專利名稱：循環(huán)腫瘤細(xì)胞、片段和碎片的分析的制作方法
優(yōu)先權(quán)信息根據(jù)35 USC §119(e)的規(guī)定，本申請要求申請日為2001年8月23日的美國臨時申請?zhí)?0/314151和申請日為2002年4月3日的美國臨時申請?zhí)?0/369628的優(yōu)先權(quán)。這兩份申請都被收作本文參考。
背景技術(shù)：
很多臨床醫(yī)生都認(rèn)為，早期階段的癌癥是局限于器官的疾病。不過，這種看法似乎是不正確的，并且，在使用現(xiàn)有方法首次檢測到時，癌癥通常是全身性疾病。有證據(jù)表明，原發(fā)性癌癥在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)之前的早期疾病階段，就開始將腫瘤細(xì)胞脫落到循環(huán)系統(tǒng)中。在腫瘤血管化時，被脫落到循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞可能附著并且定居在遠(yuǎn)處的部位，以便形成轉(zhuǎn)移腫瘤。所述循環(huán)的腫瘤細(xì)胞(CTC)，包括正常情況下不存在于健康人體細(xì)胞中的標(biāo)記，因此構(gòu)成了診斷和治療特定癌的基礎(chǔ)。因此，腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中的存在，可用于取代其他檢測方法或與所述檢測方法組合，如用于檢測乳腺癌的乳腺X光透射法，或用于檢測前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)測定。通過采用針對靶細(xì)胞上或靶細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)標(biāo)記的合適的單克隆抗體，或通過使用對細(xì)胞蛋白表達(dá)的其他測定，或通過分析細(xì)胞mRNA，可以方便地確定所述細(xì)胞的器官來源，例如，乳腺、前列腺、結(jié)腸、肺、卵巢或其他非造血癌癥。
因此，在可以檢測癌細(xì)胞的場合下，盡管基本上沒有腫瘤的臨床跡象，也可以確定癌細(xì)胞的存在以及來源器官。如果CTC是在手術(shù)之后檢測到的話，如果CTC是復(fù)發(fā)的跡象，人們可以開始佐劑治療。提供所述治療的結(jié)果是，預(yù)測患者對所述治療的需要或治療的效力，是重要而且有利的臨床信息。還可以看出的是，如果CTC的數(shù)量改變，可以預(yù)測進(jìn)展(CTC增加)或反應(yīng)(CTC減少)。
惡性腫瘤的特征是具有入侵相鄰組織的能力。一般，直徑為1毫米的腫瘤是血管化的，并且動物研究表明，存在于腫瘤中的高達(dá)4％的細(xì)胞，能夠在24小時的時間內(nèi)向循環(huán)系統(tǒng)中脫落(Butler，TP&Gullino PM，1975 Cancer Research 35512-516)。腫瘤的脫落能力最有可能取決于腫瘤的侵入性。盡管腫瘤細(xì)胞是連續(xù)的脫落到循環(huán)系統(tǒng)中的，不過，人們認(rèn)為沒有或僅有一小部分會導(dǎo)致遠(yuǎn)距離的腫瘤轉(zhuǎn)移(Butler&Gullino，同上)。預(yù)計腫瘤質(zhì)量的增加可能與CTC的頻率增加成正比，因為單細(xì)胞，或細(xì)胞簇具有增加的粘附性(并且可能具有更大的入侵潛力)。如果發(fā)現(xiàn)這種假設(shè)成立的話，具有高靈敏度的方法，將會有利于對具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者以及具有局部疾病的患者體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷的評估。在患有局部疾病的患者的外周血液中檢測到腫瘤細(xì)胞，不僅具有在較早階段檢測腫瘤的潛力，而且還能提供潛在的腫瘤入侵的證據(jù)。
不過，全血是一種復(fù)雜的體液，它包括多種細(xì)胞群和能夠在體內(nèi)和體外進(jìn)行各種生物化學(xué)和酶促反應(yīng)的可能性成分，特別是在超過24小時的長時間保存時發(fā)生這些反應(yīng)。某些反應(yīng)與CTC的免疫學(xué)破壞相關(guān)，將它識別為外源物質(zhì)?；颊叩拿庖邞?yīng)答通過正常的防御機(jī)制削弱或破壞腫瘤細(xì)胞，包括吞噬作用和嗜中性粒細(xì)胞活化?；熗瑯邮峭ㄟ^由壞死誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來減弱細(xì)胞功能和增殖。除了所述外部破壞因素之外，在有害環(huán)境中受損的腫瘤細(xì)胞可能發(fā)生程序性死亡或凋亡。發(fā)生凋亡或壞死的正常細(xì)胞和異常細(xì)胞(包括CTC)，具有改變了的膜通透性，這種通透性會使得DNA，RNA，和其他細(xì)胞內(nèi)成分可以脫離，導(dǎo)致受損細(xì)胞，破裂細(xì)胞，細(xì)胞碎片的形成，并最終完全分解。所述腫瘤細(xì)胞碎片可能仍然具有完整細(xì)胞的表位或決定簇特征，并且可以導(dǎo)致檢測到的循環(huán)癌細(xì)胞數(shù)量的懷疑的增加。同樣觀察到了來自健康個體的全血樣品，發(fā)生了易變血細(xì)胞成分的破壞，在這里稱之為降低了血液質(zhì)量，這種破壞是在超過24小時的保存期間的長時間保存時出現(xiàn)的。例如，紅細(xì)胞可能破裂，并且釋放血紅蛋白和產(chǎn)生細(xì)胞血影。已知白細(xì)胞，特別是粒細(xì)胞是不穩(wěn)定的，并且在保存時會減少。所述改變增加了有可能干擾諸如CTC的罕見靶細(xì)胞的分離和檢測的細(xì)胞碎片的數(shù)量。所述破壞過程的綜合作用被統(tǒng)稱為抽血后或體外破壞，這種破壞能明顯增加細(xì)胞碎片，這種細(xì)胞碎片可以方便地檢測到，例如，通過流式細(xì)胞和顯微技術(shù)分析，如CellSpotter或CellTracksTM。
通過顯微成像技術(shù)檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞，同樣會受到典型腫瘤細(xì)胞的懷疑的減少和干擾性可染色的碎片的相應(yīng)增加的負(fù)面影響。因此，保持血液標(biāo)本的完整性或質(zhì)量是極其重要的，因為在抽血和標(biāo)本處理期間，可能存在多達(dá)24小時的延遲。所述延遲是可以預(yù)料的，因為用于處理在該分析中所使用的血液的技術(shù)和設(shè)備，可能不是在每一個實驗室都具備的。將樣品送達(dá)進(jìn)行樣品處理的實驗室所需要的時間可能有很大差別。因此，重要的是確定可以對樣品進(jìn)行處理的時間窗。在常規(guī)血液學(xué)分析中，可以在24小時內(nèi)分析血液樣品。不過，由于罕見血細(xì)胞的分析更為關(guān)鍵，可以對血液樣品進(jìn)行分析的時間窗是較短的。一種例子是血細(xì)胞的免疫學(xué)表型分析，一般，它必須在24小時內(nèi)進(jìn)行。在癌細(xì)胞分析中，必須處理較大體積的血液，并且血液樣品的體外降解所造成的問題，可能比由分解的細(xì)胞釋放的材料所造成的問題更嚴(yán)重，所述釋放材料來自CTC和造血細(xì)胞，它們會導(dǎo)致背景的加強，并因此降低檢測腫瘤細(xì)胞的能力。
對所觀察到的小的碎片和大的團(tuán)塊狀聚集物的來源和性質(zhì)尚不完全了解，不過，被認(rèn)為與來自靶細(xì)胞，非靶細(xì)胞的細(xì)胞成分或因子相關(guān)，并且可能與血漿成分相關(guān)。由于CTC可以被稱為在免疫學(xué)上是外源物質(zhì)，甚至是在抽血之前都可能在宿主體內(nèi)發(fā)生正常的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同樣，大量的CTC可以從腫瘤部位連續(xù)脫落，并且保持一種穩(wěn)態(tài)水平，在該水平下，CTC的破壞等于它的脫落速度，而脫落速度又取決于腫瘤負(fù)擔(dān)的大小(參見JG Moreno等″Changes in CirculatingCarcinoma Cells in Patients with Metastatic Prostate CancerCorrelates with Disease State.″Urology 58.2001)。
在該具體技術(shù)領(lǐng)域中，用于從血液中回收腫瘤細(xì)胞的各種方法是已知的。例如，授予AmCell和Miltenyi的美國專利6190870披露了免疫磁力分離，然后進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)。不過，在免疫磁力分離之前，用密度梯度對血液樣品進(jìn)行預(yù)處理。另外，沒有討論除了完整細(xì)胞以外的任何細(xì)胞的分離或統(tǒng)計。也沒有對樣品進(jìn)行肉眼形態(tài)學(xué)分析。
在美國專利6197523中，Rimm等披露了統(tǒng)計100微升血液樣品中的癌細(xì)胞數(shù)量。該方法采用毛細(xì)顯微技術(shù)，證實所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞身份。所述方法特別適用于完整細(xì)胞。由于樣品的體積較小，完整的細(xì)胞必須大量存在。不過，沒有討論諸如片段或碎片的任何其他成分的分離或統(tǒng)計。
在授予Immunivest的美國專利6365362中，披露了用于磁力富集和分析血液樣品中的腫瘤細(xì)胞的方法。所述方法特別針對分析完整細(xì)胞，其中，細(xì)胞的數(shù)量與疾病狀態(tài)相關(guān)。對所分離的細(xì)胞進(jìn)行核酸和另一種標(biāo)記的存在的標(biāo)記，這種標(biāo)記能夠在分析期間排除非目標(biāo)樣品成分。
在WO02/20825中，Chen披露了將粘附基質(zhì)用于統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞數(shù)量。簡單地講，用特異性粘性分子對所述基質(zhì)進(jìn)行包衣，所述分子能夠結(jié)合具有懷疑的轉(zhuǎn)移潛力的活的癌細(xì)胞。然后可以分析所述基質(zhì)上所捕獲細(xì)胞的存在和類型。還披露了將所述基質(zhì)用于篩選治療的方法。盡管采用了分辨完整細(xì)胞和凋亡或壞死細(xì)胞的步驟，在分析中專門排除了凋亡或壞死細(xì)胞。
在來自Cell Works的WO00/47998中，披露了CTC的兩種途徑，末端和增殖途徑。這兩種途徑始于“不確定細(xì)胞”，通過形態(tài)學(xué)差別確定，所述細(xì)胞向末端或增殖途徑發(fā)展。處在末端途徑上的細(xì)胞最終會被破壞，而處在增殖途徑上的細(xì)胞會作為轉(zhuǎn)移的腫瘤形成新的轉(zhuǎn)移集落。該增殖途徑(細(xì)胞和細(xì)胞簇)是潛在的診斷焦點，但是降低了細(xì)胞片段或碎片的作用。設(shè)計這兩種途徑是為了解釋在患者樣品中所觀察到的形態(tài)學(xué)差異。
一般，耐受力更強和增殖力更強的細(xì)胞能存活，以便建立二級或轉(zhuǎn)移部位。在外周循環(huán)中，CTC在體內(nèi)(以及在體外)會受到活化嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的進(jìn)一步攻擊，逐漸導(dǎo)致膜穿孔，電解質(zhì)、較小的分子的滲露，以及包括DNA，染色質(zhì)等的重要細(xì)胞成分的最終流失，這些成分是細(xì)胞存活力所必需的。在細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點，細(xì)胞凋亡進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞破壞，細(xì)胞凋亡以一系列的逐步緩慢的細(xì)胞內(nèi)事件為特征，它不同于由諸如細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的細(xì)胞外物質(zhì)所引起或介導(dǎo)的壞死或快速細(xì)胞死亡的特征。所述破壞過程的全部或某些可能導(dǎo)致碎片和/或聚集物的形成，包括在藥物治療期間來自分解的CTC以及來自意外破壞的正常造血細(xì)胞的可染色的DNA，DNA片段和“DNA梯”結(jié)構(gòu)，因為大部分細(xì)胞毒性藥物是以接近毒性的劑量給藥的。
正如在WO00/47998，US6190870和其他文獻(xiàn)中所證實的，CTC可以作為活的和死亡的細(xì)胞循環(huán)，其中，“死的”包括整個受損的和片段化的細(xì)胞以及CTC衍生的碎片。腫瘤負(fù)擔(dān)最好可以通過包括細(xì)胞簇的完整CTC和具有細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征的受損的CTC的總數(shù)表示，不過有別于團(tuán)塊和/或聚集物。不過，某些受損的細(xì)胞，可能具有大的孔，使得液體和顆粒狀細(xì)胞質(zhì)成分能夠泄露，導(dǎo)致浮力密度產(chǎn)生大約1.06-1.08至超過1.12的改變，或遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過RBC的密度(根據(jù)Pharmacia方法，可以在d＝1.12和1.16的梯度界面上分離活的和死的細(xì)胞)。諸如在WO00/47998中所使用的常規(guī)密度梯度會將諸如受損的CTC丟失在密度大約為1.08-1.11的丟棄的RBC層中。能夠?qū)?xì)胞角蛋白陽性染色的CTC碎片也可能具有落入RBC范圍或更高范圍的密度，因為大部分細(xì)胞內(nèi)成分(有可能定位于靠近細(xì)胞質(zhì)——血塊黃層界面處的親脂性膜片段可能是例外)的密度為1.15-1.3。因此，受損的CTC和CTC碎片的主要部分可能位于血塊黃層之外，并且用密度梯度方法，如披露于WO00/47998中的方法無法看到。出現(xiàn)了受損的或片段化的CTC的某些圖象，不過很有可能是在細(xì)胞離心或隨后的處理期間所發(fā)生的損害，并因此是偽跡。盡管大部分完整腫瘤細(xì)胞的密度落在WBC區(qū)，患者樣品中的受損的CTC很有可能具有較高的密度，該密度使得它們處在RBC層；超出了梯度技術(shù)所能達(dá)到的范圍。
美國專利申請?zhí)?001/0024802披露了用于將片段和碎片結(jié)合在珠上的方法。所公開的申請披露了感興趣的片段和碎片的密度的多種可能性。在離心時，所述珠會定位于RBC上面的層，這是由于與片段和/或碎片偶聯(lián)的所述珠的預(yù)定的比重(密度)。不過，該系統(tǒng)取決于片段和碎片與所述珠的正確結(jié)合。如果任何其他樣品成分結(jié)合所述珠的話，這些珠就可能不出現(xiàn)在預(yù)定位置，并且隨后不會進(jìn)行分析。
起源組織中的上皮細(xì)胞會遵循已建立的生長和發(fā)育“規(guī)則”，所述規(guī)則包括群體控制。這意味著在正常場合下，細(xì)胞的數(shù)量和大小保持穩(wěn)定，并且只有在必要時才發(fā)生改變，以便生物體能正常生長和發(fā)育。只有上皮的基底細(xì)胞或永生化細(xì)胞會分裂，并且當(dāng)上皮發(fā)揮其功能必要的時候它們就會分裂，無論如何，它取決于上皮的性質(zhì)和位置。在某些異常而又良性場合下，細(xì)胞會增殖，并且基底層會比正常情況更快地分裂，導(dǎo)致增生。在某些其他異常的但是良性的場合下，細(xì)胞的體積會增加到超出特定組織的正常范圍，導(dǎo)致細(xì)胞巨大，如在葉酸缺陷中所出現(xiàn)的情況。
上皮組織同樣可以因為惡性前病變或惡性病變而導(dǎo)致細(xì)胞的大小或數(shù)量的增加。在這種情況下，類似于上文所述的改變伴隨著從輕度低級別上皮內(nèi)病變到嚴(yán)重惡性腫瘤的細(xì)胞核異常。人們相信，在所述細(xì)胞中的變化，可能影響上皮厚度的部分，并且隨著嚴(yán)重程度的提高，會包括所述上皮細(xì)胞的較厚的部分。所述細(xì)胞不遵循接觸抑制的限制，并且不受組織控制地持續(xù)生長。當(dāng)上皮的整個厚度受到惡性改變的影響時，這種狀況被確定為原位癌(CIS)。
所述惡性腫瘤細(xì)胞最終能夠通過基底膜，并隨著它的惡性潛力的增加侵入器官的基質(zhì)。在侵入基質(zhì)之后，所述細(xì)胞被認(rèn)為具有到達(dá)血管的潛力。一旦它們浸潤血管，細(xì)胞會發(fā)現(xiàn)它們處于完全不同于它們起源的環(huán)境中。
所述細(xì)胞能夠作為單細(xì)胞或作為兩個或兩個以上細(xì)胞的細(xì)胞簇浸潤血管。通過循環(huán)系統(tǒng)循環(huán)的來自上皮的單細(xì)胞，注定具有兩種后果中的一種。它可能死亡或者可能存活。
單細(xì)胞1.所述細(xì)胞可能由于內(nèi)在改變或細(xì)胞本身的信息而通過凋亡死亡。所述信息可能在進(jìn)入血管之前就已經(jīng)存在于所述細(xì)胞中，或者可以當(dāng)它們在血液中時接收，或者它可能因為宿主免疫系統(tǒng)的影響而死亡。所述宿主將這些細(xì)胞視為該環(huán)境的“異類”。細(xì)胞死亡的結(jié)果在CellSpotter中可以作為去核細(xì)胞、斑點狀細(xì)胞或不定型細(xì)胞識別。這種細(xì)胞不具備細(xì)胞分裂或建立集落或轉(zhuǎn)移腫瘤的潛力。
·去核細(xì)胞是細(xì)胞核分解和消失的結(jié)果(核破裂和核溶解)。它們是細(xì)胞角蛋白陽性的，和核酸陰性的。
·斑點狀細(xì)胞是細(xì)胞角蛋白和DAPI陽性的，并且表現(xiàn)出細(xì)胞降解和細(xì)胞質(zhì)分解的跡象。所述細(xì)胞對治療或宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)可能表現(xiàn)為細(xì)胞骨骼蛋白收縮。
·可以用CellSpotter識別的另一種死亡的腫瘤細(xì)胞是不定型細(xì)胞。這些細(xì)胞可能是在制備過程中受到損害的，表明這種細(xì)胞可能是更脆弱更精細(xì)的細(xì)胞，不過，還可能是細(xì)胞凋亡或免疫攻擊的結(jié)果。
2.活的惡性上皮細(xì)胞可能具有在循環(huán)中存活下來，并且在遠(yuǎn)處器官中形成集落的潛力。這些“存活細(xì)胞”在CellSpotter中以具有高的細(xì)胞核物質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)比例的完整細(xì)胞形式出現(xiàn)。所述細(xì)胞可能是未分化的，并且可以在血液中有效分裂，并且形成小的細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇可以在遠(yuǎn)處毛細(xì)血管中外滲，在這里，所述細(xì)胞可以建立新的集落，或者它可以保持作為單細(xì)胞，直到它外滲，一旦它在新組織中建立集落，它本身就開始分裂，以這種方式開始形成新的集落。
細(xì)胞簇正如B Brandt等所披露的，原發(fā)腫瘤可以脫落能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞簇(“從人類外周血中分離前列腺衍生的單細(xì)胞和細(xì)胞簇”Cancer Research 56 p4556-4561.1996)。所述細(xì)胞簇可以保持細(xì)胞簇狀態(tài)，并且侵入遠(yuǎn)處的組織，或者它們可能由于在血液中壓力的差別或免疫系統(tǒng)的干預(yù)而在循環(huán)系統(tǒng)中解離。如果所述細(xì)胞解離成單細(xì)胞的話，它們就會遵循上文結(jié)合單細(xì)胞所披露的兩種途徑之一(參見

圖1和2)。細(xì)胞簇的形成可能對存活有作用，通過用外部細(xì)胞作為屏障，所述屏障能保護(hù)內(nèi)部細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)攻擊。
一旦在新的器官中建立新的集落，某些惡性腫瘤細(xì)胞會繼續(xù)復(fù)制，以便形成新的腫瘤。如果它們到達(dá)新的毛細(xì)血管的話，腫瘤轉(zhuǎn)移的事件就會重復(fù)，并且出現(xiàn)繼發(fā)轉(zhuǎn)移。
對患已知癌的患者的治療進(jìn)行監(jiān)測腫瘤細(xì)胞數(shù)量的減少和/或反應(yīng)指數(shù)的提高可以代表對患者治療的反應(yīng)。
·總的腫瘤細(xì)胞＝死亡細(xì)胞+成活細(xì)胞(TTC＝DC+SC)·反應(yīng)指數(shù)＝死亡細(xì)胞/總的腫瘤細(xì)胞(RI＝DC/TTC)。
反應(yīng)指數(shù)越高，對治療的反應(yīng)就越好。低的反應(yīng)指數(shù)可能表明，患者對這種治療沒有反應(yīng)，和/或患者的免疫系統(tǒng)不能處理腫瘤負(fù)荷。
在治療前檢查時一共具有50個全部存活的腫瘤細(xì)胞的患者(RI＝0/50＝0)和在隨訪(治療之后)時具有50個TTC的患者，根據(jù)其RI可能具有不同的結(jié)局。如果所有的TTC是SC(即DC＝0)的話，對治療沒有反應(yīng)。如果有50個細(xì)胞，但反應(yīng)指數(shù)為40/50＝0.8的話，免疫系統(tǒng)或治療都對腫瘤負(fù)荷有負(fù)面影響，因此，是陽性患者反應(yīng)。
對患有已知前期惡性腫瘤的患者隨防中的確診當(dāng)巴氏涂片被診斷為具有帶有非典型或低級上皮內(nèi)病變的細(xì)胞時，總是存在這種可能性，即這些患者具有更嚴(yán)重的異常性，所述細(xì)胞被誤認(rèn)為是取樣誤差。可以對這些患者進(jìn)行陰道鏡檢查和生物活組織檢查，或要求它們在3個月以內(nèi)返回再次進(jìn)行巴氏涂片。如果所述非典型細(xì)胞與沒有進(jìn)行取樣的惡性腫瘤細(xì)胞的小的病灶同時出現(xiàn)的話，該患者要等待3個月時間再進(jìn)行隨訪。這可以解釋為什么某些前期惡性腫瘤似乎比其他腫瘤進(jìn)展的更快一些(由于取樣誤差導(dǎo)致的誤差，導(dǎo)致了統(tǒng)計學(xué)的不真實)。這些通常被解釋為更“具有侵入性的”前期惡性腫瘤。可以使用CellSpotter幫助確定這些患者。所有具有異常巴氏涂片的患者(在美國為5-10％的巴氏涂片)能夠馬上檢測循環(huán)的上皮細(xì)胞。具有陽性檢測結(jié)果的患者應(yīng)當(dāng)馬上進(jìn)行積極的隨防。具有陰性結(jié)果的患者可以等待3個月時間再次進(jìn)行巴氏涂片。這樣可以簡化醫(yī)生和保健專家進(jìn)行確診的過程，并且有助于患者信任她的隨防過程。
篩選可以使用CellSpotter成像分析篩選具有特定癥狀的總的群體，用特定的組織特異性抗體對所有異常樣品進(jìn)行二次檢測。CTC在患者體內(nèi)的確定可能表明存在業(yè)已啟動的原發(fā)性惡性腫瘤或者正在啟動轉(zhuǎn)移過程。如果所述細(xì)胞被確定為具有新的標(biāo)記的組織來源的話，就可以進(jìn)行器官特異性檢測，如CT導(dǎo)向的細(xì)針穿剌(FNA)證實所述惡性腫瘤的存在或缺乏。對于原發(fā)腫瘤無法確定的患者，隨后可以在建立個體基線之后重復(fù)檢測。
總之，上述因素的全部或某些能夠，并且被證實導(dǎo)致了碎片和/或聚集物的形成，業(yè)已發(fā)現(xiàn)它們的形成破壞了通過來自全血的直接富集方法對CTC的檢測，正如在本發(fā)明中所披露的。完整CTC，受損的或懷疑的CTC的數(shù)量以及CTC受損的程度可進(jìn)一步用作腫瘤負(fù)擔(dān)，腫瘤細(xì)胞的增殖潛力和/或治療效果的在診斷上重要的指標(biāo)。相反，現(xiàn)有技術(shù)的方法和方案將對CTC的不可避免的體內(nèi)損害與可以避免的體外儲存和加工損害組合在一起，從而產(chǎn)生了癌癥患者的CTC和腫瘤負(fù)擔(dān)的錯誤信息。最后，本文所披露的能夠以高的靈敏度和特異性起作用的本發(fā)明的相對簡單的血液測試可以被認(rèn)為是“整體活組織檢查”。
本發(fā)明的簡要說明本發(fā)明所披露的方法和試劑被用于分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞簇、片段和碎片。分析是通過多種平臺進(jìn)行的，包括流式細(xì)胞測定和CellSpotter熒光顯微術(shù)成像系統(tǒng)。實施例不僅證實了分析明顯的或完整的CTC的重要性，而且還證實了分析懷疑的CTC或受損的片段、CTC的簇和碎片的重要性?？梢阅M形成片段和碎片的損害。還可以通過使用穩(wěn)定劑抑制在抽血和樣品處理期間對CTC的進(jìn)一步破壞。
本發(fā)明業(yè)已證實了區(qū)分由標(biāo)本采集、運輸、儲存、加工或分析導(dǎo)致的體外損害和由細(xì)胞凋亡、壞死、患者免疫系統(tǒng)導(dǎo)致的體內(nèi)損害的能力。實際上，需要限制、減輕、消除、或者至少定性體外損害，以免這種損害干擾分析。
本文披露了根據(jù)循環(huán)的罕見細(xì)胞診斷、監(jiān)測、和篩選疾病的方法，包括通過CTC、細(xì)胞簇、片段和碎片確定的惡性腫瘤。還提供了使用所述方法分析生物學(xué)樣品的試劑盒。
附圖的簡要說明圖1腫瘤脫落和轉(zhuǎn)移模式。1a.表示細(xì)胞、細(xì)胞簇和片段的可能的階段。1b.表示具有來自樣品的實際圖象的同一種模型。
圖2-對來自7.5ml血液的免疫磁力富集的腫瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)。
圖3-來自轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的7.5ml血液樣品的CellSpotter分析，對所述樣品的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫磁力富集。短的線條相當(dāng)于用于染色過程的不同的染料，表示用細(xì)胞角蛋白PE(綠色)和DAPI(紫紅色)染色的腫瘤候選物。
圖4-從患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者的單一全血樣品中分離的腫瘤細(xì)胞的CellSpotter分類，所述細(xì)胞是用細(xì)胞角蛋白PE(綠色)和DAPI(紫紅色)染色的。
A-完整細(xì)胞B-受損的腫瘤細(xì)胞C-腫瘤細(xì)胞片段圖5-在20種臨床樣品中明顯的CTC與懷疑的CTC的數(shù)量的比較。
圖6-混入全血中，并且分離，然后用細(xì)胞角蛋白PE(綠色)和DAPI(紫紅色)染色的紫杉醇處理的LnCaP細(xì)胞的CellSpotter分類。
A-完整細(xì)胞B-死亡的腫瘤細(xì)胞C-腫瘤細(xì)胞片段本發(fā)明的詳細(xì)說明在本文中，使用了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的各種術(shù)語。這些術(shù)語要表達(dá)的含義不超出被公認(rèn)的含義。
列舉了癌患者體內(nèi)具有臨床意義的最低殘留疾病的證據(jù)。為了有效監(jiān)測最低殘留疾病，定性和定量評估是必要的。由于癌細(xì)胞在血液或骨髓中的出現(xiàn)頻率較低，在制備用于分析的樣品時涉及到的繁重的人工樣品制備方法，通常會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。為了克服這種局限性，開發(fā)了一種半自動化樣品制備系統(tǒng)，該系統(tǒng)降低了變異性，并且提供了更一致的結(jié)果，正如在申請日為2002年2月20日的共同未決美國專利申請?zhí)?0/081996中所披露的，該專利申請被收作本文參考。
有各種根據(jù)感興趣的物質(zhì)和靶物質(zhì)能特異性地與它結(jié)合的另一種物質(zhì)之間復(fù)合物的形成的、用于分析或分離上述靶物質(zhì)的方法可以利用。復(fù)合物與非結(jié)合材料的分離，可以通過重力實現(xiàn)，例如，通過沉降或通過與靶物質(zhì)結(jié)合的易碎的顆?；蛑殡x心?？梢允顾鲱w?；蛑榫哂写判?，以便有利于結(jié)合/釋放分離步驟。磁性顆粒為本領(lǐng)域所熟知，它們在免疫和其他生物特異性親和反應(yīng)中的應(yīng)用同樣為本領(lǐng)域所熟知。一般，能促進(jìn)磁力或重力分離的任何材料都可用于這一目的。不過，很顯然磁力分離方式是選擇的方法。
磁性顆?？梢愿鶕?jù)大小分類大的(1.5-大約50微米)，小的(0.7-1.5微米)，或膠體(＜200nm)，它又被稱為納米顆粒。納米顆粒又被稱為鐵流體或鐵流體樣材料，它具有典型鐵流體的多種特征，并且在本文中有時候被稱為膠體，超磁性顆粒。
上述類型的小的磁性顆粒在涉及生物特異性親和反應(yīng)的分析中是十分有用的，因為它們可以用生物功能性聚合物(例如蛋白)方便地包衣，提供非常高的表面積，并且提供合理的反應(yīng)動力學(xué)。在以下專利文獻(xiàn)中業(yè)已披露了0.7-1.5微米的磁性顆粒，例如，這些專利包括美國專利3,970,518；4,018,886；4,230,685；4,267,234；4,452,773；4,554,088；和4,659,678。業(yè)已披露上述某些顆?？捎米髅庖邔W(xué)試劑的固體支持物。
進(jìn)行磁分離的效力以及磁標(biāo)記細(xì)胞的回收和純度取決于多種因素，這些因素包括·被分離的細(xì)胞的數(shù)量，·所述細(xì)胞的受體或表位密度，·每個細(xì)胞的磁負(fù)荷，
·磁性材料的非特異性結(jié)合(NFB)，·捕獲的非靶細(xì)胞的攜帶，·所采用的技術(shù)，·血管的性質(zhì)，·血管表面的性質(zhì)，·介質(zhì)的粘度，·所采用的磁分離裝置。
如果一種系統(tǒng)的非特異性結(jié)合水平是基本上穩(wěn)定的話，這是通常出現(xiàn)的情況，隨著目標(biāo)群體的降低，純度也會降低。
不太明顯的是以下事實靶細(xì)胞的群體越小，對它進(jìn)行磁標(biāo)記和回收就會越困難。另外，標(biāo)記和回收在很大程度上取決于所采用的磁性顆粒的性質(zhì)。例如，當(dāng)細(xì)胞與諸如Dynal珠的大的磁性顆粒一起溫育時，細(xì)胞是通過由所述系統(tǒng)的混合所產(chǎn)生的碰撞進(jìn)行標(biāo)記的，因為所述珠太大，以至于不能有效擴(kuò)散。因此，如果細(xì)胞以每毫升血液1個細(xì)胞的頻率或更低的頻率出現(xiàn)在群體中的話，在極早期癌癥中的腫瘤細(xì)胞可能就是這種情況，標(biāo)記靶細(xì)胞的可能性與添加到該系統(tǒng)中的磁性顆粒的數(shù)量和混合的時間長度相關(guān)。由于將細(xì)胞與所述顆粒長時間混合是有害的，有必要盡可能地提高顆粒的濃度。不過，可以添加的磁性顆粒的數(shù)量是受限制的，因為在分離時人們可能用與其他血細(xì)胞混合的罕見細(xì)胞，取代與大量磁性顆?；旌系暮币娂?xì)胞。后一種情況不會明顯提高統(tǒng)計感興趣的細(xì)胞數(shù)量或?qū)@些細(xì)胞進(jìn)行檢查的能力。
用于實施本發(fā)明的優(yōu)選的磁性顆粒是具有膠體性質(zhì)的顆粒。所述顆粒以它們的亞微米粒度為特征，所述粒度通常小于大約200納米，并且以它們的可以長時間從溶液中重力分離的穩(wěn)定性為特征。除了很多其他優(yōu)點之外，這種顆粒大小使得各個顆?；旧蠠o法通過常用于細(xì)胞分析的分析技術(shù)觀察到。大小為90-150納米，并且具有70-90％磁質(zhì)量的顆粒可用于本發(fā)明中。合適的磁性顆粒包括超強磁性材料的晶體核心，該核心周圍由結(jié)合，例如物理吸附或共價連接在磁性合金上的分子包圍，由此產(chǎn)生穩(wěn)定化膠體特性。所述包衣材料優(yōu)選以能有效防止存在于樣品中的生物學(xué)大分子和磁性核心之間的非特異性相互作用的量使用。所述生物學(xué)大分子可以包括碳水化合物，如非靶細(xì)胞表面上的唾液酸殘基，凝集素，糖蛋白，和其他膜成分。另外，所述材料應(yīng)當(dāng)在每個納米顆粒上包含盡可能多的磁質(zhì)量。構(gòu)成所述合金的磁晶體的尺寸，小到足以使它們不包含完整的磁疇。納米顆粒的大小足夠小，以便它們的Brownian能超過它們的磁矩。其結(jié)果是，即使是在適當(dāng)強度的磁場中，所述膠體磁性顆粒的北極、南極排列，以及隨后的相互吸引/排斥似乎都不會發(fā)生，這是由于它們的溶液穩(wěn)定性。最后，磁性顆粒應(yīng)當(dāng)可以在高磁場梯度外磁場分離器中分離。以上特征有利于樣品控制，并且提供超過裝有磁鐵珠或鋼絲棉的更復(fù)雜的內(nèi)部梯度柱的分析優(yōu)點。具有上述特性的磁性顆?？梢酝ㄟ^改進(jìn)披露于美國專利4,795,698，5,597,531，和5,698,27中的基礎(chǔ)材料而制備，以上每一份專利都被收作本文參考。
在美國專利5,698,271中披露了一種用于制備顆粒的改進(jìn)方法。所述材料是在′531號專利中所披露的材料的改進(jìn)形式，其中，所述方法包括一個高溫包衣步驟，該步驟能顯著提高包衣水平。例如，通過該方法用牛血清白蛋白(BSA)包衣制備的納米顆粒與′531號專利中的DC-BSA材料相比，非特異性結(jié)合特征降低了3-5倍。業(yè)已證實，這種非特異性結(jié)合的減弱，直接是由于BSA包衣材料的水平的增加。在對所述納米顆粒進(jìn)行處理以便除去BSA包衣時，非特異性結(jié)合又恢復(fù)到高水平。因此可以確定在氧化鐵分子晶體上包衣的BSA的量和細(xì)胞的非特異性結(jié)合之間存在直接的相關(guān)性。通常，來自全血的細(xì)胞與所述顆粒的非特異性結(jié)合為0.3％，這一結(jié)果顯著好于′531號專利所產(chǎn)生的結(jié)果。因此，在10毫升全血中有大約200,000非靶細(xì)胞，這些細(xì)胞同樣可以與用于富集的細(xì)胞一起分離。
由于小的納米顆粒(30-70nm)能更容易地擴(kuò)散，與它們的較大的對應(yīng)體相比，小的顆粒能優(yōu)先標(biāo)記細(xì)胞。在使用極高的梯度時，如在內(nèi)部梯度柱中，無論其大小如何，所述材料的性能僅產(chǎn)生很小的差別。另一方面，在使用外部梯度時，或具有小于能夠在微型珠或鋼絲棉柱上產(chǎn)生的梯度時，小的納米顆粒占據(jù)細(xì)胞表面具有顯著作用。這種結(jié)果是通過分級分離DC納米顆粒，并且研究對回收的影響時所得出的結(jié)論。根據(jù)以上研究和其他優(yōu)化實驗，建立了用于通過磁力或柱分級分離納米顆粒的方法，其中，可以制備基礎(chǔ)包衣的磁性顆粒，這些顆粒缺少過分小的或過分大的納米顆粒。例如，可以生產(chǎn)平均直徑為100納米的基礎(chǔ)包衣的顆粒，這種顆粒最好含有微量小于80納米或超過130納米的材料。同樣可以制備大約為120納米的材料，這些材料沒有明顯的小于90-95納米和超過160納米的材料。所述材料在回收方面具有最佳性能，并且在含有60-70納米的納米顆粒時具有次佳性能。對于基礎(chǔ)包衣的磁性顆粒，例如BSA-包衣的磁性顆粒來說，用于實施本發(fā)明的優(yōu)選粒度范圍為90-150納米。
根據(jù)以上說明，采用具有強磁性、低非特異性結(jié)合，膠體磁性顆粒的外部磁場裝置進(jìn)行的高梯度磁力分離，是被選擇用于從真核細(xì)胞的混合群體中分離感興趣的細(xì)胞亞型的方法，特別是如果所述感興趣的亞型包括整個群體的一小部分的話。由于它們的擴(kuò)散特性，所述材料能方便地尋找并且磁力標(biāo)記罕見事件，如血液中的腫瘤細(xì)胞。為了成功地磁力分離用于分析的腫瘤細(xì)胞，所述磁顆粒必須對不存在于造血細(xì)胞上的表位有特異性。
有多種分析方法和標(biāo)準(zhǔn)被用于鑒定腫瘤細(xì)胞，首先要使通過免疫細(xì)胞化學(xué)確定何種成分構(gòu)成腫瘤細(xì)胞的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化。在本研究中，對來自前列腺癌患者的血液樣品中的能表達(dá)EpCAM的細(xì)胞進(jìn)行免疫磁富集。通過多色熒光分析，根據(jù)細(xì)胞骨骼蛋白細(xì)胞角蛋白(CK+)的表達(dá)，常見白細(xì)胞抗原CD45(CD45-)的缺乏和核酸的存在(NA+)識別腫瘤細(xì)胞?？梢酝ㄟ^流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微技術(shù)對罕見事件或罕見細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析。流式細(xì)胞術(shù)分析的優(yōu)點是它的可再現(xiàn)地定量即使是低水平的熒光的能力，而顯微技術(shù)具有更好的特異性，因為形態(tài)學(xué)特征可能有助于對免疫表型分類識別的目標(biāo)進(jìn)行分類。盡管通過流式細(xì)胞術(shù)和顯微技術(shù)在前列腺癌的患者的血液中檢測到的CTC的數(shù)量之間存在相關(guān)性，對CK+，CD45-，NA+目標(biāo)進(jìn)行的顯微檢查發(fā)現(xiàn)，只有很少的目標(biāo)是以完整細(xì)胞形式出現(xiàn)的。這一觀察與在大部分循環(huán)腫瘤細(xì)胞中證實細(xì)胞凋亡的其他報導(dǎo)吻合。
術(shù)語“生物學(xué)標(biāo)本”或“生物學(xué)樣品”可以交互使用，并且表示從被懷疑含有感興趣的細(xì)胞的人類待測對象體內(nèi)采集的要分析的少量液體或組織。生物學(xué)標(biāo)本表示流體或細(xì)胞部分，和含有可溶性物質(zhì)的部分。生物學(xué)標(biāo)本或生物學(xué)樣品包括，但不局限于體液，如外周血液，組織勻漿物，乳頭吸出物，結(jié)腸灌洗液，唾液，支氣管(肺泡)灌洗液，胸膜液，腹膜液，心包液，尿液以及可以從人類待測對象體內(nèi)獲得的任何其他細(xì)胞來源。典型的組織勻漿物可以從乳腺癌患者的前哨結(jié)中獲得。
在本文中術(shù)語“罕見細(xì)胞”被定義為正常情況下不存在于生物學(xué)標(biāo)本中的細(xì)胞，但是可以作為異常狀況，如感染性疾病，慢性病，損害，或妊娠的指標(biāo)出現(xiàn)。罕見細(xì)胞還表示可能正常存在于生物學(xué)樣品中的細(xì)胞，但是它出現(xiàn)的頻率比通常存在于正常生物學(xué)標(biāo)本中的細(xì)胞的出現(xiàn)頻率低若干個數(shù)量級。
術(shù)語“決定簇”在用于表示上述目標(biāo)生物實體時，廣義地表示存在于通常會誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的大分子抗原上的化學(xué)嵌合體。決定簇也可以與“表位”交互使用。在本文中交互使用的“生物特異性配體”或“生物特異性試劑”能夠特異性結(jié)合決定簇。決定簇表示參與并且負(fù)責(zé)與特異性結(jié)合物質(zhì)(如配體或試劑)選擇性結(jié)合的目標(biāo)生物實體部分，該部分的存在，是發(fā)生選擇性結(jié)合所必須的。在基礎(chǔ)術(shù)語中，決定簇是目標(biāo)生物實體上的分子接觸區(qū)，它們是由在特異性結(jié)合對反應(yīng)中具有它們的結(jié)合親和力的因子、配體和/或試劑識別的。
在本文中所使用的術(shù)語“特異性結(jié)合對”包括抗原-抗體，受體-激素，受體-配體，激動劑-拮抗劑，凝集素-碳水化合物，核酸(RNA或DNA)雜交序列，F(xiàn)c受體或小鼠IgG-蛋白A，親和素-生物素，鏈親和素-生物素和病毒-受體相互作用。
術(shù)語“可檢測標(biāo)記”在本文中被用于表示通過物理或化學(xué)方法直接或間接對它進(jìn)行的檢測或測定可以作為目標(biāo)生物實體在檢測樣品中的存在的指標(biāo)的任何物質(zhì)。有用的可檢測標(biāo)記的代表性例子包括，但不局限于以下物質(zhì)可以根據(jù)光吸收、熒光、反射、光散射、磷光或發(fā)光特性直接或間接檢測的分子或離子；可以通過其放射特性檢測的分子或離子；可以通過其核磁共振或順磁特性檢測的分子或離子。例如，可以根據(jù)光吸收或熒光間接檢測的分子類型包括各種酶，這些酶能導(dǎo)致合適的底物轉(zhuǎn)化(例如，由非吸光分子轉(zhuǎn)化成吸光分子，或從非熒光分子轉(zhuǎn)化成熒光分子)。分析可以用多種常見平臺中的任意一種進(jìn)行，包括多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析，CellSpotter分析，CellTracksTM分析，和自動化細(xì)胞分析。
短語“基本上排除”表示生物特異性配體或生物特異性試劑及其相應(yīng)的靶決定簇之間的結(jié)合反應(yīng)的特異性。對它們的靶決定簇具有特異性結(jié)合活性的生物特異性配體和試劑也可能具有對其他樣品成分的低水平的非特異性結(jié)合。
短語“早期癌癥”在本文中與“I期”或“II期”癌癥交互使用，并且是指業(yè)已在臨床上確診為器官局限性的癌癥。還包括小到不能夠通過常規(guī)方法檢測的腫瘤，如用于乳腺癌患者的乳房X光照相法，或用于肺癌患者的X射線。盡管乳房X光照相法可用于檢測具有大約2×108個細(xì)胞的腫瘤，本發(fā)明的方法應(yīng)當(dāng)能夠從接近這一大小或更小的腫瘤中檢測循環(huán)的癌細(xì)胞。
本文所使用的術(shù)語“富集”表示與原始生物學(xué)樣品中的比例相比，明顯提高加工的分析樣品中目標(biāo)生物實體(例如腫瘤細(xì)胞)與非目標(biāo)材料的比例的過程。在外周血被用作原材料的場合下，在評估富集程度時不考慮紅細(xì)胞。采用本發(fā)明的方法，可以使循環(huán)的上皮細(xì)胞相對白細(xì)胞富集到至少2500倍的程度，更優(yōu)選5000倍，最優(yōu)選10000倍。
術(shù)語“抗凝”或“抗凝劑”可以交互使用，并且表示為了抑制任何不希望的天然或人工凝固而添加到生物學(xué)標(biāo)本中的組分。凝固的一種例子是凝血，并且，常見的抗凝劑是螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基環(huán)己烷四乙酸(DCTA)，亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸(EGTA)，或者采用配合劑，如肝素，和肝素類，如硫酸肝素和低分子量肝素。另外，可將其總體上限定為“成團(tuán)”或“團(tuán)塊形成”。不過，所述團(tuán)塊必須與CTC的“簇”或聚集物區(qū)分開，后者如果滿足完整CTC的分類標(biāo)準(zhǔn)的話，就作為單個完整的CTC統(tǒng)計。
人們認(rèn)為CTC簇比單個CTC具有更強的增殖潛力，并且它們的存在因此被認(rèn)為在診斷上具有很大價值。具有建立繼發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤部位的增加傾向性的一種可能的原因可能是因為它們的粘附性。一種甚至更可能的原因是CTC簇的實際大小。較大的簇將會定居在小直徑的毛細(xì)管或骨骼上的孔中。一旦定居在這里，簇中的細(xì)胞的存活力將決定其在新的轉(zhuǎn)移部位的存活機(jī)會。
本文所定義的理想的“穩(wěn)定劑”或“防腐劑”(本文可交互使用)是能夠保存存在于生物學(xué)樣品中的感興趣的細(xì)胞，同時減少所述生物學(xué)標(biāo)本中干擾性聚集物和細(xì)胞碎片的組合物，無論如何它都會妨礙靶細(xì)胞的分離、檢測和統(tǒng)計，以及靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的分辨。換句話說，在與抗凝劑組合時，穩(wěn)定劑應(yīng)當(dāng)不會抵消抗凝劑的性能。相反，抗凝劑應(yīng)當(dāng)不會干擾穩(wěn)定劑的性能。另外，所披露的穩(wěn)定劑還發(fā)揮第三種固定作用，并因此穩(wěn)定透化細(xì)胞，其中，術(shù)語“透化的”或“透化”和“固定”，“固定的”或“固定化”是以細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)定義使用的。在本文中，穩(wěn)定劑的說明表示這種制劑是以適當(dāng)?shù)臐舛然蛴昧渴褂玫?，這種用量對細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的，其中，所述濃度或用量能有效穩(wěn)定靶細(xì)胞，而又不會導(dǎo)致破壞。人們將本發(fā)明的組合物，方法和裝置用于保護(hù)罕見細(xì)胞，顯然不會將它們用于損害或破壞所述罕見細(xì)胞，因此，自然會選擇合適的濃度或用量。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)甲醛供體咪唑烷基脲在占所述標(biāo)本體積的0.1-10％，更優(yōu)選0.5-5％，最優(yōu)選大約1-3％的濃度下是有效的。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，另一種制劑如聚乙二醇在以占樣品體積的大約0.1％-大約5％，更優(yōu)選大約0.1％-大約1％，最優(yōu)選0.1％-大約0.5％的優(yōu)選濃度下是有效的。
穩(wěn)定劑必須能夠?qū)悠繁４嬷辽贁?shù)小時。不過，業(yè)已證實，可以將樣品穩(wěn)定至少72小時。當(dāng)所述樣品是從遠(yuǎn)離要進(jìn)行加工和分析的場所獲得的時候，這種長期的穩(wěn)定性是重要的。另外，所述樣品針對運輸期間的機(jī)械損害必須是穩(wěn)定的。
穩(wěn)定劑必須能區(qū)分體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分解和由于體外樣品降解所導(dǎo)致的分解。因此，在題為“用于分析的細(xì)胞和生物學(xué)標(biāo)本的穩(wěn)定化”的共同未決申請中披露了穩(wěn)定制劑組合物，及其使用方法和裝置。所述共同擁有的專利被收作本文參考。
術(shù)語“明顯的細(xì)胞”或“完整細(xì)胞”可以交互使用，并且表示在成像分析期間發(fā)現(xiàn)的含有核酸和細(xì)胞角蛋白的細(xì)胞。所述細(xì)胞通?？瓷先ナ菆A形的或者是橢圓形的，不過有時候也可以是多角形的或長形的，并且是以單細(xì)胞或細(xì)胞簇形式出現(xiàn)。核酸面積(即通過核酸染料標(biāo)記的)小于細(xì)胞質(zhì)面積(即通過抗細(xì)胞角蛋白標(biāo)記的)，并且是由細(xì)胞質(zhì)面積包圍的。
術(shù)語“可疑的細(xì)胞”或“懷疑的細(xì)胞”或“片段”可以交互使用，并且表示在成像分析期間發(fā)現(xiàn)的類似完整細(xì)胞的細(xì)胞，但是看上去不同于是完整的細(xì)胞。根據(jù)成像分析，存在多種可能類型的懷疑的細(xì)胞，包括
1.去核細(xì)胞，它們的形狀類似明顯的細(xì)胞，對細(xì)胞角蛋白的染色呈陽性，但對核酸的染色呈陰性；2.斑點狀或小斑點狀細(xì)胞，它們的核酸染色呈陽性，但是具有不規(guī)則染色的細(xì)胞角蛋白；和3.不定型細(xì)胞，這種細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白和核酸染色都呈陽性，但是在形狀上不規(guī)則，或者異常大。
所述可疑的細(xì)胞是本發(fā)明所感興趣的，因為它們能提供有關(guān)CTC性質(zhì)以及患者疾病的額外信息。染色或成像偽跡有可能在分析期間出現(xiàn)。例如，去核細(xì)胞有時候表現(xiàn)出具有“影子”區(qū)，其中細(xì)胞核已經(jīng)染色，但是相應(yīng)的區(qū)域是核酸陰性的。這可能是因為多種外部因素所導(dǎo)致的，包括標(biāo)記或成像技術(shù)。另外，業(yè)已觀察到了具有“脫離的”細(xì)胞核的細(xì)胞。盡管這可能表明一種細(xì)胞釋放了它的細(xì)胞核，但更有可能是由于成像系統(tǒng)的偽跡所造成的。不過，所述“偽跡”在實際上提供了有關(guān)完整細(xì)胞有可能發(fā)生的有價值的信息。因此，作為本發(fā)明的一部分，將對懷疑的細(xì)胞作更充分的分析。
細(xì)胞片段與“碎片”的差別在于，碎片不一定與細(xì)胞類似。本文所使用的術(shù)語碎片表示在加工期間特異性或非特異性標(biāo)記的未分類的物體，并且在分析期間，作為圖象是可見的，但是與完整細(xì)胞和/或懷疑的細(xì)胞不同。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，受損的細(xì)胞會釋放核物質(zhì)。在加工期間，這些核物質(zhì)會受到非特異性的磁標(biāo)記，并且隨后被核酸染料標(biāo)記。在分析期間，當(dāng)它具有仍然附著的細(xì)胞角蛋白時，可以觀察到磁標(biāo)記的和染色的核物質(zhì)。在分析期間出現(xiàn)的同樣被磁力選擇和染色的其他物體被歸類為碎片。
本文所使用的術(shù)語“形態(tài)學(xué)分析”表示一種物體的可用眼觀察到的特征，如大小、形狀、或某些特征的存在/缺乏。為了觀察形狀學(xué)特征，通常對物體進(jìn)行非特異性染色。本文所使用的術(shù)語“表位分析”表示對業(yè)已對某些表位進(jìn)行過標(biāo)記的物體進(jìn)行的觀察。為了觀察表位特征，通常要對一種物體進(jìn)行特異性染色或標(biāo)記?？梢詫⑿螒B(tài)學(xué)分析和表位分析組合使用，以便提供對物體的更全面的分析。
當(dāng)片段和碎片通常被歸類為“不確定事件”或“未確定事件”時，進(jìn)一步視覺觀察的重要性是顯而易見的。以上術(shù)語來自非視覺分析，如通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的分析。因為流式細(xì)胞術(shù)不對物體進(jìn)行成像，不屬于符合靶細(xì)胞或非靶細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的特定群體的任何事件(在對非特異性攜帶的WBC進(jìn)行陰性標(biāo)記時就是這種情況)，都將不屬于所述群體。不過，通過本說明書可以看出，上述不確定事件是重要的。
圖1是各種CTC階段的模型，包括脫落和轉(zhuǎn)移。圖1a表示細(xì)胞、細(xì)胞簇、片段和碎片的所述階段。圖1b表示來自相同階段的樣品的實際圖象。細(xì)胞簇、片段和碎片的圖象來自對患者樣品的CellSpotter分析。組織樣品的圖象(來源和轉(zhuǎn)移部位)來自其他部位(Manual ofCytology，American Society of Clinical Pathologists Press.1983)。
簡單地講，從原發(fā)性腫瘤脫落到血液中的單細(xì)胞要么在血液中存活，要么死亡。如果它存活的話，它有可能在血液中分裂，或者定居在第二部位。如果所述細(xì)胞死亡的話，根據(jù)所使用的方法，所述細(xì)胞會降解成各種類型的片段或碎片。另一種可能性是，細(xì)胞簇從原發(fā)性腫瘤中脫落到血液中，在這里，這些細(xì)胞解離成單細(xì)胞，或保持完整，并且定居在第二部位。如果細(xì)胞簇解離的話，其行為可能類似于上述單細(xì)胞的行為，如果細(xì)胞簇保持完整的話，它更有可能由于上述原因而形成第二集落，包括大直徑的細(xì)胞簇定居在小直徑的毛細(xì)血管中。一旦定居，如果所述細(xì)胞是活細(xì)胞的話，所述細(xì)胞簇就會形成新的腫瘤。
片段和碎片與極少完整細(xì)胞的出現(xiàn)意味著存在很小的轉(zhuǎn)移幾率片段化的細(xì)胞將不能分裂，并且不能形成繼發(fā)腫瘤。實際上，只有完整的CTC或可能的CTC細(xì)胞簇能夠在第二部位定居。鑒定在粘附和穿透過程中起作用的抗原，將會有所幫助。隨訪并且評估有和沒有細(xì)胞簇的患者的轉(zhuǎn)移部位，也可能提供進(jìn)一步的信息。將核形態(tài)學(xué)用于確定細(xì)胞的活性狀態(tài)和異常性。染色質(zhì)成團(tuán)，細(xì)胞核的存在或缺乏，以及染色質(zhì)過多，是用于確定一種細(xì)胞是良性的或惡性的，對免疫應(yīng)答起反應(yīng)或?qū)χ委熎鸱磻?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。用細(xì)胞質(zhì)形態(tài)學(xué)確定分化水平(即起源組織)。例如，細(xì)胞質(zhì)形態(tài)學(xué)可以將細(xì)胞歸類為鱗狀細(xì)胞和腺細(xì)胞。
在抽血和隨后的標(biāo)本處理期間，出現(xiàn)在外周循環(huán)系統(tǒng)中的存活的受到破壞的腫瘤細(xì)胞，可能受到進(jìn)一步脅迫，并且在將血液抽入空試管期間可以被紊流和樣品處理所破壞，例如，在分析之前進(jìn)行的血液試管的轉(zhuǎn)運和混合。除了所述機(jī)械損害之外，還有在體外以時間依賴形式發(fā)生的導(dǎo)致CTC破壞的持續(xù)的免疫學(xué)、細(xì)胞凋亡和壞死過程。我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本保存的時間越長，CTC的損失越多，并且干擾性碎片和/或聚集物的量越大。實際上，在本說明書中提供的數(shù)據(jù)(圖2和3)表明了CTC數(shù)量在室溫下保存24小時或更長時間的若干血液標(biāo)本中的急劇下降，表明在抽血之后CTC的顯著體外破壞。盡管造血細(xì)胞的喪失是眾所周知的現(xiàn)象，并且是上文所引用的Streck Labs專利和其他專利的主題，由于混合和運輸所導(dǎo)致的機(jī)械損害的出現(xiàn)，迄今為止尚沒有被認(rèn)為是導(dǎo)致CTC或罕見細(xì)胞喪失的因素。細(xì)胞碎片的形成以及所積累的碎片和/或聚集物對CTC或其他罕見細(xì)胞的分析的干擾作用，迄今為止同樣沒有被認(rèn)識到。在高敏感性富集測定中最明顯和最成問題的是需要處理相對大的血液體積(5-50毫升)，并且在體積減少(少于1毫升)之后，隨后進(jìn)行靶細(xì)胞的顯微鏡檢查或成像。所述碎片要么在正常情況下看不到，要么不會干擾常規(guī)非富集分析，例如，通過流式細(xì)胞術(shù)或通過粒度梯度方法的富集。
為了說明出現(xiàn)在患者體內(nèi)的受損的上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞片段是否是由通過層析誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的凋亡所導(dǎo)致的，開發(fā)了一種模擬腫瘤細(xì)胞死亡的模型。在有或沒有紫杉醇的條件下培養(yǎng)前列腺細(xì)胞系LnCaP的細(xì)胞，并且混入健康供體的血液中。通過CellSpotter分析的紫杉醇處理的樣品的免疫磁選擇的細(xì)胞，類似于在患者血液樣品中觀察到的細(xì)胞。用紫杉醇處理過的細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的跡象。所述細(xì)胞的小斑點狀細(xì)胞角蛋白染色模式，似乎與細(xì)胞骨骼蛋白的塌陷相應(yīng)(圖4B和6B)。由紫杉醇的微管穩(wěn)定作用所導(dǎo)致的系列事件的起始事件，又能激活感受細(xì)胞骨骼壓力的促細(xì)胞凋亡基因Bim。用識別細(xì)胞角蛋白18的表位的M30細(xì)胞死亡抗體(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)獲得了來自細(xì)胞凋亡的caspase-裂解的細(xì)胞角蛋白的其他證據(jù)。所述表位只有在細(xì)胞凋亡的早期，在caspase裂解之后才暴露。只有紫杉醇處理過的LnCaP被M30染色，而大部分二聚體細(xì)胞角蛋白細(xì)胞能被M30染色，這一結(jié)果與進(jìn)行凋亡的細(xì)胞吻合。
應(yīng)當(dāng)指出的是，可以將多種不同的細(xì)胞分析平臺用于鑒定和統(tǒng)計富集樣品中的細(xì)胞。所述分析平臺的例子是Immunicon′sCellSpotter系統(tǒng)。一種磁力細(xì)胞固定和分析系統(tǒng)，通過顯微鏡檢測人工觀察在例II中披露的細(xì)胞，以及CellTracksTM系統(tǒng)，一種更先進(jìn)的自動化光學(xué)掃描系統(tǒng)。這兩種分析平臺披露于美國專利5,876,593；5,985,153和6,136,182中，以上每一份專利都被收作本文參考，它們披露用于手工或自動定量和定性細(xì)胞分析的相應(yīng)裝置和方法。
其他分析平臺包括激光掃描細(xì)胞計量術(shù)(Compucyte)，明視野基成像分析(Chromavision)，和毛細(xì)容量分析(Biometric Imaging)。
用本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的方法和組合物進(jìn)行的血液中循環(huán)上皮細(xì)胞的統(tǒng)計是這樣進(jìn)行的從血液中免疫磁選擇(富集)上皮細(xì)胞，然后分析樣品。免疫磁力樣品制備對縮小樣品體積來說是重要的，并且獲得了對靶細(xì)胞(上皮細(xì)胞)高達(dá)104倍的富集。對用于多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析的試劑進(jìn)行優(yōu)化，以便將上皮細(xì)胞定位于多維空間中的獨特位置上，所述空間是通過兩種光線散射和三種熒光參數(shù)的列表模式獲取產(chǎn)生的。其中包括1.抗全-白細(xì)胞抗原CD45的抗體，用于鑒定白細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞)；2.細(xì)胞類型特異性或核酸染料，它可以排除殘余的紅血細(xì)胞，血小板和其他非去核事件；和3.生物特異性試劑或抗細(xì)胞角蛋白的抗體或具有對EpCAM表位的特異性的抗體，該抗體與用于免疫磁選擇所述細(xì)胞的抗體不同。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，分析所富集的腫瘤細(xì)胞群的方法取決于本發(fā)明的預(yù)期用途。例如，正如下文所披露的，在篩選癌癥或監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)時，循環(huán)上皮細(xì)胞的數(shù)量可能非常少。由于存在某些“正?！彼降纳掀ぜ?xì)胞(極有可能是在血管穿剌期間導(dǎo)入的)，能夠識別上皮細(xì)胞是正常的或是腫瘤細(xì)胞的分析方法是理想的。在這種情況下，以顯微技術(shù)為基礎(chǔ)的分析將將被證明是最精確的。所述檢測可能還包括形態(tài)學(xué)檢查，對已知腫瘤因素相關(guān)分子(例如致癌基因)的鑒定。
患者患者的年齡范圍為47-91歲(平均74歲)，是在研究之前2-10年首次診斷的。查看了治療和階段的醫(yī)學(xué)記錄?；颊吆徒】抵驹刚咴谝豁椗鷾?zhǔn)的研究中簽署了知情同意書。將血液抽入10毫升EDTAVacutainerTM試管(Becton-Dickinson，NJ)中。樣品在室溫下保存，并且在采集之后6小時之內(nèi)處理，除非另有說明。
樣品制備將用能識別上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的單克隆抗體標(biāo)記的磁性納米顆粒用于標(biāo)記，并且通過磁力裝置從造血細(xì)胞中分離上皮細(xì)胞，如在共同擁有的美國專利6,365,362，和申請日為2002年2月19日的美國專利申請?zhí)?0/079,939中所披露的，以上兩份美國專利文獻(xiàn)都被全文收作本文參考。重新懸浮在200微升體積中的磁力捕獲的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，以便區(qū)分造血細(xì)胞和上皮細(xì)胞。將與藻紅蛋白(CK-PE)偶聯(lián)的能識別角蛋白4，5，6，8，10，13，和18的單克隆抗體用于鑒定上皮細(xì)胞，并且將能識別CD45的單克隆抗體用于鑒定白細(xì)胞，并且鑒定與細(xì)胞角蛋白非特異性地結(jié)合的造血細(xì)胞。
為了進(jìn)行多色熒光顯微術(shù)(CellSpotter)分析，將CD45與別藻蘭蛋白偶聯(lián)(CD45-APC，Caltag，CA)，而為了進(jìn)行流式細(xì)胞分析，使用peridinin葉綠素蛋白偶聯(lián)的CD45(CD45-PerCP，BDIS SanJose，CA)。將核酸特異性染料DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)用于在CellSpotter系統(tǒng)中鑒定和觀察細(xì)胞核，并且將Procount系統(tǒng)(BDIS，San Jose，CA)中的核酸染料用于通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞。在溫育之后，將多余的染色劑吸出，并且重新懸浮捕獲的細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)移到12×75毫米的試管中，以便進(jìn)行流式細(xì)胞分析，或轉(zhuǎn)移到CellSpottere分析室中(如在被收作本文參考的申請日為2002年2月12日的美國專利申請10/074,900中所披露的)，所述分析室裝有磁力配合組件，由它們將所述分析室保持在兩塊磁鐵之間(Captivate，Molecular Probes，OR)。
實施例1通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行樣品分析在裝有488nm氬離子激光(BDIS，San Jose，CA)的FACSCalibur流式細(xì)胞計上分析樣品。數(shù)據(jù)獲取是通過CellQuest(BDIS，San Jose，CA)進(jìn)行的，將一個閾值用在核酸染料的熒光上。在對8000個珠或80％的樣品進(jìn)行分析之后終止數(shù)據(jù)的獲取。對列表模式的數(shù)據(jù)進(jìn)行多參數(shù)數(shù)據(jù)分析(Paint-A-GatePro，BDIS，San Jose，CA)。CTC事件的分析標(biāo)準(zhǔn)包括由正向光散射所確定的大小，由正交光散射所確定的顆粒性，用PE-標(biāo)記的抗細(xì)胞角蛋白的Mab進(jìn)行的陽性染色和用PerCP-標(biāo)記的抗-CD45 Mab的不染色。對每一種樣品來說，將出現(xiàn)在上皮細(xì)胞的典型區(qū)中的事件的數(shù)量乘以1.25，以便計算出沒有通過流式細(xì)胞術(shù)分析的樣品體積。
圖2中的圖片A，B和C表示患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者的血液樣品的流式細(xì)胞計分析。圖片B中的兩條垂直線表示白細(xì)胞(紅色斑點)的核酸(NAD)的下限和上限含量。CTC候選物能表達(dá)細(xì)胞角蛋白(CK+)，缺乏CD45(CD45-)，并且含有核酸(NAD+)。具有等于或高于白細(xì)胞的NAD的CTC候選物被認(rèn)為是細(xì)胞，并且通過黑色表示。NAD含量低于白細(xì)胞的CK+，CD45事件被認(rèn)為不是靶細(xì)胞，并且用蘭色表示。通過較小的正向光散射信號證實，蘭色事件明顯比黑色CTC小。NAD染色強度的閾值明確排除了具有更低的NAD染色強度的大部分CK+，CD45事件。在分析來自健康供體的血液樣品時，很少觀察到這樣的CK+，CD45-事件，表明這種現(xiàn)象與癌癥相關(guān)。在圖2D，2E，和2F中示出了分析來自健康供體的血液的典型例子。
實施例2通過CellSpotter分析樣品CellSpotter系統(tǒng)包括一臺顯微鏡，它具有一個水銀弧光燈，一個10×的物鏡，一個高分辨率X，Y，Z載物臺，和一個四重濾光立方轉(zhuǎn)換器。對DAPI來說，在每一個四重立方體中的激發(fā)、雙色和發(fā)射濾光器分別為365nm/400nm/400nm，對于DiOC16來說，分別為480nm/495nm/510nm，對于PE來說，為546nm/560nm/580nm，而對于APC來說，為620nm/660nm/700mm。圖象是通過與數(shù)碼圖象獲取裝置連接的數(shù)碼相機(jī)獲得的。腔室的表面為80.2mm2，并且四個濾光器中每一個的四排35幅圖象，導(dǎo)致了必須獲得的560幅圖象，以便覆蓋整個表面。CellSpotter獲取程序能自動確定要在它上面獲取圖象的區(qū)域，要獲取的圖象的數(shù)量，每一個圖象的位置以及在每一個位置上使用的顯微鏡焦距。將來自一種樣品的所有圖象編輯成目錄，該目錄對于特定樣品識別來說是獨一無二的。將一種算法應(yīng)用于從一種樣品上獲得的所有圖象，以便尋找DAPI和CK-PE染色的部位。如果染色區(qū)域與潛在的腫瘤細(xì)胞的染色部位一致(DAPI+，CK-PE+)，所述軟件將所述區(qū)域的位置保存在數(shù)據(jù)庫中。所述軟件顯示每一個方框的圖，并且用戶可以證實在行中出現(xiàn)的圖象與腫瘤細(xì)胞一致，或用白細(xì)胞標(biāo)記CD45染色。由所述軟件將每一個樣品的檢查框列表，并且將信息保存在數(shù)據(jù)庫中。
圖3表示來自患有轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者的血液樣品的CellSpottere分析的例子。有可能包括腫瘤細(xì)胞的區(qū)域顯示小塊圖的行中。在該附圖左下角的刻度尺表示所述小塊圖的大小。從右到左，所述小塊圖表示細(xì)胞核(DAPI)，細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白(CK-PE)，由膜染料染色的對照細(xì)胞(DiOC16(3))，以及表面CD45(CD45-APC)染色。左側(cè)的合成圖象表示紫色細(xì)胞核(DAPI)和綠色細(xì)胞質(zhì)(CK-PE)染色的假的顏色重疊。合成圖象旁邊的對照框使得用戶能夠確定出現(xiàn)在行中的圖象與腫瘤細(xì)胞一致，并且CD45-APC圖象旁邊的對照框被用于證實白細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的非特異性染色。在該患者樣品中，所述軟件檢測2761行小塊圖，它們證實了染色與腫瘤細(xì)胞一致。在附圖中示出了2761行中的18行，它們被標(biāo)明為1631-1640和1869-1876。對編號為1631，1636，1638，1640和1873-1876的行進(jìn)行檢查，并且顯示被確定為尺寸大于4微米的CTC的特征，存在由細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白染色包圍的細(xì)胞核，并且缺乏DiOC16(3)和CD45染色。注意腫瘤細(xì)胞外觀的差別編號為1638的行中的細(xì)胞較大，而編號為1640的行中的細(xì)胞明顯較小。編號為1634和1869的行中的事件的免疫表型與腫瘤細(xì)胞吻合，但是它們的形態(tài)與完整細(xì)胞不一致。編號為1869的行中的小塊圖表示由于細(xì)胞骨骼蛋白收縮而產(chǎn)生的大的細(xì)胞核和斑點狀細(xì)胞質(zhì)，它與細(xì)胞的凋亡一致。編號為1634的行中的小塊圖表示受損害的細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞核的溢出。編號為1632的行中的小塊圖表示能同時被細(xì)胞角蛋白和CD45染色的細(xì)胞，它可能是與CD45非特異性結(jié)合的腫瘤細(xì)胞，也可能是被細(xì)胞角蛋白非特異性染色的癌細(xì)胞。在這種場合下，所述細(xì)胞的形態(tài)與淋巴細(xì)胞的形態(tài)非常類似。在編號為1633，1635，1637，1639，1870和1872的行中的小塊圖表示細(xì)胞質(zhì)角蛋白染色物體，這些物體大于4微米，但是不具有與細(xì)胞的相似性。在小塊圖1637，1639和1872中的細(xì)胞角蛋白染色物體與白細(xì)胞非常接近。
根據(jù)對若干患者樣品中CTC候選物圖象的觀察，可以將CTC分成三種類型完整CTC，受損的CTC，和CTC片段，這三種類型都不能用CD45染色，并且不能在DiOC16(3)濾光器中出現(xiàn)。圖4表示從正在進(jìn)行治療的轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的一管血液中分離的CTC的三種類型的例子。圖3A中所示出的完整的腫瘤細(xì)胞被確定為大于4微米的物體，它具有相對光滑的細(xì)胞質(zhì)膜，貫穿細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞骨骼蛋白，以及包括在細(xì)胞核中的完整的核。圖4B中所示出的受損的CTC被確定為大于4微米的物體，它具有斑點狀細(xì)胞角蛋白染色或不整齊的細(xì)胞質(zhì)膜，以及與細(xì)胞質(zhì)角蛋白染色相關(guān)的細(xì)胞膜。圖4C中所示出的腫瘤細(xì)胞片段被確定為大于4微米的圓形細(xì)胞角蛋白染色物體，它有或沒有核材料的結(jié)合，它與細(xì)胞的形態(tài)沒有類似性。
實施例3前列腺患者體內(nèi)的CTC通過流式細(xì)胞術(shù)和CellSpotter統(tǒng)計前列腺癌患者的18份血液樣品和來自健康個體的27份樣品中的CTC。通過CellSpotter所檢測的完整CTC的數(shù)量增加對表1中所示出的結(jié)果進(jìn)行分類。
表1-通過CellSpotters和流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計來自前列腺癌患者的18份血液樣品和來自健康個體的27份樣品中的CTC。
#-7.5ml血液中CTC的數(shù)量，％-通過CellSpotter檢測的所有CTC的百分比在CellSpottere分析中，完整CTC的比例明顯占CTC的最小的比例，并且占所有CTC的0-22％(平均4％)。受損的CTC的比例占1％-100％(平均34％)，而CTC片段占CTC的最大的比例，為0％-93％(平均62％)。CTC的三種類型在患者之間的分布明顯不同，這種差別體現(xiàn)在在完整的CTC和受損的CTC之間(R2＝0.20)以及完整的CTC和CTC片段之間(R2＝0.42)缺乏相關(guān)性，并且在受損的CTC和CTC片段之間(R2＝0.88)存在某種相關(guān)性。比較通過CellSpotter確定的完整的CTC和通過流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計的CTC沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性(R2＝0.26)，而通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)了受損的CTC和CTC之間的顯著相關(guān)性(R2＝0.92)，并且通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)了CTC片段和CTC之間的顯著相關(guān)性(R2＝0.93)。比較通過流式細(xì)胞術(shù)和CellSpotter檢測的CTC，發(fā)現(xiàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測的CTC包括完整的CTC和受損的CTC，并且在一定程度上包括CTC片段。
實施例4通過在LnCaP細(xì)胞中體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模擬細(xì)胞損害為了研究細(xì)胞毒性劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡對CTC的流式細(xì)胞測定和CellSpotter分析的影響，在存在或不存在40nM紫杉醇的條件下，將來自前列腺細(xì)胞系LnCaP的細(xì)胞培養(yǎng)72小時。在培養(yǎng)之后，通過臺盼蘭排除法證實了未處理過的LnCaP細(xì)胞存活力大約為95％，而紫杉醇處理過的細(xì)胞的存活力為33％。將處理過的和未處理過的LnCaP細(xì)胞接種到健康供體的血液中，通過上述鐵流體方法篩選，并且通過CellSpotter系統(tǒng)分析。在LnCaP細(xì)胞混入沒有用紫杉醇處理過的血液中的實驗中，超過95％的LnCaP細(xì)胞可以歸類為完整的腫瘤細(xì)胞，紫杉醇處理過的LnCaP細(xì)胞的形態(tài)學(xué)外觀表現(xiàn)出與患者樣品中觀察到的CTC的外觀極為相似，并且如圖6所示。在圖6A中示出了在紫杉醇處理之后存活的完整的LnCaP細(xì)胞，在圖6B中示出了其主要部分表現(xiàn)出斑點狀細(xì)胞角蛋白染色的LnCaP，而在圖6C中示出了腫瘤片段。
還制備了混入了用紫杉醇處理過的和未處理過的LnCaP細(xì)胞的正常血液樣品，以便進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。在圖2G，2H，和2I中示出了混入了501 LnCaP細(xì)胞的血液樣品的流式細(xì)胞術(shù)分析。在圖中用黑色顯示并且示出了通過大的正向光線散射信號表示的主要為明亮的細(xì)胞角蛋白陽性群體，其核酸含量大于正常人類白細(xì)胞，并且具有相對大的體積。在樣品中只檢測到少量的CK+，CD45-事件的NAD含量低于白細(xì)胞，并且用蘭色表示。圖2J，2K和2L表示混入血液的紫杉醇處理過的LnCaP細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。與活的LnCaP相反，在大部分群體中觀察到了細(xì)胞角蛋白染色的廣泛分布，這表明具有較低濃度的核酸含量。另外，觀察到了像白細(xì)胞那樣具有較低核酸含量的大量小的細(xì)胞角蛋白陽性事件。所述患者的情況與紫杉醇處理過的LnCaP細(xì)胞的情況非常類似，從而支持了以下假設(shè)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到的CTC表示癌癥患者血液中的完整的CTC和多種分解的細(xì)胞。
上述數(shù)據(jù)表明，在前列腺癌患者的血液中，通過流式細(xì)胞術(shù)和CellSpottere檢測的CTC包括完整的細(xì)胞和處在各種分解階段的細(xì)胞。在體外通過紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡表明，在患者血液樣品中檢測到的CTC正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，壞死，或通過處理或治療所導(dǎo)致的各種程度的體內(nèi)損害，通過經(jīng)由血管系統(tǒng)或通過免疫系統(tǒng)導(dǎo)致的機(jī)械損害。
不過，另一種體外導(dǎo)致的細(xì)胞分解的來源，可能是通過樣品制備或在抽血之后缺乏CTC或其他血液成分的穩(wěn)定而導(dǎo)入的。為了研究樣品老化的影響，已知這種影響會導(dǎo)致?lián)p害，如果有足夠的血液可供利用的話，在抽血之后2小時之內(nèi)，24小時之后，以及6和18小時之后對從12位前列腺癌患者體內(nèi)抽取的血液樣品進(jìn)行加工，并且通過流式細(xì)胞測定分析。在12種患者樣品中有8種檢測到的CTC含量高于在正常供體中檢測到的平均值+3SD。如表2所示，在所有8種樣品中都觀察到隨著樣品老化而出現(xiàn)的CTC損失。
表2-通過流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計8份前列腺癌患者樣品中的CTC，所述樣品是在抽血之后的不同時間點加工和分析的
hr＝小時#CTC＝5ml血液中的CTC數(shù)量當(dāng)血液加工推遲時，檢測到CTC數(shù)量的顯著減少，這表明了CTC的脆弱性，并且使得有必要在抽血之后不超過6小時加工不穩(wěn)定的血液樣品，以便獲得準(zhǔn)確的CTC計數(shù)。為了可靠地評估臨床上相關(guān)的信息是否包含在腫瘤細(xì)胞降解的不同階段，血液防腐劑是必要的，它能在抽血時穩(wěn)定CTC，以便獲得能準(zhǔn)確反應(yīng)在體內(nèi)所發(fā)生的情況的信息。另外，用于富集CTC的靈敏測定的樣品制備方法，需要對所有類型的CTC進(jìn)行捕獲，并因此排除了使用現(xiàn)有技術(shù)中的傳統(tǒng)密度梯度分離方法。
實施例5明顯的CTC和懷疑的CTC是重要的指標(biāo)正如本文所披露的，為了進(jìn)行靈敏的測定，重要的是能夠區(qū)分體內(nèi)和體外損害。這一條在確定處理或治療效果的測定中顯得尤為重要，已知所述處理或治療會導(dǎo)致體內(nèi)損害。如果樣品操作、加工或分析會導(dǎo)致靶細(xì)胞損害，形成懷疑的的細(xì)胞、細(xì)胞片段或碎片的話，所述測定將不能提供有價值的結(jié)果。
將一種測定方法通過流式細(xì)胞術(shù)直接用于檢測100微升血液中的CTC，不采用任何富集方法。所述100微升測定只能檢測EpCAM陽性細(xì)胞，并且其靈敏度非常低。不過，具有高的CTC計數(shù)的某些晚期癌癥患者預(yù)期是可以觀察的。這種測定方法應(yīng)當(dāng)能提供對CTC的可靠的確診性評估，因為它是不涉及任何操作的直接測定。數(shù)據(jù)是使用所述測定方法由若干患者樣品產(chǎn)生的，以便回答若干問題。
所述100微升的測定根據(jù)諸如大小和染色強度的性質(zhì)對細(xì)胞進(jìn)行分類。明顯的CTC具有明亮的核酸染色(類似于白細(xì)胞)，陽性EpCAM抗原染色，以及類似于白細(xì)胞的大小或更大一些。懷疑的CTC是對EpCAM抗體呈陽性的任何物體，但不是鑒定為明顯的CTC(即模糊的核酸，尺寸小于白細(xì)胞)。所述測定方法能從兩種類型中識別目標(biāo)。
圖5表示通過100微升測定方法確定的血液中明顯的和懷疑的CTC的存在。懷疑的CTC不是在樣品加工期間產(chǎn)生的(體外損害)，因為100微升的測定方法是一種直接測定方法，并且不涉及任何分離或洗滌步驟。以上數(shù)據(jù)還表明，在明顯的和懷疑的CTC的數(shù)量之間存在關(guān)系。懷疑的CTC的數(shù)量似乎隨著明顯的CTC的數(shù)量的增加而增加。當(dāng)對懷疑的和明顯的CTC的數(shù)量進(jìn)行作圖時，2.92的斜率表示與明顯的CTC相比，存在于樣品中的懷疑的CTC的比例。r2＝0.0.97的相關(guān)系數(shù)表示在多種臨床樣品的明顯的CTC和懷疑的CTC之間存在良好的相關(guān)性。另外，還在鐵流體-篩選測定中觀察到了懷疑的CTC，并且具有類似于通過直接測定在血液中檢測到的懷疑的CTC的特征。除了正常的CTC之外將懷疑的CTC包括在總的腫瘤細(xì)胞數(shù)量內(nèi)是重要的。
一個重要的問題是，如何將來自100微升測定的數(shù)據(jù)與鐵流體選擇的CTC(富集的CTC)進(jìn)行比較。所述鐵流體測定方法能定量檢測CTC嗎？另一個問題是如果所述流體測定數(shù)據(jù)是正確的，鐵流體選擇測定中的CTC的回收率是多少。有三種主要因素決定在100微升測定中CTC的回收·EpCAM密度·細(xì)胞角蛋白陽性，和·細(xì)胞核陽性。
與明顯的CTC相比，懷疑的CTC具有較低的EpCAM密度，這種現(xiàn)象的重要性尚沒有得到充分認(rèn)識。
使用7毫升血液將通過100毫升測定方法確定的明顯和懷疑的CTC與由鐵流體選擇測定方法確定的正常和懷疑的CTC進(jìn)行了比較。該數(shù)據(jù)是從前列腺患者樣品中獲得的，并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析。明顯的和懷疑的CTC都隨著儲存時間的延長而增加，并且其趨勢類似于在鐵流體選擇測定中檢測的CTC，因此證實了100毫升測定方法的效力。根據(jù)100微升血液中的CTC，來自鐵流體選擇測定的CTC的回收率為大約90％。已知來自該患者的CTC的MFI(平均熒光強度，它與EpCAM密度相關(guān))很高(MFI＝300)，并且所有EpCAM陽性細(xì)胞都是細(xì)胞角蛋白陽性的。不過，來自某些其他臨床樣品的CTC的回收率已經(jīng)低至20％。有若干種因素導(dǎo)致了較低的回收率，如EpCAM陽性/細(xì)胞角蛋白陰性細(xì)胞，細(xì)胞角蛋白模糊細(xì)胞，細(xì)胞表面上的粘蛋白抑制了鐵流體結(jié)合細(xì)胞的能力。
上述測定方法是在兩個時間點上在患者身上進(jìn)行的。反應(yīng)是通過病變的二維成像測定的。其比例(比例＝明顯的CTC/總CTC)類似于早先披露的反應(yīng)指數(shù)，并且可以用作治療成功的數(shù)字指標(biāo)。以上結(jié)果歸納在表3中。接近于1.0的比例表示總的CTC是明顯的CTC，而接近于0.0的比例表示有更多的懷疑的CTC或碎片。進(jìn)展表示病變的大小增加，部分反應(yīng)表示對治療的反應(yīng)，其中所述比例相對低，而穩(wěn)定的比例表示沒有變化，或病變縮小。陽性變化表示完整CTC數(shù)量的增加，相當(dāng)于疾病的進(jìn)展。陰性變化表示完整的CTC的數(shù)量的減少，或懷疑的CTC和/或碎片的數(shù)量的可能的增加，相當(dāng)于對治療的反應(yīng)。
以上結(jié)果表明了在分析對治療的反應(yīng)時將懷疑的CTC和碎片包括在內(nèi)的重要性，因為僅僅是完整的或明顯的CTC的數(shù)量不能夠提供盡可能多的信息。另外，所述指標(biāo)可用于對處理或治療進(jìn)行短期監(jiān)測，或?qū)徑夂?或復(fù)發(fā)進(jìn)行長期監(jiān)測。
表III-與治療反應(yīng)相應(yīng)的明顯的CTC和懷疑的CTC
統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞碎片可以證實在癌癥診斷和治療方面，比在檢測大的增殖性細(xì)胞簇方面更有價值。因為業(yè)已發(fā)現(xiàn)大小為大約1-3微米(血小板的大小)的碎片顆粒的存在量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于完整細(xì)胞的數(shù)量，它們可能構(gòu)成了一種分離的、獨立的、并且可能比完整的腫瘤細(xì)胞更靈敏的標(biāo)記。當(dāng)免疫系統(tǒng)是完整的并且最有活性的時候，受損的CTC的存在可能與早期癌癥的檢測特別相關(guān)。類似地，在治療期間碎片的顯著增加可能表明循環(huán)和組織腫瘤細(xì)胞的破裂(即治療效果)，同時伴隨著細(xì)胞成分的大量釋放，如在腫瘤分解期間觀察的鈣。與可溶性腫瘤標(biāo)記類似，所述碎片可以在沒有富集的情況下，在血液中檢測到，或者通過有限富集之后在血塊黃層中檢測到，并且構(gòu)成了另一種，并且有可能比完整細(xì)胞富集/分析更簡單的診斷工具。由于CTC碎片喪失了形態(tài)學(xué)，檢測可以通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行，只要所述碎片能夠?qū)线m的決定簇，如細(xì)胞角蛋白染色進(jìn)行。
正如上文所討論的，有或沒有DNA的受損的或分解的CTC，在理論上是可以預(yù)期的，因此，不是來自正在進(jìn)行有效治療的患者和具有強免疫系統(tǒng)的未治療的患者的標(biāo)本中不理想的事件。完整的CTC與總的可檢測事件的比例或百分比可能被證實是一種更有用的參數(shù)，可以被醫(yī)生用于評估患者的免疫系統(tǒng)或?qū)χ委煹姆磻?yīng)。正常的免疫防御，特別是活化的中性粒細(xì)胞，同樣能通過一種被稱為“細(xì)胞外殺傷”的過程作為外源物質(zhì)破壞或分解CTC，即使CTC大于所述中性粒細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)僅有小百分比的脫落的CTC是完整的細(xì)胞似乎并不令人吃驚，除非免疫系統(tǒng)在疾病的晚期已經(jīng)不起作用或治療是無效的。
因此，有多種方法可用于體外癌癥檢測方法對完整循環(huán)細(xì)胞/細(xì)胞簇的結(jié)論性檢測，諸如循環(huán)腫瘤碎片的推論性方法(包括總的和腫瘤特異性RNA/DNA)，和常規(guī)可溶性腫瘤標(biāo)記。不過，沒有一種方法本身是足夠靈敏的。與CTC形態(tài)學(xué)相比，碎片檢測的較低的特異性可能是在篩選中能夠減小的一個問題(例如通過三重標(biāo)記)，但是它是監(jiān)測中的次要問題。另外在評估碎片分析的靈敏性和特異性方面，與正常個體相比對在患者體內(nèi)的完整的相對CTC和診斷階段的碎片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析和相關(guān)性似乎是有價值的。
可以用本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒檢測的不同類型的癌癥的例子包括胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤，迷芽瘤，鰓原瘤，惡性類癌綜合癥，類癌心臟病，癌，例如，Walker癌，基底細(xì)胞癌，基底鱗狀細(xì)胞癌，Brown-Pearce癌，導(dǎo)管癌，Ehrlich腫瘤，原位癌，Krebs2，merkel細(xì)胞癌，粘液細(xì)胞癌，非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞癌，乳頭瘤，硬癌，細(xì)支氣管肺泡癌，支氣管肺癌，鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖，黑素瘤，成軟骨細(xì)胞瘤，軟骨瘤，軟骨肉瘤，纖維瘤，纖維肉瘤，巨大細(xì)胞瘤，組織細(xì)胞瘤，脂肪瘤，脂肪肉瘤，間皮瘤，粘液瘤，粘液肉瘤，骨瘤，骨肉瘤，Ewing′s肌瘤，滑膜瘤，腺纖維瘤，腺淋巴瘤，癌肉瘤，脊索瘤，間質(zhì)瘤，中腎瘤，肌肉瘤，造釉細(xì)胞瘤，牙骨質(zhì)瘤，牙瘤，畸胎瘤，throphoblastic瘤，腺癌，腺瘤，膽管瘤，膽脂瘤，圓柱瘤，囊腺癌，囊腺瘤，肉芽腫細(xì)胞瘤，gynandroblastoma，肝癌，汗腺腺癌，胰島細(xì)胞瘤，leydig細(xì)胞瘤，乳頭瘤，sertoli細(xì)胞瘤，泡膜細(xì)胞瘤，平滑肌瘤，平滑肌肉瘤，成肌細(xì)胞瘤，肌瘤，肌肉瘤，橫紋肌瘤，橫紋肌肉瘤，室管膜瘤，神經(jīng)節(jié)瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，腦膜瘤，神經(jīng)鞘瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，神經(jīng)上皮瘤，神經(jīng)纖維瘤，神經(jīng)瘤，副神經(jīng)結(jié)瘤，非嗜鉻副神經(jīng)結(jié)瘤，antiokeratoma，血管瘤硬化，血管瘤病，血管球瘤，血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤，血管瘤，血管外皮細(xì)胞瘤，血管肌瘤，淋巴管瘤，淋巴管肌瘤，lymphangiosarcoma，松果體瘤，癌肉瘤，軟骨肉瘤，葉狀囊性肉瘤，纖維肉瘤，血管肌瘤，平滑肌瘤，白血病性肌瘤，脂肪肉瘤，淋巴管肉瘤，肌肉瘤，粘液肉瘤，卵巢癌，橫紋肌肉瘤，肉瘤(Kaposi′s，和肥大細(xì)胞)，贅生物(例如，骨骼，消化系統(tǒng)，結(jié)腸直腸，肝臟，胰腺，腦垂體，睪丸，眼眶，頭部和頸部，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，聽覺系統(tǒng)，骨盆，呼吸道，和泌尿道)，神經(jīng)纖維瘤病，和宮頸發(fā)育不良。
不過，本發(fā)明并不局限于檢測循環(huán)上皮細(xì)胞和/或細(xì)胞簇、片段或碎片。例如，業(yè)已在患有心肌梗塞的患者的血液中觀察到了內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、和病毒感染的細(xì)胞，如上皮細(xì)胞具有通過現(xiàn)有單克隆抗體識別的細(xì)胞類型特異性決定簇。因此，本發(fā)明的方法和試劑盒可能適用于檢測所述循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。另外，本發(fā)明可以檢測存在于患有感染性疾病的患者的外周血液中的細(xì)菌細(xì)胞，所述患者還可以用本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒評估。有理由認(rèn)為，所述罕見細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中的行為是類似的，并且片段和/或碎片將會在類似于上文所述的條件下存在。
相信本文所披露的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案使得本發(fā)明可應(yīng)用于除了癌癥診斷以外的領(lǐng)域和用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明的改進(jìn)的診斷方法并不局限于上述對優(yōu)選實施方案的說明。最后，盡管上面所提供的某些實施方案披露了詳細(xì)說明，以下權(quán)利要求書并不局限于由所述詳細(xì)說明所限定的范圍。實際上，在不超出以下權(quán)利要求書的構(gòu)思的前提下，可以對所述方案進(jìn)行各種改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于診斷待測對象的疾病的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的罕見細(xì)胞的混合細(xì)胞群，并且還包括i.源于罕見細(xì)胞的細(xì)胞片段，或ii.源于罕見細(xì)胞的細(xì)胞碎片；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌希雠潴w能特異性地與所述完整的罕見細(xì)胞和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的罕見細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞，和所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片，所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞，所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片的存在表明了疾病的存在。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
5.如權(quán)利要求1的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的罕見細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行了富集。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述分析是基于以下方法中的至少一種形態(tài)學(xué)分析和表位分析。
8.一種用于診斷待測對象的疾病的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的罕見細(xì)胞和罕見細(xì)胞的細(xì)胞簇的混合細(xì)胞群；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌?，所述配體能特異性地與所述完整的罕見細(xì)胞和所述罕見細(xì)胞的細(xì)胞簇起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的罕見細(xì)胞和所述罕見細(xì)胞的細(xì)胞簇，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞和所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞的細(xì)胞簇，所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞和所述標(biāo)記過的罕見細(xì)胞的細(xì)胞簇的存在表明了疾病的存在。
9.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
10.如權(quán)利要求16的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
11.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
12.如權(quán)利要求15的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的罕見細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行了富集。
13.如權(quán)利要求15的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
14.一種用于診斷待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞群，并且還包括i.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞片段，或ii.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞碎片；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆粒混合，所述配體能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片的存在表明了惡性腫瘤的存在。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
16.如權(quán)利要求15的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
18.如權(quán)利要求14的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行了富集。
19.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
20.如權(quán)利要求14的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過凋亡還是壞死導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
21.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過機(jī)械損害、藥物誘導(dǎo)的損害、或免疫學(xué)損害導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
22.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述分類是基于以下方法中的至少一種形態(tài)學(xué)分析和表位分析。
23.一種用于診斷待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的混合細(xì)胞群；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆粒混合，所述配體能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞簇，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的存在表明了惡性腫瘤的存在。
24.如權(quán)利要求23的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
25.如權(quán)利要求24的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
26.如權(quán)利要求23的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
27.如權(quán)利要求23的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇進(jìn)行了富集。
28.如權(quán)利要求23的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
29.一種用于篩選待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞群，并且還包括i.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞片段，或ii.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞碎片；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌?，所述配體能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片的存在表明了惡性腫瘤的存在。
30.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
31.如權(quán)利要求30的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
32.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
33.如權(quán)利要求29的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行了富集。
34.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
35.如權(quán)利要求29的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過凋亡還是壞死導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
36.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過機(jī)械損害、藥物誘導(dǎo)的損害、或免疫學(xué)損害導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
37.如權(quán)利要求35的方法，其中，所述分類是基于以下方法中的至少一種形態(tài)學(xué)分析和表位分析。
38.一種用于篩選待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的混合細(xì)胞群；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌?，所述配體能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞簇，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的存在表明了惡性腫瘤的存在。
39.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
40.如權(quán)利要求39的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
41.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
42.如權(quán)利要求38的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇進(jìn)行了富集。
43.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
44.一種用于監(jiān)測待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞的混合細(xì)胞群，并且還包括i.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞片段，或ii.源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞碎片；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌希雠潴w能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物學(xué)特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，或所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞，所述標(biāo)記過的細(xì)胞片段，和所述標(biāo)記過的細(xì)胞碎片的存在表明了惡性腫瘤的存在。
45.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
46.如權(quán)利要求45的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
47.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
48.如權(quán)利要求44的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行了富集。
49.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
50.如權(quán)利要求44的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過凋亡還是壞死導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
51.如權(quán)利要求50的方法，其中，所述分析還包括根據(jù)其來源，即是通過機(jī)械損害、藥物誘導(dǎo)的損害、或免疫學(xué)損害導(dǎo)致的而對細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片進(jìn)行分類。
52.如權(quán)利要求50的方法，其中，所述分類是基于以下方法中的至少一種形態(tài)學(xué)分析和表位分析。
53.一種用于監(jiān)測待測對象的惡性腫瘤的方法，包括a.從所述待測對象獲得生物學(xué)標(biāo)本，所述標(biāo)本包括懷疑含有完整的惡性腫瘤細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的混合細(xì)胞群；b.制備磁標(biāo)記的樣品，其中，將所述生物學(xué)樣品與和第一種生物特異性配體偶聯(lián)的磁性顆?；旌?，所述配體能特異性地與所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇起反應(yīng)，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；c.讓所述磁標(biāo)記的樣品與至少一種其他的生物特異性配體接觸，所述配體能特異性標(biāo)記所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇，以便基本上排除其他標(biāo)本成分；d.分析所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞簇，所述標(biāo)記過的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇的存在表明了惡性腫瘤的存在。
54.如權(quán)利要求53的方法，其中，所述生物學(xué)標(biāo)本是血液。
55.如權(quán)利要求54的方法，其中，在獲得所述生物學(xué)標(biāo)本之后，讓它與能夠穩(wěn)定所述生物學(xué)標(biāo)本的試劑接觸。
56.如權(quán)利要求53的方法，其中，所述磁性顆粒是膠體。
57.如權(quán)利要求53的方法，其中，在制備所述磁標(biāo)記的樣品的步驟之后，讓所述樣品接受高梯度磁場的處理，以便產(chǎn)生分離的磁標(biāo)記的級分，該級分對所述完整的惡性腫瘤細(xì)胞和所述惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇進(jìn)行了富集。
58.如權(quán)利要求53的方法，其中，所述分析是從下組方法中選擇的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，免疫熒光顯微技術(shù)，激光掃描細(xì)胞計量術(shù)，明視野基成像分析，毛細(xì)容量分析，光譜成像分析，人工細(xì)胞分析和自動化細(xì)胞分析。
59.一種用于分析生物學(xué)標(biāo)本中惡性腫瘤細(xì)胞，和源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞片段或源于惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞碎片的存在的試劑盒，包括a.包衣的磁性納米顆粒，包括i.磁性核心材料，ii.蛋白基包衣材料，和iii.能特異性地結(jié)合所述惡性腫瘤細(xì)胞的第一種特征性決定簇，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片的抗體，其中，所述抗體與所述基礎(chǔ)包衣材料偶聯(lián)；b.具有對所述惡性腫瘤細(xì)胞的第二種特征性決定簇，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片具有特異性的至少一種抗體；c.能夠?qū)λ鰫盒阅[瘤細(xì)胞，和所述細(xì)胞片段或所述細(xì)胞碎片的其他特征進(jìn)行染色的試劑。
60.如權(quán)利要求59的試劑盒，還包括一組抗體，這些抗體分別對不同的特征性決定簇有特異性。
61.如權(quán)利要求59的試劑盒，還包括一種能夠標(biāo)記非目標(biāo)實體的特異性試劑。
全文摘要
將本發(fā)明所披露的方法和試劑用于分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞簇，片段和碎片的用途。分析是用多種平臺進(jìn)行的，包括流式細(xì)胞術(shù)和CellSpotter
文檔編號G01N33/49GK1596265SQ02821200
公開日2005年3月16日 申請日期2002年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月23日
發(fā)明者G·C·勞, C·拉森, M·雷伯萊特, H·魯特納, L·特爾斯塔彭, S·M·奧哈拉, S·格羅斯 申請人:免疫公司