一種多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和應(yīng)用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn最適pH值為5.0，最適溫度為60℃；在pH 3.0-8.0下37℃處理1h還保持90％的酶活力，在50℃下處理1h之后還保持85％的酶活力，這說明此酶具有很好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。利用畢赤酵母表達(dá)后，比活高達(dá)27,561U/mg。
【專利說明】一種多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 果膠是一類帶負(fù)電的高分子雜多糖，是果蔬植物細(xì)胞中膠層的主要成分，廣泛存 在于各類高等植物尤其是水果和蔬菜的組織中（Stevenson et al.，1988)。果膠質(zhì)含有由 不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵連接而成的多糖鏈，側(cè)鏈常帶有阿拉伯糖、 鼠李糖、木糖、半乳糖等成分，是非淀粉多糖（NSP)的成分之一。果膠質(zhì)填充在植物的細(xì)胞 壁之間，具有使細(xì)胞粘合在一起的作用。果膠類物質(zhì)可分為4類：原果膠（protopectin)、 果膠（pectin)、果膠酸（pectic acid, pectate)和果膠酯酸（pectinic acid, pectinate)。 果膠作為細(xì)胞初生壁中間層結(jié)構(gòu)的主要成分，它與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成一個植物細(xì) 胞阻擋外界的堅韌屏障（O'Neill et al.，2004)，所以在很多工業(yè)生產(chǎn)中果膠是一種不利 因素需要去除，而果膠酶則能有效降解果膠。
[0003] 在眾多的果膠酶系中，多聚半乳糖醒酸酶（Polygalacturonase)是降解果膠骨架 結(jié)構(gòu)的主要酶種之一，同時也是果蔬汁加工中應(yīng)用最為廣泛的酶。根據(jù)消去半乳糖醛酸的 方式不同，多聚半乳糖醛酸酶分為內(nèi)切PG酶（EC3. 2. 1. 15)和外切PG酶（EC3. 2. 1.67)兩 種。內(nèi)切PG酶能隨機地從多聚半乳糖醛酸鏈內(nèi)部打開α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生聚合度為10- 14的寡聚半乳糖醛酸。內(nèi)切PG酶的水解作用可使果汁溶液的澄清度提升，粘度顯著下降， 產(chǎn)生強烈的解聚降粘作用，是目前商品化復(fù)合果膠酶系中的主要組成酶種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的多聚半乳糖醛酸酶。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。
[0009] 本發(fā)明從Thielavia arenaria ΧΖ7中分離得到一種多聚半乳糖醒酸酶PG7fn，其 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] MILSTLVLSLGALAAANPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLND GTKVIFSGTTTFGYKEWEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHV KNTPVQAFSINGATNLGVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCS GGHGLSIGSVGGRSDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPT GTPTAGVPITDLTLNGVTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
[0011] 該酶包括365個氨基酸，N端16個氨基酸為信號肽序列。
[0012] 因此，成熟的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0013] NPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGTTTFGYKE WEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHVKNTPVQAFSINGATNL GVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCSGGHGLSIGSVGGRSDN TVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPTGTPTAGVPITDLTLNG VTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
[0014] 信號肽序列為 MILSTLVLSLGALAAA(SEQ ID NO. 3).
[0015] 本發(fā)明提供了編碼上述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，具體地，該基因的基因組序 列（含有兩個內(nèi)含子）如SEQ ID NO. 4所示。
[0016] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCC AACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCAT CACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCT TCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTG GAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGAC GAAGCCTAAGTAGGGGTGTCCAGTCTTTGTTCAGATCAAAATCGCAACTAATCATCTCCCAGATTCTTCTACGCCCA TAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCA CAAACCTCGGGGTGTAAGTTACAGCCCAAGTGTGATATATAGCACCCCGCAGGGTCTCCAGTTGGGACTAACATGAA GAAACAGCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTC GGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCAC CAACATCACCGTATGTTTTCTTTTACCCCTCAAACTTGACAACCCCCTTACCCAGCTCCTAACCCCAACATCTGGCA GTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCA AAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACG GGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGA CTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGG GGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAG GTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0017] 該基因的cDNA序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0018] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCC AACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCAT CACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCT TCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTG GAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGAC GAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTC AGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCC GGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCA GGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCT CGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCG CAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCT GTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGG GCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTC TGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGA GAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0019] 去除信號肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0020] AATCCGGTCCCTGCCAACTCCAACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCC ATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGAC CAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCTTCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGA TTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTGGAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGG GATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGACGAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAA AGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCA GTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTC TACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGG CGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTAC GCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTC TCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAA TGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGA GTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTT ACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
[0021] 其中，信號肽的基因序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0022] ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCC
[0023] 本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重組載體，優(yōu)選為 pPIC9r-PG7fn。
[0024] 本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為 大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種制備高比活多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，包括以下步 驟：
[0026] 1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0027] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組多聚半乳糖醛酸酶表達(dá)；
[0028] 3)回收并純化所表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
[0029] 此低溫多聚半乳糖醛酸酶的理論分子量為37. 4kDa。該多聚半乳糖醛酸酶PG7fn 的最適pH為5. 0,在pH4. 0?5. 5的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的70%以上。多 聚半乳糖醛酸酶PG7fn在pH 3. 0-8. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶 活性近90%，這說明此酶具有較好的pH穩(wěn)定性；最適溫度60°C，在40°C -65°C范圍內(nèi)，酶活 性均維持在最大酶活性的60%以上。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn在50°C下處理60min后剩 余酶活性在85%以上，這說明此酶具有很好的熱穩(wěn)定性。利用畢赤酵母表達(dá)后，比活高達(dá) 27, 561U/mg。
[0030] 本發(fā)明還提供了編碼上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的基因 PG7fn。
[0031] 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，DNA全序列 分析結(jié)果表明，多聚半乳糖醛酸酶PG7fn結(jié)構(gòu)基因 PG7fn全長1098bp，編碼365aa和一個 終止密碼子，N端16個氨基酸預(yù)測為信號肽序列。蛋白理論分子量為37. 4kDa，等電點為 8. 78,有一個第二十八家族的催化結(jié)構(gòu)域。在GenBank中的比對結(jié)果表明PG7fn是一個新 的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶。
[0032] 本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重組載體，優(yōu)選為 pPIC9r-PG7fn。將本發(fā)明的多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點 之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施 方案，優(yōu)選為將多聚半乳糖醛酸酶基因插入到質(zhì)粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶 切位點之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9r-PG7fn。
[0033] 本發(fā)明還提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株 GS115/PG7fn。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種制備多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步驟：
[0035] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[0036] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組多聚半乳糖醛酸酶的表達(dá)；
[0037] 3)回收并純化所表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶。
[0038] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵 母細(xì)胞GS115，得到重組菌株GS115/PG7fn。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1 :在畢赤酵母中表達(dá)的重組多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分 子量蛋白質(zhì)Marker ;1:去糖基化處理的酶液；2:純化的酶液。
[0040] 圖2 :重組多聚半乳糖醛酸酶的最適pH。
[0041] 圖3 :重組多聚半乳糖醛酸酶的pH穩(wěn)定性。
[0042] 圖4 :重組多聚半乳糖醛酸酶的最適溫度。
[0043] 圖5 :重組多聚半乳糖醛酸酶的熱穩(wěn)定性。
[0044] 圖6 :用HPAEC對重組多聚半乳糖醛酸酶以PGA為底物時的產(chǎn)物分析。

【具體實施方式】
[0045] 試驗材料和試劑
[0046] 1、菌株及載體：表達(dá)宿主Pichia pastoris GS115,表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9r為本實 驗室保存。
[0047] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司， 多聚半乳糖醛酸購自Sigma公司。其它都為國產(chǎn)分析純試劑（均可從普通生化試劑公司購 買得到）。
[0048] 3、培養(yǎng)基：
[0049] (1) LB 培養(yǎng)基（g/Ι):酵母粉 5.0,蛋白胨 10.0, NaCl 10.0, ρΗ7·0。
[0050] (2)平板篩選培養(yǎng)基（g/1):酵母粉5· 0,蛋白胨10. 0, NaCl 10. 0,瓊脂15. 0， ρΗ7· 0。
[0051] 實施例1沙棲梭孢殼ΧΖ7來源的多聚半乳糖醛酸酶編碼基因 PG8fn的克隆
[0052] 提取基因組DNA及RNA。根據(jù)第二十八家族內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶真菌基因的保 守[NQDDCL(V)A和NGVRI (V)KT]序列設(shè)計合成了簡并引物G28n-F和G28n-R :
[0053] G28n-F :5'-GAACCARGAYGAYTGYSTIGC-3' ；
[0054] G28n-R :5'-GGTCTTNAYNCKNACICCRTT-3'
[0055] 以上述的沙棲梭孢殼XZ7基因組DNA為模板進行PCR擴增。降落PCR反應(yīng)參數(shù)為： 94°C變性5min ;94°C變性30sec，51-46°C退火30sec，72°C延伸lmin，10個循環(huán)（每個循環(huán) 降落0. 5°C )，然后94°C變性30sec，46°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C保溫 lOmin。得到一約180bp片段，將該片段回收后與連接pEASY-T3載體送三博生物技術(shù)有限 公司測序。
[0056] 根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設(shè)計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物：設(shè)計 方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每 兩個引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長度一般20?30nt，退火溫度在61°C。并將它們 分別命名為7fn-uSPl，7fn-uSP2, 7fn-uSP3(上游特異性引物）；
[0057] 7fn-dSPl，7fn-dSP2, 7fn-dSP3 (下游特異性引物）見表 1。按照改進的 TAIL-PCR 中的程
[0058] 序?qū)啥藗?cè)翼序列進行擴增。
[0059] 表1.多聚半乳糖醛酸酶PG8fn TAIL-PCR特異性引物
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種多聚半乳糖醛酸酶PG7fn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所示。
2. -種多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，其特征在于，其編碼權(quán)利要求1所述的多聚半乳 糖醛酸酶PG7fn。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示。
4. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重組載體。
5. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重組載體pPIC9r-PG7fn。
6. 包含權(quán)利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因 PG7fn的重組菌株。
7. 如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，其所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢 桿菌或乳酸桿菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組菌株，所述重組菌株為重組畢赤酵母菌株GS115/PG7fn。
9. 權(quán)利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的應(yīng)用。
10. -種制備權(quán)利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，其特征在于，所述方法 包括以下步驟： 1) 用權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組多聚半乳糖醛酸酶表達(dá)； 3) 回收并純化所表達(dá)的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
【文檔編號】C12N15/56GK104232604SQ201410419780
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】姚斌, 孟昆, 涂濤, 石鵬君, 黃火清, 王亞茹, 楊培龍, 羅會穎, 師霞, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所