專利名稱：一種普魯蘭酶XWPu2及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種嗜堿性類芽孢桿菌XW-6-66來源的I型普魯蘭酶XWPu2及其基因。
背景技術(shù)：
普魯蘭酶(Pullulanase, E C 3.2. I. 41)即a -糊精-6-葡聚糖水解酶,能專一性地水解多糖的a -1,6-糖苷鍵,使支鏈型多糖的分支鏈脫支,形成一系列鏈長不一的直鏈淀粉(Yu B，Wang J P，Zhang H X，et al. Molecules, 2011，16:3010-3017)。在淀粉水解過程中，普魯蘭酶與a-淀粉酶、糖化酶配合使用，可以將淀粉徹底降解為葡萄糖；與
淀粉酶配合用時(shí)可以將淀粉完全轉(zhuǎn)化成麥芽糖，在淀粉加工中發(fā)揮著重要作用。另外，普魯蘭酶與其他糖苷水解酶類協(xié)同作用于不同類型底物還可以獲得不同類型的終產(chǎn)物，因此，普魯蘭酶在化工和制藥等行業(yè)中是一種不可或缺的酶類。普魯蘭酶是一種重要的工業(yè)用酶，然而天然菌株產(chǎn)酶低、難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本高，限制了其推廣應(yīng)用。利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建高效生物反應(yīng)器，可以提高普魯蘭酶的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本文從嗜堿性類芽孢桿菌sp.)XW-6-66基因組中克隆普魯蘭酶基因JT/如 與表達(dá)載體pET28a(+)連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)并對普魯蘭酶XWPu2酶學(xué)性質(zhì)及水解淀粉、多糖進(jìn)行了初步研究，為后期推廣普魯蘭酶的應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種普魯蘭酶XWPu2。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述普魯蘭酶XWPu2的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明所述普魯蘭酶XWPu2來自嗜堿性類芽孢桿菌iPaenibacillus sp. )，XWPu2的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明的普魯蘭酶XWPu2總共含有653個(gè)氨基酸，理論分子量為74. 02 kDa。以普魯蘭糖為底物最適溫度50°C ;最適pH5. 8-6. 8 ;終濃度I mM的P -巰基乙醇和I mM金屬離子 Ca2+、Mn2+、Fe2+ 和 K+ 對酶有較強(qiáng)的激活作用，Cu2+、Hg+、Co+、Zn2+、Pb+、SDS 和 EDTA有較強(qiáng)的抑制作用；普魯蘭酶XWPu2熱穩(wěn)定性研究表明，37 1和50 °C保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH穩(wěn)定性研究表明，pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6的緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%、74. 5%和57%以上；普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5 U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環(huán)糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業(yè)中有潛在的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供了編碼上述普魯蘭酶的基因XWPu2，該基因序列如SEQ ID NO. 2。
本發(fā)明通過PCR的方法克隆了普魯蘭酶XWPu2的編碼基因JT/如 ，其全長1959bp,起始密碼為 ATG,終止密碼為 TAA。經(jīng) BLAST 在 GeneBank(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析,該普魯蘭酶基因編碼的氨基酸序列與GeneBank中Paenibacillus Iactis 154來源的潛在I型普魯蘭酶(ZP_09000293. I)具有最高一致性，
'與Paenibac illus vortex V453來源潛在 I 型普魯蘭酶(ZP_07901047. I)具有最高一致性，為65%，說明普魯蘭酶JT/如 是一種新的普魯蘭酶。本發(fā)明還提供了包含上述普魯蘭酶基因JT/如 的重組載體，優(yōu)選為pET-JT/如 。將本發(fā)明的普魯蘭酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明的普魯蘭酶基因插入到質(zhì)粒pET-28a(+)上的及^7 I和通o I限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒 pET-JT/^J。本發(fā)明還提供了包含上述普魯蘭酶基因JT/如 的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株現(xiàn)^ (DE3)/ XWPu2。本發(fā)明制備普魯蘭酶XWPU2的方法按以下步驟進(jìn)行
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組普魯蘭酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的普魯蘭酶XWPu2。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株現(xiàn)之2 (DE3)/ XWPu2。本發(fā)明提供了一個(gè)新的普魯蘭酶基因，其編碼的普魯蘭酶以普魯蘭糖為底物最適溫度50°C;最適pH5. 8-6. 8 ;終濃度I mM的P -巰基乙醇和I mM金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+和K+對酶有較強(qiáng)的激活作用，Cu2+、Hg+、Co+、Zn2+、Pb+、SDS和EDTA有較強(qiáng)的抑制作用；普魯蘭酶XWPu2熱穩(wěn)定性研究表明，37°C和50 °C保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH穩(wěn)定性研究表明，pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6的緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%,74. 5%和57%以上；普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5 U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環(huán)糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業(yè)中有較廣的應(yīng)用前景。


圖I :在大腸桿菌中表達(dá)的重組普魯蘭酶XWPu2的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 :純化的重組普魯蘭酶XWPu2。圖2 :重組普魯蘭酶XWPu2的最適溫度。圖3 :重組普魯蘭酶XWPu2的熱穩(wěn)定性。圖4 :重組普魯蘭酶XWPu2的最適pH。圖5 :重組普魯蘭酶XWPu2的pH穩(wěn)定性。圖6 :不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組普魯蘭酶XWPu2活性的影響。圖7 :薄層層析定性分析重組普魯蘭酶XWPu2的水解產(chǎn)物，其中圖7- (A) :1，麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品；2，普魯蘭糖對照；3，普魯蘭酶XWPu2水解普魯蘭糖；4，麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品；5，糊精；圖7- (B) 1, a-環(huán)糊精對照；2，普魯蘭酶XWPu2水解a -環(huán)糊精；3，普魯蘭酶XWPu2水解P -環(huán)糊精；4，^ -環(huán)糊精對照；5，普魯蘭酶XWPu2水解玉米支鏈淀粉；6，玉米支鏈淀粉對照；7，普魯蘭酶XWPu2水解糊精；8，糊精對照；9，糊精。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料和試劑
I、菌株及載體嗜堿性類芽孢桿菌(作洲/如ci77m sp.與保藏編號為CGMCC No. 2096的芽孢桿菌屬菌株LZ-10性質(zhì)相似);大腸桿菌coli BL21 (DE3)和表達(dá)載體pET_28a ( + )可購于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4連接酶購自Promega公司；普魯蘭糖和玉米支鏈淀粉購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團(tuán)。3、培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，氯化鈉1%，pH自然(約為7. O)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。實(shí)施例I :普魯蘭酶基因XWPu2的克隆
提取嗜堿性類芽孢桿菌如ci77心sp.)基因組DNA =CTAB裂解法，具體步驟為將液體培養(yǎng)12 h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 UL溶液I ( 20 mM Tris, pH8. 0, 2 mMNa2-EDTA,終濃度20 mg/mL溶菌酶)，37 °C保溫30 min，加100 u L 10% SDS上下顛倒混勻，再加 10 UL 10 mg/mL 的蛋白酶 K，37 °C保溫 30 min，加 150 u L 5 M NaCl 和 150 u L10% CTAB溶液上下顛倒混勻，65 °C保溫20 min，分裝成600 U L每管，再加入600 yL — /氯仿/異丙醇(體積比25 :24 :1)進(jìn)行抽提,在4 "€下12000 rpm離心10 min,取上清300iiL于300 U L氯仿/異丙醇(體積比24 :1)中再次抽提除去雜蛋白，4 1下12000 rpm離心10 min，再取上清200 U L并加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的pH5. 2 3 M NaAc,-70°C沉淀lh，4 1下13500 rpm離心20 min，棄上清，再用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，力口入適量TE溶解，置于-20 °C備用。根據(jù)嗜堿性類芽孢桿菌(Ami如sp.)全基因組測序及基因注釋分析普魯蘭酶基因XWPu2并設(shè)計(jì)表達(dá)引物CarF和CarR
上游引物 CarF: 5 ’ CCGGAATTCATGGCGGTGCAGAAGGATAGGA 3 ’(劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn))
下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGTTACCTGTCACAGCCGAGAATGACC 3’(劃線部分為ZAo I 酶切位點(diǎn))
上游引物 17: 5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG 3，
下游引物Hter: 5’TGCTAGTTAITGCTCAGCGG 3’為PCR檢測陽性克隆子引物。以嗜堿性類芽孢桿菌如ci77心sp.)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94 °C預(yù)變性5 min;然后94 °C變性30 sec ；60 °C退火30 sec ；72 °C延伸Imin30 sec ;30個(gè)循環(huán)后72 °C保溫5 min。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)I和沿o I雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達(dá)載體pET-28a (+)連接構(gòu)建質(zhì)粒pET-JT/如 ，4°C 過夜。取 10 ii I 連接產(chǎn)物 pET-Zr/^/J 轉(zhuǎn)化到 100 u I Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37 1溫箱培養(yǎng)13 h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，Hter)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌IBL21 (DE3) /XWPu2。實(shí)施例2 :重組普魯蘭酶XWPu2的制備
取含有重組質(zhì)粒pET-Zr/^/J的Escherichia coli BL21 (DE3)菌株和只含有 pET-28a (+)的空質(zhì)粒coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含50 l^g/mL Kan)培養(yǎng)液中，37 1快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50吒/mL Kan)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3 h (OD600達(dá)到0.6-1. 0)后，加入終濃度0. 7 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于20 1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20 h或26 °C振蕩培養(yǎng)約8 h。12000 rpm離心5 min，收集菌體。用適量的pH7. 0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)13，000 rpm離心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果(圖I)表明，重組普魯蘭酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)，經(jīng)Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶,蛋白質(zhì)分子量大小約74 kDao純化的重組普魯蘭酶XWPu2的性質(zhì)測定
I、重組普魯蘭酶XWPu2的活性分析
實(shí)施例2純化的重組普魯蘭酶XWPu2的活性測定方法采用DNS法取三支10 ml試管，分別編號1、2、3,1號和2號試管為實(shí)驗(yàn)組,3號為對照組。分別向I號、2號和3號試管中加入0.9 ml 1%普魯蘭糖底物(底物為50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液配制)，40 °C預(yù)熱5 min,向I號和2號試管中加入100 U I適當(dāng)稀釋的酶液，40 °C水浴鍋中反應(yīng)30 min，然后向I號、2號和3號試管中加入I. 5 ml DNS終止反應(yīng),并將在3號試管中補(bǔ)加100 y I酶液，取出三支試管沸水浴7 min,震蕩混勻，流動(dòng)冷水冷卻后，在分光光度計(jì)540 nm下測定其吸光度值。I個(gè)酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物普魯蘭糖生成I ymoL葡萄糖所需要的酶量。2、重組普魯蘭酶XWPu2的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測定
酶的最適溫度的測定將普魯蘭酶XWPu2在含I mM Ca2+的50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液下，分別在 23 0C >30 0C >37 0C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 1和 65 °C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。溫度穩(wěn)定性的測定將普魯蘭酶XWPu2在含I mM Ca2+的50 mmol/L pH6. 6的磷酸鉀緩沖液下，分別在37。。和50 °C下分別保溫20 min、40 min、60 min、80 min > 100min、120 min、和 140 min 后在溫度 50 °C ,含 I mM Ca2+ 的 50 mmol/L pH6. 6 的憐酸鉀緩沖液進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以1%普魯蘭糖為底物，反應(yīng)30 min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明XWPu2的最適溫度50°C (圖2) ； 37°C和50 °〇保溫140 min殘余酶活依次在84%和52%以上(圖3)。3、重組普魯蘭酶XWPu2的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定
酶的最適pH的測定將普魯蘭酶XWPu2在最適溫度50 °C，分別在含I mM Ca2+的50 mM醋酸緩沖液(PH3. 6，4. 6，5. 0)、磷酸鉀緩沖液(5. 8，6. 0，6. 2，6. 4，6. 6，6. 8，7. 0，7. 4，7. 6，7. 8,8. 0)和甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(8. 6,9. 0)條件下酶促反應(yīng)。pH穩(wěn)定性的測定將普魯蘭酶XWPu2在最適溫度50°C，在含ImM Ca2+的pH5. 0、pH5. 8和pH8. 6緩沖液下分別耐受15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min后進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以1%普魯蘭糖為底物，反應(yīng)30min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明XWPu2的最適pH6. 6 (圖4);在含ImM Ca2+的50 mM pH5. O、pH5. 8和pH8. 6緩沖液下處理90 min殘余酶活依次在74%、74. 5%和57%以上(圖5)。普魯蘭酶XWPu2的比活力為383. 5U/mg
4、不同金屬離子及化學(xué)試劑對重組普魯蘭酶XWP u2活性的影響
在酶促反應(yīng)體系中加入終濃度I mM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響。以1%普魯蘭糖為底物，在50 °C、pH6. 6條件下，反應(yīng)30 min，測定純化普魯蘭酶XWPu2的酶活力。結(jié)果(圖6)表明，終濃度I mM的￠-巰基乙醇和I mM金屬離子Mn2+、Fe2+、K+和Ca2+對酶有較強(qiáng)的激活作用，Cu2+、Hg2+、Co2+、Zn2+、Pb2+、SDS和EDTA有較強(qiáng)的抑制作用。5、薄層層析定性分析重組普魯蘭酶XWPu2的水解產(chǎn)物
分別以1%普魯蘭糖、1%玉米支鏈淀粉、1% a -環(huán)糊精、1% ^ -環(huán)糊精和1%糊精為底物，在重組普魯蘭酶XWPu2最適反應(yīng)條件(pH6. 6，50°C )下進(jìn)行水解反應(yīng)30 min,產(chǎn)物經(jīng)離心并稀釋適當(dāng)倍數(shù)取0. 5 Ul進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果(如圖7)表明，普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環(huán)糊精生成葡萄糖。
權(quán)利要求
1.一種普魯蘭酶XWPu2，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼權(quán)利要求I所述的普魯蘭酶XWPu2的普魯蘭酶基因JT/如 ，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權(quán)利要求2所述普魯蘭酶基因JT/如 的重組載體。
4.一種包含權(quán)利要求2所述普魯蘭酶基因JT/如 的重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明是一種普魯蘭酶XWPu2及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，提供普魯蘭酶基因XWPu2的重組載體和重組菌株。本發(fā)明以普魯蘭糖為底物的普魯蘭酶XWPu2具有以下性質(zhì)最適溫度50℃；最適pH5.8-6.8；終濃度1mM的β-巰基乙醇和1mM金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+和K+對酶有較強(qiáng)的激活作用；37℃和50℃保溫140min殘余酶活依次在84%和52%以上；pH5.0和pH8.6的緩沖液下處理90min殘余酶活在74%和57%以上；比活力383.5U/mg。此外，薄層層析定性分析普魯蘭酶XWPu2徹底水解普魯蘭糖生成單一麥芽三糖；水解玉米支鏈淀粉生成糊精；水解環(huán)糊精生成葡萄糖。以上研究表明，普魯蘭酶XWPu2在食品、化工、制藥、能源等行業(yè)中有潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/19GK102965361SQ20121051145
公開日2013年3月13日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者黃遵錫 申請人:昆明愛科特生物科技有限公司