一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法
【專利摘要】一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，屬于酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用一種10×發(fā)酵液處理溶液處理來源于重組菌解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980?BdP的普魯蘭酶發(fā)酵液，經(jīng)過處理的發(fā)酵液中普魯蘭酶酶活穩(wěn)定性明顯高于未經(jīng)處理的發(fā)酵液。本發(fā)明所述方法在以重組菌解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980?BdP為菌種發(fā)酵制備普魯蘭酶工藝的后提取階段可以減少酶活損失。
【專利說明】
一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，屬于酶工程和發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭酶(Pul lulanase，EC3.2.1.41)是一種水解支鏈淀粉α-1，6糖苷鍵的水解酶，在以淀粉為原料制取葡萄糖的工藝中可以提高葡萄糖得率。本課題組在前期工作中，以解淀粉芽孢桿菌為宿主菌構(gòu)建了一株表達重組普魯蘭酶的重組菌:解淀粉芽孢桿菌/PUC980-及爐[孫娟娟沈微石貴陽王正祥.普魯蘭酶基因在解淀粉芽孢桿菌BF7658菌株中的分泌表達.工業(yè)微生物，2011，41(6): 18-22]。該重組菌具有較好的產(chǎn)普魯蘭酶的能力。
[0003]在工業(yè)酶制劑的發(fā)酵制備中，在發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液一般要經(jīng)過固液分離、濃縮、添加酶穩(wěn)定劑等過程方能獲得性能比較穩(wěn)定的成品酶。工業(yè)上酶的濃縮過程一般采用超濾法，很多情況下由于超濾設(shè)備價格較高，所以一次發(fā)酵得到的發(fā)酵液往往要經(jīng)過比較長的時間才能全部完成超濾濃縮過程。在這一段時間內(nèi)，由于一些尚不完全清楚的原因，有些酶液如果不進行冷藏處理，則容易發(fā)生酶的失活從而導(dǎo)致經(jīng)濟損失。
[0004]用重組菌解淀粉芽孢桿菌/pUC980_及/P制備的普魯蘭酶，在發(fā)酵結(jié)束、固液分離操作完成之后，若不能很快完成酶的濃縮并添加護酶劑則普魯蘭酶的酶活會有相當(dāng)大的部分失活，因此這一階段需要進行冷藏處理。不進行冷藏，則經(jīng)過固液分離后的清液中的普魯蘭酶在常溫下放置24h后，會有30%以上的酶活力損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是減少發(fā)酵后普魯蘭酶逐步失活的問題，提供一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，普魯蘭酶發(fā)酵上清液經(jīng)過這種發(fā)酵液處理溶液在一定條件下的處理后，其酶活穩(wěn)定性明顯提高。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，采用10X發(fā)酵液處理溶液與9倍體積的普魯蘭酶發(fā)酵液的上清液混合，將混合液在60°C保溫30min，即得到處理后的發(fā)酵液。
[0007]所述10 X發(fā)酵液處理溶液具體為含200mM檸檬酸-檸檬酸鈉、10mM EDTA-Na2、50mmol/L KCl，pH3.4-3.6的溶液。
[0008]所述的普魯蘭酶發(fā)酵液具體為采用重組解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-及爐進行發(fā)酵獲得的發(fā)酵液，再經(jīng)過固液分離后得到的上清液。
[0009](I)普魯蘭酶發(fā)酵及發(fā)酵液上清液的制備方法:將-70°C甘油管保藏的重組解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-及/P在含20mg/L卡那霉素的LB平板上劃線，挑取單菌落。接種于含20mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基。在500mL三角瓶中裝液量為lOOmL，一般同時做3瓶。34°C、200r/min搖瓶發(fā)酵24h，按10%接種量接種于預(yù)先裝有已經(jīng)滅菌的2.7L發(fā)酵液的5L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程用氨水控制pH在6.8-7.5。發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液于離心管中，12000rpm離心1min，上清液普魯蘭酶酶活一般在20-30U/mL。
[0010](2) 10 X發(fā)酵液處理溶液配制方法:在IL容量瓶中加入800mL去離子水。WAEDTA-Na2.2H20 37.2 g，無水檸檬酸30.5g，無水檸檬酸鈉10.3g，氯化鉀3.7g，pH 3.4-3.6，如果pH偏離則用NaOH或HCl調(diào)整pH至3.4-3.6，并加去離子水至1L。
[0011 ] (3)發(fā)酵液的處理:10 X發(fā)酵液處理溶液與9倍體積的普魯蘭酶發(fā)酵液的上清液混合。混合液在60 °C保溫30 min。
[0012](4)發(fā)酵液的酶活變化:將經(jīng)過處理的發(fā)酵液在20°C室溫放置，每間隔4h，取樣檢測普魯蘭酶酶活。
[0013]普魯蘭酶酶活測定:按文獻[BibelM, Brett C，Gosslar U, et al.1solat1nand analysis of amylolytic enzyme of the hyperthermophiIic bacteriumThermotoga maritime.FEMS Microb1l Lett, 1998, 158:9-15]方法進行。
[0014]LB培養(yǎng)基:在“Sambrook等1989分子克隆實驗手冊”中描述。
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖50g/L，豆餅粉30g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸銨10g/L，無水氯化鈣
0.5g/L，加去離子水配制。
[0016]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明實施后，在以重組解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-BdP發(fā)酵制備普魯蘭酶的后提取階段，可以提高普魯蘭酶的穩(wěn)定性，減少普魯蘭酶酶活損失。
[0017]生物材料樣品保藏:解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-執(zhí)/Λ公開于[孫娟娟沈微石貴陽王正祥.普魯蘭酶基因在解淀粉芽孢桿菌BF7658菌株中的分泌表達.工業(yè)微生物，2011，41(6): 18-22] ο
【附圖說明】
[0018]圖1普魯蘭酶發(fā)酵液上清液經(jīng)不同處理后的酶活穩(wěn)定性。
[0019]A:90 mL上清液與10 mL雙蒸水混合后常溫放置30 min。
[0020]B:90 mL上清液與10 mL雙蒸水混合后60°C放置30 min。
[0021]C:90 mL上清液與10 mL10X發(fā)酵液處理溶液混合后60°C放置30 min。
【具體實施方式】
[0022]通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，實施例將不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0023]實施例1:普魯蘭酶發(fā)酵液不同處理方法對酶活穩(wěn)定性的影響
取5L發(fā)酵罐發(fā)酵制取的普魯蘭酶發(fā)酵液上清液，三份各90mL，分別標(biāo)記為A、B和C。其中A和B中加入雙蒸水1mL，C中加入10 X發(fā)酵液處理溶液1mL?；旌虾驛在常溫下放置，B和C在60°C保溫30min，上述獲得的酶液即為經(jīng)過預(yù)處理的普魯蘭酶A、B和C。取出后于20°C水中降溫1min，然后將上述三種溶液在室溫20°C下檢測普魯蘭酶酶活。
[0024]加入雙蒸水后未經(jīng)保溫的酶液的酶活為100%。在后24h內(nèi)每隔4h檢測一次普魯蘭酶酶活，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，在20°C放置的24h內(nèi)，未經(jīng)60°C保溫處理的上清液A的酶活下降幅度最大，超過50%;經(jīng)60 0C保溫處理的上清液B的酶活下降幅度比A略小，但也接近50%;加入了 10 X發(fā)酵液處理溶液并經(jīng)過60°C保溫30min的C上清液的普魯蘭酶酶活下降幅度相比A、B明顯要小，大約是19%，其在最初的12 h內(nèi)酶活下降幅度小于10%，而A和B在相應(yīng)的時間內(nèi)酶活下降幅度均超過30%。
[0025]由此可見，解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-及/P發(fā)酵制備的普魯蘭酶發(fā)酵液經(jīng)固液分離后得到的上清液，在用10 X發(fā)酵液處理溶液處理后，上清液中的普魯蘭酶酶活穩(wěn)定性明顯提高。若酶的濃縮過程時間較長，未經(jīng)同樣處理的發(fā)酵液上清液中普魯蘭酶酶活會有較大損失，而經(jīng)過處理的上清液的酶活損失相對較小。
【主權(quán)項】
1.一種提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，其特征在于:采用10 X發(fā)酵液處理溶液與9倍體積的普魯蘭酶發(fā)酵液的上清液混合，將混合液在60°C保溫30min，即得到處理后的發(fā)酵液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，其特征在于:所述1X發(fā)酵液處理溶液具體為含200mM檸檬酸-檸檬酸鈉、10mM EDTA-Na2、5OmmoI/L KCl，pH3.4-3.6的溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高普魯蘭酶穩(wěn)定性的發(fā)酵液處理方法，其特征在于:所述的普魯蘭酶發(fā)酵液具體為采用重組解淀粉芽孢桿菌BF7658/pUC980-及/P進行發(fā)酵獲得的發(fā)酵液，再經(jīng)過固液分離后得到的上清液。
【文檔編號】C12N9/44GK106011114SQ201610601731
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】沈微, 肖亞朋, 韓冰, 李婷霖, 朱金寸, 陳獻忠, 樊游
【申請人】江南大學(xué)