正確。在一些情況中，尤其在采用后一設置時，目測的NFI曲線形狀和初步數學描述符(NFI終點比率，NFI跡線特性，絕對SFI水平等)與指示單感染的那些很接近。這可以通過化學的(使用發(fā)射強度大約相似的染料，即NFI比率更穩(wěn)定而不依賴于靶物劑量和絕對信號形成的伴隨水平)，數學的(分別適于分析初級生長和次級NFI曲線的更先進的統(tǒng)計工具)，以及技術的方式(針對快速循環(huán)而特別設計的TC阻斷和操作軟件配置，如這里所用的TC分布曲線；這有助于使初級生長曲線平滑，進而穩(wěn)定NFI比率跡線圖像)改善。
更甚者，圖4，b(反應#13-24)和圖4，c(反應#1-6)顯示類型I的共感染實例，即HCV加HIV-1-O的情況，其導致“非偶聯(lián)的”SFI(FAM)和SFI(JA274)形成。隨后，NFI比率跡線圖延伸，并保持遠在平衡線之下，因為HCV擴增比HIV-O-1好得多(尤其是內多態(tài)性影響引物/探針結合位點的后果)。此外，HIV-1-O單獨形成的JA274特異信號強度遠低于HBV單感染形成的信號這再一次與理論相吻合。這有助于進一步區(qū)別共感染和單感染。
總之，類型IV共感染更難從單感染中區(qū)別開來，尤其當高劑量的參量5(針對R1[Ry]和R3[Rx]產生高SFI水平)與非常低劑量的參量2(只形成很少的附加R1)組合時，但在多數情況下，就像在初步檢測系統(tǒng)中既使使用相當簡單的數學標準和“最壞情況模型”染料對時也是可能發(fā)生的。在類型IV共感染中組合2種很好擴增的靶物，比如參量5[用R1+R3指示]和參量4[用R3指示]因為非同步且不對稱地加入高含量的R 3強度，就顯出較少不明確。如果參量4相對于參量5的相對豐度可以忽略不計，則可以觀察到類似的分辨率極限。與包含參量2的(如預期的)的類型IV共感染相反，類型I共感染更易從通過相同的但經過生化偶聯(lián)染料對指示的單感染中區(qū)別出來。這明顯體現(xiàn)在NFI比率的終點水平和沿反應坐標的NFI跡線上，以及顯著較低的R1[Ry]染料信號強度。是由于大部分R3強度通過參量4形成，既使其劑量很低，同時產生自參量2特異探針斷裂的R1強度大多很低并且在60個循環(huán)的過程中形成的相當晚。所以，由于幾乎不可避免的初始滴定度，或提取/洗提/擴增效率的差異，在整個反應中不可能產生50∶50的信號分布。
權利要求
1.一種測定至少3種分析物的方法，包括步驟a)提供含有至少3種分析物或懷疑含有一種或多種分析物，和至少3種不同的結合配偶體的樣品混合物，在容許該結合配偶體與所述分析物特異結合的條件下，其中-至少3種結合配偶體中的第一結合配偶體特異于至少3種分析物中的第一分析物，并且與第一標記物偶聯(lián)，-至少3種結合配偶體中的第二結合配偶體特異于至少3種分析物中的第二分析物，并與第二標記物偶聯(lián)，且該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可獨立檢測的，以及-至少3種結合配偶體中的第三結合配偶體特異于至少3種分析物中的第三分析物，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，b)檢測指示第一和第二標記物的信號強度，c)利用步驟b)中測得的信號強度確定樣品中存在的分析物，其特征在于所述的分析物是擴增的核酸。
2.權利要求1的方法，其特征在于不同的結合配偶體是核酸序列特異性探針。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述的核酸是利用PCR擴增的。
4.權利要求1至3任一項的方法，其特征在于所述的標記物是均相檢測的。
5.權利要求4的方法，其特征在于所述的標記物是利用熒光能量轉移檢測的。
6.權利要求1至5任一項的方法，其特征在于所述第一、第二和第三結合配偶體中的第一結合配偶體特異于HIV，第二結合配偶體特異于HCV，第三結合配偶體特異于HBV。
7.權利要求1至5任一項的方法，其特征在于第一結合配偶體特異于HIV-1-M，第二結合配偶體特異于HIV-1-0，第三結合配偶體特異于HIV-2，第四結合配偶體特異于HCV，第五結合配偶體特異于HBV，并且第六結合配偶體特異于HAV。
8.一種組合物，包含-特異于第一分析物，偶聯(lián)于第一標記物的第一結合配偶體，-特異于第二分析物，偶聯(lián)于第二標記物的第二結合配偶體，其中該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可獨立檢測的，和-特異于第三分析物的第三結合配偶體，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，其特征在于所述的分析物是擴增的核酸。
9.一種測定至少3種分析物的試劑盒，在一個或多個容器中包含-特異于第一分析物，偶聯(lián)于第一標記物的第一結合配偶體，-特異于第二分析物，偶聯(lián)于第二標記物的第二結合配偶體，其中該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可獨立檢測的，和-特異于第三分析物的第三結合配偶體，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，其特征在于所述的分析物是擴增的核酸。
10.權利要求9的試劑盒進一步包含在所述容器或一個或多個其它容器中的用于所述結合配偶體與所述分析物特異結合的工具。
11.權利要求9或10的試劑盒進一步包含在所述一個容器或一個或多個其它容器中的用于核酸擴增的試劑。
12.用于測定樣品中至少3種分析物的至少3種結合配偶體的用途，其中-特異于第一分析物的第一結合配偶體偶聯(lián)于第一標記物，-特異于第二分析物的第二結合配偶體偶聯(lián)于第二標記物，其中該第二標記物與偶聯(lián)于第一結合配偶體的第一標記物是可獨立檢測的，以及-特異于第三分析物的第三結合配偶體，其中第一含量的該第三結合配偶體與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，并且該第一含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第二結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，第二含量的第三結合配偶體不與偶聯(lián)于第一結合配偶體的相同標記物偶聯(lián)，其特征在于所述的分析物是擴增的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用特異的結合配偶體測定至少3種分析物的方法。將可檢測標記物的組合偶聯(lián)到結合配偶體上以保證每個結合配偶體分子只偶聯(lián)于一種可檢測標記物。這就容許不必限制可用標記物的范圍而測定多于不同標記物的不同分析物。本發(fā)明也涉及試劑盒，物質組合物及其用途。
文檔編號G01N33/566GK1575342SQ02821239
公開日2005年2月2日 申請日期2002年8月24日 優(yōu)先權日2001年8月28日
發(fā)明者K·魏因德爾, S·克賴斯, F·貝格曼, H·-P·約瑟爾, D·海因德爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司